JP2000219698A - 物質分離材料、物質分離システムおよび物質分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 標的物質との結合反応が迅速で、標的物質を
吸着した分離材料を容易に分離することができる。 【解決手段】 下限臨界溶液温度を有する高分子に標的
物質に対して特異的親和性を有する物質を結合してな
り、下限臨界溶液温度以下で非固相である非ミセル型物
質分離材料料、該非ミセル型物質分離材料を用いた物質
分離システムおよび物質分離方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、標的物質に対して特異
的親和性を有する物質を結合した下限溶液臨界温度（以
下、「ＬＣＳＴ」という）を有する高分子を利用した下
限臨界溶液温度以下で非固相の（以下、「非固相」とい
う）非ミセル型物質分離材料及び凝集促進剤との組み合
わせを利用した分離システムおよび該分離システムを用
いてなる標的物質の分離方法に関する。ＬＣＳＴとは、
温度感受性ポリマーの固液相転移温度を表し、ＬＣＳＴ
以下では液相、以上で固相となる。

【０００２】

【従来の技術】近年の細胞工学技術や遺伝子工学技術の
発展により、生物学的プロセスを利用した物質生産が盛
んに行われるようになっている。これらの物質生産方法
によりタンパクを中心とした主として水溶性生体高分子
が盛んに製造さており、これらの生理活性を損なうこと
なく効率よく培養プロセスから分離するための方法が望
まれている。これらの生物学的プロセスを利用した物質
生産の多くでは、標的物質の濃度が低いことが多く、ま
た製造主体である細胞や菌体由来のタンパクなどの不純
物が大量に含まれているため、一般的な生化学的工程に
よる分離方法では充分な純度及び収率を得るためには複
雑な工程が必要であった。一方、近年Ｎ−イソプロピル
アクリルアミドなどに代表されるＮ置換アクリル系ポリ
マーがＬＣＳＴを有することから、これらのポリマーと
標的物質に対して特異的親和性を有する物質との結合体
を固体担体に固定化して細胞分離を行うなどの分離方法
が報告されている（たとえば、特開平７−１３５９５７
など）。この方法は結合した細胞を穏やかな条件で剥離
させることができる特徴がある一方で、タンパクなどの
水溶性生体高分子の分離に用いる上では固体担体を用い
ているために標的物質との結合速度が制限される、無菌
化が困難などの問題があった。固体担体を用いずに温度
感受性ポリマーと標的物質に特異的親和性を有する物質
との結合体を用いる方法も報告されているが、多くの場
合これらの結合体の一部は疎水的温度感受性ポリマーと
親水的な特異的親和性物質が結合した結果、両親媒性の
構造となり水中でミセル構造となる。ミセル構造を形成
すると、本来温度感受性ポリマーが凝集し水と相分離を
起こす環境条件下に於いても水中で安定化され相分離を
起こしにくく、標的物質の分離には強度の遠心分離を要
するためコスト上の問題に加えて細胞や菌体などが障害
を受けるなどの問題があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、標的物質と
の結合速度が速く、水溶液からの分離が容易であり、滅
菌することができる物質分離材料を提供することを目的
とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記発明の目的は以下の
分離材料及び分離システムによって達成される。本発明
は、下限溶液臨界温度（以下、「ＬＣＳＴ」という）を
有する高分子（以下、「ＬＣＳＴを有する高分子」とい
う）に標的物質に対して特異的親和性を有する物質を結
合してなり、下限溶液臨界温度以下で非固相である非ミ
セル型物質分離材料、該物質分離材料と凝集促進剤を組
み合わせてなる物質分離システム、ならびに該システム
を用いた標的物質の物質分離方法を提供するものであ
る。本発明において、該物質分離材料はＬＣＳＴ以下で
非固相であるが、ここで非固相というのは該物質分離材
料が固相担体を含まず水溶性であることを示す。これ
は、例えば１００ｇの水に該物質分離材料を０．１ｇ添
加して溶解することを示している。本発明に於いて、標
的物質は特に限定されないが、例えばモノクローナル抗
体、抗原、レクチン、酵素タンパク、ＤＮＡ結合タンパ
ク、ウイルス遺伝子などの特定配列のＤＮＡあるいはＲ
ＮＡなどの核酸などを挙げることができる。標的物質に
対して特異的親和性を有する物質は特に限定されない
が、上記の標的物質の例示に対応して、例えば抗原、抗
体、糖鎖（糖タンパク）、基質或いはその誘導体、相補
的配列のＤＮＡプローブなどを挙げることができるほ
か、アビジン（又はストレプトアビジン）を用いてビオ
チン標識した標的物質の分離を行うこともできる。

【０００５】ＬＣＳＴを有する高分子としては特に限定
されないが、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
ポリマーあるいはＮ−ブチルアクリルアミドポリマーな
どのＮ置換アクリルアミド誘導体ポリマー、ビニルメチ
ルエーテルポリマー、エチレンオキサイドポリマー、ビ
ニルアルコールポリマー、またはこれらとメチルメタク
リレートやアクリルアミドなどとの共重合体などが挙げ
られる。これらのＬＣＳＴを有する高分子の分子量範囲
は、１，０００〜１，０００，０００、好ましくは２，
０００〜２００，０００であることが望ましい。

【０００６】本発明においては、上記物質分離材料と凝
集促進剤を組み合わせて物質分離システムとすることが
できる。凝集促進剤としては特に限定されないが、例え
ば、硫酸マグネシウム、クエン酸ナトリウムのような低
分子、あるいはポリアクリル酸ナトリウム、硫酸デキス
トラン、メタクリル酸共重合体、スルホン化イソプレン
重合体などの水溶性高分子、標的物質に対して特異的親
和性を有する物質を結合していないＬＣＳＴを有する高
分子自身あるいはこの高分子を表面に有する粒子を挙げ
ることができる。

【０００７】凝集促進剤が多価イオンであればより低濃
度で効果的な凝集促進効果を持っているため浸透あるに
悪影響は少なく、さらに高分子多価イオンはそれ自身が
凝集し細胞や菌体から分離できるため特に好ましい。ま
た、標的物質に対して特異的親和性を有する物質を結合
していないＬＣＳＴを有する高分子はこの高分子の有効
濃度を増大させることにより凝集を促進することができ
る。これらの凝集促進剤を適切に用いると、該物質分離
材料は大きな凝集塊を形成し、遠心分離器などを用いず
とも重力沈降あるいはナイロンメッシュなどによるろ過
分離で容易に細胞や菌体あるいは水溶性の不純物と分離
することができる。同様にこの高分子を表面に有する粒
子もまた凝集促進効果を持ち粒子であるが故に迅速な重
力沈降速度を得ることができ、同じく細胞などと容易に
分離することができる。

【０００８】凝集促進剤は、上記分離材料と等量程度使
用する。実用的には、物質分離材料と凝集促進剤をそれ
ぞれ０．１重量％程度使用する。標的物質に対して特異
的親和性を有する物質とＬＣＳＴを有する高分子との結
合は、公知の方法で行うことができる。例えば、ＬＣＳ
Ｔを有する高分子末端に導入したカルボキシル基と標的
物質に対して特異的親和性を有するタンパクのリジン残
基のε−アミノ基とを水溶性カルボジイミドで縮合させ
ることができる。

【０００９】本発明において、標的物質に対して特異的
親和性を有する物質と高分子は、モル比として、標的物
質：親和性物質：高分子＝１：(１〜２)：(５〜２０)程
度の割合で使用される。標的物質に対して特異的親和性
を有する物質とＬＣＳＴを有する高分子との結合体を非
ミセル型とする方法は、例えば、該結合体を１重量％以
上の高濃度とした後、水溶液中でＬＣＳＴ以上の温度条
件に加温して生じる白濁液を遠心分離して沈殿分画とし
て得る方法、あるいは、適当な凝集剤を添加して凝集沈
殿させた分画としても得る方法を挙げることができる。
ミセル型となった該結合体は遠心分離や多価イオン凝集
促進剤の添加で沈殿する凝集物を形成しにくいので非ミ
セル分画から分離することができる。

【００１０】本発明の非固相非ミセル型物質分離材料を
滅菌する方法としては、例えば、本物質分離材料がＬＣ
ＳＴ以下の温度条件で水溶性であることを利用して、孔
径０．２μｍ程度のフィルターを用いてろ過することに
より、容易に滅菌することができる。本発明の非固相非
ミセル型物質分離材料を標的物質を含む細胞あるいは菌
体培養液中などに添加する濃度は、標的物質濃度および
分離材料と標的物質との間の親和性に応じて適宜決定さ
れるべきであるが、一般的には細胞あるいは菌体培養液
に対して１重量％未満の比較的低濃度で用いることが望
ましい。

【００１１】標的物質を吸着した物質分離材料の凝集沈
降はＬＣＳＴ以上の温度で凝集促進剤の添加により促進
することができる。イオン性凝集促進剤を使用した場
合、これはＬＣＳＴ以下の温度で水和していた温度感受
性ポリマーからの脱水を凝集促進剤が促進するためと考
えられ、１価のイオン、例えば塩化ナトリウムなどに較
べより低濃度で効果的な凝集を引き起こすことができ
る。細胞や菌体が標的物質と共存している場合にはこの
点は特に重要であり、凝集促進効果を塩化ナトリウムだ
けで行うには高濃度が必要であり浸透圧が上昇するため
細胞や菌体に致死的な影響を及ぼすことがある。

【００１２】標的物質と物質分離材料との結合は短時間
で行うことができる。実際の分離条件下では、標的物質
を含む細胞あるいは菌体培養液などに物質分離材料を添
加した後３０分以内、好ましくは１０分以内に凝集促進
剤を添加して標的物質を結合した分離材料を培養液中か
ら分離、回収することができる。これは本発明の物質分
離材料がであるためであり、固体担体を用いた場合に較
べ液中での拡散が阻害されないためと推定される。

【００１３】本発明において、凝集促進剤を添加するこ
とにより物質分離材料は大きな凝集塊を形成、あるいは
凝集促進剤が粒子である場合には粒子との結合体として
容易に重力沈降する凝集体を形成する。凝集促進剤の濃
度は、物質分離材料の０．０１〜５重量％、好ましくは
０．０５〜１重量％で用いられる。これらの凝集塊ある
いは凝集体は、適当なメッシュサイズのナイロンメッシ
ュなどによるろ過処理、あるいは重力沈降により分離す
ることができる。これらの分離方法は、いずれも遠心機
などの大きな重力加速度を加えることなく穏やかな条件
で分離を行うものであるので、遠心機などの大規模な設
備が不要である点に加えて、細胞や菌体に与える障害を
低減することができる利点を持っている。

【００１４】標的物質は、結合した物質分離材料から公
知の手段で解離させることができる。例えば、中性ｐＨ
の適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水など、で
凝集物を洗浄して凝集促進剤を除去した後、０．２Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ４．５）などを添加することにより
標的物質が解離する。このとき、凝集物の懸濁液の温度
を物質分離材料のＬＣＳＴ以上に保つことにより、物質
分離材料は不溶性に保ったままで標的物質だけを可溶性
分画として回収することができる。

【００１５】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲の項の記
載により定まるものであり、以下の実施例により制限を
受けるものではない。

【００１６】＜実施例１ ＬＣＳＴを有する高分子の重
合及びプロテインＡを結合させた非固相非ミセル型物質
分離材料の調製＞ （１）３０ｇのＮ−イソプロピルアクリルアミド、反応
開始剤として０．０８７ｇのＡＩＢＮ、連鎖移動剤とし
て０．２８ｇの３−メルカプトプロピオン酸を１５０ｇ
のジメチルホルムアミドに溶解し、窒素気流下で７０℃
５時間反応させて、ポリマー末端にカルボキシル基を持
つＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマーを重合し
た。得られたポリマーはジエチルエーテル中で再沈を繰
り返して精製し、分子量は５，４００のＮ−イソプロピ
ルアクリルアミドポリマーを得た。 （２）上記（１）で得られたポリマー１ｇ、０．２１ｇ
のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、０．３８ｇのジシク
ロヘキシルカルボジイミドを１ｇのジメチルホルムアミ
ドに溶解し、４℃１６時間反応させた。生成したジシク
ロヘキシル尿素をろ過分離した後、ポリマー溶液をジエ
チルエーテル中で再沈を繰り返して精製した。真空乾燥
した０．５ｇのポリマーに５ｇのリン酸緩衝生理食塩水
に溶解した０．１ｇのプロテインＡを添加し、４℃で１
６時間反応させプロテインＡ固定化Ｎ−イソプロピルア
クリルアミドポリマーを得た。 （３）上記（２）で得られたプロテインＡ固定化Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミドポリマーを３７℃１０分間加
温後、３７℃で１５，０００ｒｐｍ×１０分遠心分離し
て沈殿分画を回収した。沈殿分画に回収された非ミセル
型プロテインＡ固定化Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
ポリマーの収率は６０％であった。 （４）該非ミセル型プロテインＡ固定化Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミドポリマーのプログラマブル温度制御装
置（日立製作所ＳＰＲ−１０型）で温度制御した分光光
度計（日立製作所製Ｕ２０００型）にセットし、経時的
に温度を上昇させつつ透過率（測定波長４００ｎｍ）を
測定したところ、ＬＣＳＴは３１．４℃であった。一
方、遠心分離後の３７℃上清分画に回収された白濁状態
のプロテインＡ結合Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポ
リマーを動的光散乱法（大塚電子製ＬＰＡ−３１００
型）で分析した結果、光散乱粒径約２００ｎｍの粒子と
して存在し、粒径は３７℃１時間放置しても変化しなか
った。従って、上清分画のプロテインＡ固定化Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドポリマーは疎水的Ｎ−イソプロ
ピルアクリルアミドポリマーを核とし親水的プロテイン
Ａとのミセルを形成して水中で安定化されているものと
推定された。

【００１７】＜実施例２ プロテインＡ固定化Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドポリマーによるＩｇＧ抗体の分
離＞ （１）ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１を１０
重量％ウシ胎児血清を含むイスコフ変法ダルベッコ培地
で３日間培養後に、ウサギ正常抗体ＩｇＧを０．１ｇ／
Ｌになるよう添加した。孔径０．２２μｍのフィルター
（ミリポア社マイレックスＧＶ）でろ過滅菌した０．１
ｇのプロテインＡ固定化Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマーを２５℃１００ｍｌの細胞培養液中に添加し
た後、１、５、１０、３０分間攪拌後に０．１ｇの硫酸
デキストランを添加し、均一に攪拌後３７℃で５分間静
置しプロテインＡ固定化Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマーのＩｇＧ吸着体の凝集物を生成させた。 （２）生成したプロテインＡ固定化Ｎ−イソプロピルア
クリルアミドポリマーのＩｇＧ吸着体の凝集物を１５０
メッシュのナイロンメッシュでろ過し、凝集物を分離し
た。次いで、ナイロンメッシュ上に捕捉された凝集物を
３７℃リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、４℃１０ｍｌの
蒸留水に溶解し、一部をイオン交換クロマトグラフィー
（アマシャムファルマシア社ＦＰＬＣ、ＭｏｎｏＱＨ
Ｒ）で分析してＩｇＧを定量した。攪拌時間とＩｇＧ回
収率との関係を表１に示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】＜比較例１ 多価イオン不使用でのプロテ
インＡ固定化Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー
によるＩｇＧ抗体の分離＞実施例２と同じ条件でプロテ
インＡ固定化Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー
を３７℃で添加し、白濁した培養液を同じくナイロンメ
ッシュでろ過後、メッシュ上に捕捉されたIgGを定量し
た。ＩｇＧ回収率は攪拌時間に関係なく５％未満で一定
であった。

【００２０】＜比較例２ プロテインＡ固定化ポリスチ
レン粒子＞粒径１．２μｍのカルボキシル変性ポリスチ
レン粒子の０．０００１Ｍの塩酸懸濁液０．５ｇに、
０．０１ｇの水溶性カルボジイミド（物質名）を添加
し、２５℃６時間攪拌した。遠心分離により蒸留水で３
回洗浄した後、０．０２５ｇのプロテインＡを加え、５
０℃１６時間反応させた。１００ｍｌの細胞培養液を
１，０００ｒｐｍ×１０分遠心し細胞を沈殿除去した
後、０．１ｇのプロテインＡ固定化粒子を３７℃遠心上
清中に添加し、１、５、１０、３０分間攪拌後に１０，
０００ｒｐｍ×１０分間遠心分離して粒子を分離した。
沈殿した粒子を０．２Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．０で洗
浄してＩｇＧを回収し、イオン交換クロマトグラフィー
でＩｇＧを定量した。

【００２１】

【表２】

【００２２】

【発明の効果】本発明の物質分離材料は標的物質との結
合反応が迅速で回収率が高く、標的物質を吸着した分離
材料を容易に分離することができる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下限臨界溶液温度を有する高分子に標的
   物質に対して特異的親和性を有する物質を結合してな
   り、下限臨界溶液温度以下で非固相である非ミセル型物
   質分離材料。
2. 【請求項２】 下限臨界溶液温度を有する高分子がＮ置
   換アクリルアミド系ポリマーである請求項１記載の物質
   分離材料
3. 【請求項３】 下限臨界溶液温度を有する高分子がＮ−
   イソプロピルアクリルアミドを含むポリマーである請求
   項１記載の物質分離材料
4. 【請求項４】 請求項１記載の分離材料と凝集促進剤を
   組み合わせてなる物質分離システム。
5. 【請求項５】 請求項１記載の物質分離材料と標的物質
   を混和し、さらに凝集促進剤を加えることにより標的物
   質を分離することを特徴とする物質分離方法。