WO2009123348A1 - ウイルス濃縮法 - Google Patents

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WO2009123348A1
WO2009123348A1 PCT/JP2009/057040 JP2009057040W WO2009123348A1 WO 2009123348 A1 WO2009123348 A1 WO 2009123348A1 JP 2009057040 W JP2009057040 W JP 2009057040W WO 2009123348 A1 WO2009123348 A1 WO 2009123348A1
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virus
lectin
carrier
sugar
eluate
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PCT/JP2009/057040
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高倉由光
市川雅子
近藤一博
清水昭宏
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日本たばこ産業株式会社
株式会社 ウイルス医科学研究所
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Priority to CA2722957A priority patent/CA2722957A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16051—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/36—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)

Definitions

  • the present invention relates to a new method for concentrating a virus or a virus vector while maintaining its infectivity, and a kit for performing the method.
  • the present invention relates to a safe and simple concentration technique for vectors useful for gene therapy and vaccines such as retrovirus vector 1 and herpes virus vector 1.
  • An example of a method for increasing the concentration of virus in the solution and concentrating the virus is an ultracentrifugation method.
  • this method requires expensive equipment and long separation time, and requires a lot of labor for the work.
  • these methods are used in subsequent procedures such as other components used in the reagent are harmful to the sensitized cells. May interfere. For this reason, the sample must be purified after virus precipitation, which requires a lot of labor.
  • a method for concentrating virus particles themselves using an antibody has been developed (specialized 200 0 7 8 4 8 5). However, this method may affect the virus infectivity by inhibiting the protein function of the virus surface. For example, when separating virus particles from antibodies, it was necessary to use strong acidic conditions (for example, pH 2-3), which could cause defects in virus particles.
  • virus concentration method for example, magnetic particles bound with mannose-binding lectin Is disclosed (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-16559 Do)
  • a method using streptavidin and a pyotinylated lectin is also disclosed as a method for increasing the retrovirus titer or isolating a retrovirus from a specimen sample (W02001 / 079456).
  • the virus is used while bound to the carrier, and the virus itself cannot be isolated. Therefore, the usage of the virus concentrated by these methods was determined by P.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-078485
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-165591
  • Patent Document 3 International Application Publication No. WO 2001/079456 Pamphlet
  • an object of the present invention is to provide a technique for concentrating virus vectors useful for gene therapy and vaccines such as a retrovirus vector and a herpesvirus vector safely and powerfully and simply.
  • the present inventors have conducted a research and developed a technique capable of concentrating a virus virus vector in a solution by a simple method. More specifically, the present inventors bound a lectin to a desired virus-containing solution, further bound a virus-lectin complex with a carrier, and then separated and recovered the carrier bound with the virus, By adding, only the target virus is removed from the carrier into an appropriate amount of solution without losing infectivity. Elution and successful preparation to a concentration higher than that of the original virus-containing solution.
  • the present inventors have also identified as lectins, SBA (derived from dies, sugar chains to be bound: sugar chains containing N-acetyl galactosamine (Ga 1 NAc)), S SA (two Derived from honnitoco, sugar chain to be bound: ⁇ 2-6-linked sialic acid (Siaa2-6) -containing sugar chain), DSA (derived from datura, bound sugar chain: N-acetylcylcosamine (Gl cNAc ), WGA (derived from wheat germ, bound sugar chain: N-acetyl darcosamine (GlcNAc) or sugar chain containing sialic acid), the recovery rate of virus vector is remarkable. I found it to be high.
  • the present inventors succeeded in eluting the viral vector from the viral vector-binding carrier by treating the carrier to which the virus or viral vector recovered by the above method is bound with an appropriate sugar. .
  • the virus isolated in this way remained infectious.
  • the present inventors have proposed that as a sugar for eluting such viruses and virus vectors, chito-oligosaccharides when lectin power ⁇ WGA, N-acetylyl D-galactosamine when lectin is SBA, or It has been found that it is preferable to use a sugar containing this.
  • the present invention provides a novel concentration method that enables virus and virus vectors to be easily concentrated while maintaining infectivity.
  • the present invention is as follows.
  • Aspect 1 Method for concentrating virus comprising the following steps:
  • the lectin is linked to a molecule that can bind to the carrier, and further, by binding to the carrier via the molecule, the virus bound to the lectin indirectly binds to the carrier, or (ii) The lectin is directly bound to the carrier, so that the virus bound to the lectin binds to the carrier;
  • the recovered carrier is treated with an eluate containing sugar to elute the virus from the carrier, where The eluate is smaller than the volume of the virus-containing solution in (1); and (4) The carrier is separated from the eluate in (3) to obtain a virus concentrate;
  • Aspect 2 Method for concentrating virus comprising the following steps:
  • Embodiment 3 The method according to embodiment 1 or 2, wherein the virus is an enveloped virus or a virus derived from the virus.
  • Embodiment 4 The method according to embodiment 1 or 2, wherein the virus is a lentivirus or a herpes virus.
  • the lectin is a sugar containing at least one of N-acetyl galactosamine (Ga 1 NAc;), ⁇ 2_6-linked sialic acid (Sia 2-6), and N-acetyl darcosamine (G 1 cNAc).
  • a method according to embodiment 1 or 2 which is a lectin that binds.
  • Aspect 6 The method according to aspect 5, wherein the lectin is selected from the group consisting of SBA (derived from soybean), SSA (derived from Nihontoko), DSA (derived from Chiyosen morning glory), and “WGA (derived from wheat germ). .
  • SBA derived from soybean
  • SSA derived from Nihontoko
  • DSA derived from Chiyosen morning glory
  • WGA derived from wheat germ
  • Aspect 7 Lectin power ⁇ WGA (from wheat germ) and the sugar used for virus elution is chitooligosaccharide; or the lectin is SBA (from soybean) and the sugar used for virus elution is N-acetyl
  • Virus is lentivirus, lectin power SWGA (from wheat germ), and sugar used for elution of virus is chitooligosaccharide; or virus is lentivirus
  • the lectin is SBA (derived from soybean)
  • the sugar used for elution of the virus is N-acetyl-D-galactosamine or a sugar containing the same;
  • Embodiment 9 Method for concentrating virus comprising the following steps:
  • Figure 1 is a fluorescence micrograph showing the results of testing for nonspecific adsorption of HHV-6 to tamavidin beads.
  • the green dot indicates that the EGFP recombinant HH V-6 is infected with MT-4 cells, one of the Indike cells, and one dot represents one infectious virus particle ( The difference in brightness at each point is due to the difference in viral gene expression after infection. is there).
  • the photo on the left shows the case where HHV-6 virus solution (stock solution) was allowed to act on MT-4 cells.
  • the photo on the right shows the case where HHV-6 virus solution (stock solution) was contacted with evening mavidin beads in the absence of lectin, and the virus adsorbed on tamavidin beads was allowed to act on MT-4 cells.
  • FIG. 2 is a fluorescence photomicrograph showing the results of testing the concentration effect of HHV-6 by each lectin of ABA, DSA, Lotus, MAM, and PHA_E4.
  • a green dot indicates that EGFP recombinant HH V-6 is infecting MT-4 cells, which are indigenous cells, and one dot represents one infectious virus particle. (Differences in brightness at each point are due to differences in viral gene expression after infection).
  • FIG. 3 is a fluorescence micrograph showing the results of testing the concentration effect of HH V-6 by lectins of P HA—L 4, UEA_I, S B A, and S S A.
  • the green light points indicate that EGFP recombinant HH V-6 is infected with MT-4 cells, which are the cells of Indike, and one dot represents one infectious virus particle. (The difference in brightness at each point is due to the difference in viral gene expression after infection).
  • Figure 4 is a graph showing the degree of concentration of HHV-6 in saliva by lectins and evening mavidin beads.
  • Fig. 5 is a graph showing the degree of concentration of HHV-6 when lectin and evening mavidin beads are used to elute HHV-6 in saliva with concentrated opiate.
  • Figure 6 is a fluorescence micrograph showing the results of testing the concentration of lentiviral vectors with lectins and evening mavidin beads.
  • a green dot indicates that the EGFP recombinant lentiviral vector is infected with 2 9 3 cells, which are indike overnight cells, and one dot represents one infectious virus particle (each The difference in brightness of the spots is due to the difference in virus gene expression after infection).
  • FIG. 7 is a graph showing the degree of concentration of lentiviral vector by lectin and evening mavidin beads.
  • the present invention is a method for concentrating a virus comprising the following steps: (1) Contact the lectin with the virus-containing solution to bind the virus and the lectin, where
  • the lectin is linked to a molecule that can bind to the carrier, and further, by binding to the carrier via the molecule, the virus bound to the lectin indirectly binds to the carrier, or (ii) The lectin is directly bound to the carrier, so that the virus bound to the lectin binds to the carrier;
  • the method is provided.
  • the virus to be concentrated in the method of the present invention is an enveloped virus or a virus vector derived from the virus.
  • the virus to be concentrated is box virus, box virus-derived vector, togavirus, togavirus-derived vector, coronavirus, coronavirus-derived vector, flavivirus, flavivirus-derived vector, retrovirus, It may be selected from the group consisting of retrovirus-derived vectors, herpesviruses, and herpesvirus-derived vectors.
  • the virus to be concentrated is lentivirus, lentivirus-derived vector, human herpesvirus 6 (variants A and B of human herpesvirus 6: hereinafter referred to as HHV-6), HHV —6-derived vector, human herpesvirus 7 (hereinafter referred to as HHV-7), HHV-7-derived vector, cytomegalovirus ( ⁇ named human herpesvirus 5), HHV-5-derived vector, Epsyutine 'Bar' virus (EBV) or EBV-derived vector, more preferably lentivirus, lentivirus-derived vector, HHV-6, HHV-6-derived vector, HHV-7 or HHV-7-derived vector May be.
  • human herpesvirus 6 variant A and B of human herpesvirus 6: hereinafter referred to as HHV-6
  • HHV-7 human herpesvirus 7
  • HHV-7-derived vector cytomegalovirus
  • cytomegalovirus ⁇ named human herpesvirus 5
  • the “virus-containing liquid” means a target to be concentrated in the method of the present invention. It is a material containing virus. Therefore, the virus-containing solution may contain, for example, a virus or virus vector to be concentrated in a buffer solution, or may be a body fluid. In the present specification, the “virus-containing liquid” may be simply referred to as a sample. A solution containing the virus or virus vector to be concentrated can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • the sickle may be selected from the group consisting of, but not limited to, saliva, blood, serum, semen, cerebral fluid, pharyngeal wiping fluid, breast milk, ascites, sweat, tears, and urine.
  • Body fluids can be collected by methods known to those skilled in the art. The collected body fluid may be treated as necessary as long as it does not affect the infectivity of the virus particles.
  • lectin refers to a sugar-binding protein that recognizes and binds to sugar chains.
  • the sugar chain to which the lectin binds has specificity for each lectin.
  • the lectin used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it can bind to a virus.
  • preferred lectins include at least one of N-acetyl galactosamine (Ga 1 NAc), ⁇ 2-6 linked sialic acid (Sia 2-6), N-acetyl darcosamine (Gl cNAc) It is a lectin that binds to a sugar chain, and more preferably SBA (dies derived lectin.
  • Bound sugar chain a sugar chain containing N-acetyl galactosamine (GaNAc)), SSA (a lectin derived from two honey mint.
  • Binding sugar chain ⁇ 2-6-linked sialic acid (S i aa2 -6) containing sugar chain), DSA (Datura-derived lectin.
  • Linked sugar chain N-acetyl darcosamine (G 1 cNAc) containing sugar chain), or WGA (Wheat germ-derived lectin.
  • Bond Sadasada N-acetylyldarcosamine (GlcNAc) or sugar chain containing sialic acid).
  • SBA, SSA, DSA, or WGA can be more preferably used for concentrating human herpesvirus or human herpesvirus-derived vector.
  • SBA or WGA can be more preferably used for the enrichment of lentivirus or lentivirus-derived vectors.
  • the lectin may be used by directly binding to a carrier.
  • the lectin may be used indirectly bound to a carrier. Indirect results An example of this is the binding of a lectin and a carrier through the binding of a piotin-piotin binding protein. More specifically, indirect binding of the lectin to the carrier is achieved by piotinizing the lectin, binding the protein to the surface of the carrier, and binding the protein to the surface of the carrier. Can be achieved.
  • the carrier is not particularly limited as long as it is a solid or insoluble material (for example, a material that can be separated from the reaction mixture by filtration, soot, magnetic separation, etc.).
  • Materials constituting the solid support are cellulose, Teflon (trade name), nitrocellulose, agarose, highly cross-linked spherical agarose, dextran, chitosan, polystyrene, polyacrylamide, polyester, polystrength Ponate, polyamide, polypropylene, nylon, polyvinylidene Difluoride, Latex, Silica, Glass, Glass fiber, Gold, Platinum, Silver, Copper, Iron, Stainless steel, Ferrite, Silicon wafer, Polyethylene, Polyethyleneimine, Polylactic acid, Resin, Polysaccharide, Protein (albumin etc.), Including, but not limited to, carbon or combinations thereof.
  • the shape of the solid support includes beads, magnetic beads, thin films, capillaries, filters, plates, microplates, carbon nanotubes, sensor chips, etc. As is known in the art, a pit, groove, bottom of the filter, etc. may be provided.
  • the magnetic peas can have a sphere diameter in the range of about 10 nm to about 1 mm. In preferred embodiments, the magnetic beads have a diameter in the range of about 25 nm to about 1 mm, about 50 nm to about 100; m. The size of the magnetic beads can be selected depending on the particular application.
  • a pea comprising a highly cross-linked spherical agarose such as Sepharose can have a diameter in the range of about 24 4 im to about 1 65 m.
  • the highly crosslinked spherical agarose beads have a diameter in the range of about 24 m to about 44 m.
  • the size of the via-bridged spherical agarose beads can be selected depending on the particular application.
  • solid supports having a hydrophobic surface examples include polystyrene latex beads such as those commercially available from Polysciences or Spherotech.
  • magnetic beads with a hydrophilic surface examples include beads commercially available from Polysciences under the name B i om ag® Rupoxyl or beads from Bangs Laboratory (MC O 2 N / 2 9 2 8) Etc. Alternatively, M-270, etc. commercially available from Dynal Biotech can be used.
  • the lectin and the carrier can be used by directly binding to each other.
  • the carrier is a nanobead that is large enough to allow browning.
  • a preferred sphere diameter range for the nanobeads is a sphere diameter of 10 nm to 100 nm, more preferably a sphere diameter of 30 nm to 70 nm.
  • magnetic nanobeads such as MACS MicroBeads (diameter 50 mm) of Miltenyi Biotech Can be mentioned.
  • the lectin and carrier can be linked using a protein-carrier coupling method known to those skilled in the art.
  • the surface of the carrier is modified so that the carboxyl group is exposed, and the carboxyl group and the amino group of the protein are coupled in the presence of the cross-linking reagent 1-ethyl-1- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide (EDC).
  • EDC cross-linking reagent 1-ethyl-1- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide
  • the protein and the carrier can be linked.
  • a carrier in which a carboxyl group on the surface of the carrier is activated esterified with N-hydroxysuccinimide (NH 2 S) and a protein are mixed in a buffer solution of PH 6.5 to 9 containing no primary amino group.
  • NH 2 S N-hydroxysuccinimide
  • crosslinking reagent BS 3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate) or DSS (disuccinimidyl suberate
  • SPDP N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate
  • GMB S N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide
  • the lectin may be used indirectly bound to a carrier.
  • indirect binding of the lectin and the carrier can be achieved by piotinizing the lectin, binding the pectin-binding protein to the surface of the carrier, and binding the pectin and the thiotin-binding protein.
  • beads can be preferably used as the carrier, but the preferred sphere diameter range of beads is 0.1 m to: L 00 m sphere diameter, more preferably 0.5 / m to 10 zm sphere diameter, more preferably 1 Atn! Spherical diameter of ⁇ 5 xm.
  • Piotin is a general name of D — [(+) — cis-hexahydro-2-hexoxo 1H-thieno- (3,4) -imidazo-l-ru 4-valeric acid]. is there.
  • Biotin is a type of water-soluble vitamin classified into the vitamin B group, sometimes called vitamin B 7 , or sometimes called vitamin H or coenzyme R. Piotin binds very strongly to avidin, a glycoprotein contained in egg white.
  • the term “piotine” means iminobiot in (Hofmann, et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4666-4668), It also includes thiotin (desthiobiotin) (Hirsch, et al., (2002) Anal. Biochem., 308: 343-357), and thiotin analogues such as biocytin and biotin sulfoxide.
  • a method using a piotination reagent can be mentioned.
  • the PIERCE machine (linker in order is the linker, reactive group)
  • EZ-Link (registered trademark) Sulfo- HS-Biotin (13.5 A, 1st grade amine)
  • EZ-Link (Registered trademark) Sulfo-NHS-LC-Biotin (22.4 people, 1st grade amine)
  • EZ-Link registered trademark
  • EZ-Link (Registered trademark) PFP-Biotin (9.6 A, Amine)
  • EZ-Link (registered trademark) Maleimide-PE0 2 -Biotin (29.1 A, thiol group), EZ-Link (registered trademark) Biotin- PE0 2 Amine (20.4A, carboxyl group), EZ-Link (registered trademark) Biotin-PE
  • a piotination reagent containing NHS ester dissolve it in an organic solvent such as DMSO (dimethyl sulfoxide) or a pH 7_9 phosphate buffer, and add it to the lectin to bind it. Can do.
  • an organic solvent such as DMSO (dimethyl sulfoxide) or a pH 7_9 phosphate buffer
  • the carboxyl group of the lectin can be changed using a calpositimide such as EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide hydrochloride: ⁇ ).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpositimide hydrochloride
  • a lectin to which piotin is bound may be purchased, for example, as piotin-labeled lectin from Sakai Oil Miles.
  • a biotin labeling kit for example, but not limited to, EZ-Link® NHS-Lc-Biotin manufactured by Pierce, or Biot in Labeling Kit-NH2 manufactured by Dojindo Molecular Technologies) Etc.
  • EZ-Link® NHS-Lc-Biotin manufactured by Pierce or Biot in Labeling Kit-NH2 manufactured by Dojindo Molecular Technologies
  • the lectin gene is fused with DNA encoding a peptide containing a piotinization sequence, a vector expressing this fusion gene is constructed, and expressed as a fusion protein with the pyotinization sequence in any host ( Schwarz et al., (1988). J. Biol. Chem. 263: 9640-9645) Pyotin ⁇ lectin may be made.
  • Examples of such vectors include, but are not limited to, vectors containing Invitrogen's BioEase TM tag. Among them, there are pcDNA TM 6 vector for mammalian cell expression, PET 104 vector for E. coli expression, and pM T / BioEase vector for Drosophila expression.
  • the avidin-binding protein includes avidin, streptavidin, neutravidin, AVR protein (Biochem. J., (2002), 363: 609-617), bradavidin (J. Biol. Chem. , (2005), 280: 13250-13255), Rhizavidin (Biochem. J., (2007), 405: 397-405), evening mavidin and their mutants, etc. Any of them can be suitably used. In particular, tamavidin and its mutants can be preferably used.
  • the evening Vidin is a piotin-binding protein discovered from the edible mushroom Pleurotus conucopiae (W0 02/072817; Takakura et al., (2009) FEBS J., 276: 1383-1397 ).
  • Examples of the evening mavidin mutant include high binding ability and low non-specific binding evening mavidin (Japanese Patent Application No. 2 0 0 8-2 0 8 7 6 6 unpublished).
  • “Tamavidin” in the present invention means evening mavidin 1 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 5, nucleic acid sequence encoding it: SEQ ID NO: 4), tamavidin 2 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 7, nucleic acid sequence encoding the same): SEQ ID NO: 6), or a variant thereof.
  • the evening mavidin of the present invention typically comprises a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, or a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • the tamavidin of the present invention is a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, or a protein encoded by a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6. It may be a protein having a piotin binding activity similar to that of Mavidin 1 or 2, or a protein having a high binding ability / low non-specific binding activity. In the present specification, evening mavidin 1, evening mavidin 2, and variants thereof may be collectively referred to simply as evening mavidin.
  • a tamavidin 1 or 2 variant is a protein comprising an amino acid sequence comprising a deletion, substitution, insertion and Z or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7, It may be a protein having a piotin binding activity similar to that of evening mavidin 1 or 2.
  • the substitution may be a conservative substitution, which is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics.
  • Non-limiting examples of conservative substitutions include substitution between fatty acid-containing amino acid residues, such as I 1 e, V a 1, B 61 or 8 1 a mutual substitution, Lys and A Substitutions between polar residues such as rg, G 1 u and Asp, G 1 n and Asn mutual substitution are included.
  • Mutations with amino acid deletions, substitutions, insertions, and Z or addition can be performed on the DNA encoding the wild type protein, eg, site-directed mutagenesis (eg, uc leic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487-6500, 1982, which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • site-directed mutagenesis eg, uc leic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487-6500, 1982, which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • amino acid means an amino acid that can be deleted, substituted, inserted and / or added by site-directed mutagenesis.
  • one or more amino acids may mean one or several amino acids depending on circumstances.
  • Mavidin 1 or 2 variants further have at least 60%, preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, more preferably 99.3% or more of a protein comprising an amino acid sequence having amino acid identity, and comprising tamavidin It may be a protein having the same piotin binding activity as 1 or 2, or a protein having a high binding ability and a low nonspecific binding activity.
  • the percent identity between two amino acid sequences may be determined by visual selection and mathematical calculation. Alternatively, the percent identity between two protein sequences is based on the algorithm of Needleman, SB and Wunsch, CD (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970), and the University of Wisconsin Genetics Computer Group ( It may be determined by comparing the sequence information using the GAP Review — Evening program available from UWGCG). Preferred default parameters for the GAP program include: (1) Henikoff, S. and Henikoff, JG (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992), Scoring 'matrix, blos um62; (2) 12 gap weights; (3) 4 gap length weights; and (4) No penalty for end gaps.
  • the percent identity can be determined by comparison with sequence information using, for example, the BLAST program described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997). .
  • the program can be used online from the National Center for Biotechnology Information (Information) or the DNA Data Bank of Japan (DDBJ) website.
  • the various conditions for “same search by BLAST program” 14 (parametrics) are described in detail in the same page, and it is possible to change some settings as appropriate. Do.
  • the percent identity between two amino acid sequences may be determined using a program such as genetic information processing software GENETYX Ver. 7 (manufactured by Genetics) or the FASTA algorithm. The search uses the default value May be.
  • the percent identity of two nucleic acid sequences can be determined by visual selection and mathematical calculation, or more preferably, this comparison is made by comparing the sequence information using a computer program.
  • a typical and preferred computer program is the Wisconsin Package, Version 10.0 program “GAP” from the Genetics Convenience Group (GCG; Madison, Wis.) (Devereux, etal., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387).
  • GAP Genetics Convenience Group
  • two amino acid sequences can be compared, and a nucleic acid sequence and an amino acid sequence can be compared.
  • preferable tamavidins include the following tamavidin variants. (Japanese Patent Application 2008-208766 unpublished).
  • a protein showing a thiotin-binding activity comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or an amino acid sequence having 1 to several amino acid mutations in this sequence, or an amino acid sequence having 80% or more identity with this sequence .
  • a modified piotin-binding protein wherein one or more residues selected from are substituted with acidic amino acid residues or neutral amino acid residues.
  • the 40th aspartic acid residue is substituted with an asparagine residue, and the 104th arginine residue is substituted with a glutamic acid residue. );
  • a modified vitin-binding protein (D40N—K141) in which the 40th aspartic acid residue is substituted with an asparagine residue and the 141st lysine residue is substituted with a glutamic acid residue E); and
  • the 40th aspartic acid residue is substituted with an asparagine residue
  • the 104th arginine residue is substituted with a glutamic acid residue
  • 1 4 1st lysine residue A modified piotin-binding protein (D 4 0 N—R 1 0 4 E—K 1 4 1 E), in which the group is substituted with a dalumaate residue
  • a modified piotin-binding protein selected from the group consisting of
  • the linking of the piotin-binding protein and the carrier can be carried out using a force-pulling method for the protein and carrier known to those skilled in the art.
  • the carrier surface is modified so that the carboxyl group is exposed, and the force lpoxyl group and the amino group of the protein are combined in the presence of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), a cross-linking reagent.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the protein and the carrier can be linked by force pulling reaction.
  • a carrier whose carboxyl group on the surface of the carrier is activated esterified with N-hydroxysuccinimide (NH 2 S) and a protein are mixed in a buffer solution of pH 6.5 to 9 containing no primary amino group. By doing so, it is possible to bind the force lupoxyl group on the carrier surface to the amino group of the protein.
  • the amino group of the carrier surface and the amino group of the protein or the crosslinking reagent SPDP (N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate) or GMB S (N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide) can be used to link the amino group on the carrier surface with the protein thiol group. it can.
  • various carriers having various functional groups arranged on the surface are commercially available, and therefore they can be preferably used.
  • a microplate having functional groups arranged on the surface for example, Reacti-Bind (trademark) Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96-Well Plates (PIERCE) 1
  • Immobilizer TM -Amino Modules / Plates ifi as an active amino group plate, or an ELISA plate as a carboxyl group plate, eg MS — 8 7 9 6 F (9 6 well ⁇ C type ⁇ flat bottom ' (Carbo) (Sumitomo Bakelite 3 ⁇ 4) Can be mentioned.
  • microbeads having functional groups arranged on the surface as highly cross-linked agarose beads, for example, Sepharose (trademark) (GE Healthcare Biosciences) includes, but is not limited to, magnetic beads such as Dynabeads (trademark) (Dynal), and the like. For the connection, follow the instructions attached to the carrier.
  • Sepharose trademark
  • Dynabeads trademark
  • microplates such as Reacti-Bind TM Streptavidin Coated Plates (PIERCE E3 ⁇ 4) and Nunc Streptavidin Coated 96 Micro Well TM Plates (N a 1ge Nun c3 ⁇ 4)
  • commercially available magnetic beads such as Dynabeads M-280 Streptavidin (Dyna 1) and MagnaBind TM Streptavidin Beads (PI ERCE3 ⁇ 4), but are not limited thereto.
  • piotin and piotin-binding protein for example, histidine tag, FLAG TM tag, or dartathione 1 S-transferase (GST) is bound to lectin, and Ni-NTA is attached to the carrier. It is also possible to indirectly bind the lectin and the carrier by binding (antibitritriacetic acid), anti-FLA G antibody, or dartathione, and binding each.
  • the method of the present invention includes a step of obtaining a virus-containing liquid and a lectin.
  • the conditions for bringing the virus-containing liquid into contact with the lectin are not particularly limited as long as the virus and the lectin in the virus-containing liquid are bound to each other. Elements of contact conditions include the composition of the virus-containing liquid, incubation temperature and incubation time.
  • the composition of the virus-containing liquid is not particularly limited as long as the conditions for binding the virus and the lectin in the virus-containing liquid are maintained.
  • a preferred virus-containing solution may be a buffer solution having a pH of 7 to 8, for example, a buffer solution based on Tris / EDTA (TE), PBS, HEPES, TBS, or the like.
  • the pH of the virus-containing liquid may be 6-9, preferably 7-8. If the virus-containing liquid is a body fluid, it may be contacted with the lectin as it is or after adding a desired buffer solution or the like.
  • the lower limit of the incubation temperature may be 4 or 10, and the upper limit may be 50, 45, 40, 37, 30 :, 25, and 20.
  • Suitable incubation temperatures include 10 to -3 7, 10 to -25, 10 to 20, 15.
  • the lower limit of the incubation time may be selected from the group consisting of 1 minute, 3 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes, 30 minutes, and the upper limit is overnight, 10 hours, 10 hours, 8 hours , 5 hours, 3 hours, 2 hours, 1.5 hours, and 1 hour.
  • Preferable incubation time includes 5 minutes to 1 hour, 5 minutes to 5 hours, and 10 minutes to 2 hours.
  • the lectin and the carrier are bonded via a molecule capable of binding to the carrier before, simultaneously with, or after contacting the lectin and the virus-containing solution. 3 ⁇ 4 and combine them.
  • the conditions for bringing the lectin into contact with the carrier are not particularly limited as long as the lectin can sufficiently bind to the carrier via a molecule capable of binding to the carrier.
  • Factors for contact conditions include incubation temperature and incubation time.
  • the conditions similar to the above-mentioned conditions for contacting the virus with the lectin can be appropriately selected, but particularly preferred incubation times include 1 minute to 2 hours, 3 minutes to 1 hour, and 5 minutes to 30 minutes. .
  • the carrier capturing the virus to be concentrated via the lectin is separated from the sample containing the virus and collected by a technique known to those skilled in the art according to the nature of the carrier.
  • separation of the carrier from the sample may be accomplished by centrifugation followed by removal of the supernatant.
  • the carrier may be separated from the sample by collecting the carrier using a magnet and removing the supernatant.
  • the carrier may be separated from the sample by lifting the carrier from the sample or passing the sample through the carrier. If the carrier is designed to catch viruses inside the well structure, such as a microplate, the carrier may be separated from the sample by simply removing the sample from the Wel force.
  • a step of washing the separated carrier may be added in order to remove a substance non-specifically bound to the carrier separated from the sample.
  • the conditions of the washing solution and temperature used in the washing step are not particularly limited as long as the conditions of maintaining the binding between the virus and the lectin and the binding between the virus and the lectin and the carrier are maintained.
  • the wash solution is buffered and may be a buffer solution having a pH of 7-8, eg, a buffer based on Tris / EDTA (TE), PBS, HEPES, TBS, etc.
  • the pH of the cleaning solution may be 6-9, preferably 7-8.
  • washing temperature is not particularly limited, the lower limit of the washing temperature may be 4 or 0, the upper limit is 50, 45: 40, 37, 30, 25, and 20 May be selected from the group consisting of Preferred washing temperatures include 10 to 37, 10 to 25, 1 Ot: to 20 and 15.
  • the method of the present invention includes a step of eluting a virus trapped on a carrier via a lectin from the carrier using an eluate containing sugar. If the lectin and virus remain bound, it is assumed that the virus infectivity may be adversely affected depending on the type of virus. Furthermore, in concentrating viral vectors used for gene therapy, it is essential to elute and isolate viral vectors from carriers.
  • elution of a virus from a carrier means that the virus trapped on the carrier is released from the carrier by dissociating the sugar chain-lectin bond to make it difficult to remove from the carrier.
  • elution of a virus from a carrier means that at least a part of the virus captured by the carrier is in a state of being formed from the carrier, and all of the virus captured by the carrier is not necessarily used. Does not mean that the virus will be free.
  • isolated virus in the case of elution and isolation of a virus from a carrier means that the virus trapped on the carrier is detached from the carrier and released from the carrier. And to remove the carrier component. Therefore, in the present specification, “isolated virus” means that it does not contain at least a component of a carrier, and does not necessarily define the degree of purity of the virus.
  • viruses bound to a lectin can be isolated by elution from a carrier without losing the infectivity of the virus by treating with a solution containing an appropriate sugar. I found it. Therefore, in the method of the present invention, viruses bound to lectins can be eluted by using sugars. Elution of viruses from virus-binding lectins
  • the sugar is selected from monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides or glycosides having a sugar to which the lectin binds.
  • sugars for elution of viruses from lectins that have captured viruses include N-acetylyl D-galactosamine for SBA, lactose for SSA, and DSA.
  • WGA includes chitooligosaccharide N-acetyl-D-glucosamine.
  • the eluate containing sugar is a pH 7-8 buffer, such as Tris / EDTA (TE), PBS,
  • the pH of the eluate containing sugar may be 5-9, preferably 7-8.
  • the concentration of sugar in the eluate containing sugar is 0.01 to: 1M, preferably 0.05M to 0.5M, more preferably 0.1M to 0.3M. Alternatively, it is 0.1% to 5% (w / v), more preferably 0.5% to 2% (w / v).
  • the temperature of the elution process is not particularly limited, but the room temperature or the lower limit of the washing temperature may be 4 or 10, and the upper limit is from 50 :, 45, 40, 37, 30, 25, and 20. May be selected from the group consisting of Preferable washing temperatures include room temperature, 1 O: ⁇ 37, 10t: ⁇ 25, 10 ⁇ 20, and 15.
  • the elution treatment time is not particularly limited, and may be 30 seconds to 1 day, preferably 5 minutes to 2 hours, and more preferably 1 minute to 30 minutes.
  • the amount of the eluate used for elution of the virus is not particularly limited as long as it is smaller than the volume of the virus-containing solution initially used in the method of the present invention.
  • it may be 1 2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 or 1Z500 of the original amount of virus-containing liquid.
  • elution of the virus can also be achieved by making the pH of the eluate acidic (preferably pH 1-5) or alkaline (preferably pH 9-l 1). can do.
  • the virus concentrate can be obtained by allowing the eluate to act on the carrier and then removing the carrier. After the treatment with the eluate, the carrier in the eluate is separated from the eluate and removed by a method known to those skilled in the art according to the nature of the carrier. For example, for particulate carriers such as beads, a virus concentrate may be obtained by centrifugation and subsequent collection of the supernatant. In the case of carrier-powered beads, the virus concentrate may be obtained by collecting the carrier using a magnet and collecting the supernatant. When the carrier is in the form of a thin film or a filter, the carrier may be separated by pulling up the carrier from the eluate or passing the sample through the carrier. If the carrier is designed to capture virus inside the well structure, such as a microplate, the virus concentrate may be obtained simply by collecting the eluate from the well.
  • the present invention also provides a kit for concentrating a virus in a virus-containing liquid based on the method of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises at least a pyotinylated lectin, a carrier bound with a pyotin-binding protein, and a sugar for elution.
  • Lectins, piotin-binding proteins, carriers and elution sugars are as defined above.
  • the kit of the present invention comprises at least nanobeads bound with a lectin and a saccharide for elution.
  • Lectins, nanobeads and sugars for elution are as defined above.
  • the kit of the present invention is further used in the method of the present invention to buffer a virus and a lectin, to wash a separated virus-binding carrier, and to elute the virus from Z or the carrier. Buffer solution may be included.
  • each reagent may be enclosed in a suitable container. Further, the kit of the present invention may also include a package for appropriately packing the reagents contained therein.
  • the kit of the present invention may contain appropriate instructional materials. Instructions for use include, but are not limited to, instructions on how to use the package, or printed materials, electronic storage media (eg magnetic disks, tapes, cartridges, tips), and optical media (eg CD ROM), Etc., and a medium that can convey to the user how to use the kit of the present invention.
  • electronic storage media eg magnetic disks, tapes, cartridges, tips
  • optical media eg CD ROM
  • Etc. e.g CD ROM
  • Etc. e.g CD ROM
  • the address description on the Internet site that provides the instruction manual is also included in the instruction manual. It is.
  • HHV cultured with 15 types of pectin lectins (Con A, DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA) — Reacted with 6 solutions, evening magnetic binding with mavidin (whether it was possible to concentrate HH V-6 by binding to 4 beads.
  • pectin lectins Con A, DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA
  • a cultured T cell derived from umbilical cord blood was infected with recombinant HHV-6 expressing EGF P (Patent No. 39235 05) to prepare an EGFP type HHV-6 solution.
  • Magnetic beads coated with carboxyl groups (Dynabeads M-270 Carboxylic, Acid, Dynal 3 ⁇ 4) 300 1 were washed with 0.01N sodium hydroxide 300 1 for 10 minutes, and then with brine 300 1 for 10 minutes. Washed 3 times per minute.
  • the EG FP type HHV-6 solution prepared in 1 was placed on the shelf and it was confirmed whether virus concentration was achieved using the infectious titer of recombinant HHV-6 as an indicator.
  • There are 15 types of J-Oil Mills lectins Con A, DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA) It was used.
  • EGFP recombinant HHV-6 solution 100 1 (virus concentration 10 4 / m 1 TE) and PBS 500 1 were mixed and incubated at 15 for 1 hour (mixed by inversion).
  • the evening mavidin magnetic beads prepared in 2 above were added to the reaction solution, and further incubated at 15 for 1 hour (mixed by inversion).
  • the Eppendorf tube containing the reaction solution was placed on a magnetic stand for Dynabeads, and then washed twice with PBS 2 mM EDTA 0.5% BS A 200 1.
  • this was suspended in a culture medium (RPMI 1640 + 10% urine fetal serum) 5001, and the entire amount was suspended with 0.5 ml of Indike overnight cells (MT 4 cells).
  • EGFP-type HHV-6 is present, EGFP-type HH V-6 is infected with Lindike-Evening cells, and HHV-6 DNA enters the cell, and the EGFP gene incorporated into the virus is contained therein. It is thought to express and emit GFP fluorescence.
  • both the virus with the beads still attached and the sensitized vesicle are sinking to the bottom of the liquid. Therefore, the decrease in the association probability between the virus and the infected cell, which can be a problem, is usually a problem.
  • the virus concentration in the local area becomes very high, and the infection efficiency is expected to improve.
  • EGFP recombinant HHV-6 solution 100 1 virus concentration 10 4 Zm 1 TE
  • PBS 500 1 piotinylated lectin 1 O ⁇ g
  • the evening mavidin magnetic beads prepared in 2 above were added to the reaction solution, and further incubated for 1 hour at 15 (mixed by inversion).
  • Saliva from the subject was collected using salivets (salivet cotton, manufactured by Sarstatt). The subject squeezed the oral cavity twice with distilled water just before collecting saliva, and then included saliva in the oral cavity for 2 minutes and collected saliva.
  • the obtained DNA was subjected to quantitative PCR.
  • quantitative PCR the HHV-6 U65 / 66 region was quantified by real-time PCR.
  • the primer and probe sequences used for PCR were
  • TaqMan probe FAM 5 '-AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC-3' TAMRA (SEQ ID NO: 3), using FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche 3 ⁇ 4) at reaction temperature 95 Real-time PCR was performed once for 10 minutes, 5 cycles of 95 seconds + 60 31 seconds, and 45 cycles.
  • Saliva 400 1 collected as described in item 1 above was mixed with 10 times the concentration of PBS and piotylated SBA 1 nmo 1 and incubated at 15 for 1 hour (mixed by inversion).
  • evening mavidin magnetic beads 1001 prepared in Example 1 were added to the reaction solution, and further incubated at 15 for 1 hour (inversion mixing).
  • the Etpendorf tube containing the reaction solution was set on a magnet stand for Dynabeads, and then washed three times with PBS 5001. TE was added to this and treated with 98 for 10 minutes, and then the supernatant was collected on a magnet stand, 5 l of which was subjected to quantitative PCR.
  • quantitative PCR the HHV-6 U65 66 region was quantified by the real-time PCR method in the same manner as in item 2 of this Example.
  • the amount of HHV-6 in the eluate 51 used for quantitative PCR was measured as 2934 copies (Fig. 4).
  • the HHV-6 solution could be concentrated about 40 times by using the biotinylated SBA and evening mavidin magnetic beads.
  • the concentration efficiency was about 15 times.
  • the amount of HHV-6 contained in the test plots without the addition of pyotinylated lectin was 40 copies or less and was not concentrated (Fig. 4).
  • the elution sugar in the eluate is N-acetylyl D-galactosamine (0.2 M) in the system using piotinylated SBA, and chitooligosaccharide (1%) in the system using piotinylated WGA. It was. Then, the eluate-treated test tube containing the eluate was placed on a magnetic stand for Dynabeads, and the evening mavidin magnetic beads were collected, and the supernatant was collected. 51 of the collected liquid thus obtained was subjected to quantitative PCR. In Quantitative PCR, the HHV-6 U 65/66 region was quantified by real-time PCR as in item 2 above.
  • the lentivirus used was the HI V base gene and the LSV virus vector with the VSV-G envelope recombined with the EGFP gene (provided by Dr. Hiroyuki Miyoshi of the independent administrative corporation Rika ⁇ W Laboratory) .
  • Piotinylated lectins are manufactured by J—Oil Mills, Inc. 1 5 types (Con A, DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA) were used.
  • EGFP recombinant lentivirus solution 100 ⁇ 1 virus concentration 10 2 Zm 1 TE, virus with low titer was used to observe concentration effect
  • PBS 50 0 fi I piotin 1 O g of modified lectin was mixed and incubated for 1 hour at 15 (mixed by inversion).
  • the evening mavidin magnetic beads prepared in Example 1 were added to the reaction solution, and further incubated for 1 hour at 15 (inversion mixing).
  • the Eppendorf tube containing the reaction solution was placed on a magnetic stand for Dynabeads, and then washed twice with PBS 2 mM EDTA 0.5% BSA 200 1.
  • PBS 2 mM EDTA 0.5% BSA 200 1.
  • concentration rate was quantified.
  • EG FP recombinant lentivirus solution (titer: 10 Vm 1)
  • 200 g of pyotinylated SBA or pyotinylated WGA then add 100 ⁇ 1 tamavidin magnetic beads for 15 min at room temperature They were combined by inversion. This was placed on a magnetic stand for Dynabeads, washed twice with PBS containing 0.5% ushi serum albumin and 2 mM EDTA, and 100 1 eluate (for elution with PBS + 2% urine fetal serum). Elution with sugar added).
  • the elution sugar in the eluate was N-acetyl-D-galactosamine (0.2M) for SBA and chitooligosaccharide (1%) for WGA. Thereafter, the eluate-treated test tube containing the eluate was placed on a Dynabeads magnet stand to collect tamavidin magnetic beads, and the supernatant was collected. The recovered liquid thus obtained was infected by adsorbing the virus titer to Indike overnight cells (HeLa cells) at 37 for 1 hour, and the number of EG FP-expressing cells one day later was infected. The Ilska value was measured.
  • the present invention provides a novel method and kit for carrying out the method, which makes it possible to more easily concentrate viruses and virus vectors in a virus solution having a low concentration.
  • the method of the present invention makes it easy to concentrate while maintaining the infectivity of viruses and virus vectors. For example, in the fields of gene therapy and vaccine therapy using virus vectors, It is expected to be used as a simple vector enrichment technique. More specifically, since the method of the present invention is a simple method that does not require complicated column operation or ultracentrifugation as in the conventional method, it can be expected to be applied to automation and high-throughput systems.

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Abstract

　本発明は、濃度の低いウイルス液中のウイルスやウイルスベクターを、より簡便に濃縮することを可能にする新規な方法および当該方法を行うためのキットを提供する。濃度の低いウイルス液から効率よくウイルスを濃縮することは、従来、煩雑な操作や、高価な機器、あるいは熟練した技術が必要であった。本発明の方法は、ウイルスベクターの感染能を維持しつつ濃縮することを容易にするものであるので、ウイルスベクターを用いる遺伝子治療やワクチン治療などの分野において安全で簡便なベクター濃縮技術としても適用可能である。

Description

明細書
ウィルス濃縮法
技術分野
本発明は、 ウィルスやウィルスベクタ一について、 その感染能を維持しつつ濃縮する新 規な方法および当該方法を行うためのキットに関する。 本発明は、 レトロウイルスベクタ 一やへルぺスウィルスベクタ一などの遺伝子治療やワクチンなどに有用なベクタ一の安全 で簡便な濃縮技術に関する。
背景技術
昨今、 遺伝子治療やワクチン治療を目的に、 さまざまなウィルスベクターが開発され、 その颇が期待されている。 し力、し、 ウィルスベクタ一濃度が低いと、 十分に望んだ効果 が得られないため、濃度を調整する必要がある。遺伝子治療分野では、細胞への遺伝子導入 ' 効率が治療の成否を左右するため、遺伝子導入効率の高いウィルスべク夕一が使われる。し かし，レンチウィルスベクターを含むレトロウイルスベクタ一などでは力価の高いウィル スが得られないため、 充分な遺伝子導入効率が得られていない。 このため様々なウィルス 濃縮技術や、それらを利用した製品が開発されているが、実用的には未だ様々な問題点を含 むのが現状である。
溶液中のウィルスの濃度を上げ、 ウィルスを濃縮する方法としては、 例えば、 超遠心分 離法が挙げられる。 しかし、 この方法は高価な機器と長い分離時間を要し、 作業には多大 な労力が必要となるものである。 また、 硫酸アンモニゥムゃポリエチレングリコールによ りウィルスを沈殿させて濃縮する方法もあるが、 これらの方法は、 使用する試薬ゃ«す る他の成分が感謹胞に有害になるなど、その後の手順を阻害する恐れがある。そのため、 ウィルス沈殿後に試料の精製を行なわねばならず、 多大な労力が必要となるという問題点 がある。 また、 抗体を用いてウィルス粒子そのものを濃縮する方法も開発されている （特 開 2 0 0 2— 7 8 4 8 5 )。 しかし、 この方法では、 ウィルス表面のタンパク質機能を阻害 して、 ウィルスの感染性に影響を与えるおそれがある。 例えば、 ウィルス粒子を抗体から 分離する場合には、 強い酸性条件 （例えば p H 2〜3 ) を用いる必要があり、 これがウイ ルス粒子に不具合を生じさせるおそれがあった。
この他のウィルス濃縮法として、 例えばマンノース結合型レクチンが結合した磁性粒子 を用いる方法が開示されている （特開 2002-16559 Do
さらには、 レトロウイルスの力価を高め、 あるいは、 検体サンプルからレトロウイルス を単離する方法として、 ストレプトアビジンとピオチン化レクチンを利用した方法も開示 されている （W02001/079456)。 し力、し、 上記いずれの文献中でも、 ウィルス は担体と結合したまま用いられており、 ウィルス自体を単離できていない。 従って、 これ らの方法で濃縮したウイルスの用途は、 P艮定されたものであつた。
先行技術文献
特許文献 1 特開 2002— 078485号公報
特許文献 2 特開 2002— 165591号公報
特許文献 3 国際出願公開第 WO 2001 / 079456号パンフレット
発明の概要
発明が解決しょうとする課題
体液中のウィルスを定量する場合、 濃度が低く、 既存方法の検出限界以下である場合、 定量できないことがある。 また、 ウィルスベクターを遺伝子治療やワクチン治療等に利用 する場合に、 ウィルスベクタ一濃度が薄いと望ましい効果が得られないため、 濃度を調整 することが必要になる。
本発明は、溶液中のウィルスやウィルスベクタ一を簡潔な方法で濃縮することができる 方法を提供することを目的とする。 本発明の目的はまた、 濃度の低いウィルス溶液から、 ウィルスやウィルスベクターを、 その感染能を維持しつつ、 簡易に濃縮し、 かつ単離され た状態で取得する方法を提供することにもある。 本発明は特に、 レトロウイルスベクター やへルぺスウィルスベクタ一などの遺伝子治療やワクチンなどに有用なウィルスベクター を安全に、 力つ簡便に濃縮する技術を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
上記課題を解決するため、 本発明者らは髓研究を行った結果、 溶液中のウィルスゃゥ ィルスべクタ一を簡潔な方法で濃縮することができる技術を開発した。 より具体的には、 本発明者らは、 所望のウィルス含有液にレクチンを結合させ、 さらにウィルス一レクチン 複合体を担体と結合させた後、 ウィルスを結合した当該担体を分離 ·回収し、 糖を加える ことで、 対象ウィルスのみを、 感染能を失わせることなく、 当該担体から適量の溶液中に 溶出し、 最初のウィルス含有液の濃度よりも高い濃度に調製することに成功した。
また、 本発明者らは、 ヒトヘルぺスウィルスについては、 レクチンとして、 SBA (ダ ィズ由来、 結合する糖鎖： N—ァセチルガラクトサミン （Ga 1 NAc) を含む糖鎖)、 S SA (二ホンニヮトコ由来、 結合する糖鎖： α 2— 6結合のシアル酸 (S i aa2-6) を含む糖鎖)、 DSA (チョウセンアサガオ由来、 結合する糖鎖： N—ァセチルダルコサミ ン （Gl cNAc) を含む糖鎖)、 WGA (コムギ胚芽由来、 結合する糖鎖： N—ァセチル ダルコサミン （Gl cNAc) またはシアル酸を含む糖鎖） を使用することにより、 ウイ ルスべクタ一の回収率が顕著に高くなることを見出した。
また、 レンチウィルスベクターについては、 レクチンとして WGA又は SB Aを使用す ることにより、 ウィルスベクターの回収率が顕著に高くなることを見出した。
さらに、 本発明者らは、 上記の方法で回収したウィルスやウィルスべクタ一が結合した 担体を、 適切な糖で処理することにより、 ウィルスベクター結合担体からウィルスベクタ 一を溶出することに成功した。 驚くべきことに、 このようにして単離されたウィルスは、 感染能を維持したままであった。 また、 本発明者らは、 このようなウィルスやウィルスべ クタ一を溶出するための糖として、 レクチン力 ^WGAのときはキトオリゴ糖、 レクチンが SBAのときは N—ァセチル一D—ガラクトサミン、 またはこれを含む糖、 を使用するこ とが好ましいことを見出した。
本発明は以上の知見に基づき、 ウィルスやウィルスベクターについて、 感染能を維持し つつ、 簡易に濃縮することを可能にする新規な濃縮方法を提供するものである。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
態様 1 ： ウィルスを濃縮する方法であって、 以下の工程：
(1) ウィルス含有液にレクチンを接触させ、 ウィルスとレクチンを結合させる、 ここで、
(1)当該レクチンは担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体 に結合させることにより、 レクチンに結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または ( i i )当該レクチンは担体に直接的に結合しており、それによりレクチンに結合したウイ ルスは担体に結合し；
(2) 担体をウィルス含有液から分離し；
(3)回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウィルスを溶出する、 ここで 当該溶出液は （1) のウィルス含有液の容積よりも少ない量である；そして (4) (3) の溶出液から担体を分離して、 ウィルス濃縮液を得る；
を含む、 前記方法。
態様 2 ： ウィルスを濃縮する方法であって、 以下の工程：
(1)ウィルス含有液にピオチン化レクチンを混和して、ウィルスとピオチン化レクチンを ¾ させ、 さらに、 ピオチン結合タンパク質が結合した担体を添加して、 ピオチン化レク チンと結合したウィルスを担体に結合させ；
(2) 担体をウィルス含有液から分離し；
(3)回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウィルスを溶出する、 ここで 当該溶出液は （1) のウィルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
(4) (3) の溶出液から担体を分離して、 ウィルス «液を得る；
を含む、 前記方法。
態様 3： ウィルスが、 エンベロープを有するウィルスまたは当該ウィルス由来のウイ ルスである、 態様 1または 2に記載の方法。
態様 4： ウィルスが、 レンチウィルスまたはへルぺスウィルスである、 態様 1または 2に記載の方法。
態様 5： レクチンが、 N—ァセチルガラクトサミン （Ga 1 NAc；)、 α2_6結合の シァル酸 (S i aa2— 6)、 N—ァセチルダルコサミン （G 1 cNAc)の少なくとも一 つを含む糖に結合するレクチンである、 態様 1または 2に記載の方法。
態様 6 ： レクチンが、 SBA (ダイズ由来)、 SSA (二ホンニヮトコ由来)、 DSA (チヨゥセンアサガオ由来)、および "WGA (コムギ胚芽由来）からなる群より選択される、 態様 5に記載の方法。
態様 7 ： レクチン力 ^WGA (コムギ胚芽由来） であり、 ウィルスの溶出に用いる糖が キトオリゴ糖である；または、 レクチンが SBA (ダイズ由来） であり、 ウィルスの溶出 に用いる糖が N—ァセチル一 D—ガラク卜サミン、 またはこれを含む糖である；態様 1ま たは 2に記載の方法。
態様 8 ： ウィルスがレンチウィルスであり、 レクチン力 SWGA (コムギ胚芽由来） で あり、 ウィルスの溶出に用いる糖がキトオリゴ糖である；または、 ウィルスがレンチウイ ルスであり、 レクチンが S B A (ダイズ由来） であり、 ウィルスの溶出に用いる糖が N— ァセチル— D—ガラクトサミン、 またはこれを含む糖である；態様 1または 2に記載の方 法。
態様 9 ： ウィルスを濃縮する方法であって、 以下の工程：
( 1 )ウィルス含有液に、直径 1 0 nm〜 1 0 0 nmのナノビーズに直接結合しているレク チンを ¾Mさせ、 ウィルスをナノビーズに結合させ、 ；
( 2 ) ナノビーズをウィルス含有液から分離し；
( 3 )回収したナノビーズを糖を含む溶出液で処理して、該ナノビーズからウィルスを溶出 する、 ここで当該溶出液は （1 ) のウィルス含有液の容積よりも少ない量である；そして (4) ( 3 ) の溶出液からナノビーズを分離して、 ウィルス濃縮液を得る；
を含む、 前記方法。
態様 1 0 ： 態様 2に記載の方法によりウィルスを濃縮するためのキッ卜であって、 ビ ォチン化レクチン、 ピオチン結合タンパク質ビーズ、 および担体からウィルスを溶出する ための糖、 を含む、 前記キット。
態様 1 1 ： 態様 2に記載の方法によりウィルスを濃縮するためのキットであって、 以 下：
( a) ピオチン化 WGA、 ピオチン結合タンパク質、 およびキトオリゴ糖；または
(b) ピオチンィ匕 S BA、 ピオチン結合タンパク質、および N—ァセチルー D—ガラクトサ ミン、 またはこれを含む糖；
を含む、 前記キット。
発明の効果
本発明により、 溶液中のウィルスやウィルスベクタ一について、 感染能を維持しつつ、 簡易に濃縮することが可能となった。
図面の簡単な説明
図 1は、 タマビジンビーズへの HHV— 6の非特異的吸着について試験した結果を示 す蛍光顕微鏡写真である。 緑色に光る点は、 E G F P組換え HH V— 6がィンディケ一夕 一細胞である MT - 4細胞に感染していることを示すもので、 点 1個が感染性のウィルス 粒子 1個を表す （各点の明るさの違いは、 感染後のウィルス遺伝子発現の差によるもので ある)。左の写真は HHV— 6ウィルス液 (原液)を MT— 4細胞に作用させた場合を示す。 右の写真は、 レクチンの非存在下で HHV— 6ウィルス液 （原液） を夕マビジンビーズと 接触させ、タマビジンビーズに吸着したウィルスを MT— 4細胞に作用させた場合を示す。
図 2は、 ABA、 D S A、 L o t u s , MAM、 および P HA_ E 4の各レクチンに よる HHV— 6の濃縮効果について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 緑色に光 る点は、 E G F P組換え HH V— 6がィンディケ一夕一細胞である MT— 4細胞に感染し ていることを示すもので、 点 1個が感染性のウィルス粒子 1個を表す （各点の明るさの違. いは、 感染後のウィルス遺伝子発現の差によるものである）。
図 3は、 P HA— L 4、 UEA_ I、 S B A、 および S S Aの各レクチンによる HH V— 6の濃縮効果について試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 緑色に光る点は、 E G F P組換え HH V— 6がィンディケ一夕一細胞である MT— 4細胞に感染しているこ とを示すもので、 点 1個が感染性のウィルス粒子 1個を表す （各点の明るさの違いは、 感 染後のウィルス遺伝子発現の差によるものである）。
図 4は、 レクチンと夕マビジンビーズによる唾液中の HHV— 6の濃縮の度合いを示 すグラフである。
図 5は、 レクチンと夕マビジンビーズを用いて、 唾液中の HHV— 6の濃縮おょぴ膽 による溶出を行った際の HHV— 6の濃縮の度合いを示すグラフである。
図 6は、 レクチンと夕マビジンビーズによるレンチウィルスベクターの濃縮について 試験した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 緑色に光る点は、 E G F P組換えレンチウイ ルスベクターがインディケ一夕一細胞である 2 9 3細胞に感染していることを示すもので、 点 1個が感染性のウィルス粒子 1個を表す （各点の明るさの違いは、 感染後のウィルス遺 伝子発現の差によるものである）。
図 7は、 レクチンと夕マビジンビーズによるレンチウィルスベクターの濃縮の度合い を示すグラフである。
発明を実施するための形態
以下、 本発明についてさらに詳細に説明する。
1 . ウィルスを濃縮する方法
本発明は、 ウィルスを濃縮する方法であって、 以下の工程： ( 1 ) ウィルス含有液にレクチンを接触させ、 ウィルスとレクチンを結合させる、 ここで、
( 1 )当該レクチンは担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体 に結合させることにより、 レクチンに結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または ( i i )当該レクチンは担体に直接的に結合しており、それによりレクチンに結合したウイ ルスは担体に結合し；
( 2 ) 担体をウィルス含有液から分離し；
( 3 ) 回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウィルスを溶出する、 ここで 当該溶出液は （1 ) のウィルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
(4) ( 3 ) の溶出液から担体を分離して、 ウィルス濃縮液を得る；
を含む、 前記方法を提供する。
以下、 本発明の方法の各構成について詳細に説明する。
ウィルス
本発明の方法において濃縮の対象となるウィルスは、 エンベロープを有するウィルスま たは当該ウィルス由来のウィルスベクターである。 好ましい態様において濃縮対象のウイ ルスは、 ボックスウィルス、 ボックスウィルス由来ベクター、 トガウィルス、 トガウィル ス由来べクタ一、 コロナウィルス、 コロナウィルス由来べクタ一、 フラビウィルス、 フラ ビウィルス由来べクタ一、 レトロウイルス、 レトロウイルス由来ベクター、 ヘルぺスウイ ルス、 及びへルぺスウィルス由来ベクターからなる群より選択されてもよい。 別の好まし い態様において濃縮対象のウィルスは、 レンチウィルス、 レンチウィルス由来ベクター、 ヒトヘルぺスウィルス 6 (ヒトヘルぺスウィルス 6のバリアント Aおよび B：以下合わせ て HHV— 6と表記する）、 HHV—6由来ベクター、 ヒトヘルぺスウィルス 7 (以下、 H HV— 7と表記する）、 HHV—7由来べクタ一、サイトメガロウィルス （^名ヒトヘルべ スウィルス 5 )、 HHV— 5由来ベクター、 ェプシユタイン 'バー 'ウィルス （E B V)、 または E B V由来ベクターであってもよく、 さらに好ましくはレンチウィルス、 レンチウ ィルス由来ベクター、 HHV— 6、 HHV—6由来ベクター、 HHV—7または HHV— 7由来ベクターであってもよい。
ウィルス含有液
本明細書において 「ウィルス含有液」 とは、 本発明の方法において濃縮の対象となるゥ ィルスを含有する材料である。 したがってウィルス含有液は、 例えば緩衝液中に濃縮の対 象となるウィルスまたはウィルスベクタ一を含むものであってもよく、 あるいは体液であ つてもよい。 本明細書において、 「ウィルス含有液」 を単に試料と記載することもある。 濃縮の対象となるウィルスまたはウィルスベクターを含む液は、 当業者に公知の手法に より調製することができる。
本明細書において鎌とは、 非限定的に、 唾液、 血液、 血清、 精液、 脳龍液、 咽頭拭 い液、 母乳、 腹水、 汗、 涙および尿からなる群より選択されても良い。 体液は当業者に公 知の方法で採取することができる。 また、 採取した体液については、 ウィルス粒子の感染 能に影響を及ぼさなければ、 必要に応じた処理を行っても構わない。
レクチン
本明細書において、 「レクチン」 とは、糖鎖を認識して結合する糖結合性タンパク質をい う。 レクチンが結合する糖鎖は、 それぞれのレクチンについて特異性がある。
本発明の方法において用いるレクチンは、 ウィルスに結合可能なものであれば特に限定 されない。好ましいレクチンの例としては、 N—ァセチルガラクトサミン（Ga 1 NAc)、 α 2-6結合のシァリレ酸 （S i aa2— 6)、 N—ァセチルダルコサミン （Gl cNAc) の少なくとも一つを含む糖鎖に結合するレクチンであり、 さらに好ましくは、 SBA (ダ ィズ由来レクチン。結合糖鎖： N—ァセチルガラクトサミン（Ga lNAc)を含む糖鎖)、 SSA (二ホンニヮトコ由来レクチン。 結合糖鎖： α 2— 6結合のシアル酸 (S i aa2 -6) を含む糖鎖)、 DSA (チョウセンアサガオ由来レクチン。結合糖鎖： N—ァセチル ダルコサミン（G 1 cNAc) を含む糖鎖)、 または WGA (コムギ胚芽由来レクチン。結 合辦貞： N—ァセチルダルコサミン （G l cNAc) またはシアル酸を含む糖鎖） 等のレ クチンが挙げられる。
特にヒトヘルぺスウィルスまたはヒトヘルぺスウィルス由来べクタ一の濃縮のためには、 SBA、 SSA、 DSAまたは WGAをより好ましく用いることができる。 レンチウィル スまたはレンチウィルス由来ベクターの濃縮のためには、 SB Aまたは WGAをより好ま しく用いることが、できる。
本発明の一態様においてレクチンは担体と直接結合させて使用してもよい。
別の態様において、 レクチンは間接的に担体と結合させて使用してもよい。 間接的な結 合の例としては、 ピオチン一ピオチン結合性夕ンパク質の結合を介したレクチンと担体の 結合である。 より具体的にはレクチンをピオチン化するとともに、 担体の表面にピオチン 結合性夕ンパク質を結合させ、 ピオチンとピオチン結合性夕ンパク質を結合させることに より、 レクチンと担体の間接的な結合が達成できる。
雄
本発明において、 担体は、 固体または不溶性材料 （例えば、 濾過、 體、 磁性分離など により反応混合物から分離することができる材料)である担体であれば特に Pg¾されない。 固体担体を構成する材料は、 セルロース、 テフロン （養商標)、 ニトロセルロース、 ァ ガロース、 高架橋球形ァガロース、 デキストラン、 キトサン、 ポリスチレン、 ポリアクリ ルアミド、 ポリエステル、 ポリ力一ポネート、 ポリアミド、 ポリプロピレン、 ナイロン、 ポリジビニリデンジフルオライド、 ラテックス、 シリカ、 ガラス、ガラス繊維、金、 白金、 銀、 銅、 鉄、 ステンレススチール、 フェライト、 シリコンウェハ、 ポリエチレン、 ポリエ チレンィミン、 ポリ乳酸、 樹脂、 多糖類、 タンパク （アルブミン等)、 炭素またはそれらの 組合せ、 などを含むがこれらに限定されない。
固体担体の形状は、 ビーズ、 磁性ビーズ、 薄膜、 細管、 フィルタ一、 プレート、 マイ クロプレート、 カーボンナノチューブ、 センサーチップなどを含むがこれらに限定されな レ^ 薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、 当該技術分野で知られているように、 ピッ ト、 .溝、 フィルタ一底部などを設けてもよい。
本発明の一態様において、 磁性ピーズは、 約 1 0 nm〜約 l mmの範囲の球体直径を有 しうる。 好ましい態様では、 磁性ビーズは約 2 5 nm〜約 1 mm、 約 5 0 nm〜約 1 0 0 ； mの範囲の直径を有する。 磁性ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。 本発明の一態様において、セファロースなどの高架橋球形ァガロースからなるピーズは、 約 2 4 i m〜約 1 6 5 mの範囲の直径を有しうる。 好ましい態様では、 高架橋球形ァガ ロースビーズは約 2 4 m〜約 4 4 mの範囲の直径を有する。 高架橋球形ァガロースビ ーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。
疎水性表面を有する固体担体の例には、 Polysciences社または Spherotech社から市販 されているものなどのポリスチレンラテックスビーズが挙げられる。
シリカ （S i〇 ） —処理またはシリカ （S i 02) ベースの固体担体の例には、 Polysciences社から入手可能な、超常磁性シリカビーズ等が挙げられる。あるいは、 Dynal Biotech社から市販されている M— 2 8 0等も使用されうる。
親水性表面を有する磁性ビーズの例としては、 B i om a g (登録商標） 力ルポキシル の名称で Polysciences社から市販されているビーズまたは Bangs Laboratory社のビーズ (MC O 2 N/ 2 9 2 8) などが挙げられる。 あるいは、 Dynal Biotech社から市販されて いる M— 2 7 0等が使用されうる。
レクチンと担体の直接的結合
本発明の一態様において、 レクチンと担体は直接結合させて使用することができる。 こ の場合、 ウィルスとレクチン結合担体の会合可能性を向上させる観点から、 担体はブラウ ン運動できる程度の大きさのナノビーズである。ナノビーズの好ましい球体直径の範囲は、 1 0 nm〜 1 0 0 nmの球体直径、より好ましくは 3 0 nm〜7 0 nmの球体直径である。 また、 この場合、 磁石で簡便に回収できる磁 体を含むことが好ましく、 例えば、 これに 限定されるわけではないが、 Mi l tenyi Biotech社の MACS MicroBeads (直径 5 0 匪) な どの磁性ナノビーズが挙げられる。
レクチンと担体の連結は、 当業者に公知のタンパク質と担体のカップリング法を用いて 行うことができる。 例えば、 担体表面をカルボキシル基が露出するよう修飾し、 当該カル ボキシル基とタンパク質のアミノ基を、 架橋試薬である 1ーェチル一 3 - ( 3—ジメチル ァミノプロピル） カルポジイミド （E D C) の存在下でカップリング反応させることによ り、 タンパク質と担体を連結することができる。 または、 例えば、 担体表面のカルボキシ ル基が N—ヒドロキシスクシンイミド （NH S) により活性エステル化された担体とタン パク質とを一級アミノ基を含まない P H 6. 5〜9の緩衝液中で混和することにより、 担 体表面のカルボキシル基とタンパク質のァミノ基を結びつけることができる。
あるいは、架橋試薬 B S 3 (ビス [スルホスクシンィミジル]スべレ一卜）や D S S (ジ スクシンイミジルスべレート）を用いて、担体表面のァミノ基とタンパク質のアミノ基を、 あるいは架橋試薬 S P D P (N—スクシンィミジル 3— [ 2—ピリジルジチォ] プロピ ォネート） や GMB S (N— （4一マレイミドブチリルォキシ） スクシンイミド） を用い て、 担体表面のアミノ基とタンパク質のチオール基を結びつけることができる。
レクチンと担体の間接的結合 本発明の別の態様において、 レクチンは間接的に担体と結合させて使用してもよい。 例 えば、 レクチンをピオチン化するとともに、 担体の表面にピオチン結合性タンパク質を結 合させ、 ピオチンとピオチン結合性タンパク質を結合させることにより、 レクチンと担体 の間接的な結合が達成できる。
この場合に担体として、 ビーズを好ましく用いることができるが、 ビーズの好ましい球 体直径の範囲は、 0. 1 m〜： L 00 mの球体直径、 より好ましくは、 0. 5 /m〜l 0 zmの球体直径、 さらに好ましくは、 1 Atn！〜 5 xmの球体直径である。
本明細書において、 「ピオチン」 とは、 D— [(+) — c i s—へキサヒドロ一 2—ォキ ソー 1H—チエノ— （3， 4) —イミダゾ一ルー 4—吉草酸] の一般名称である。 ビォチ ンは、 ビタミン B群に分類される水溶性ビタミンの一種で、 ビタミン B7と呼ばれること もあり、 あるいは、 ビタミン H、 補酵素 Rと呼ばれることもある。 ピオチンは卵白中に含 まれる糖タンパク質の一種、 アビジンと非常に強く結合する。
本明細書中において「ピオチン」とは、上記ピオチンの他、ィミノピオチン（iminobiot in) (Hofmann, et al.， (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4666-4668) や、 デスチオビ ォチン (desthiobiotin) (Hirsch, et al., (2002) Anal. Biochem., 308: 343-357)、 あ るいはビオシチン （biocytin) やピオチンスルホキシド （biotin sulfoxide) 等のピオチ ン類縁体も含む。
レクチンをピオチン化する際には、 ピオチン化試薬を用いる方法が挙げられる。 ピオチ ン化試薬として例えば、 PIERCE機の （カツコ内は順にリンカ一長、 反応基） EZ-Link (登 録商標） Sulfo- HS-Biotin ( 1 3. 5 A、 1級ァミン）、 EZ-Link (登録商標） Sulfo-NHS-LC-Biotin(22.4人、 1級ァミン）、 EZ-Link (登録商標） Sul fo-NHS-LCLC- Bio tin' (30. 5A、 1級ァミン）、 EZ-Link (登録商標） PFP-Biotin (9. 6 A、 ァミン）、 EZ- Link (登録商標） Maleimide-PE02-Biotin (29. 1 A、 チオール基)、 EZ-Link (登録商標） Biotin- PE02 Amine (20. 4A、 カルボキシル基)、 EZ-Link (登録商標） Biotin-PE03 -LC Amine (22. 9ん カルボキシル基)、 EZ-Link (登録商標） Biotin-Hydrazide (15. 7A、 ァリレデヒド基)、 EZ-Link (登録商標） Biotin-LC-Hydrazide (24. 7 A, アルデヒ ド基)、 EZ-Link (登録商標） NHS- Iminobiot in (13. 5 A, 1級ァミン） などを利用でき るが、 これらに限定されるものではない。 このようなピオチン化試薬を用いて、 レクチンに、 公知の方法を使用してピオチンを結 合させることができる。
例えば、 NHSエステルを含むピオチン化試薬を用いる場合は、 DM S〇 （ジメチルス ルホキシド） のような有機溶媒か、 pH7_ 9のリン酸緩衝液で溶解し、 レクチンに添加 することによってピオチンを結合させることができる。 また、 例えばアミノ基を含むピオ チン化試薬を用いる場合は、 EDC (1—ェチル— 3— (3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミド塩酸:^) のようなカルポジイミドを用いて、 レクチンのカルボキシル基を 活性化エステルに変換させた後、 pH 5付近の緩衝液で溶解したピオチン化試薬を添加し て、 ピオチンを結合させてもよい。
また、 ピオチンを結合させたレクチンは、 例えば卜 Oil Mi lis社からピオチン標識レク チンとして購入してもよい。 あるいはまた、 ピオチン標識キット （例えば、 これらに限定 するものではないが、 Pierce社製の EZ-Link (登録商標) NHS-Lc-Biotinや、 Dojindo Molecular Technologies社製の Biot in Label ing Ki t-NH2など） を用いて所望のレクチン にピオチンを結合させて作製してもよい。
あるいはまた、 レクチンの遺伝子を、 ピオチン化配列を含むペプチドをコードする DN Aと融合し、 この融合遺伝子を発現するベクターを構築、 任意の宿主においてピオチン化 配列との融合タンパク質として発現させることにより （Schwarz et al.， (1988). J. Biol. Chem.263： 9640-9645) ピオチン^レクチンを作製してもよい。 このようなベクターとし てこれに限定されるわけではないが、 例えば Invitrogen社の BioEase (商標） タグが含ま れるベクターが挙げられる。 このうち哺乳類細胞発現用には、 pcDNA (商標） 6べク 夕一が、大腸菌発現用には PET 104ベクタ一が、あるいは Drosophila発現用には pM T/B i oEa s eベクターがある。
本発明において、ピオチン結合性タンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、 ニュートラアビジン、 AVRタンパク質 （Biochem. J., (2002), 363: 609-617)、 ブラダ ビジン （Bradavidin) (J. Biol. Chem. , (2005), 280: 13250-13255) , リザビジン (Rhizavidin) (Biochem. J., (2007), 405: 397-405)、 夕マビジンやこれらの変異体等、 ピオチンとピオチン アビジン結合するタンパク質であれば、 いずれも好適に使用するこ とができる。 特に、 タマビジンとその変異体を好ましく用いることができる。 なお、 夕マ ビジンは、 食用キノコである担子菌夕モギ夕ケ （Pleurotus conucopiae) から発見された ピオチン結合性タンパク質である (W0 02/072817； Takakura et al . , (2009) FEBS J. , 276 : 1383-1397)。 夕マビジンの変異体としては、 例えば、 高結合能'低非特異結合夕マビジン (特願 2 0 0 8 - 2 0 8 7 6 6 未公開） 等が挙げられる。
本発明における 「タマビジン」 は、 夕マビジン 1 (アミノ酸配列：配列番号 5、 それを コードする核酸配列：配列番号 4)、 タマビジン 2 (アミノ酸配列：配列番号 7、 それをコ ードする核酸配列：配列番号 6 )、 またはそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明 の夕マビジンは典型的には、 配列番号 5もしくは配列番号 7のァミノ酸配列を含んでなる タンパク質、 または、 配列番号 4もしくは配列番号 6の塩基配列を含んでなる核酸によつ てコードされるタンパク質、 であってよい。 あるいは、 本発明のタマビジンは、 配列番号 5もしくは配列番号 7のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、 または、 配列番号 4もし くは配列番号 6の塩基配列を含んでなる核酸によってコ一ドされるタンパク質、 の変異体 であって、 夕マビジン 1または 2と同様のピオチン結合活性を有するタンパク質、 あるい は、高結合能 ·低非特異結合の活性を有するタンパク質であってよい。本明細書において、 夕マビジン 1、 夕マビジン 2、 およびそれらの変異体を総称して、 単に夕マビジンと呼ぶ ことがある。
タマビジン 1または 2の変異体は、 配列番号 5または 7のアミノ酸配列において、 1ま たは複数のアミノ酸の欠失、 置換、 挿入および Zまたは付加を含むアミノ酸配列を含んで なるタンパク質であって、 夕マビジン 1または 2と同様のピオチン結合活性を有するタン パク質であってもよい。 置換は、 保存的置換であってもよく、 これは、 特定のアミノ酸残 基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。 保存的置換の非限定的 な例には、 I 1 e、 V a 1、 乙6 1または八1 a相互の置換のような脂«基含有アミノ 酸残基の間の置換、 L y sおよび A r g、 G 1 uおよび A s p、 G 1 nおよび A s n相互 の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
アミノ酸の欠失、 置換、 挿入および Zまたは付加による変異体は、 野生型タンパク質を コードする D NAに、 例えば周知技術である部位特異的変異誘発 （例えば、 uc leic Ac id Research, Vol. 10, No. 20， p. 6487-6500, 1982参照、 引用によりその全体を本明細書に 援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、 「1または複数の アミノ酸」 とは、 部位特異的変異誘発法により欠失、 置換、 挿入および/または付加でき る程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「1または複数のアミノ酸」とは、 場合により、 1または数個のアミノ酸を意味してもよい。
夕マビジン 1または 2の変異体はさらに、 配列番号 5または 7のアミノ酸配列と少なく とも 60%以上、 好ましくは 65%以上、 70%以上、 75%以上、 80 %以上、 85% 以上、 90 %以上、 95 %以上、 96 %以上、 97 %以上、 98 %以上または 99 %以上、 より好ましくは 99. 3%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタン パク質であって、 タマビジン 1または 2と同様のピオチン結合活性を有するタンパク質、 あるいは、 高結合能 ·低非特異結合の活性を有するタンパク質であってもよい。
2つのアミノ酸配列の同一性％は、 視覚的髓および数学的計算によって決定してもよ 。あるいは、 2つのタンパク質配列の同一性パーセントは、 Need leman, S. B. 及び Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol., 48: 443-453， 1970) のアルゴリズムに基づき、 そしてウイスコ ンシン大学遺伝学コンピューターグループ （UWGCG) より入手可能な GAPコンビュ —夕一プログラムを用い配列情報を比較することにより、 決定してもよい。 GAPプログ ラムの好ましいデフォルトパラメ一夕一には：（1) Henikoff, S. 及び Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919， 1992) に記載されるような、 スコアリ ング 'マトリックス、 b l o s um62 ; (2) 12のギャップ加重；（3) 4のギャップ 長加重；及び （4) 末端ギャップに対するペナルティなし、 が含まれる。
当業者に用いられる、 配列比較の他のプログラムもまた、 用いてもよい。 同一性のパー セントは、 例えば Altschulら (Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997) に記載され ている BLASTプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。 当該 プロクラムは、 イン夕一ネット上で National Center for Biotechnology Information (隱）、 あるいは DNA Data Bank of Japan (DDBJ) のウェブサイトから利用することが可 能である。 BLASTプログラムによる同」14検索の各種条件 （パラメ一夕一） は同サイ 卜に詳しく記載されており、 一部の設定を適宜変更することが可能であるが、 検索は通常 デフォルト値を用いて行う。 または、 2つのアミノ酸配列の同一性％は、 遺伝情報処理ソ フトウェア GENETYX Ve r. 7 (ゼネティックス製）などのプログラム、または、 FASTAアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。 その際、 検索はデフォルト値を用 いてよい。
2つの核酸配列の同一性％は、 視覚的輕と数学的計算により決定可能であるか、 また はより好ましくは、 この比較はコンピュータ ·プログラムを使用して配列情報を比較する ことによってなされる。 代表的な、 好ましいコンピュータ ·プログラムは、 遺伝学コンビ ュ一夕 ·グループ （GCG；ウィスコンシン州マディソン） のウィスコンシン ·パッケ一 ジ、バージョン 10. 0プログラム「GAP」である（Devereux, etal.， 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387)。 この 「GAP」 プログラムの使用により、 2つの核酸配列の比較の他に、 2つのアミノ酸配列の比較、 核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。 本発明において、好ましいタマビジンには、以下のタマビジン改変体が含まれる。 （特願 2008-208766 未公開）。
配列番号 7に記載のアミノ酸配列、 あるいはこの配列中に 1から数個のアミノ酸変異を 有するアミノ酸配列、 又はこの配列と 80 %以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、 ピオチン結合活性を示すタンパク質において、 以下のグループ
1 ) 配列番号 7の 104番目のアルギニン残基；
2) 配列番号 7の 141番目のリジン残基；
3) 配列番号 7の 26番目のリジン残基；及び
4 ) 配列番号 7の 73番目のリジン残基
から選択される 1または複数の残基が、 酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換さ れていることを特徴とする、 改変型ピオチン結合夕ンパク質である。
より好ましくは、 配列番号 7において、 104番目のアルギニン残基がグルタミン酸残 基に置換されており、 そして、 141番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されて いる、 改変型ピオチン結合タンパク質 （R 104E— K 141 E)；
配列番号 7において、 40番目のァスパラギン酸残基がァスパラギン残基に置換されて おり、 そして、 104番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、 改変 型ピオチン結合タンパク質 （D40N— R 104E)；
配列番号 7において、 40番目のァスパラギン酸残基がァスパラギン残基に置換されて おり、 そして、 141番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、 改変型ビ ォチン結合タンパク質 （D40N— K141 E)；並びに、 配列番号 7において、 4 0番目のァスパラギン酸残基がァスパラギン残基に置換されて おり、 1 0 4番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、 そして、 1 4 1番目のリジン残基がダル夕ミン酸残基に置換されている、 改変型ピオチン結合夕ンパク 質 （D 4 0 N—R 1 0 4 E— K 1 4 1 E)、
力、らなるグループから選択される、 改変型ピオチン結合タンパク質である。
ピオチン結合性夕ンパク質と担体の連結は、 当業者に公知の夕ンパク質と担体の力ップ リング法を用いて行うことができる。 例えば、 担体表面をカルボキシル基が露出するよう 修飾し、 当該力ルポキシル基とタンパク質のアミノ基を、 架橋試薬である 1—ェチル—3 - ( 3 -ジメチルァミノプロピル） カルポジィミド （E D C) の存在下で力ップリング反 応させることにより、 タンパク質と担体を連結することができる。 または、 例えば、 担体 表面のカルボキシル基が N—ヒドロキシスクシンイミド （NH S) により活性エステル化 された担体と夕ンパク質とを一級アミノ基を含まない p H 6. 5〜 9の緩衝液中で混和す ることにより、 担体表面の力ルポキシル基とタンパク質のアミノ基を結びつけることがで さる。
あるいは、架橋試薬 B S 3 (ビス [スルホスクシンィミジル]スベレート） や D S S (ジ スクシンィミジルスべレート）を用いて、担体表面のアミノ基とタンパク質のアミノ基を、 あるいは架橋試薬 S P D P (N—スクシンィミジル 3— [ 2—ピリジルジチォ] プロピ ォネート） や GMB S (N— (4—マレイミドブチリルォキシ） スクシンイミド） を用い て、 担体表面のァミノ基とタンパク質のチォ一ル基を結びつけることができる。
上記のような結合を用いて、 ピオチン結合性タンパク質を担体に固定化する場合、 様々 な官能基が表面に配置された各種担体が市販されているので、 それらを好ましく用いるこ とができる。 例えばこれらに限定されるわけではないが、 官能基が表面に配置されたマイ クロプレートとしては、無水マレイン酸プレートとして例えば Reacti-Bind (商標） Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96-Well Plates (PIERCE社） 1 活性型アミノ基プ レートとして例えば Immobilizer™-Amino Modules/Plates (N u n c社） ifi、 あるいは カルボキシル基プレートとして例えば E L I S A用プレート M S— 8 7 9 6 F ( 9 6ゥェ ル · Cタイプ ·平底 'カルボ） （住友ベークライト ¾) 力挙げられる。 また、 官能基が表 面に配置されたマイクロビーズとしては、 高架橋ァガロースビーズとして例えば Sepharose (商標） (GE ヘルスケアバイオサイエンス社） が、 磁性ビーズとして例えば Dynabeads (商標） （Dyna l社） 等が挙げられるが、 これらに限定されるわけではな レ^ ピオチン結合性タンパク質と固体担体の連結は、 担体に添付された説明書に従えばよ い。
あるいはまた、 ピオチン結合性タンパク質を固定化した担体としては、 例えば、 Reacti-Bind™ Streptavidin Coated Plates (PIERCE E¾)、 Nunc Streptavidin Coated 96 Micro Well™ Plates (N a 1 g e Nun c¾) 等のマイクロプレート類、 あるいは Dynabeads M-280 Streptavidin (D y n a 1社） 、 MagnaBind™ Streptavidin Beads (P I ERCE¾)等の磁性ビーズ類などの市販品も挙げられるが、 これらに限定されるわ けではない。
ピオチンとピオチン結合性タンパク質を使用しない場合には、 例えば、 レクチンにヒス チジンタグ、 FLAGTMタグ、 またはダルタチオン一S—トランスフェラ一ゼ （GST) を結合させるとともに、 担体にはそれぞれ、 N i -NTA (二トリ口トリ酢酸)、抗 FLA G抗体、 またはダルタチオンを結合させ、 それぞれを結合させることにより、 レクチンと 担体を間接的に結合させることもできる。
ウィルス含有液とレクチンの接触
本発明の方法は、 ウィルス含有液とレクチンとを ¾ させる工程を含む。 ウィルス含有 液とレクチンとを接触させる条件は、 ウィルス含有液中のウィルスとレクチンとが結合す る条件であれば特に制限されない。 接触条件の要素としては、 ウィルス含有液の組成、 ィ ンキュベ一ション温度およびィンキュベーション時間を含む。
ウィルス含有液の組成は、 ウィルス含有液中のウィルスとレクチンとが結合する条件を 維持する限り、 特に制限されない。 好ましいウィルス含有液は、 pH7〜8の緩衝液、 例 えば Tr i s/EDTA (TE)、 PBS、 HEPES、 TBS、 等を基本とする緩衝液で あってよい。また、ウィルス含有液の pHは、 6〜9、好ましくは 7〜8であってもよい。 ウィルス含有液が体液であれば、 そのまま、 あるいは当該体液を、 所望の緩衝液等を加 えてから、 レクチンと接触させてもよい。
インキュベーション温度の下限は 4でまたは 10でであってよぐ上限は 50で、 45 、 40で、 37 、 30 ：、 25で、 および 20 からなる群より選択されてもよい。 好ま しいインキュベーション温度として、 1 0で〜3 7 、 1 0で〜2 5で、 1 0 〜2 0 、 1 5 が挙げられる。
インキュベーション時間の下限は 1分、 3分、 5分、 1 0分、 1 5分、 2 0分、 3 0分 からなる群より選択されてもよく、 上限は一晩、 1 0時間、 8時間、 5時間、 3時間、 2 時間、 1 . 5時間、 および 1時間からなる群より選択されてもよい。 好ましいインキュべ ーシヨン時間として、 5分〜一晚、 5分〜 5時間、 1 0分〜 2時間が挙げられる。
本発明の方法におけるレクチンと担体とが間接的に結合する態様においては、 レクチン とウィルス含有液を接触させる前に、 それと同時に、 またはその後に、 担体に結合可能な 分子を介してレクチンと担体とを ¾ させて結合させる。 レクチンと担体を接触させる条 件は、 レクチンが、 担体に結合可能な分子を介して担体に十分に結合できる条件であれば 特に制限されない。 接触条件の要素としては、 インキュベーション温度およびインキュべ —ション時間を含む。 上述したウィルスとレクチンを接触させる条件と同様の条件を適宜 選択することができるが、特に好ましいインキュベーション時間としては、 1分〜 2時間、 3分〜 1時間、 5分〜 3 0分が挙げられる。
担体の分離
レクチンを介して濃縮対象のウィルスを捕捉した担体は、 その担体の性質に応じた当業 者に公知の手法により、 試料であるウィルス含碰から分離し、 回収する。
例えば、 ビーズなど粒子状の担体については遠心分離とそれに続く上清の除去により、 担体の試料からの分離を達成してもよい。 担体力 性ビーズの場合は、 磁石を用いて担体 を集め、 上清を除去することにより、 担体を試料から分離してもよい。 担体が、 薄膜ゃフ ィルターなどの形状である場合は、 担体を試料から引き上げることにより、 あるいは担体 に試料を通過させた後、担体を試料から分離してもよい。担体が、マイクロプレートなど、 ゥェル構造の内部でウィルスを補足するように設計されている場合は、 単に試料をゥエル 力、ら除くことにより担体を試料から分離してもよい。
また、必要に応じて試料から分離した担体に非特異的に結合した物質を除去するために、 分離した担体を洗浄する工程を加えてもよい。 洗浄工程に用いる洗浄液や温度の条件は、 ウィルスおよびレクチンの間の結合、 ならびにノまたは、 レクチンと担体の間の結合を維 持するという条件が維持される限り、 特に限定されない。 好ましくは、 洗浄液は緩衝されており p H 7〜8の緩衝液、 例えば T r i s /E DTA (T E)、 P B S、 H E P E S、 T B S、 等を基本とする緩衝液であってよい。 また、 洗浄 液の p Hは 6〜9、 好ましくは 7〜8、 であってもよい。
洗浄温度は、 特に限定されないが、 洗浄温度の下限は 4でまたは 0でであってよく、 上限は 5 0で、 4 5 ：、 4 0 、 3 7で、 3 0 、 2 5 、 および 2 0でからなる群より 選択されてもよい。 好ましい洗浄温度として、 1 0 〜3 7で、 1 0で〜 2 5 、 1 O t: 〜2 0で、 1 5でが挙げられる。
糖を用いた溶出
本発明の方法は、 レクチンを介して担体に捕捉されたウィルスを、 糖を含む溶出液を用 いて担体から溶出する工程を含む。 レクチンとウィルスが結合したままでは、 ウィルスの 種類によってはウィルスの感染能に悪影響を及ぼす場合もあることが想定される。さらに、 遺伝子治療に用いるウィルスベクターを濃縮するにあたっては、 担体からウィルスベクタ —を溶出して単離することは不可欠である。
本明細書において、 担体からウィルスを溶出するとは、 担体に捕捉されたウィルスを、 糖鎖一レクチン結合を解離させることによりウィルスを該担体から脱離させて、 該担体か ら難した状態にすることを意味する。 また、 本明細書において、 担体からウィルスを溶 出するとは、 少なくとも担体に捕捉されたウィルスの一部が担体から して した状 態となることを意味し、 必ずしも担体に捕捉されたすベてのウィルスが遊離した状態にな ることを意味しない。
また、 本明細書において、 担体からウィルスを溶出して単離する場合の 「単離する」 と いう文言は、 担体に捕捉されたウィルスを該担体から脱離させて、 該担体から遊離した状 態にし、 そして該担体の成分を除いた状態にすることを意味する。 したがって、 本明細書 において、 「単離されたウィルス」 とは、 少なくとも担体の成分を含まないことを意味し、 必ずしもウィルスの純度の程度を規定するものではない。
本発明者らは、 レクチンに結合したウィルスを、 適切な糖を含む溶液で処理することに より、 ウィルスの感染能を失わせることなく、 担体から溶出して単離することができるこ とを見出した。 よって、 本発明の方法において、 レクチンに結合したウィルスは糖を使用 することにより、 溶出することができる。 ウィルス結合レクチンからウィルスを溶出可能 な糖は、 そのレクチンが結合する糖を有する単糖類、 二糖類、 オリゴ糖または配糖体、 か ら選択される。
ウィルスを捕捉したレクチンからウィルスを溶出するための糖の具体的なものとしては、 例えば、 SB Aに対しては N—ァセチルー D—ガラクトサミンを、 SS Aに対してはラク トースを、 DS Aにはキトオリゴ糖を、 WGAにはキトオリゴ糖ゃ N—ァセチルー D—グ ルコサミンが挙げられ、 それぞれ好ましく利用することができる。
糖を含む溶出液は、 pH7〜8の緩衝液、 例えば Tr i s/EDTA (TE), PBS、
HEPES、 TBS、 等を基本とする緩衝液であってよい。 また、 糖を含む溶出液の pH は 5〜9、 好ましくは 7〜8、 であってもよい。
糖を含む溶出液中の糖の濃度は、 0. 01〜： 1M、 好ましくは 0. 05M〜0. 5M、 より好ましくは 0. 1M〜0. 3Mである。 または、 0. 1%〜5% (w/v) 、 より好ま しくは 0. 5%〜2% (w/v) である。 溶出処理の温度は、 特に限定されないが、 室温、 または、 洗浄温度の下限は 4 または 10 であってよく、 上限は 50 ：、 45で、 40で、 37 、 30で、 25 、 および 20でからなる群より選択されてもよい。好ましい洗浄温度として、室温、 1 O ：〜 37で、 10t：〜 25 、 10で〜 20で、 15でが挙げられる。
溶出処理の時間は、 特に限定されないが、 30秒〜1日、 好ましくは 5分〜 2時間、 さ らに好ましくは、 1分〜 30分、 であってもよい。
また、 ウィルスの溶出のために用いる溶出液の量は、 本発明の方法において当初に用い たウィルス含有液の容積よりも少ない量であれば特に限定されない。 好ましくは、 当初の ウィルス含有液の量の 1 2、 1/3, 1/4, 1/5, 1/10, 1/20、 1/50, 1/100または 1Z500であってよい。
なお、 担体からの溶出に糖を使用しない場合は、 溶出液の pHを酸性 （好ましくは pH 1〜5)、 またはアルカリ性（好ましくは pH9〜l 1) にすることによつても、 ウィルス を溶出することができる。
ウィルス濃縮液の取得
ウィルス濃縮液は、 担体に対して溶出液を作用させた後、 担体を除去することにより得 る。 溶出液で処理した後、 溶出液中の担体は、 その担体の性質に応じた当業者に公知の手法 により、 溶出液から分離し、 除去する。 例えば、 ビーズなど粒子状の担体については遠心 分離とそれに続く上清の回収により、 ウィルス濃縮液を得てもよい。 担体力 性ビーズの 場合は、 磁石を用いて担体を集め、 上清を回収することにより、 ウィルス濃縮液を得ても よい。 担体が、 薄膜やフィルターなどの形状である場合は、 担体を溶出液から引き上げる ことにより、 あるいは担体に試料を通過させた後、 担体を分離してもよい。 担体が、 マイ クロプレートなど、ゥエル構造の内部でウィルスを補足するように設計されている場合は、 単に溶出液をゥエルから回収することによりウイルス濃縮液を得てもよい。
2. キット
本発明はまた、 本発明の方法に基づいて、 ウィルス含有液中のウィルスを濃縮するため のキットを提供する。
一態様において、 本発明のキットは、 少なくともピオチン化レクチン、 ピオチン結合夕 ンパク質を結合した担体、 および溶出のための糖を含む。 レクチン、 ピオチン結合タンパ ク質、 担体、 および溶出用の糖については上記に定義したとおりである。
別の態様において、 本発明のキットは、 少なくともレクチンが結合したナノビ一ズ、 お よび溶出用の糖を含む。 レクチン、 ナノビーズおよび溶出のための糖については、 上記に 定義したとおりである。
本発明のキットは、 さらに本発明の方法において、 ウィルスとレクチンの結合のための 緩衝液、 分離したウィルス結合担体を洗浄するための緩衝液、 および Zまたは、 担体から ウィルスを溶出する際に用いるための緩衝液を含んでいてもよい。
本発明のキットは、 各々の試薬が適切な容器に封入されていていてもよい。 また、 本発 明のキットは、 それに含まれる試薬等を適切に梱包するためのパッケージをも含んでいて もよい。
また、 本発明のキットには適切な使用説明資料が含まれていてもよい。 使用説明資料に は、 非限定的に、 パッケージへの使用方法の記載、 あるいは、 印刷物、 電子記憶媒体 （例 えば磁気ディスク、 テープ、 カートリッジ、 チッフ °)、 および光学媒体（例えば CD RO M)、等、本発明のキットの使用方法を利用者に伝達可能な媒体が含まれる。 また、使用説 明資料を提供するイン夕一ネッ卜サイ卜へのアドレスの記載もまた、 使用説明資料に含ま れる。
実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の 術的範囲を 限定するものではない。 当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾 ·変更を 加えることができ、 それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例 1 HHV— 6を濃縮することのできるレクチンの探索
ピオチン化されたレクチン 15種類 (Con A, DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA) を、 培養した HHV— 6溶液と反応させ、 夕 マビジンを結合した磁 (4ビーズに結合させることにより HH V— 6の濃縮が出来るかどう かを検討した。
1. 培養 T細胞からの HHV— 6溶液の作製
ヒ卜臍帯血由来培養 T細胞に EGF Pを発現する組換え HHV— 6 (特許第 39235 05号） を感染させ、 EGFP型 HHV—6溶液を作製した。
2. 夕マビジン磁性ビーズの作製
カルボキシル基で表面がコ一トされた磁性ビーズ (Dynabeads M-270 Carboxyl ic、 Acid、 Dynal ¾) 300 1を、 0. 01N 水酸化ナトリウム 300 1で 10分間洗浄後、 さらに纖水 300 1で 10分間 3回洗浄した。 洗浄済みの磁性ビーズに、 冷超純水で 溶解した 1_ェチル一3— (3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミド ·ハイドロク 口ライド （EDC) (PIERCE社） を最終濃度 0. 2 Mになるように添加し、 30分間、 室 温で振とうした。その後、冷舰水 300 1、続いて 5 OmM MES ©¾ (pH5. 0) 300 z 1で磁性ピーズを洗浄し、 50mM MES^« (pH5. 0) に置換し た 0. 6mg/ml 夕マビジンを 300jLi l ( 180 μ g) 混和した。 室温で 30分間 振とうさせることにより、 共有結合にて夕マビジンと磁性ビーズを結合させた。 磁石で磁 性ビーズを回収し、 上清を除去した。 次に 50 mM トリス緩衝液 （ p H 7. 0 ) 300 1でビーズの未反応カルボキシル基を消去後、 0. 5% BSA、 0. 1% Twe e n 20を含む PBS緩衝液 300 1で磁性ビーズをブロッキングした。 PBS緩衝液 3 00 lで磁性ビーズを懸濁し、 磁性ピーズを完成させた。 ストレプトアビジンについて も同様に磁性ビーズを作成した。 3. 組換え HHV— 6溶液の濃縮
1で作製した EG F P型 HHV— 6溶液を禾棚して、 組換え HHV— 6の感染力価を指 標にウィルス濃縮がなされているかを確かめた。ピオチン化レクチンは、 J—オイルミル ズ レクチン 15種類 (Con A, DBA, LCA， PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA) を使用した。
まず、 レクチンの探索を行なう前に、 バックグランドとなる夕マビジンの非特異的吸着 の確認を行なった。
最初に、 EGFP組換え HHV— 6液 100 1 (ウィルス濃度 104/m 1 TE)、 PBS 500 1を混和し、 15 で 1時間、インキュべ一ションを行なった (転倒混和)。 次に、上記 2で作製した夕マビジン磁性ビーズを反応液に添加し、さらに 15でで 1時間、 インキュベーションした（転倒混和)。その後、反応液の入ったエツペンドルフチューブを ダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 PBS 2mM EDTA 0.5% BS A 200 1で 2回洗浄した。 次いでこれを培養液 (RPMI 1640 + 10%ゥシ胎 児血清） 500 1にて懸濁した後、全量を 0. 5m 1のィンディケ一夕一細胞 (MT 4細 胞）と懸濁した。 EGFP型 HHV— 6が存在すれば、 E G F P型 HH V— 6はィンディケ —夕一細胞に感染し、 HHV— 6の DNAが細胞中に入って、 その中でウィルスに組み込 まれた EGFP遺伝子が発現して GFP蛍光を発するものと考えられる。 なお、 本実験に おいては、ビーズが結合したままのウィルスと感麵胞とはともに液底に沈んでいるため、 通常、 問題となりうるウィルスと感染細胞との会合確率の低下は問題とならず、 却って局 所におけるウィルス濃度が非常に高くなるため、 感染効率は向上すると考えられる。
上記実験の結果、 図 1にみられる様に、 夕マビジンビーズへの HHV— 6の非特異的吸 着はほとんどないことが確認された。
次に、 各種レクチンを用いたウィルス濃縮が可能かどうかを調べた。
最初に、 EGFP組換え HHV— 6液 100 1 (ウィルス濃度 104Zm 1 TE)、 PBS 500 1、ピオチン化レクチン 1 O^gを混和し、 15でで 1時間、インキュべ ーシヨンを行なった (転倒混和)。 次に、 上記 2で作製した夕マビジン磁性ビーズを反応液 に添加し、 さらに 15 で 1時間インキュベーションした (転倒混和)。 その後、 反応液の 入ったエツペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 P B S 2mM EDTA 0. 5% BSA 200 1で 2回洗浄した。次いでこれを培養液（R PMI 1640 + 10 %ゥシ胎児血清） 500 ^ 1にて懸濁した後、 全量を 0. 5m 1の インディケ一夕一細胞 （MT4細胞） と懸濁し、 EGFPの発現を観察した。 なお、 EG FP型 HHV— 6を濃縮できていれば、 レクチン一ピオチン一夕マビジンを介して磁性ビ —ズと結合している EGFP型 HHV— 6はインディケ一夕一細胞に感染し、 ウィルスに 組み込まれた E G F P遺伝子が発現して G F P蛍光を発するものと考えられる。
実験の結果、 SBA、 SSA、 DSA、 WG Aを使用した場合に、 ウィルス原液よりも 多くの EGFPの発現が観察された。 結果の一部を図 2、 図 3に示した。 このことから、 これらのレクチンを使用して効率的に HHV— 6を濃縮できることが示された。
実施例 2 唾液中 HH V - 6の濃縮
唾液中の HHV— 6について、 レクチン化ピオチン、 夕マビジン磁性ビーズを利用して 濃縮を試みた。
1. 唾液の採取
被験者からの唾液をサリベット （サリベットコットン、 ザルスタツト社製） を用いて採 取した。 被験者は、 唾液採取の直前に蒸留水で口腔内を 2度漱いだ後、 2分間サリベット の中綿を口腔内に含み、 唾液を採取した。
2. HHV—6の定量
まず、 唾液中の HHV— 6濃度を定量した。
上記項目 1. のように採取した唾液 400 1について、 BioRobot EZl (QIAGEN ¾) と EZl Virus Mini Kit v2.0 (QIAGE ¾) を用いて、 EZl Virus Mini Handbook (QIAGE ¾) のプロトコ一ルに従い、 唾液中の HHV— 6 DNAを精製した。
得られた DNAを、定量 PCRに供試した。定量 PCRでは、 HHV—6 U65/66 領域を、 リアルタイム PC R法で定量した。 PCRに使用したプライマ一およびプローブ の配列は、
プライマ一： 5' - GACMTCACATGCCTGGATMTG-3' (配列番号 1) ;および
プライマ一： 5' -TGTMGCGTGTGGTMTGGACTM-3' (配列番号 2)；ならびに
TaqManプローブ： FAM 5' - AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC- 3' TAMRA (配列番号 3) であり、 FastStart Universal Probe Master (Rox) (ロシュ ¾) を用いて、 反応温度 95で 10分間 1回、 95で 5秒 +60 31秒、 を 45サイクルでリアルタイム PCRを 行った。
なお、 本試験は、 ウィルス実験に極めて賽繊した実験者によって行なわれた。
その結果、 唾液 lml中の HHV— 6DNAは、 14616コピー /m 1であった。 従 つて唾液 5 a 1に含まれる HHV— 6は、 73.08コピーと算出された（図 4：精製前）。
3. ピオチン化レクチン、 夕マビジン磁性ビーズを利用した HHV— 6の濃縮
上記項目 1.のように採取した唾液 400 1に、 の 10倍濃度の P B S、ピオ チン化 SB A 1 nmo 1を混和し、 15 で 1時間インキュベーションを行なった（転倒 混和） 。 次に、 実施例 1で作製した夕マビジン磁性ビーズ 100 1を反応液に添加し、 さらに 15でで 1時間ィンキュベーションした (転倒混和)。 その後、 反応液の入ったエツ ペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネッ卜スタンドに立てた後、 PBS 500 1で 3回洗浄した。 ここに TEを 10 1加え、 98 で 10分間処理した後、 マグネッ トスタンドにおいて、 上清を回収し、 うち 5 l を定量 PCRに供試した。 定量 PCRで は、本実施例の上記項目 2. と同様に、 HHV— 6 U65 66領域を、 リアルタイム P C R法で定量した。
以上の実験の結果、 ピオチン化 SB Aとタマビジン磁性ビーズを利用した場合、 定量 P CRに供試した溶出液 5 1中の HHV— 6量は、 2934コピーと測定された（図 4)。 本実施例の上記項目 2. の結果と比較すると、 ピオチン化 SB Aと夕マビジン磁性ビーズ を用いることで、 HHV— 6溶液をおよそ 40倍に濃縮することができた。 同様にビォチ ン化 SS Aを用いた場合には約 15倍の濃縮効率であった。 一方、 ピオチン化レクチンを 加えない試験区に含まれる HHV— 6量は 40コピー以下であり、 濃縮されていなかった (図 4)。
4. ピオチン化レクチン及びタマビジン磁性ビーズを利用した HHV— 6の濃縮と糖鎖 による溶出
上記項目 1. のように採取した唾液 lm 1に、 100 ^ gのピオチン化 SBAまたはピ ォチン化 WG Aを添加した後、 実施例 1で作製したタマビジン磁性ビーズ 50 1を反応 液に添加し、 15分間、 室温で転倒混和することにより、 結合させた。 これを、 ダイナビ ーズ用マグネットスタンドに立てた後、 0. 5% ゥシ血清アルブミン、 2 mM EDTA 入り PBSで 2回洗浄後、 20 1の溶出液 （PBS +2% ゥシ胎児血清に溶出用の 糖鎖を加えたもの） で溶出処理した。 溶出液中の溶出用の糖は、 ピオチン化 SB Aを用い た系においては N—ァセチルー D—ガラクトサミン （0. 2M) を、 ピオチン化 WGAを 用いた系においてはキトオリゴ糖 (1 %) を用いた。 その後、 溶出処理を行った溶出液の 入った試験管をダイナビーズ用マグネットスタンドに立てて、 夕マビジン磁性ビーズを集 め、 上清を回収した。 このようにして得られた回収液の 5 1を定量 PC Rに供試した。 定量 PC Rでは、 上記項目 2. と同様に、 HHV— 6 U 65/66領域を、 リアルタイム PCR法で定量した。
以上の実験の結果、 ピオチン化 S B Aとタマビジン磁性ビーズを利用して HHV— 6を 集めて N—ァセチル一 D—ガラクトサミンで溶出した場合、 精製前のウィルス濃度と比較 して 2. 7倍の濃縮効率であった。 また、 ピオチン化 WGAとタマビジン磁性ビーズを利 用して HHV— 6を集めてキトオリゴ糖で溶出した場合、 精製前のウィルス濃度と比較し て 4. 7倍の濃縮効率であった （図 5)。
実施例 3 レクチンを用いたレンチウィルスベクタ一の濃縮
(1) 濃縮
レンチウィルスとして、 HI V b a s eの遺伝子と、 V S V— Gのエンベロープを持つ レンチウィルスベクターに EGFP遺伝子を組み換えたものを使用した （独立行政法人 理化^ W究所の三好浩之先生から分与された)。ピオチン化レクチンは J—オイルミルズ社 製 ピオチン化レクチン 1 5種類 （Con A, DBA, LCA, PHA-E4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ABA, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA， SSA) を使用した。
最初に、 EGFP組換えレンチウィルス液 1 00 μ 1 (ウィルス濃度 102Zm 1 T E、 なお、 濃縮効果を観察するために、 力価の低いウィルスを使用した。）、 PBS 50 0 fi I、ピオチン化レクチン 1 O gを混和し、 1 5 で 1時間インキュベーションを行 なった (転倒混和)。 次に、 実施例 1で作製した夕マビジン磁性ビーズを反応液に添加し、 さらに 1 5 で 1時間ィンキュベーションした (転倒混和)。 その後、 反応液の入つたェッ ペンドルフチューブをダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 PBS 2mM E DTA 0. 5% BSA 200 1で 2回洗浄した。次いでこれを培養液（RPMI 1 640 + 10 %ゥシ胎児血清） 500 ^ 1にて懸濁した後、 全量をィンディケ一夕一細胞 (293細胞） に感染させ， EGFP発現によってウィルスの感染力価を測定した。
その結果、 VSV— Gエンベロープを持つレンチウィルスベクターが、 WGAまたは S B Aを利用した場合に、感染性を失うことなく充分に濃縮されることが分かった酒 6)。 なお、 原液のウィルスでは EG FP発現細胞はほとんど見られなかった。
(2) 濃縮率の定量
次に、 濃縮率の定量を行った。 1mlの EG FP組換えレンチウィルス溶液 （力価： 1 0 Vm 1 ) に、 200 gのピオチン化 S B Aまたはピオチン化 WGAを添加した後、 100^ 1のタマビジン磁性ビーズを添加し 15分間、 室温で転倒混和することにより、 結合させた。 これを、 ダイナビーズ用マグネットスタンドに立てた後、 0. 5% ゥシ血清 アルブミン、 2mM EDTA入り PBSで 2回洗浄後、 100 1の溶出液 （P B S + 2 %ゥシ胎児血清に溶出用の糖を加えたもの)で溶出処理した。溶出液中の溶出用の糖は、 SB Aでは、 N—ァセチル— D—ガラクトサミン （0. 2M)、 WGAではキトオリゴ糖 (1%)を用いた。その後、溶出処理を行った溶出液の入った試験管をダイナビーズ用マグ ネットスタンドに立ててタマビジン磁性ビーズを集め、 上清を回収した。 このようにして 得られた回収液について、ウィルス力価をインディケ一夕一細胞（HeL a細胞）に 37で で 1時間吸着させることにより、 感染させ、 1日後の EG FP発現細胞数によって感染ゥ ィルスカ価を計測した。
その結果、 ピオチン化 SB Aを用いた系では回収率 56 %、 ピオチン化 WGAを用いた 系では回収率 98 %でウイルスを回収することができた。濃縮率はそれぞれ 5. 6倍、 9. 8倍となった （図 7)。
産業上の利用可能性
本発明は、 濃度の低いウィルス溶液中のウィルスやウィルスべクタ一を、 より簡便に濃 縮することを可能にする新規な方法および当該方法を行うためのキットを提供する。 本発 明の方法は、 ウィルスやウィルスベクタ一の感染能を維持しつつ濃縮することを容易にす るものであるので、 例えば、 ウィルスベクターを用いる遺伝子治療やワクチン治療などの 分野における、 安全で簡便なベクタ一の濃縮技術としての活用が期待される。 より具体的 には、 本発明の方法は、 従来の方法のような煩雑なカラム操作や超遠心などが不要な簡便 な方法であるため、 自動化やハイスループットなシステムへの応用も期待できる。

Claims

請求の範囲
1. ウィルスを濃縮する方法であって、 以下の工程：
(1) ウィルス含有液にレクチンを接触させ、 ウィルスとレクチンを結合させる、 ここで、
(1)当該レクチンは担体に結合可能な分子に連結しており、さらに当該分子を介して担体 に結合させることにより、 レクチンに結合したウィルスは間接的に担体に結合し、 または
(i i)当該レクチンは担体に直接的に結合しており、それによりレクチンに結合したウイ ルスは担体に結合し；
(2) 担体をウィルス含有液から分離し；
(3)回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウィルスを溶出する、 ここで 当該溶出液は （1) のウィルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
(4) (3) の溶出液から担体を分離して、 ウィルス 液を得る；
を含む、 前記方法。
2. ウィルスを濃縮する方法であって、 以下の工程：
(1)ウィルス含有液にピオチン化レクチンを混和して、ウィルスとピオチン化レクチンを 接触させ、 さらに、 ピオチン結合タンパク質が結合した担体を添加して、 ピオチン化レク チンと結合したウィルスを担体に結合させ；
(2) 担体をウィルス含有液から分離し；
(3)回収した担体を糖を含む溶出液で処理して、該担体からウィルスを溶出する、 ここで 当該溶出液は （1) のウィルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
(4) (3) の溶出液から担体を分離して、 ウィルス濃縮液を得る；
を含む、 前記方法。
3. ウィルスが、 エンベロープを有するウィルスまたは当該ウィルス由来のウィルスで ある、 請求項 1または 2に記載の方法。
4. ウィルスが、 レンチウィルスまたはへルぺスウィルスである、 請求項 1または 2に 記載の方法。
5. レクチンが、 N—ァセチルガラク卜サミン （Ga lNAc)、 α 2— 6結合のシアル 酸（S i aa2_6)、 N—ァセチルダルコサミン （G 1 cNAc)の少なくとも一つを含 む糖に結合するレクチンである、 請求項 1または 2に記載の方法。
6. レクチンが、 S B A (ダイズ由来)、 S S A (二ホンニヮトコ由来)、 D S A (チヨ ゥセンアサガオ由来)、 およ (コムギ胚芽由来）からなる群より選択される、 請求 項 5に記載の方法。
7. レクチンが ^VGA (コムギ胚芽由来） であり、 ウィルスの溶出に用いる糖がキトォ リゴ糖である；または、 レクチンが S BA (ダイズ由来） であり、 ウィルスの溶出に用い る糖が N—ァセチル一 D—ガラクトサミン、 またはこれを含む糖である；請求項 1または 2に記載の方法。
8. ウィルスがレンチウィルスであり、 レクチンが ^WGA (コムギ胚芽由来） であり、 ウィルスの溶出に用いる糖がキトオリゴ糖である；または、 ウィルスがレンチウィルスで あり、 レクチンが S B A (ダイズ由来） であり、 ウィルスの溶出に用いる糖が N—ァセチ ル— D—ガラクトサミン、 またはこれを含む糖である；請求項 1または 2に記載の方法。
9. ウィルスを濃縮する方法であって、 以下の工程：
( 1 )ウィルス含有液に、直径 1 0 nm〜： L 0 0 nmのナノビーズに直接結合しているレク チンを させ、 ウィルスをナノビーズに結合させ、 ；
( 2) ナノビーズをウィルス含有液から分離し；
( 3 )回収したナノビーズを糖を含む溶出液で処理して、該ナノビーズからウィルスを溶出 する、 ここで当該溶出液は （1 ) のウィルス含有液の容積よりも少ない量である；そして
(4) ( 3 ) の溶出液からナノビーズを分離して、 ウィルス濃縮液を得る；
を含む、 前記方法。
1 0. 請求項 2に記載の方法によりウィルスを濃縮するためのキットであって、 ビォチ ン化レクチン、 ピオチン結合タンパク質ビーズ、 および担体からウィルスを溶出するため の糖、 を含む、 前記キット。
1 1 . 請求項 2に記載の方法によりウィルスを濃縮するためのキッ卜であって、 以下： ( a) ピオチン化 WGA、 ピオチン結合タンパク質、 およびキトオリゴ糖；または
(b) ピオチン化 S B A、 ピオチン結合タンパク質、および N—ァセチルー D—ガラクトサ ミン、 またはこれを含む糖；
を含む、 前記キット。
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