JP2014512843A - 細胞からの抽出 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、非限定的な、図および実施例を参照して以下に説明される。
要約
スチレンマレイン酸(SMA)共重合体が、膜貫通タンパク質を分離して保持するために脂質/重合体の集合体(「脂質ナノディスク」)を形成することができるという最近の発見は、生物学の当該分野における飛躍的な前進であった。したがって、円偏光二色性などの技法は、構造的および機能的分析について、これらの膜貫通タンパク質を特徴付けるために使用されてきた(Knowles et al, 2009)。
本発明者らは、標的の治療用タンパク質をペリプラズムから抽出する、より効率的な方法を得るために、新たなペリプラズムタンパク質放出方法を開発することを決定した。最も広く使用されているペリプラズム放出方法は、トリス/スクロース/リゾチーム/EDTA(TSLE)緩衝液を使用するので、実験においてコントロールとして使用した。このTSLE放出法を用いて、タンパク質の高い割合をペリプラズムから放出することができるが、この方法は、リゾチーム酵素の量および費用が原因で、大規模な工業的プロセスで使用するために規模を拡大することは非常に困難である。
総タンパク質濃度を測定するためのBCA(ビシンコニン酸)分析
この分析は、(562nmで)紫色のBCA−Cu+反応複合体の比色検出に基づいており、試料中のタンパク質の総量を測定する。この手順は、アルカリ性媒体中におけるタンパク質による銅イオンの還元(Cu2+――>Cu+)(ビウレット反応と称される)と、BCAの2分子にキレートすることができる単一のCu+イオンの性質とを組み合わせ、紫色の反応複合体を形成する。
SMA2000P(Sartomer社から入手)と1Mの水酸化ナトリウム(10%w/v)との溶液を、マグネチックスターラー上の丸底フラスコ中において穏やかに室温で一晩攪拌した(25gのSMA2000Pを250mlのNaOH中に溶解させた)。続いて、いくつかの抗沸顆粒を、凝縮器を取り付けた加熱マントル上に置いた丸底フラスコに加えた。SMA/NaOH溶液を沸点に到達させた。煮沸後、熱を下げ、2時間還流し、溶液を2日間冷室に移した。これらの工程は、ドラフトチャンバー中で行われた。この冷却期間の後、体積を測定してSMAの含有率を計算し、50mlファルコンチューブに等分し、−70℃で保存した。
使用されたE.coli株は、プラスミドpQR126を含むK12細菌株JM107であった。細胞を、1%デンプン(w/v)および20μg/mlのカナマイシンを含有する栄養寒天プレート上で一晩増殖させた。この栄養寒天プレートからの単一コロニーを、20μg/mlのカナマイシンを添加した、50mlの「テリフィックブロス」(TB)を含む三角フラスコに植菌し、回転式振とう培養機内において一晩37℃で植菌した。
この一晩培養物を50mlファルコンチューブにおける10個の40mlアリコートに分けた。続いて、これらのファルコンチューブを、ベックマンコールター社製GS−6R遠心分離機を用いて4℃で10分間遠心分離(3750rpm)し、上清(細胞外画分)を廃棄した。ペレットは、50mMトリス緩衝液(pH7.5)を用いて洗浄され、再度4℃で10分間にわたって再遠心分離(3750rpm)し、上清を再び除去した。
これらの細胞の単一のペレットを、8mlの50mMトリス(pH7.5)中に十分に再懸濁し、1.5mlエッペンドルフチューブにおける8つの1mlアリコートに分配した。その後、これらのチューブを、14,000rpmでベンチトップ遠心分離機(Spectrafuge(商標)16M)を用いて室温で5分間遠心分離した。続いて、ペレットを残して上清を除去した。ペリプラズム画分を、種々の抽出方法を用いてE.coli細胞から放出した。
ペリプラズム放出の従来法は、リゾチーム/EDTAを用いて得られた。単一細胞ペレットを、50mMトリス(pH7.5)、20%スクロース、EDTA(1mM)およびリゾチーム(500μg/ml)を含む緩衝液1mlに再懸濁した。その後、これは、T/S/L/E緩衝液と称される。続いて、これを室温で15分間培養し、14,000rpmの速度で室温において5分間の遠心分離することによって細胞を回収した。上清(ペリプラズム画分)を別々の1.5mlエッペンドルフチューブに静かに移した。
単一細胞ペレットを、50mMトリス(pH7.5)、20%スクロース、およびリゾチーム(500μg/ml)を含む緩衝液1mlに再懸濁し、室温で15分間攪拌した。続いて、細胞を、室温で5分間の遠心分離(14,000rpm)によって集め、上清(ペリプラズム画分)を別の1.5mlのエッペンドルフチューブに静かに移した。
単一細胞ペレットを、特定の長さの時間(2時間または6時間)にわたって、50mMトリス(pH8.0)/0.5M NaClを含む緩衝液1mlに再懸濁し、37℃で培養した。培養後、細胞を、室温で5分間の遠心分離(14,000rpm)によって集め、上清(ペリプラズム画分)を別の1.5mlのエッペンドルフチューブに静かに移した。
また、スチレンマレイン酸(SMA)の様々な濃度を用いた処理を、E.coli細胞のペリプラズム内容物を抽出するために使用した。多くの別個の細胞ペレットを、異なる濃度のSMA(50mMトリス pH8.0/0.5M NaCl)を含む緩衝液中に十分に再懸濁し、室温または37℃のいずれかで様々な期間で培養した。培養後、細胞を、室温で5分間遠心(14,000rpm)することによって集め、上清(ペリプラズム画分)を別の1.5mlのエッペンドルフチューブに静かに移した。
細胞を、750μlのT/S/L/E緩衝液(上述のように)、または750μlのSMA(50mMトリス pH8.0/0.5M NaCl)のいずれか中に十分に再懸濁した。細胞懸濁液を、これらの緩衝液のいずれかとともに室温で15分間静的に培養した。この後、冷水を等量添加した。さらに、この細胞懸濁液を、特定の条件に応じて)特定の期間培養し、5分間にわたって14,000rpmで遠心分離することによってペリプラズム画分を回収前した。
3つの別々のαアミラーゼペリプラズム画分(TSLE、2.5%SMA、および50mMトリス/0.5M NaCl)の使用は、AUC実験で使用するために必要であった。T/S/L/E αアミラーゼ画分を、12〜14KDaの透析膜で透析した。これに対して、SMAおよびトリス/NaCl αアミラーゼ画分を、3.5kDaの透析膜で透析した。これらの画分のすべてを、汚染物質の存在しない高度に純粋な試料を得るために、50mMトリス pH8.0/500mM NaClを含む緩衝液中で透析した。これらの試料の分析は、その後、分析超遠心を使用して行った。
分析における使用のために必要な停止溶液は、50mlのヨウ化カリウム(2%w/v)に溶解された、100μlのヨウ素保存溶液(2.2%I2/4.4%KI)を用いて作製された。
ペリプラズム画分(20μl)を、5μlのタンパク質試料ローディング色素に結合させ、SDS−PAGEゲル上のウェルに入れた。タンパク質マーカーがゲルの末端に達するまで、ゲルを約1時間、100Vで泳動した。続いて、ゲルを、Instant Blue(商標)(クーマシーブルー)を使用して染色し、多数のタンパク質バンドが見えるようになるまで、ロッカーの上に置いた。この染色処理の後、Instant Blue(商標)染色を除去し、ゲルを脱イオン水によって一晩脱染色した。続いて、ゲル上に存在するタンパク質バンドを、存在するタンパク質のサイズを決定するために、予め染色されたタンパク質マーカーに対して分析した。
この分析で使用されるE.coli株は、プラスミドpACYC ΔHNを含む182細菌株MALX400であった。これらの細胞は、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを含む栄養寒天プレート上で一晩増殖させた。
β−ガラクトシダーゼ分析における使用のためのZ緩衝液は、0.06MのNa2HPO4、0.04MのNaH2PO4、0.01Mの塩化カリウム(KCl)、0.01MのMgSO4、および(実験当日に加えられた)0.05Mのβ−メルカプトエタノールを用いて作製された。
β−galチューブ:
1.9ml Z緩衝液+0.1ml 細胞溶解物→0.5ml ONPG→1ml Na2CO3
コントロールI(細胞溶解物なし):
2ml Z緩衝液→0.5ml ONPG→1ml Na2CO3
コントロールii(ONPGなし):
1.9ml Z緩衝液+0.1ml 細胞溶解物→0.5ml Z緩衝液→1ml Na2CO3
同一の基本的なプロトコルを、他の一連の実験に続いて行ったが、溶液の体積は、反応混合物を96ウェルプレートに合わせるために10倍縮小された。したがって、試料については、10μlのβ−ガラクトシダーゼ含有細胞または細胞画分の追加とともに、190μlのZ緩衝液をプレートの特定ウェルに添加した。
エシュリヒア・コリー(Eschrichia coli)細胞からのペリプラズムαアミラーゼ放出の際に変化する条件の影響。
E.coli細胞(プラスミドpQR126を含むK12細菌細胞株JM107)のペリプラズムからαアミラーゼを抽出するために、初期αアミラーゼ分析を確立し、この酵素の放出における条件の変化の影響を調べた。
本研究の間に行われたこれらの分析のそれぞれについて、反応を、複数のデータセットを得るために、2回または3回反復して行った。したがって、棒グラフは、それぞれのペリプラズムタンパク質の放出方法について、ペリプラズムから抽出されたαアミラーゼの平均割合(%)を示している。
この最初の結果の後、SMA共重合体によるαアミラーゼのペリプラズム抽出における37℃での培養の時間的な影響を示すために、αアミラーゼ分析を開発する必要があった。したがって、別の分析において、これらのE.coli細胞を、37℃で、様々な異なる培養時間にさらした。
E.coli細胞のペリプラズムからのαアミラーゼの抽出における、SMAの異なる濃度(0.5%〜4.5%)の効果を試験するためにこの分析をさらに発展させる必要があった。一定に維持するために、培養時間は、これらのSMA濃度のそれぞれについて2時間(37℃)で保たれた。
E.coli細胞のTSLE処理における温度の影響を調べるために新たな分析が確立された。
最適なTSLE放出方法(室温で15分間の培養)を、4℃における、αアミラーゼ126細胞の分離したペレットと同様の培養時間と比較した。これらの2つの温度を、αアミラーゼのそれぞれの放出によって比較すると、現実的な差は認められなかった(100%に対して99.5%)。
上述のペレットを氷冷水で洗浄して「冷水洗浄画分」を得た(方法において記載された)。これらの画分から得られた結果は、最適なTSLEペリプラズム放出方法(図12)に比較して、αアミラーゼ放出の有意な減少があり、αアミラーゼ放出の17.3%または5.4%(4℃)のいずれかをもたらすことを示した。この結果は、これらの条件から製造されたαアミラーゼのほとんどが「ペリプラズム画分」に放出されたことを示した。
さらなる分析を、E.coli細胞のペリプラズムからのαアミラーゼ抽出に、氷冷水の適切な体積を添加する効果を試験するために行った。この分析のために、この浸透圧ショック法(方法を参照のこと)を、ペリプラズムタンパク質放出についての、TSLE、2%SMA、および2.5%SMA処理(図13)と併せて行った。この分析の結果は、浸透圧ショックが、細胞からαアミラーゼを放出するための、T/S/L/E処理の効率にほとんど影響を与えないことを示した(100%に対して99.3%の効率)。しかしながら、浸透圧ショックを、2%SMA処理(85.9%から92.6%)と2.5%SMA(75.8%から88.4%)との両者に組み合わせて両者を使用したとき、放出されるαアミラーゼの量がわずかに増加した。
リゾチーム作用におけるEDTAの効果は、既に以前に示されており(図4)、E.coli細胞のペリプラズムから放出されるαアミラーゼ量における刺激効果を有することが見出された。したがって、EDTAが、SMA脂質粒子(SMALPs)の性質に任意の影響を有し、E.coliのペリプラズム間隙からαアミラーゼを放出するかどうかを確認する必要があった。
第1の試験管分析は、これらのE.coli細胞中のβ−ガラクトシダーゼの存在を示すために確立された。このことは、トルエンおよびデオキシコール酸ナトリウムを用いて細胞を透過性にすることによって得られた。ONPGの存在下において、(420nmの光学密度で)20分間にわたって0.53の吸光度の変化があった(0.05から0.58まで)ので、β−ガラクトシダーゼの有意な放出が示される。一方、ONPGの非存在下において、同様の期間にわたって(同一の光学密度で)吸光度の変化はなかった。この場合、放出されたβ−ガラクトシダーゼは、その作用を発揮することができない。なぜなら、ONPG(無色)をONP(黄色)に変換することができないからである。ONPGの存在下においてZ緩衝液を用いる別の陰性コントロール実験では、(420nmでの)吸光度に変化はなかった。なぜなら、この酵素を含有する細胞が存在しないからである。これらのβ−ガラクトシダーゼ分析のそれぞれについて、吸光度の変化は、この酵素の活性の増加を表した(図15)。
β−ガラクトシダーゼ細胞から「冷水洗浄画分」を得る方法(上述の方法)を、この酵素の放出を検出するために使用した。この処理の結果は、β−ガラクトシダーゼが、「冷水洗浄画分」(cwf)において放出されなかったことを示した。このことは、すべてのβ−galが「ペリプラズム画分」に放出されたことを示した(図17)。
この分析を、E.coli細胞から抽出された、ペリプラズム画分(pf’s)および冷水洗浄画分(cwf’s)の多くに存在するタンパク質の量および濃度を検出するために使用した。これらの画分のそれぞれの正味吸光度を、総タンパク質濃度を決定するために、BSA標準曲線上にプロットした(図18)。
(−)=特定タンパク質の放出がないことを示している。
(+)または(++)=その特定タンパク質の最小限の放出を示している。
(++++)=その特定タンパク質の非常に優れた放出を示している。
(+++++)=その特定タンパク質の最も優れた放出を示している。
Knowlesらによる最近の研究では、膜貫通タンパク質を研究する全く新規の方法が開発された。このことは、「スチレンマレイン酸(SMA)共重合による単分散脂質ディスク」の形成によるものである。これらの脂質「ナノディスク」(SMALPs)の形成は、核磁気共鳴(NMR)分光法、および円二色性(CD)分光法などの、生物物理学的および構造的分析を正確に調べるために保存される膜貫通型タンパク質をもたらすことができる。
結論として、TSLEタンパク質放出法は、ある時はαアミラーゼのわずかに多い量をもたらし得るが、このことは細胞質タンパク質(すなわち、β−ガラクトシダ−ゼ)の放出によって汚染された可能性がある。したがって、大規模なバイオプロセス産業において、リゾチームを用いる費用と、下流処理におけるその後の精製工程とによってこのことは高価な選択肢であろう。一方、スチレンマレイン酸(SMA)の使用は、外膜にSMALP複合体を形成することによって、ペリプラズム間隙からタンパク質を選択的に放出するために使用することができる(図21)。したがって、大規模なバイオプロセス産業において、この方法は、スチレンマレイン酸重合体の費用削減と、このタンパク質を製造するために必要な精製工程を削減するという事実とによって、良好な経済的価値があるであろう。
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E.coliは、抗体断片(FAB断片)をコードする遺伝子を含むプラスミドで形質転換された。細胞を増殖させ、遺伝子発現を誘導した。細胞を遠心分離によって分離し、続いて37℃におけるSMAの増加した量を含む緩衝液(たとえば、50mMトリスHCl pH7.4、150mM NaCl)中に再懸濁した。1時間の培養後、スフェロプラストを遠心分離によって溶液から分離し、その後(FAB断片を含む)上清を回収した。放出されたFAB断片の量は、FAB断片に対する抗体で標識されたウエスタンブロットを用いて評価された。上清中の総タンパク質は、SDS PAGEを用いて評価された。
Claims (21)
- スチレンマレイン酸共重合体(SMA)を含む溶液中で細菌細胞を培養することを含むことを特徴とする、細菌細胞のペリプラズム間隙の内容物を放出するための方法。
- スチレン:マレイン酸の比率は、約1:2から10:1までであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- スチレン:マレイン酸の比率は、約2:1であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記SMAは、約0.5%〜4.5%の間の濃度であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記SMAの濃度は、約2%〜2.5%であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、約15分から6時間までの間、SMAとともに培養されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、SMAとともに約2時間培養されることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、SMAとともに約37℃で培養されることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌細胞は、グラム陰性細菌種であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記グラム陰性細菌種は、E.coli、サルモネラ(Salmonella)属、シュードモナスフルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シゲラ(Shigella)属、エルシニア(Yersinia)属、またはクレブシエラ(Klebsiella)属であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- (i)細菌細胞の集団を作製する工程と、
(ii)細菌細胞を、約2:1のスチレン:マレイン酸の比率を有するSMAを含む溶液に約2%〜2.5%の濃度で懸濁する工程と、
(ii)前記細菌細胞を約37℃で約2時間にわたって前記溶液中で培養する工程とを含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記溶液は、EDTAを実質的に含まないことを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液は、0.5M NaClにおいて、pH8.0の50mM TRISを含むことを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を浸透圧ショックにさらすことをさらに含むことを特徴とする請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- ペリプラズム間隙の1つの成分の少なくとも一部を前記溶液から回収することをさらに含むことを特徴とする請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペリプラズム間隙は、組み換えポリペプチドを含むことを特徴とする請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 組み換えポリペプチドの少なくとも一部を前記溶液から回収することを含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 組み換えポリペプチドの実質的に純粋な試料を作製する方法であって、
(i)組み換えポリペプチドを含む細菌細胞の集団を作製する工程と、
(ii)細菌細胞を、約2:1のスチレン:マレイン酸の比率を有するSMAを含む溶液に約2%〜2.5%の濃度で懸濁する工程と、
(ii)前記細菌細胞を約37℃で約2時間にわたって前記溶液中で培養する工程と、
(iv)前記溶液から前記組み換えポリペプチドを回収する工程とを含むことを特徴とする方法。 - ペリプラズム間隙の内容物を放出するためのスチレンマレイン酸共重合体(SMA)の使用。
- (i)スチレンマレイン酸共重合体(SMA)を含む溶液と、(ii)取扱説明書とを含むことを特徴とする、部品のキット。
- タンパク質精製カラムまたは樹脂を含む1以上の追加の成分を、さらに含むことを特徴とする、部品のキット。
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