CN103649325A

CN103649325A - 自细胞的提取

Info

Publication number: CN103649325A
Application number: CN201280033450.XA
Authority: CN
Inventors: 蒂莫西·达弗恩; 欧文·罗伯特·蒂里尼斯-托马斯
Original assignee: University of Birmingham
Current assignee: University of Birmingham
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2032-05-09
Also published as: JP5886940B2; US20140199751A1; EP2707494B1; JP2014512843A; GB201107737D0; WO2012153089A8; WO2012153089A1; CN103649325B; EP2707494A1; US9523086B2

Abstract

本发明提供了一种用于释放细菌细胞的周质间隙的内含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液中温育所述细菌细胞。本发明还提供了一种制备重组多肽的基本上纯的样品的方法。所述方法可应用于从细菌细胞回收物质如蛋白质。

Description

自细胞的提取

本发明涉及用于改善从细胞回收物质的方法。

生物加工工业在生物治疗药物和生物技术领域已经历了巨大成长，并且在近年来，在使用这样的方法制备的生物医药产品(例如疫苗和单克隆抗体)的数量方面有很大增长。最近的数据显示了全部药物的约44%是生物医药产品。

生物加工的技术由多个步骤组成。制备可以合成目的生物药物产品的宿主细胞。在宿主细胞发酵(“生物反应器步骤”)后，产物通常从所述细胞分泌和/或提取，即“产物释放步骤”。接着具体产物需要通过下游加工纯化，如过滤、离心和各种色谱法步骤。这样的方法可以用来制备用于治疗应用的生物药物产品。所述产物释放步骤和随后的这样的产物的回收在生物加工技术中是关键阶段。

由于各种各样的原因，选择用于生产生物药物以及其他目的重组蛋白的宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性菌。这些细胞可以容易生长，并且含有相对简单的基因组。这些细胞的遗传学可以易于操控，这使得它们在微生物学、生物技术和生物加工领域中很重要。

像通常细胞膜一样，革兰氏阴性菌如大肠杆菌含有额外的外膜，该外膜含有脂多糖和脂蛋白以及磷脂和膜蛋白。脂多糖由连接于O-多糖的共价结合的脂质A分子组成，这给外膜提供强负电荷。在内膜和外膜之间存在间隙，称为周质间隙，其在革兰氏阴性菌中含有薄的肽聚糖基质层-已知其在细胞壁中提供结构功能。肽聚糖基质层由两种糖即N-乙酰胞壁酸和(β1-4)N-乙酰葡糖胺组成，这两种糖在所述层的结构中交替。所述N-乙酰胞壁酸单体含有具有由若干氨基酸残基构成的肽链的侧链。这种肽链具有结合另一个N-乙酰胞壁酸单体中的另一个肽链的潜力，以致所述肽聚糖可以形成'网状'层。这种肽聚糖层还含有小孔或开口，这可以足够达以用于蛋白通过。

在有机体如大成杆菌中，一些蛋白可以运输到细胞质外和各种其他膜隔室中，包括周质间隙。预定从细胞质输出的蛋白含有“信号肽”，其是蛋白N-端的延伸。这些'信号肽'含有三个保守区域；N-端区域，核心区域和C-端区域。一旦所述蛋白已到达其需要的目的地，则信号肽可以通过称为信号肽酶的酶从成熟蛋白裂解，由此在细胞膜的指定隔室(例如周质)中释放成熟多肽。

蛋白至周质间隙的易位已由生物加工工业开发以有助于生物药物产品的回收。这是为了使从细胞质释放的污染物的量最小，并且还避免细胞的微粉化。

文献中有大量现有方法用于释放周质蛋白，但没有一个是理想的。使用去污剂(如Triton X-100)和氯仿对细菌细胞的化学处理导致外膜的透过性增大，而且还导致低的蛋白纯度，因此增加关于下游加工的成本。用阴离子表面活性剂处理大肠杆菌细胞也可以导致大量周质蛋白释放，包括青霉素酰化酶。外膜也可以通过用甘氨酸处理被透化以释放细菌的内含物，包括α-淀粉酶，获得这种蛋白的70-80%回收。渗透压休克的技术也已在从大肠杆菌细胞的周质释放青霉素酰化酶中显示前景。尽管这些方法在实验室的小规模上显示了相对成功，但是使这些技术在更大规模上可行的上升显示很少的前景。

迄今周质蛋白释放的最有效方法利用EDTA(乙二胺四乙酸)联合溶菌酶。EDTA导致二价阳离子如Ca²⁺的螯合，其引起膜去稳定化，从而允许溶菌酶接近而分解存在于周质中的肽聚糖基质。这允许释放更大量的周质蛋白，如α-淀粉酶。即使这种方法在小规模实验室实验期间导致增加的周质释放，但是当在工业上规模化以更大体积使用时，它已被证明是昂贵的方法。

因此，仍然需要开发有效而廉价的方法以释放革兰氏阴性菌的周质内含物。

本发明的发明人决定开发一种新的周质蛋白释放方法以实现提取靶向周质的治疗蛋白的更有效方式。他们已惊人地发现，苯乙烯马来酸(SMA)共聚物可以特异地破坏细菌细胞的外膜从而释放周质的内含物，同时不破坏内膜，由此避免来自细胞质的污染蛋白在蛋白样品中存在。

因此，本发明的第一方面提供一种用于释放细菌细胞的周质间隙的内含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液中温育细菌细胞。

本发明的发明人决定研究苯乙烯马来酸(SMA)是否可以用来从细胞提取周质蛋白。他们已惊人地发现，SMA特异地破坏细菌细胞的外膜但不破坏内膜。因此，SMA可以用来选择性地提取周质蛋白同时不释放来自细胞质的污染蛋白。所述提取方法易于进行并且可以易于规模化至大规模生物加工过程。所述方法显著地降低了涉及的成本，因为在下游加工中有较少的纯化步骤。

虽然SMA之前已被用来分离和保存跨膜蛋白，以及用于递送治疗剂，但是直至本发明，还没有公开或启示SMA可以用来释放周质间隙的内含物。

实践中，本发明的方法可以易于用来选择性地将周质间隙的内含物释放到溶液中。周质间隙的具体组分，例如用于工业用途的重组蛋白，然后可以易于从所述溶液分离。因此，本发明具有明显有益的和工业的应用。

本发明第一方面的方法包括在含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液中温育细菌细胞。

细菌物种通常可以分成“革兰氏阳性”和“革兰氏阴性”物种，区别具体地可归因于取决于其细菌细胞壁的结构差异的特定染料的保持。

可以用于所述方法的细菌细胞可以是任何合适的细胞。优选地，所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌物种，优选是大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp.)或克雷伯氏菌属物种(Klebsiella sp.)。这样的细菌物种在本领域是熟知的。这些物种的细菌细胞可以易于获得，例如从商业供应商或生物学材料保藏中心如ATCC(http://www.lgcstandards-atcc.org/)。

如本领域熟知的，也已制备了这样的革兰氏阴性细菌物种的突变衍生物，其提高了产生的蛋白的量的质量和/或数量。它们因此也被认为是因此可以用于本发明的此方面的细菌细胞的实例。

制备用于本发明方法中的细菌细胞的方法在本领域是熟知的。如下面进一步概述的，在一些情形中，细菌细胞将含有重组多肽。在培养基中以足够时间并且在合适条件下培养上述这样的细胞以获得所述重组多肽的表达的方法在本领域是熟知的。本文在所附实施例部分中提供了一种这样的方法的一个实例。

本发明的第一方面的方法使用含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液。

在一些实施方案中，提供苯乙烯和马来酸的共聚物包括提供苯乙烯和马来酸酐的共聚物，和将所述马来酸酐水解为马来酸。苯乙烯和马来酸酐的共聚物以商品名

2000和

3000可获自Sartomer CompanyInc.,Exton PA,USA。合适的水解方法在本领域中是已知的。

作为实例，可以使用以下方案来制备可以用于本发明第一方面的方法中的SMA的溶液。

将SMA2000P(获自Sartomer)和1M氢氧化钠(10%w/v)的溶液在室温在磁力搅拌子上在圆底烧瓶中温和地混合过夜(25g的SMA2000P溶解在250ml的NaOH中)。然后向圆底烧瓶中加入几个抗爆沸颗粒，然后将圆底烧瓶置于连接有冷凝器的加热套上。允许SMA/NaOH溶液到达沸点。在沸腾后，关闭加热并且允许该溶液回流2小时，然后转移到冷室达2天。这些过程在通风橱中进行。在这个冷却期之后，测量体积并计算SMA的百分比含量，然后等分到50ml falcon管中并储存在-70℃。

当使用时，优选地，所述溶液含有50mM TRIS pH8.0、0.5M NaCl。

在一些实施方案中，提供其中苯乙烯:马来酸比为0.5:1至10:1的苯乙烯和马来酸的共聚物，包括提供其中苯乙烯:马来酸比为1:1至5:1的苯乙烯和马来酸的共聚物。在一些其他实施方案中，苯乙烯:马来酸比为1.5:1至4:1，或2:1至3:1。

应理解，由于聚合过程的特性，这样的单体比是大量平均值，并且不作为对具有指定的单体排布的特定分子结构的描述。然而，一般地预期单体类型遍布所述共聚物。

在一些实施方案中，提供苯乙烯和马来酸的共聚物包括提供分子量为3000Da至120000Da的苯乙烯和马来酸的共聚物。在一些其他实施方案中，所述共聚物的分子量为5000Da至15000Da。在一些其他实施方案中，所述共聚物的分子量为7000至10000Da。

本发明的发明人已研究了可以用来释放周质间隙内含物的SMA的浓度范围。他们已经证实，SMA在溶液中的至少约0.5-4.5%的范围可以成功地用于该目的。在一个实施方案中，SMA的浓度为约0.5%-10%、1%-7%或1.5%-5%。在另一个实施方案中，SMA的浓度为约2-2.5%。

本发明的发明人已研究了SMA对释放周质间隙内含物的时间影响。他们已证实，至少约15分钟至6小时温育时间范围可以成功用于该目的。优选地，温育时间为约2小时。同样，优选地，所述细菌细胞在约37℃用SMA温育。

相应地，因此根据本文中提供的信息，本发明第一方面的一个优选实施方案是其中所述方法包括以下步骤：(i)制备细菌细胞的群；(ii)将所述细菌细胞悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5%；和(ii)将所述细菌细胞在约37℃在所述溶液中温育约2小时。

本发明的发明人还注意到，在具有SMA的溶液中EDTA(1mM)的存在导致从周质间隙释放的材料的显著减少。因此，本发明方法的一个优选实施方案是其中所述溶液基本上不含有EDTA。

本发明的发明人还研究了渗透压休克对周质间隙的内含物的释放效率的作用。如在所附实施例中显示的，使用渗透压休克引起从周质间隙释放的材料增多。因此本发明的方法的一个优选实施方案是其中所述方法包括将细胞暴露于渗透压休克。优选地，渗透压休克在细胞用SMA溶液温育后进行。

本发明的方法可以用来释放周质间隙的内含物。周质的组成可以包括寡糖、氨基酸、肽和各种小分子。本发明的方法的操作者可以使用上述方法来从细胞释放这些组分，其随后可以使用本领域熟知的方法从所述溶液进一步纯化。

在本发明的一个优选实施方案中，细菌细胞表达靶向周质的重组多肽。将重组多肽引向周质的方法在本领域是熟知的。相应地，因此本发明的方法可以用作大规模生物加工过程的一部分以选择性地将周质的内含物(包括这样的重组多肽)释放到溶液中用于后续纯化。

因此本发明的另一个实施方案是其中所述方法还包括从所述溶液回收周质间隙的一种组分的至少一部分。本发明的另一个实施方案是其中周质间隙含有重组多肽。本发明的另一个实施方案是其中所述方法还包括从所述溶液回收重组多肽的至少一部分。

重组多肽可以使用本领域已知的标准技术容易地从溶液分离，包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱法，磷酸纤维素色谱法，疏水相互作用色谱法，亲和色谱法，羟磷灰石色谱法和凝集素色谱法。

在需要分离已被遗传改造以包含纯化标签(如多个组氨酸残基，或谷胱甘肽S-转移酶)的具体重组多肽的情况中，这样的多肽可以通过适于所使用的特定纯化标签的任何方法进行纯化，如例如亲和色谱法。也可以使用本领域中熟知的其他蛋白纯化技术，如本领域技术人员容易理解的。

本发明的另一方面提供一种制备重组多肽的基本上纯的样品的方法，所述方法包括：(i)制备包含所述重组多肽的细菌细胞的群；(ii)将所述细菌细胞悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5%；和(ii)在约37℃将所述细菌细胞在所述溶液中温育约2小时；(iv)从所述溶液回收所述重组多肽。

为了避免怀疑，本发明第一方面的实施方案还应用于本发明此方面的方法。

因此作为实例，以下方案可以用作本发明的方法一个实施方案。

细菌细胞的群在适当培养条件下生长。如果所述细菌细胞合成重组的靶向周质的多肽，则所述培养条件是这样的以促进这样的多肽的表达和积累。所述细胞然后使用实验室方法(例如离心)收获并悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5%。细胞悬浮液在约37℃温育2小时。然后使用标准实验室方法(例如离心)将所述细胞从所述溶液除去。所得的溶液含有周质间隙的内含物。然后可以使用例如本领域已知的亲和纯化手段分离周质间隙的具体组分。

本发明的另一方面提供苯乙烯马来酸共聚物(SMA)用于释放周质间隙的内含物的用途。

本发明的另一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括：(i)含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液；和(ii)操作手册。优选地，所述试剂盒还包括一种或多种另外的部件，所述一种或多种另外的部件包括蛋白质纯化柱或树脂。

所述操作手册可以包括涉及例如如本文提供的优选的温育条件和反应程序的信息，以及根据需要的其他这样的信息。

本发明现在将参考以下的非限制性附图和实施例进行描述。

附图说明

图1：革兰氏阴性细菌的细胞壁结构

图2：苯乙烯马来酸(SMA)

图3：通过SMA形成脂质纳米盘(nanodisk)以保存和分离跨膜蛋白。

图4：各种条件对α-淀粉酶的周质释放的影响。

图5：自大肠杆菌细菌细胞的多种周质释放方法的效率。

图6：延长的37℃温育时间对通过SMA的α-淀粉酶的周质释放的影响。

图7：更长的温育时间对通过SMA的α-淀粉酶的周质释放的影响。

图8：自大肠杆菌的多种SMA周质释放方法的效率。

图9：增大的SMA脂质聚合物浓度对α-淀粉酶从周质释放的影响。

图10：变化的SMA脂质聚合物浓度对α-淀粉酶从周质释放的影响。

图11：自大肠杆菌的多种SMA周质释放方法的效率。

图12：温度变化对最佳TSLE释放方法的作用模式的影响。

图13：渗透压休克对多种周质释放方法的影响。

图14：EDTA对周质α-淀粉酶释放的各种处理的影响。

图15：检测β-半乳糖苷酶在这些大肠杆菌细胞中的存在的初始测定。

图16：各种条件对β-半乳糖苷酶的释放的影响。

图17：多种条件对从大肠杆菌细胞提取β-半乳糖苷酶的影响。

图18：牛血清清蛋白(BSA)样品的稀释系列的线性相应。

图19：显示大肠杆菌细胞的各种周质级分的SDS-PAGE凝胶。

图20：显示大肠杆菌细胞的各种周质级分的SDS-PAGE凝胶。

图21：提出的TSLE和SMA对大肠杆菌细菌细胞的作用模式。

图22：FAB片段从大肠杆菌的周质的释放：(A)显示从用SMA处理的细胞释放的FAB片段的蛋白质印迹结果。(B)显示从使用渗透压休克处理的细胞释放的FAB片段的蛋白质印迹结果。(C)从使用渗透压休克处理的细胞释放的总蛋白的SDS PAGE。(D)从用SMA处理的细胞释放的总蛋白的SDS PAGE。

实施例1：SMA选择性地从周质释放蛋白的用途

概要

最近的发现，即苯乙烯马来酸(SMA)共聚物可以形成脂质/聚合物组装件('脂质纳米盘')以便分离和保存跨膜蛋白，在生物学的这个领域具有巨大突破。因此包括圆二色谱在内的技术已被用来表征这些跨膜蛋白以用于结构和功能分析(Knowles等，2009)。

数十年来，一直需要有效且廉价的处理以选择性地从大肠杆菌细菌细胞的周质间隙释放蛋白，所述处理可以在大型生物加工工业中规模化(细胞壁的结构参见图1)。在本研究期间，本发明的发明人使用SMA共聚物作为用于释放基于周质的治疗蛋白的方法。这种测定可以通过研究各种因素对蛋白释放效率的影响来开发；如改变SMA浓度，使温育时间不同，渗透压休克和添加EDTA。在所有实验中使用阳性对照–通过将这种新方法与使用Tris/蔗糖/溶菌酶/EDTA(TSLE)的最佳释放方法进行比较。周质蛋白释放的这种新方法使用三种生化测定(α-淀粉酶、β-半乳糖苷酶和BCA总蛋白测定)开发。

本发明的发明人发现，SMA共聚物可以有效且选择性地从大肠杆菌细胞的周质释放蛋白。他们发现，使用这种共聚物温育这些细胞的理想条件是浓度为2-2.5%(在37℃持续2小时)。因此这些新处理具有被规模化至大规模生物加工工业的巨大潜力。这将显著降低所涉及的成本-因为SMA相对廉价，并且在下游加工中需要更少的纯化步骤。

引言

本发明的发明人决定开发一种新的周质蛋白释放方法以实现提取靶向周质的治疗蛋白的更有效方式。最广泛使用的周质释放方法使用Tris/蔗糖/溶菌酶/EDTA(TSLE)缓冲液，并且因此在实验中被用作对照。使用这种TSLE释放方法，高比例的蛋白可以从周质释放，但这种方法极难规模化用于大规模工业过程，原因在于溶菌酶的量和成本。

近来的发现，即被称为SMA(苯乙烯马来酸；图2)的聚合物能够结合至脂质颗粒以形成SMA/脂质颗粒(SMALP)在跨膜蛋白研究中是一个巨大突破(Knowles等，2009；图3)。

因此本发明的发明人决定研究SMA共聚物是否可以特异地破坏大肠杆菌细胞的外膜以选择性地提取周质蛋白同时不释放来自细胞质的污染蛋白。

方法和材料

用来确定总蛋白浓度的BCA(二喹啉甲酸)测定

这种测定基于成紫色的BCA-Cu⁺反应复合物的比色检测(在562nm)以确定样品中的蛋白总量。这种方案结合了在碱性介质中蛋白还原铜离子(Cu²⁺-->Cu⁺)(称为双缩脲反应)与单个Cu⁺离子能够与两个BCA分子螯合从而形成紫色反应复合物的能力。

这种反应复合物在562nm处具有强吸收，其随牛血清清蛋白(BSA)浓度的增大而以线性方式增加。

10%SMA2000P的制备

将SMA2000P(获自Sartomer)和1M氢氧化钠(10%w/v)的溶液在室温下在磁力搅拌子上在圆底烧瓶中轻轻地混合过夜(25g的SMA2000P溶解在250ml的NaOH中)。然后向圆底烧瓶中加入几个抗爆沸颗粒，然后将该圆底烧瓶置于连接有冷凝器的加热套上。使SMA/NaOH溶液达到沸点。在沸腾后，关闭加热并使溶液回流2小时，然后转移到冷室达2天。这些过程在通风橱中进行。在此冷却期后测量体积并计算SMA的百分比含量，然后等分到50ml falcon管中并储存在-70℃。

α-淀粉酶126培养物的制备

使用的大肠杆菌株是含有质粒pQR126的K12细菌株JM107。细胞在含有1%淀粉(w/v)和20μg/ml卡那霉素的营养琼脂板生长过夜。使用无菌技术，将来自此营养琼脂板的单个菌落接种到含有补加有20μg/ml卡那霉素的50ml的“Terrific Broth”(TB)的锥形烧瓶中，并在37℃在旋转式摇床温育箱中接种过夜。

细胞分级

将此进一步的过夜培养物分成在50ml Falcon管中的十个40ml等分式样。随后使用Beckman-Coulter GS-6R离心机将这些falcon管在4℃离心(3750rpm)10分钟，然后抛弃上清(胞外级分)。细胞沉淀(pellet)使用50mM Tris缓冲液(pH7.5)洗涤并在4℃再离心10分钟(3750rpm)，然后再除去上清。

从大肠杆菌细胞的周质级分提取α-淀粉酶

将这些细胞的单个沉淀充分重悬在8ml的Tris50mM(pH7.5)中并分布到在1.5ml Eppendorf管中的八个1ml等分式样中。然后以14,000rpm使用小型台式离心机(Spectrafuge^TM16M)在室温下将这些管离心5分钟。然后除去上清，留下沉淀。使用各种提取方法使周质级分从大肠杆菌细胞释放。

溶菌酶/EDTA处理

周质释放的传统方法使用溶菌酶/EDTA实现。将单个细胞沉淀重悬在含有50mM Tris(pH7.5)、20%蔗糖、EDTA(1mM)和溶菌酶(500μg/ml)的1ml缓冲液中。这随后称为T/S/L/E缓冲液。然后将此在室温温育15分钟，接着通过在室温以14,000rpm的速度离心5分钟收集细胞。将上清(周质级分)倾析到单独的1.5ml Eppendorf管中。

在一些实验中，获得另外的“冷水洗涤级分”。这通过用1ml冰冷的去离子水(4℃)洗涤来自Eppendorf管的剩余的细胞沉淀实现。然后通过在室温离心5分钟收集细胞(14,000rpm)，然后将上清(冷水洗涤级分)倾析到单独的1.5ml Eppendorf管中。

溶菌酶处理

将单个细胞沉淀重悬在含有50mM Tris(pH7.5)、20%蔗糖和溶菌酶(500μg/ml)的1ml的缓冲液混合物中，然后在室温搅拌15分钟。然后通过在室温离心5分钟(14,000rpm)收集细胞，接着将上清(周质级分)倾析到单独的1.5ml Eppendorf管中。

Tris/NaCl处理

将单个细胞沉淀重悬在含有50mM Tris(pH8.0)/0.5M NaCl的1ml的缓冲液中，然后在37℃温育特定长度的时间(2小时或6小时)。在温育后，通过在室温离心5分钟(14,000rpm)收集细胞，然后将上清(周质级分)倾析到单独的1.5ml Eppendorf管中。

苯乙烯马来酸(SMA)处理

通过使用各种浓度的苯乙烯马来酸(SMA)的处理也用来提取大肠杆菌细胞的周质内含物。将多个个体细胞沉淀重悬在含有不同浓度的SMA(在50mM Tris pH8.0/0.5M NaCl中)的缓冲液中，然后在室温或在37℃温育不同长度的时间。在温育后，通过在室温离心5分钟(14,000rpm)收集细胞，然后将上清(周质级分)倾析到单独的1.5ml Eppendorf管中。

溶菌酶/EDTA或SMA处理，继之以渗透压休克

将细胞充分重悬在750μl的T/S/L/E缓冲液(如前所述)或750μl的SMA(在50mM Tris pH8.0/0.5M NaCl中)中。将细胞悬浮液与这些缓冲液中的任一种在室温静止地温育15分钟。在此时间后，加入等体积的冷水。将这种进一步的细胞悬浮液温育特定时间(取决于特定情形)，然后通过以14,000rpm离心5分钟回收周质级分。

从α-淀粉酶周质级分制备样品用于分析超速离心(AUC)

在AUC实验中需要使用三种单独的α-淀粉酶周质级分(TSLE，2.5%SMA和50mM Tris/0.5M NaCl)。T/S/L/Eα-淀粉酶级分使用12-14kDa透析膜进行透析。而SMA和Tris/NaClα-淀粉酶级分使用3.5kDa透析膜进行透析。所有这些级分在含有50mM Tris pH8.0/500mM NaCl的缓冲液中透析以获得高纯的样品而不存在污染物。随后使用分析超速离心对这些样品进行分析。

确定由细菌细胞的周质间隙释放的α-淀粉酶的量的测定

使用100μl溶解在50ml碘化钾(2%w/v)中的碘储液组成用于所述测定所需的终止溶液。

α-淀粉酶的活性通过使用以下测定确定，其中酶活性通过测量淀粉/碘复合物(2.2%I₂/4.4%KI)的吸光度值的降低计算。

周质级分的稀释液以1:10的比(100μl样品加上900μl Tris200mM pH7.5)制备，并且将150μl的各种稀释的周质级分放入96孔板的单独的孔中并在50℃预温育。在测定开始时，以交错的时间间隔使用多通道吸液管，将150μl的预温育(50℃)的淀粉溶液(0.5%w/v)添加到适当孔中。允许该反应在50℃发生3分钟。

在3分钟后，将15μl各种反应混合物添加到不同96孔板上的适当孔中，所述孔含有300μl的终止溶液(I₂/KI)。在添加各种周质级分的反应混合物之后，在Molecular Devices^TM E-max Precision读板器上在590nm测量吸光度。对于各个级分，一式两份或一式三份地进行这些反应中的每一个以获得多组数据。

然后α-淀粉酶活性的效率能够通过测量淀粉/碘复合物的吸光度值的降低进行计算。

周质级分的SDS-PAGE

将周质级分(20μl)与5μl的蛋白上样染料合并，然后上样到SDS-PAGE凝胶上的孔中。将凝胶在100V下运行约一小时，直至蛋白标记物已到达所述凝胶的末端。所述凝胶随后使用Instant Blue^TM(考马斯蓝(Coomassie Blue))染色并置于振荡器上直至大量蛋白条带变得可见。在此染色过程之后，除去Instant Blue^TM染色并通过使用去离子水脱色过夜。然后相对预染的蛋白标记物分析凝胶上存在的蛋白条带以确定存在的蛋白的大小。

用于β-半乳糖苷酶测量的培养物的生长

此测定中使用的大肠杆菌株是含有质粒pACYCΔHN的M182细菌株MALX400。这些细胞在含有四环素和氯霉素的营养琼脂板上生长过夜。

利用无菌技术，使用无菌环将来自此营养琼脂板的单个菌落接种到含有补充了10μg/ml氯霉素和35μg/ml四环素的10ml LB的烧瓶中，并在37℃在振荡水浴中温育过夜。在温育后，用200μl的过夜预培养物接种另一个容纳有10ml LB(有四环素和氯霉素)的锥形烧瓶并在37℃水浴中振荡2-3小时。这持续直至在650nm的光密度(OD_650nm)为0.3至0.5，这时将培养物储存在冰上。

为了使细胞可渗透，将50μl的甲苯和1%脱氧胆酸钠加入到所述培养物中并通过用封口膜(parafilm)覆盖烧瓶的颈部简短地混合。然后将该培养物在37℃在振荡水浴中通气以使甲苯蒸发。将溶菌产物储存在冰桶中直至实验使用所需。

用于β-gal测定的Z-缓冲液、ONPG和Na ₂ CO ₃ 的制备

用于β-半乳糖苷酶测定的Z-缓冲液使用0.06M Na₂HPO₄、0.04MNaH₂PO₄、0.01M氯化钾(KCl)、0.01M MgSO₄和0.05Mβ-巯基乙醇(其在实验当天添加)制备。

ONPG溶液需要制备成浓度为4mg/ml。这通过将80mg的冻干ONPG粉末添加到20ml的Z-缓冲液中实现。碳酸钠(“终止试剂”)也需要制备成终浓度为1M。

将Z-缓冲液(1.9ml)量入到所需数量的试管中，包括用于对照实验的试管。细胞裂解物的等分式样(100μl)添加到用于β-半乳糖苷酶测量的试管中，而将100μl的Z-缓冲液添加到对照管中。

β-gal管：

1.9ml Z-缓冲液+0.1ml细胞裂解物→0.5ml ONPG→1ml Na₂CO₃

对照I(无细胞裂解物)：

-2ml Z-缓冲液→0.5ml ONPG→1ml Na₂CO₃

对照ii(没有ONPG)：

-1.9ml Z-缓冲液+0.1ml细胞裂解物→0.5ml Z-缓冲液→1ml Na₂CO₃。

通过添加0.5ml邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)开始反应并允许分别进行0、5、10和20分钟。在这些具体时间后，使用1ml的1M Na₂CO₃终止反应，然后记录在420nm的光密度(OD_420nm)。对于在0分钟的测试β-gal活性的试管，加入碳酸钠，然后加入ONPG。然后，在适当的时间，对于培养物，计算每个试管的β-半乳糖苷酶活性。

在这些试管测定期间，使用Cecil Instruments^TM CE-272Linear ReadoutUltraviolet Spectrophotometer(线性读出紫外分光光度计)测量吸光度。

使β-gal测定适合96-孔板

对于另一组的实验，依照相同的基本方案，但将溶液的体积按比例缩小十倍以将反应混合物装入到96孔板中。因此对样品，将190μl的Z-缓冲液添加到所述板的特定孔中–添加含有细胞或细胞级分的10μl的β-半乳糖苷酶。

为了反应开始，将50μl的ONPG(邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷)添加到特定孔中，并且允许反应进行0、5和20分钟。通过添加100μl的1M碳酸钠(Na₂CO₃)溶液终止反应，并使用读板器测量在450nm的光密度(OD₄₅₀)。

在这组实验期间，进行大量对照实验。使用容纳有1ml的已使用5μl甲苯和5μl脱氧胆酸钠渗透化的β-半乳糖苷酶细胞的Eppendorf管(添加或未添加ONPG)进行阳性和阴性对照。而在不一起使用细胞裂解物/级分下进行另外的阴性对照试验。含有目的酶(β-半乳糖苷酶)的细胞级分使用如对于α-淀粉酶测定(前面描述)所述的相同方法进行提取。

在96孔板中进行二喹啉甲酸(BCA)测定以检测总蛋白的量

BCA工作试剂通过混合50份的BCA试剂A与1份的BCA试剂B制备。在这种测定的情况下，将9.8ml的试剂A与0.2ml的试剂B混合。这种工作试剂然后可以储存在室温并且可以稳定达一天。

使用96-孔微测定板，将10μl的各标准物或样品(周质级分)添加到所述板中的适当孔中。向该体积的标准物或样品添加200μl的工作试剂。另外，使用10μl的适当缓冲液，在板中的适当孔中制备一组空白溶液，利用200μl的工作试剂制备。所述板在振荡器上混合30秒，然后在37℃温育30分钟。然后使用读板器在570nm测量吸光度。然后将空白在570nm的平均吸光度从各个标准物或未知样品中的每一个的平均吸光度减去，以生成BSA标准曲线。根据该BSA标准曲线，可以确定各个特定周质级分的蛋白浓度。

结果

不同条件对自大肠杆菌细胞的周质α-淀粉酶释放的影响

为了从大肠杆菌细胞(含有质粒pQR126的K12细菌株JM107)的周质提取α-淀粉酶，进行初始α-淀粉酶测定以研究不同条件对这种酶的释放的影响。

在此初始测定中，个体α-淀粉酶沉淀用多种缓冲液处理以提取大肠杆菌的周质内含物。这些不同周质释放方法包括使用Tris/蔗糖/溶菌酶(TSL)缓冲液、Tris/蔗糖/溶菌酶/EDTA(TSLE)缓冲液、2.5%苯乙烯马来酸(SMA)聚合物缓冲液(在各种温度和温育时间下)和Tris/NaCl缓冲液。

如所预期的，用TSLE缓冲液处理α-淀粉酶126沉淀得到α-淀粉酶的最高提取(80.5%)，但当用苯乙烯马来酸聚合物(浓度为2.5%)处理其他个体α-淀粉酶126沉淀时，有一些有希望的结果。而且相比于TSL周质释放法，TSLE缓冲液导致自大肠杆菌细胞的α-淀粉酶的释放多35%(80.5%，相比于45.7%)。这因此表明，EDTA对溶菌酶的作用模式具有刺激作用。

对于周质蛋白释放，当α-淀粉酶126细胞用2.5%SMA聚合物在37℃处理2小时时，这些条件最显著，这得到这种酶的68%提取(图4)。因此，相比于使用TSLE的最佳释放方法(100%)，这种SMA周质释放法为84.5%有效(图5)。在这些初始结果之后，需要尝试并开发改良的测定以测试变化的条件对这些大肠杆菌细胞的SMA处理的影响。

对α-淀粉酶测定图的误差棒(error bar)的解释

对于此研究期间进行的这些测定中的每一个，一式两份或一式三份地进行反应以获得多组数据。因此，图形棒柱表示每种周质蛋白释放方法的自周质提取的α-淀粉酶的平均百分比(%)。

由于这些多组数据所致，在每个图中需要包括误差棒。因此，对于每个图形棒柱，上误差棒表示每种周质蛋白释放方法的自周质的α-淀粉酶的最大提取，而下误差棒表示每种周质蛋白释放方法的自周质的α-淀粉酶的最小提取。

周质α-淀粉酶提取随着37℃温育期的增加而增加

在此初始结果之后，需要开发α-淀粉酶测定以证实37℃温育对通过SMA共聚物的α-淀粉酶的周质提取的时间影响。在单独的测定中，这些大肠杆菌细胞因此在37℃暴露于宽范围的不同温育时间。

这些测定的结果(图6)首次显示在15分钟(13.8%)至2小时(67.2%)之间提取自这些细胞的周质的α-淀粉酶的量的巨大地显著的时间增加(～5倍)。此结果表明给予SMA脂质聚合物更长的作用时间一定增大从大肠杆菌细菌细胞的周质提取α-淀粉酶的可能性。

需要开发这种测定以进一步测试用SMA温育更长时间(2小时至6小时)(在37℃)对自大肠杆菌细菌细胞的周质α-淀粉酶提取的影响。此测定的结果(图7)显示在这些时间期之间这种酶的释放仅有可忽略的增加(78.7%至82.3%)。

需要组合来自这两个单独的时间过程测定的结果以测量各种周质蛋白释放方法的效率(图8)。因此，这些结果显示用2.5%SMA温育这些大肠杆菌细胞达2小时(在37℃)产生最有希望的结果，相比于最佳TSLE释放方法(100%)，产生的α-淀粉酶的周质释放为90.9%有效。

周质α-淀粉酶提取随着苯乙烯马来酸(SMA)的浓度增加而降低

需要进一步开发这种测定以测试不同浓度的SMA(0.5%至4.5%)对从大肠杆菌细胞的周质提取α-淀粉酶的影响。为了保持一个常数，对这些SMA浓度中的每一个，温育时间保持在2小时(在37℃)。

利用不同浓度的SMA进行大量单独的测定。这些α-淀粉酶测定(图9)首次显示在2%至4.5%SMA之间周质α-淀粉酶提取的显著降低(64.3%至29.3%)。进一步开发这种测定以研究当用浓度为0.5%至2.5%的SMA处理时自大肠杆菌细胞的周质的α-淀粉酶的提取。该测定的结果(图10)显示提取自这些大肠杆菌细胞的α-淀粉酶的量显著增大(59.7%至81.6%)。

需要合并来自这两个单独测定的结果以测量这些不同周质释放方法的效率(图11)。当这用2%至2.5%SMA进行时，在从周质释放α-淀粉酶方面，相比于最佳释放方法(TSLE缓冲液)，产生几乎相同的结果。该结果表明，SMA脂质聚合物产生α-淀粉酶从周质的极好释放。

温度对周质α-淀粉酶释放的TSLE方法没有影响

建立新测定以研究温度对大肠杆菌细胞的TSLE处理的影响。将最佳TSLE释放方法(在室温温育15分钟)与在4℃的α-淀粉酶126细胞的单独的沉淀的类似长度的温育进行比较(图12)。当在其各自的α-淀粉酶释放方面对这两个温度进行比较时，没有实际差异(100%对99.5%)。

“冷水洗涤”对周质蛋白释放的影响

当用冰冷水洗涤之前的沉淀时获得“冷水洗涤级分”(之前在方法中描述的)。从这些级分获得的结果显示，相比于最佳TSLE周质释放方法，α-淀粉酶释放显著降低(图12)，产生α-淀粉酶的17.3%释放(在室温)或5.4%(在4℃)释放。该结果表明，制备自这些条件的大部分α-淀粉酶被释放在“周质级分”中。

渗透压休克对周质α-淀粉酶释放的效率的影响

进行进一步的测定以测试添加适当体积的冰冷水对从大肠杆菌细胞的周质提取α-淀粉酶的影响。对于该测定，结合用于周质蛋白释放的TSLE、2%SMA和2.5%SMA处理进行此渗透压休克程序(参见方法)(图13)。该测定的结果显示，渗透压休克对T/S/L/E处理从细胞释放α-淀粉酶的效率几乎没有影响(100%至99.3%效率)。但是当结合两种SMA处理使用渗透压休克时释放的α-淀粉酶的量有轻微增加；2%(85.9%至92.6%)和2.5%SMA(75.8%至88.4%)。

EDTA对各种周质蛋白释放方法的影响

EDTA对溶菌酶作用的影响在之前已证明(图4)，并且发现其对从大肠杆菌细胞的周质释放的α-淀粉酶的量具有刺激作用。因此，需要判断EDTA是否对SMA脂质颗粒(SMALP)从大肠杆菌的周质间隙释放α-淀粉酶的能力具有任何影响。

当相同浓度的EDTA(1mM)添加到使用不同设置的温育条件的2%SMA缓冲液时，显示从这些大肠杆菌细胞的周质释放的α-淀粉酶的量显著降低。例如，当使用2%SMA缓冲液在37℃研究从大肠杆菌细胞释放周质α-淀粉酶达2小时(添加或不添加EDTA)时，从周质间隙释放的α-淀粉酶的量有显著降低(图19)。相比于TSLE最佳释放方法(100%)，α-淀粉酶的量从79.5%降低至4.2%。

不同条件对β-半乳糖苷酶从大肠杆菌细胞释放的影响

构建初始试管测定以显示在这些大肠杆菌细胞中存在β-半乳糖苷酶。这通过使用甲苯和脱氧胆酸钠使细胞渗透化而实现。在ONPG存在下，在20分钟时间期内(在420nm的光密度)，吸光度改变了0.53(从0.05至0.58)，因此表明β-半乳糖苷酶的显著释放。而在没有ONPG存在下，在类似时间期内(在相同光密度)，吸光度没有变化。在这种情况下，释放的β-半乳糖苷酶不能发挥其作用，因为ONPG(无色)不能转化为ONP(黄色)。在另一个阴性对照实验中，利用Z-缓冲液在ONPG存在下，吸光度还是没有变化(在420nm)。这是因为不存在含有这种酶的细胞。对于这些β-半乳糖苷酶测定中的每一个，吸光度的变化表示这种酶的活性增加(图15)。

为了研究不同处理和条件对细胞质酶β-半乳糖苷酶从大肠杆菌细胞(含有质粒pACYCΔHN的M182细菌株MALX400)释放的影响，在96-孔板中进行若干不同测定。

在这些测定的第一个中，细胞用TSLE缓冲液、2%SMA缓冲液和2.5%SMA缓冲液处理(图16)。这些细胞还可以用甲苯和脱氧胆酸钠渗透化以释放β-半乳糖苷酶作为阳性对照。该测定的结果对于TSLE处理以及对于渗透化的细胞(在ONPG存在下)显示阳性结果(β-半乳糖苷酶释放)。而当这些细胞用SMA聚合物处理时没有或有最少的β-半乳糖苷酶释放。阴性对照实验在存在β-半乳糖苷酶(渗透化细胞)而不存在ONPG的情况下进行。因此在不存在该β-gal底物的情况下，没有检测到吸光度(在450nm)的变化。

这些结果显示TSLE处理能够从大肠杆菌的细胞质提取β-半乳糖苷酶，而通过SMA处理释放显示的阴性结果表明，SMA脂质颗粒(SMALP)不释放任何这种细胞质酶。

在随后的测定中，为了检测β-半乳糖苷酶的释放，使用Tris/NaCl缓冲液释放大肠杆菌细胞的周质内含物(图17)。这种特定缓冲液同样不导致β-半乳糖苷酶的释放，这又一次表明，细胞质膜必需保持完整。

“冷水洗涤”对β-半乳糖苷酶的释放的影响

使用从β-半乳糖苷酶细胞获得“冷水洗涤级分”的程序(之前描述的方法)以检测这种酶的释放。来自该处理的结果显示没有β-半乳糖苷酶释放在“冷水洗涤级分”(cwf)中。这表明所有的β-gal被释放在“周质级分”中(图17)。

使用二喹啉甲酸(BCA)测定来检测在周质和冷水洗涤级分中存在的总蛋白的量

使用此测定来检测在提取自大肠杆菌细胞的多种周质级分(pf)和冷水洗涤级分(cwf)中存在的蛋白的量和浓度。这些级分中每一个的净吸光度被作图于BSA标准曲线上以确定总蛋白浓度(图18)。

从大肠杆菌细胞(含有质粒pQR126的K12细菌株JM107)的周质级分检测到的总蛋白的最高量是通过使用周质蛋白释放的最佳TSLE方法，其产生0.3625的净吸光度(在570nm)，因此表明总蛋白浓度为～500μg/ml。该结果表明，TSLE缓冲液能够破坏外膜和细胞质膜以从周质间隙和细胞质二者释放更大量的蛋白。

当细胞用2.5%SMA[在50mM Tris(pH8.0)/0.5M NaCl中]处理以释放周质内含物时，存在0.112的较小的净吸光度，其表明更小量的总蛋白从细胞释放(～200μg/ml)。这同样表明之前的结果，因为蛋白仅从这些大肠杆菌细胞的周质而不是细胞质释放。而且，当细胞用Tris/NaCl缓冲液处理以释放周质内含物时，有更低的净吸光度0.0615(～100μg/ml)。这个结果表明使用这种方法释放的蛋白较少，这同样表明之前由α-淀粉酶测定显示的结果。使用来自这些方法的“冷水洗涤级分”不实际改变在570nm处的净吸光度。这显示使用这种方法释放的蛋白非常少或没有。

来自这种特定BCA总蛋白测定的结果对于获得自β-半乳糖苷酶大肠杆菌细胞(含有质粒pACYCΔHN的M182细菌株MALX400)的周质级分非常类似。唯一的差别来自使用最佳TSLE释放方法，这产生0.254的稍微较低的净吸光度，表明总蛋白的浓度为～400μg/ml。

这表明，使用最佳TSLE周质蛋白释放方法从这些大肠杆菌细胞释放的蛋白稍少–这是由以下事实所致：相比于其他细菌株，在这些细胞中存在更少的α-淀粉酶。最佳拟合的线指示已知的标准物或蛋白样品在570nm的线性净吸光度(在x轴和y轴的0处截取)。

运行SDS-PAGE凝胶以显示在大肠杆菌细胞的周质级分中存在多种蛋白。结果显示在图19中。

在第2道和第3道中在相同分子量(以kDa计)附近存在单独的条带。所述条带在第2道中更明显，因为这是单独的TSLE缓冲液，而第3道中的条带表示TSLE周质级分。该条带最有可能表示在缓冲液或周质级分中存在的溶菌酶。由于使用2.5%SMA周质释放处理所致，SMA聚合物在第5-9道中显示。这指示表示约7.5kDa的较小蛋白的条带。用于该SDS-PAGE凝胶的所有周质级分也用于α-淀粉酶测定并且针对预染的蛋白标记物运行(第1道)。

需要运行另外的SDS-PAGE凝胶以研究在大肠杆菌细胞的周质内含物的提取中使用的蛋白(图20)。

在所述凝胶的第1道(TSLE周质级分)中存在蛋白条带，这最可能表示溶菌酶蛋白。这与凝胶的第2道(2.5%SMA周质级分)形成对比，第2道显示表示约7.5kDa的较小蛋白(SMA脂质聚合物)的条带。

在第5道至第7道中发现与第2道大小类似的条带。这些道分别代表二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)盘(disk)、磷脂酰胆碱(PC)盘和2.5%SMA缓冲液。

在凝胶的第4道中，单独地跑了α-淀粉酶蛋白。这指示代表更大蛋白(～54kDa)的条带。这些周质级分/蛋白针对预染色的蛋白标记物运行(第8道)。

依据使用这三种生化测定方法从大肠杆菌细胞释放的不同蛋白的量进行项目的基本结果指南

注：在整个项目中，相比于最佳TSLE方法，SMA周质蛋白释放处理产生在～80-99.4%变化的α-淀粉酶释放。这种差异仅仅是由于在多种单独测定中使用这种处理所致。

检索表

(-)=表明没有特定蛋白的释放

(+)或(++)=表明特定蛋白的最小释放

(++++)=表明特定蛋白的极好的释放

(+++++)=表明特定蛋白的优异释放

讨论

Knowles等的最近研究已经打开了研究跨膜蛋白的全新路线。这是由于“由苯乙烯马来酸(SMA)共聚物的单分散脂质盘”的形成所致。这些脂质“纳米盘”(SMALP)的形成可以导致跨膜蛋白得到保护以被精确研究以进行生物物理学和结构分析，如核磁共振(NMR)谱学和圆二色(CD)谱学。

SMALP可以结合外膜并与其形成复合物的此发现已产生这样的理论，即这些脂质纳米盘可以被用作从多种其他膜室(即周质)分离和提取蛋白的可能手段。

迄今，就释放的蛋白的最大量来说，从革兰氏阴性菌(即大肠杆菌)提取蛋白的最佳方法联合使用溶菌酶和EDTA。

已知的是，溶菌酶靶向细菌细胞壁的肽聚糖组分。因此在革兰氏阳性菌(即芽孢杆菌(Bacillus)物种)中，溶菌酶可以容易地破坏该层。在革兰氏阴性菌如大肠杆菌中，存在的额外的外膜可以保护肽聚糖层免于外部环境。添加试剂如EDTA可以导致二价阳离子(Ca²⁺、Mg²⁺)的螯合，这引起外膜失去稳定–因此允许溶菌酶接近存在于周质间隙中的肽聚糖层，并且随后导致大量蛋白从“溶解的”细胞中释放。

通过溶菌酶/EDTA处理的大肠杆菌细菌细胞的周质蛋白释放同样不依赖于温度，因为该因素不会导致从周质间隙释放蛋白的显著变化。

在37℃用浓度为2.5%的SMA共聚物处理大肠杆菌细胞2小时产生有希望的结果–就自周质的蛋白释放而言(图1)。由于在大肠杆菌细胞的外膜中存在磷脂、脂多糖和脂蛋白，这些特定的SMA聚合物能够形成聚合物/脂质组装件–也被称为“脂质-纳米盘”(Knowles等，2009)。这些复合物的形成可以导致蛋白从周质释放。SMA共聚物形成脂质/聚合物组装件以释放周质蛋白的能力在多种条件下被测试–如不同的聚合物浓度(图6-8)、温度和测定的时间过程。

在37℃使用2.5%SMA聚合物来处理大肠杆菌细胞–持续时间的范围为15分钟至6小时，导致自周质的α-淀粉酶的释放的显著增加。由于SMA脂质聚合物(SMALP)在一定时间期内与外膜相互作用，这导致更大量的周质α-淀粉酶释放。该反应看起来几乎在2小时耗尽，因为之后仅释放极少量的α-淀粉酶。

因此用SMA共聚物处理大肠杆菌细胞6小时在生物加工工业将不是可行的选项，因为在37℃运行温育箱的成本增加，所以用2.5%SMA处理2小时就生物设计以释放靶向周质的治疗剂而言可能更经济。

使用0.5%至4.5%的各种浓度的SMA聚合物(在37℃持续2小时)，就从大肠杆菌细胞的周质释放的α-淀粉酶的量而言，产生不同的结果。该结果表明，随着SMA的浓度增加(2.5%至4.5%)，这将对SMA形成脂质/聚合物组装件以释放大肠杆菌细胞的周质的内含物的能力具有抑制作用。另一种可能性可以是，随着SMA的浓度增加至4.5%，这会导致周质α-淀粉酶的天然解折叠，这需要通过圆二色谱分析确认。因此周质环境会变得氧化性更低–使得蛋白不能形成其特征性的三级结构。而当SMA浓度增大(0.5%至2.5%)时，这产生增加的周质α-淀粉酶释放，这表明所述脂质/聚合物组装件复合物能够以增大的强度结合至外膜–刺激增多的α-淀粉酶释放。因此，使用苯乙烯马来酸(在2-2.5%)对于生物加工中的应用可能是最佳选择，因为这是从大肠杆菌细胞的周质获得蛋白的更经济的选项。

而且当SMA共聚物(在2%浓度)联合1mM EDTA使用时，这导致α-淀粉酶从周质的最少释放。这可以表明，EDTA破坏了SMA脂质颗粒(SMALP)在大肠杆菌的外膜上形成。不能形成脂质/聚合物组装件因此导致极少或没有周质蛋白释放。

在此研究期间，渗透压休克(发展自French等，1996)联合各种周质释放处理使用。添加水对释放α-淀粉酶的SMA方法具有轻微积极影响。这可以表明，经由渗透压休克的在外膜处的增加或更紧密的SMALP复合物的装配可以导致更稳定的周质蛋白释放机制。

在生物加工方法期间，如果靶向周质类治疗蛋白，则需要从周质选择性地除去蛋白–而不从细胞质释放污染物。细胞质酶β-半乳糖苷酶的释放使用相同的蛋白释放方法在新测定中进行测试。获得的结果在以下事实上非常有意思，即TSLE处理释放大比例的β-半乳糖苷酶，而SMA(在2和2.5%浓度)处理不释放任何这种酶。这表明，SMA聚合物仅在外膜处形成复合物并且不靶向内部的细胞质膜。在外膜处形成“脂质纳米盘”也可能是由于由这种膜显示的强负电荷所致。这种负电荷是由于存在脂多糖和脂蛋白所致。

因此，将来自较早测定的结果与这个令人震惊的结果结合；SMA处理能够产生α-淀粉酶从周质的极高释放同时没有来自任何细胞质蛋白的污染。这在生物加工工业中可以是非常重要的，因为在周质类治疗剂(生物药物)的生产中，在初始“细胞破坏”步骤中的纯蛋白的释放可以显著地降低的下游加工中涉及的进一步成本(Bracewell等，2009)。

通过TSLE处理的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶的高释放是由于这样的事实所致，即溶菌酶充当murimidase以破坏肽聚糖层中的特定键。之前的研究(Vollmer等，2004；Demchick和Koch，1996)已显示，肽聚糖层含有平均半径为2.06nm的孔隙。因此该尺寸的孔隙应能够允许质量为22-24kDa的球形蛋白透过。因此，溶菌酶(具有的分子量为14-15kDa)将能够容易地通过这些孔隙从而损坏细胞质膜。而且阴性染色的SMALP的电子显微镜研究(Knowles等，2009)已表明这些复合脂质/聚合物组装件的～11nm的平均直径。因此这些SMALP不能通过在肽聚糖层中存在的孔隙–所以它们可以选择性地靶向周质蛋白的释放。

使用TSLE“冷水洗涤级分”的α-淀粉酶和β-半乳糖苷酶的最少释放或没有释放指示在初始周质级分中存在的这些蛋白的量极高。因此表明该方法在释放最大量的该第一周质级分中的蛋白方面增加的效率。

从α-淀粉酶和β-半乳糖苷酶生化测定获得的结果通过使用BCA总蛋白测定确认。通过TSLE周质蛋白释放方法从大肠杆菌细胞释放的总蛋白的更高量表示高量的α-淀粉酶(自周质)和β-半乳糖苷酶(自细胞质)的释放。而通过SMA周质蛋白释放方法从大肠杆菌细胞释放的总蛋白量减少表示显示极高α-淀粉酶释放同时没有来自细胞质蛋白的污染的早期结果。

结论

总之，即使TSLE蛋白释放方法有时可以产生稍高量的α-淀粉酶，这可能被细胞质蛋白(即β-半乳糖苷酶)的释放污染–因此在大规模生物加工工业中，由于使用溶菌酶以及在下游加工中的后续纯化步骤的成本所致，这将是昂贵的选择。然而，使用苯乙烯马来酸(SMA)可以通过在外膜形成SMALP复合物而用来从周质间隙选择性地释放蛋白(图21)。因此在大规模生物加工工业中，由于苯乙烯马来酸聚合物的降低的成本和生产这种蛋白需要更少的纯化步骤的事实所致，这种方法将具有更佳的经济价值。

参考文献

French C.,Keshavarz-Moore E.,Ward JM.-'Development of a simplemethod for the recovery of recombinant proteins from the Escherichia coliperiplasm(用于从大肠杆菌周质回收重组蛋白的简单方法的开发)'-Enzy.Micro.Tech.1996;19;332-338.

Knowles TJ,Finka R,Smith C,Lin YP,Dafforn T,Overduin M.-'Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticlesbounded by styrene maleic acid copolymer(膜蛋白完整溶解在含有被苯乙烯马来酸共聚物结合的纳米颗粒的脂质中)'-J Am Chem Soc.2009Jun10;131(22):7484-5.

Vollmer W.,Holtje JV.(2004)-'The Architecture of the Murein(Peptidoglycan)in Gram-Negative Bacteria：Vertical Scaffold or HorizontalLayer(s)?(革兰氏阴性菌中的胞壁质(肽聚糖)的结构：垂直支架或水平层?)'-J.Bacteriol.186(18);5978-5987

Demchick,P.,and A.L.Koch.-'The permeability of the wall fabric ofEscherichia coli and Bacillus subtilis.(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的壁结构的渗透性)'-J.Bacteriol.178:768-773.

实施例2：使用SMA从大肠杆菌的周质释放FAB抗体片段

大肠杆菌用含有编码融合至周质输出序列的抗体片段(FAB片段)的基因的质粒进行转化。培养细胞并诱导基因表达。通过离心分离细胞然后将其在37℃重悬在含有增加量的SMA的缓冲溶液(例如50mMTrisHClpH7.4,150mMNaCl)中。在温育1小时后，通过离心从溶液分离原生质球并且收集上清(含有FAB片段)。释放的FAB片段的量使用用于FAB片段的抗体探针探测的蛋白质印迹进行评估。上清中的总蛋白使用SDSPAGE进行评估。

如图22所示，当表达FAB片段的细胞用2.5%SMA在37℃处理2小时时(A)释放的FAB片段的量与使用现有的渗透压休克方法(B)获得的量相当。使用SMA方法(D)释放的非-FAB片段蛋白的量显著低于使用渗透压休克(C)。

Claims

1.一种用于释放细菌细胞的周质间隙的内含物的方法，所述方法包括在含有苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液中温育所述细菌细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中苯乙烯:马来酸比为约1:2至10:1.

3.根据权利要求2所述的方法，其中苯乙烯:马来酸比为约2:1。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述SMA的浓度为约0.5-4.5%。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述SMA浓度为约2-2.5%。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞用所述SMA温育约15分钟至6小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细菌细胞用所述SMA温育约2小时。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞在约37℃用所述SMA温育。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌物种。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌物种是大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp.)或克雷伯氏菌属物种(Klebsiella sp.)。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)制备细菌细胞的群；(ii)将所述细菌细胞悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5%；和(ii)在约37℃在所述溶液中将所述细菌细胞温育约2小时。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液基本上不含有EDTA。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述溶液含有50mM TRIS pH8.0、0.5M NaCl。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述细胞暴露于渗透压休克。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述溶液回收所述周质间隙的一种组分的至少一部分。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述周质间隙含有重组多肽。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法包括从所述溶液回收重组多肽的至少一部分。

18.一种制备重组多肽的基本上纯的样品的方法，所述方法包括：(i)制备包含所述重组多肽的细菌细胞的群；(ii)将所述细菌细胞悬浮在含有SMA的溶液中，所述SMA具有的苯乙烯:马来酸比为约2:1并且浓度为约2-2.5%；和(ii)在约37℃在所述溶液中将所述细菌细胞温育约2小时；(iv)从所述溶液回收所述重组多肽。

19.苯乙烯马来酸共聚物(SMA)用于释放周质间隙的内含物的用途。

20.一种试剂盒，所述试剂盒包括：(i)包含苯乙烯马来酸共聚物(SMA)的溶液；和(ii)操作手册。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，所述试剂盒还包括一个或多个另外的部件，所述一个或多个另外的部件包括蛋白质纯化柱或树脂。