CN101983238B - 病毒浓缩方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够更简便地浓缩低浓度的病毒溶液中的病毒、病毒载体的新方法,以及用于进行该方法的试剂盒。从低浓度的病毒液高效率地浓缩病毒,传统上需要麻烦的操作、昂贵的仪器或者熟练的技术。本发明的方法能够使在保持病毒载体的感染能力的同时使进行浓缩变得容易,因此,适于在使用病毒载体的基因治疗、疫苗治疗等领域中作为安全且简便的载体浓缩技术应用。
Description
技术领域
本发明涉及能够在保持其感染能力的同时对病毒、病毒载体进行浓缩的新方法,以及用于进行该方法的试剂盒。本发明涉及逆转录病毒载体、疱疹病毒载体等、对基因治疗、疫苗等有用的载体的安全且简便的浓缩技术。
背景技术
目前为止,出于基因治疗、疫苗治疗目的,开发出了各种病毒载体,其成果值得期待。但是,如果病毒载体浓度低,则无法充分地获得期望的效果,因而有调整浓度的必要。在基因治疗领域中,针对细胞的基因导入效率左右着治疗的成败,因此,使用基因导入效率高的病毒载体。但是,对于包括慢病毒载体在内的逆转录病毒载体等而言,尚未获得效价高的病毒,因而无法获得充分的基因导入效率。因此,开发出了各种病毒浓缩技术、以及利用该技术得到的制品,但现状是在实用方面还存在多种问题。
作为提高溶液中病毒的浓度、对病毒进行浓缩的方法,可以列举出例如超离心分离法。但是,该方法需要昂贵的仪器和漫长的分离时间,且作业中需要大量的劳力。此外,还有用硫酸铵、聚乙二醇等沉淀病毒来进行浓缩的方法,但这些方法中,由于使用的试剂或进行沉淀的其它成分对感染细胞有害等原因,存在阻碍后续操作的隐患。因此,存在的问题是:病毒沉淀后必须对试样进行纯化,需要大量的劳力。此外,还开发出了使用抗体来浓缩病毒粒子本身的方法(特开2002-78485)。但是,该方法抑制病毒表面的蛋白质功能,存在对病毒的感染性造成影响的隐患。例如,将病毒粒子从抗体分离时,必须要使用强酸性条件(例如pH2~3),这就存在给病毒粒子造成不适的隐患。
作为其它的病毒浓缩方法,公开了例如使用结合有甘露糖结合型凝集素的磁性粒子的方法(特开2002-165591)。
而且,作为提高逆转录病毒的效价、或者从待检物样品分离逆转录病毒的方法,还公开了利用链霉抗生物素蛋白与生物素化凝集素的方法(WO2001/079456)。但是,在上述的任何文献中,病毒均是以与载体结合的形式使用,无法分离出病毒本身。因此,采用这些方法浓缩的病毒的用途受到了限制。
现有技术文献
专利文献1特开2002-078485号公报
专利文献2特开2002-165591号公报
专利文献3国际申请公开第WO2001/079456号小册子
发明内容
发明所要解决的问题
在对体液中的病毒进行定量时,如果浓度低至现有方法的检测限以下,则有时无法进行定量。此外,在将病毒载体应用于基因治疗、疫苗治疗等时,如果病毒载体浓度小,则无法获得期望的效果,因此存在调整浓度的必要。
本发明的目的是提供:一种能够以简洁的方法浓缩溶液中的病毒、病毒载体的方法。此外,本发明的目的还在于提供:从浓度低的病毒溶液中在保持病毒、病毒载体的感染能力的同时,简单容易地对病毒、病毒载体进行浓缩,并以已分离的状态获取病毒、病毒载体的方法。本发明的目的还在于提供:安全且简便地对逆转录病毒载体、疱疹病毒载体等在基因治疗、疫苗等中有用的病毒载体进行浓缩的技术。
解决问题的方法
为解决上述课题,本发明人等进行了深入研究,结果开发出了能够以简洁的方法对溶液中的病毒、病毒载体进行浓缩的技术。更具体地,本发明人等通过使凝集素与含目标病毒液结合、再使病毒-凝集素复合体与载体结合,然后分离并回收结合了病毒的该载体,并加入糖,仅将对象病毒从该载体洗脱到适量的溶液中,而不使其失去感染能力,从而成功制备使其浓度高于最初的含病毒液的浓度。
此外,本发明人等发现:对于人疱疹病毒,通过使用SBA(大豆来源,结合糖链:含N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)(GalNAc)的糖链)、SSA(无梗接骨木(ニホンニワトコ,Sambucus racemosa)来源,结合糖链:含α2-6键的唾液酸(α2-6合のシアル)(Siaα2-6)的糖链)、DSA(白曼陀罗(チヨウセンアサガオ,Datura metel)来源,结合糖链:含N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine)(GlcNAc)的糖链)、WGA(小麦胚芽来源,结合糖链:含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)或唾液酸的糖链)作为凝集素,病毒载体的回收率显著提高。
此外,还发现:对于慢病毒载体,通过使用WGA或SBA作为凝集素,病毒载体的回收率显著提高。
而且,本发明人等通过用合适的糖对采用上述方法回收的结合了病毒、病毒载体的载体进行处理,成功地从结合了病毒载体的载体洗脱了病毒载体。令人惊讶的是,这样分离出的病毒能够保持感染能力。此外,本发明人等发现:作为这样的用于洗脱病毒、病毒载体的糖,当凝集素是WGA时优选使用壳寡糖(chito-oligosaccharide);当凝集素是SBA时,优选使用N-乙酰基-D-半乳糖胺或含N-乙酰基-D-半乳糖胺的糖。
基于以上认识,本发明提供对于病毒、病毒载体,能够在保持其感染能力的同时,简单容易地对其进行浓缩的新浓缩方法。
即,本发明如下。
实施方式1:一种浓缩病毒的方法,该方法包括以下步骤:
(1)通过使凝集素与含病毒液接触并使病毒与凝集素结合,从而(i)该凝集素与能够与载体结合的分子相连接,进而通过该分子结合于载体,从而与凝集素结合的病毒间接地结合于载体,或者(ii)该凝集素直接结合于载体,由此与凝集素结合的病毒结合于载体;
(2)从含病毒液分离载体;
(3)用含糖的洗脱液处理回收的载体,并从该载体洗脱病毒,其中,该洗脱液的量少于(1)的含病毒液的容积;以及
(4)从(3)的洗脱液分离载体,从而得到病毒浓缩液。
实施方式2:一种浓缩病毒的方法,该方法包括以下步骤:
(1)在含病毒液中混合生物素化凝集素,并使病毒与生物素化凝集素接触,添加结合有生物素结合蛋白质载体,使与生物素化凝集素结合的病毒结合于载体;
(2)从含病毒液分离载体;
(3)用含糖的洗脱液处理回收的载体,从该载体洗脱病毒,其中,该洗脱液的量少于(1)的含病毒液的容积;以及
(4)从(3)的洗脱液分离载体,从而得到病毒浓缩液。
实施方式3:根据实施方式1或2所述的方法,其中,所述病毒是具有包膜的病毒或从具有包膜的病毒来源的病毒。
实施方式4:根据实施方式1或2所述的方法,其中,所述病毒是慢病毒或疱疹病毒。
实施方式5:根据实施方式1或2所述的方法,其中,所述凝集素是与包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、α2-6键的唾液酸(Siaα2-6)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)中的至少一种的糖结合的凝集素。
实施方式6:根据实施方式5所述的方法,其中,所述凝集素选自SBA(大豆来源)、SSA(无梗接骨木来源)、DSA(白曼陀罗来源)和WGA(小麦胚芽来源)。
实施方式7:根据实施方式1或2所述的方法,其中,所述凝集素是WGA(小麦胚芽来源),用于病毒的洗脱的糖是壳寡糖;或者,所述凝集素是SBA(大豆来源),用于病毒的洗脱的糖是N-乙酰基-D-半乳糖胺或含N-乙酰基-D-半乳糖胺的糖。
实施方式8:根据实施方式1或2所述的方法,其中,所述病毒是慢病毒,所述凝集素是WGA(小麦胚芽来源),用于病毒的洗脱的糖是壳寡糖;或者,所述病毒是慢病毒,所述凝集素是SBA(大豆来源),用于病毒的洗脱的糖是N-乙酰基-D-半乳糖胺或含N-乙酰基-D-半乳糖胺的糖。
实施方式9:一种浓缩病毒的方法,该方法包括以下步骤:
(1)使直接结合于直径10nm~100nm的纳米珠的凝集素与含病毒液接触,并使病毒结合于纳米珠;
(2)从含病毒液分离纳米珠;
(3)用含糖的洗脱液处理回收的纳米珠,并从该纳米珠洗脱病毒,其中,该洗脱液的量少于(1)的含病毒液的容积;以及
(4)从(3)的洗脱液分离纳米珠,从而得到病毒浓缩液。
实施方式10:一种用于通过实施方式2所述的方法浓缩病毒的试剂盒,该试剂盒包含生物素化凝集素、生物素结合蛋白质珠和用于从载体洗脱病毒的糖。
实施方式11:一种用于通过实施方式2所述的方法浓缩病毒的试剂盒,该试剂盒包含:
(a)生物素化WGA、生物素结合蛋白质和壳寡糖;或
(b)生物素化SBA、生物素结合蛋白质和N-乙酰基-D-半乳糖胺或含N-乙酰基-D-半乳糖胺的糖。
发明效果
根据本发明,对于溶液中的病毒、病毒载体,能够在保持其感染能力的同时,简单容易地对其进行浓缩。
附图说明
【图1】图1为荧光显微镜照片,显示了针对HHV-6对tamavidin珠的非特异性吸附进行试验的结果。发绿色光的点表示EGFP重组HHV-6感染作为指示细胞(indicator cell)的MT-4细胞,1个点表示1个感染性病毒粒子(各点的亮度差异是由感染后病毒基因表达的差异引起的)。左侧照片表示使HHV-6病毒液(原液)作用于MT-4细胞的情况。右侧照片表示在不存在凝集素的条件下使HHV-6病毒液(原液)与tamavidin珠接触、并使吸附于tamavidin珠的病毒作用于MT-4细胞的情况。
【图2】图2为荧光显微镜照片,显示了针对ABA、DSA、Lotus、MAM和PHA-E4各凝集素的HHV-6浓缩效果进行试验的结果。发绿色光的点表示EGFP重组HHV-6感染作为指示细胞的MT-4细胞,1个点表示1个感染性病毒粒子(各点的亮度差异是由感染后病毒基因表达的差异引起的)。
【图3】图3为荧光显微镜照片,显示了针对PHA-L4、UEA-I、SBA、和SSA各凝集素的HHV-6浓缩效果进行试验的结果。发绿色光的点表示EGFP重组HHV-6感染作为指示细胞的MT-4细胞,1个点表示1个感染性病毒粒子(各点的亮度差异是由感染后病毒基因表达的差异引起的)。
【图4】图4为图表,显示了利用凝集素和tamavidin珠对唾液中的HHV-6进行浓缩的程度。
【图5】图5为图表,显示了使用凝集素和tamavidin珠对唾液中的HHV-6进行浓缩以及利用糖进行洗脱时的HHV-6的浓缩程度。
【图6】图6为荧光显微镜照片,显示了利用凝集素和tamavidin珠对慢病毒载体进行浓缩的试验结果。发绿色光的点表示EGFP重组慢病毒载体感染作为指示细胞的293细胞,1个点表示1个感染性病毒粒子(各点的亮度差异是由感染后病毒基因表达的差异引起的)。
【图7】图7为图表,显示了利用凝集素和tamavidin珠对慢病毒载体进行浓缩的程度。
发明的具体实施方式
以下,对本发明进行更具体的说明。
1.浓缩病毒的方法
本发明提供一种浓缩病毒的方法,该方法包括以下步骤:
(1)通过使凝集素与含病毒液接触并使病毒与凝集素结合,其中,(i)通过使该凝集素与能够和载体结合的分子相连接,进而通过该分子结合于载体,从而与凝集素结合的病毒间接地结合于载体,
或者(ii)该凝集素直接结合于载体,由此与凝集素结合的病毒结合于载体;
(2)从含病毒液分离载体;
(3)用含糖的洗脱液处理回收的载体,并从该载体洗脱病毒,其中,该洗脱液的量少于(1)的含病毒液的容积;以及
(4)从(3)的洗脱液分离载体,从而得到病毒浓缩液。
以下,对本发明的方法的各要素进行具体说明。
病毒
在本发明的方法中作为浓缩对象的病毒是具有包膜的病毒或该病毒来源的病毒载体。在优选的实施方式中,浓缩对象病毒可以选自痘病毒(poxvirus)、痘病毒来源载体、披膜病毒(toga virus)、披膜病毒来源载体、冠状病毒(Coronavirus)、冠状病毒来源载体、黄病毒(flaVivirus)、黄病毒来源载体、逆转录病毒(retrovirus)、逆转录病毒来源载体、疱疹病毒(Herpesvirus)以及疱疹病毒来源载体。在其它优选的实施方式中,浓缩对象病毒可以是慢病毒(Lentivirus)、慢病毒来源载体、人疱疹病毒(human herpes virus)6(人疱疹病毒6的变体A和B:以下合称HHV-6)、HHV-6来源载体、人疱疹病毒7(以下记作HHV-7)、HHV-7来源载体、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)(别名人疱疹病毒5)、HHV-5来源载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barrvirus)(EBV)或EBV来源载体,更优选为慢病毒、慢病毒来源载体、HHV-6、HHV-6来源载体、HHV-7或HHV-7来源载体。
含病毒液
在本说明书中,“含病毒液”是指:含有在本发明的方法中作为浓缩对象的病毒的材料。因此,含病毒液可以是例如,缓冲液中包含作为浓缩对象的病毒或病毒载体而得到的液体,或者可以是体液。在本说明书中,有些情况下也将“含病毒液”简记为试样。
包含作为浓缩对象的病毒或病毒载体的液体,可以采用本领域技术人员公知的方法来制备。
在本说明书中,并非限定,体液可以选自唾液、血液、血清、精液、脑脊髓液、咽喉擦出液(pharyngeal swab)、母乳、腹水、汗、泪和尿。体液可以采用本领域技术人员公知的方法采集。此外,对于采集的体液,在不影响病毒粒子的感染能力的前提下,也可以视需要进行处理。
凝集素
在本说明书中,“凝集素”是指识别糖链并与之结合的糖结合性蛋白质。就与凝集素结合的糖链而言,各种凝集素具有特异性。
在本发明的方法中所用的凝集素只要是能够结合病毒即可,没有特殊限制。优选的凝集素的例子是与包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、α2-6键的唾液酸(Siaα2-6)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)中的至少一种的糖链结合的凝集素,更优选可以列举出SBA(大豆来源凝集素。结合糖链:含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的糖链)、SSA(无梗接骨木来源凝集素。结合糖链:含α2-6键的唾液酸(Siaα2-6)的糖链)、DSA(白曼陀罗来源凝集素。结合糖链:含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的糖链)、或WGA(小麦胚芽来源凝集素。结合糖链:含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)或唾液酸的糖链)等凝集素。
特别是,为了浓缩人疱疹病毒或人疱疹病毒来源载体,更优选使用SBA、SSA、DSA或WGA。为了浓缩慢病毒或慢病毒来源载体,更优选使用SBA或WGA。
在本发明的一类实施方式中,凝集素可以与载体直接结合并使用。
在其它实施方式中,凝集素可以间接与载体结合并使用。作为间接结合的例子,可以是生物素-生物素结合性蛋白质的结合介导的凝集素与载体的结合。更具体地,通过将凝集素生物素化,并在载体表面结合生物素结合性蛋白质,使生物素与生物素结合性蛋白质结合,可以实现凝集素与载体的间接结合。
载体
在本发明中,载体只要是固体或不溶性材料(例如,能够通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物分离的材料)的载体即可,没有特殊限制。
构成固体载体的材料包括纤维素、特氟隆(teflon)(注册商标)、硝酸纤维素(nitrocellulose)、琼脂糖、高交联球形琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯(polydivinylidene difluoride)、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片(silicon wafer)、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白质(白蛋白等)、碳以及它们的组合等,但不限于此。
固体载体的形状包括但不限于:珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样,薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
在本发明的一类实施方式中,磁珠可以具有约10nm~约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中,磁珠具有约25nm~约1mm、约50nm~约100μm范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
在本发明的一类实施方式中,由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子可以具有约24μm~约165μm范围的直径。在优选的实施方式中,高交联球形琼脂糖珠具有约24μm~约44μm范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences公司或Spherotech公司购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。
二氧化硅(SiO2)处理或二氧化硅(SiO2)基的固体载体的例子包括可从Polysciences公司购买的超常磁性二氧化硅珠等。或者,还可以使用可从Dynal Biotech公司购买的M-280等。
作为具有亲水性表面的磁珠的例子,可以列举出Polysciences公司销售的名称为Biomag(注册商标)羧基的珠子、或者Bangs Laboratory公司的珠子(MC02N/2928)等。或者,可以使用Dynal Biotech公司销售的M-270等。
凝集素与载体的直接结合
在本发明的一类实施方式中,凝集素与载体可以直接结合来使用。这种情况下,从提高病毒与结合有凝集素的载体的结合可能性的观点出发,载体可以是能够做布朗运动程度大小的纳米珠。纳米珠的优选球体直径的范围是10nm~100nm的球体直径、更优选30nm~70nm的球体直径。此外,这种情况下,优选包含能够用磁铁简便回收的磁体,例如可以列举出但不限于Miltenyi Biotech公司的MACS MicroBeads(直径50nm)等磁性纳米珠。
凝集素与载体的连接可以采用本领域技术人员公知的蛋白质与载体的偶联方法来进行。例如,对载体表面进行修饰,使得羧基露出来,然后使该羧基与蛋白质的氨基在交联试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的存在下进行偶联反应,从而将蛋白质与载体连接起来。或者,例如,通过在不含伯氨基的pH6.5~9的缓冲液中混合载体表面的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯化后的载体与蛋白质,可以将载体表面的羧基与蛋白质的氨基连接起来。
或者,可以使用交联试剂BS3(双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸盐)或DSS(双琥珀酰亚胺基辛二酸酯(Disuccinimidyl suberate)),将载体表面的氨基与蛋白质的氨基连接起来,或者使用交联试剂SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酸酯)或GMBS(N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酰亚胺)将载体表面的氨基与蛋白质的硫醇基(チオ一ル基)连接起来。
凝集素与载体的间接结合
在本发明的其它实施方式中,凝集素可以间接与载体结合来使用。例如,通过将凝集素生物素化,并在载体表面结合生物素结合性蛋白质,使生物素与生物素结合性蛋白质结合,可以实现凝集素与载体的间接结合。
这种情况下,作为载体,可以优选使用珠子,珠子的优选球体直径的范围是0.1μm~100μm的球体直径,更优选0.5μm~10μm的球体直径,更优选1μm~5μm的球体直径。
在本说明书中,“生物素”是指D-[(+)-cis-六氢-2-氧代-1H-噻吩并-(3,4)-咪唑-4-戊酸]的通用名。生物素是属于B族维生素的一种水溶性维生素,也称作维生素B7、维生素H或辅酶R。生物素是卵清中包含的一种糖蛋白质,其非常强烈地结合抗生物素蛋白。
在本说明书中,“生物素”除了上述的生物素以外,还包括亚氨基生物素(iminobiotin)(Hofmann,et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4666-4668)、脱硫生物素(desthiobiotin)(Hirsch,et al.,(2002)Anal.Biochem.,308:343-357)、生物胞素(biocytin)或生物素亚砜(biotin sulfoxide)等生物素类似物。
在对凝集素进行生物素化时,可以列举出使用生物素化试剂的方法。作为生物素化试剂,可以利用例如:PIERCE公司制造的EZ-Link(注册商标)Sulfo-NHS-Biotin(13.5伯胺)(括号内依次为接头长度、反应基团)、EZ-Link(注册商标)Sulfo-NHS-LC-Biotin(22.4伯胺)、EZ-Link(注册商标)Sulfo-NHS-LCLC-Biotin(30.5伯胺)、EZ-Link(注册商标)PFP-Biotin(9.6胺)、EZ-Link(注册商标)Maleimide-PEO2-Biotin(29.1硫醇基)、EZ-Link(注册商标)Biotin-PEO2 Amine(20.4羧基)、EZ-Link(注册商标)Biotin-PEO3-LC Amine(22.9羧基)、EZ-Link(注册商标)Biotin-Hydrazide(15.7醛基)、EZ-Link(注册商标)Biotin-LC-Hydrazide(24.7醛基)、EZ-Link(注册商标)NHS-Iminobiotin(13.5伯胺)等,但不限于此。
使用这样的生物素化试剂,可以通过公知方法使生物素结合于凝集素。
例如,在使用含NHS酯的生物素化试剂的情况下,通过用DMSO(二甲基亚砜)这样的有机溶剂或pH7-9的磷酸缓冲液进行溶解、并添加凝集素,可以结合生物素。此外,例如,在使用含氨基的生物素化试剂的情况下,通过使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)这样的碳化二亚胺,在将凝集素的羧基转换为活化酯后,添加用pH5附近的缓冲液溶解的生物素化试剂,可以结合生物素。
此外,结合有生物素的凝集素例如可以从J-Oil Mills公司以生物素标记凝集素的形式购入。此外,还可以通过使用生物素标记试剂盒(例如但不限于Pierce公司制造的EZ-Link(注册商标)NHS-Lc-Biotin、Dojindo MolecularTechnologies公司制造的Biotin Labeling Kit-NH2等),使生物素结合于期望的凝集素来制作。
此外,通过将凝集素基因与编码含生物素化序列的肽的DNA相融合,构建表达该融合基因的载体,并在任意宿主中以与生物素化序列的融合蛋白质的形式进行表达(Schwarz et al.,(1988).J.Biol.Chem.263:9640-9645),也可以制作生物素化凝集素。这样的载体可以列举出但不限于:例如Invitrogen公司的含BioEase(商标)标签的载体。这其中,哺乳类细胞表达用的有pcDNA(商标)6载体,大肠杆菌表达用的有pET104载体,或者果蝇(Drosophila)表达用的有pMT/BioEase载体。
在本发明中,作为生物素结合性蛋白质,只要是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)、AVR蛋白质(Biochem.J.,(2002),363:609-617)、Bradavidin(J.Biol.Chem.,(2005),28013250-13255)、Rhizavidin(Biochem.J.,(2007),405:397-405)、tamavidin或它们的突变体等,与生物素和生物素/抗生物素蛋白结合的蛋白质,均可以适宜使用。特别是,可以优选使用tamavidin及其突变体。而且,tamavidin是在食用蘑菇白黄侧耳(pleurotus cornucopiae)中发现的生物素结合性蛋白质(WO02/072817;Takakura et al.,(2009)FEBS J.,276:1383-1397)。作为tamavidin的突变体,可以列举出例如高结合能力/低非特异性结合tamavidin(如本特愿2008-208766,未公开)等。
本发明中的“tamavidin”是指:tamavidin 1(氨基酸序列:SEQ ID NO:5、编码其的核酸序列:SEQ ID NO:4)、tamavidin 2(氨基酸序列:SEQ ID NO:7、编码其的核酸序列:SEQ ID NO:6)或它们的突变体。具体地,本发明的tamavidin典型地可以是包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白质,或者可以是由包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的碱基序列的核酸编码的蛋白质。或者,本发明的tamavidin可以是包含SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白质,或由包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、且具有与tamavidin 1或2相同的生物素结合活性的蛋白质或具有高结合能力/低非特异性结合的活性的蛋白质。在本说明书中,有些情况下也简单地将tamavidin1、tamavidin 2以及它们的突变体统称为tamavidin。
tamavidin 1或2的突变体可以是包含在SEQ ID NO:5或7的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列而形成的蛋白质、并且具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性的蛋白质。取代可以是保守取代,即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。
氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而产生的突变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(例如参见NucleicAcid Research,Vol.10,No.20,p.6487-6500,1982,通过引用将其全文引入到本说明书中)来制作。在本说明书中,“一个或多个氨基酸”是指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外,在本说明书中,“一个或多个氨基酸”根据情况也可以指1个或数个氨基酸。
tamavidin 1或2的突变体还可以是包含与SEQ ID NO:5或7的氨基酸序列具有至少60%以上、优选65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更优选99.3%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列的蛋白质,并且该蛋白质具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性或者具有高结合能力/低非特异性结合的活性。
两个氨基酸序列的同一性%可通过目测和数学计算来确定。或者,两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.(J.Mol.Bol.,48:443-453,1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括:(1)Henikoff,S.以及Henikoff,J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919,1992)所记载的得分/矩阵、blosum62;(2)12分的空位罚分;(3)4分的空位长度罚分;以及(4)末端空位不罚分。
也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比,例如:Altschul等(Nucl.Acids.Res.,25,p.3389-3402,1997)中记载的使用BLAST程序可以对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bankof Japan(DDBJ)网站使用。在相同站点,对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载,可对部分设定进行适当变更,但检索通常使用默认值来进行。此外,两个氨基酸序列的同一性%也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时,也可用默认值检索。
两个核酸序列的同一性%可通过目测和数学计算来确定,此外,该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG;威斯康星州Madison)的威斯康星·软件包、10.0版“GAP”程序(Devereux等,1984,Nucl.Acids Res.,12:387)。使用该“GAP”程序,不仅可对两个核酸序列进行比较,还可比较两个氨基酸序列,并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。
在本发明中,优选的tamavidin包含以下的tamavidin修饰体(日本特愿2008-208766,未公开)。
在包含SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列、或者在该序列中具有1~数个氨基酸突变的氨基酸序列、或者与该序列具有80%以上同一性的氨基酸序列,且显示生物素结合活性的蛋白质中,选自下组中的1或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质:
1)SEQ ID NO:7的104位的精氨酸残基;
2)SEQ ID NO:7的141位的赖氨酸残基;
3)SEQ ID NO:7的26位的赖氨酸残基;以及
4)SEQ ID NO:7的73位的赖氨酸残基。
更优选选自下组中的修饰型生物素结合蛋白质:
在SEQ ID NO:7中,104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(R104E-K141E);
在SEQ ID NO:7中,40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E);
在SEQ ID NO:7中,40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-K141E);以及
在SEQ ID NO:7中,40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E-K141E)。
生物素结合性蛋白质与载体的连接可以采用本领域技术人员公知的蛋白质与载体的偶联方法来进行。例如,对载体表面进行修饰,使得羧基露出来,然后使该羧基与蛋白质的氨基在交联试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的存在下进行偶联反应,从而可以将蛋白质与载体连接起来。或者,例如,通过在不含伯氨基的pH6.5~9的缓冲液中混合载体表面的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯化后的载体与蛋白质,可以将载体表面的羧基与蛋白质的氨基连接起来。
或者,可以使用交联试剂BS3(双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸盐)或DSS(双琥珀酰亚胺基辛二酸酯)将载体表面的氨基与蛋白质的氨基连接起来,或者使用交联试剂SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酸酯)或GMBS(N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酰亚胺)将载体表面的氨基与蛋白质的硫醇基连接起来。
在利用诸如上述的结合将生物素结合性蛋白质固定于载体时,表面配置有各种官能团的各种载体是商品化的,因此可以优选使用这些载体。可以列举出但不限于例如:在表面配置有官能团的微板方面,作为马来酸酐板有例如Reacti-Bind(商标)Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96-WellPlates(PIERCE公司),作为活性型氨基板有例如ImmobilizerTM-AminoModules/Plates(Nunc公司),作为羧基板有例如ELISA用平板MS-8796F(96孔·C型·平底·羧基)(Sumitomo Bakelite公司)。此外,在表面配置有官能团的微珠方面,作为高交联琼脂糖珠有例如Sepharose(商标)(GE HealthcareBio-Science公司),作为磁珠有例如Dynabeads(商标)(Dynal公司)等,但不限于此。生物素结合性蛋白质与固体载体的连接可以按照载体附带的说明书来进行。
此外,作为固定有生物素结合性蛋白质的载体,还可以列举出例如Reacti-BindTM Streptavidin Coated Plates(PIERCEE公司)、Nunc StreptavidinCoated 96 Micro WellTM Plates(Nalge Nunc公司)等微板类,或者DynabeadsM-280 Streptavidin(Dynal公司)、MagnaBindTM Streptavidin Beads(PIERCE公司)等磁珠类等市售品,但不限于此。
在不使用生物素与生物素结合性蛋白质的情况下,例如,可以在凝集素上结合组氨酸标签、FLAGTM标签或谷胱甘肽硫转移酶(GST),并在载体上分别结合Ni-NTA(氮川三乙酸)、抗FLAG抗体或谷胱甘肽,通过它们之间的结合,也可以使凝集素与载体间接结合。
含病毒液与凝集素的接触
本发明的方法包括使含病毒液与凝集素相接触的步骤。对于使含病毒液与凝集素相接触的条件没有特殊限制,只要是含病毒液中的病毒与凝集素结合的条件即可。作为接触条件的要素,包括含病毒液的组成、温育温度和温育时间。
对于含病毒液的组成没有特殊限制,只要能够保持含病毒液中的病毒与凝集素结合的条件即可。优选的含病毒液可以是以pH7~8的缓冲液、例如Tris/EDTA(TE)、PBS、HEPES、TBS等为基础的缓冲液。此外,含病毒液的pH可以是6~9、优选7~8。
如果含病毒液是体液,则可以直接与凝集素接触,或者可以在该体液中加入期望的缓冲液等,然后再与凝集素接触。
温育温度的下限可以是4℃或10℃,上限可以选自50℃、45℃、40℃、37℃、30℃、25℃和20℃。作为优选的温育温度,可以列举出10℃~37℃、10℃~25℃、10℃~20℃、15℃。
温育时间的下限可以选自1分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和30分钟,上限可以选自一夜、10小时、8小时、5小时、3小时、2小时、1.5小时和1小时。作为优选的温育时间,可以列举出5分钟~一夜、5分钟~5小时、10分钟~2小时。
在本发明的方法中的凝集素与载体间接结合的实施方式中,在使凝集素与含病毒液接触前、或接触的同时、或接触后,通过能够与载体结合的分子使凝集素与载体相接触并结合。对于使凝集素与载体相接触的条件没有特殊限制,只要是凝集素通过能够与载体结合的分子可以充分地结合于载体的条件即可。作为接触条件的要素,包括温育温度和温育时间。可以适宜地选择与上述的使病毒与凝集素相接触的条件相同的条件,作为特别优选的温育时间,可以列举出1分钟~2小时、3分钟~1小时、5分钟~30分钟。
载体的分离
通过凝集素而捕捉到作为浓缩对象的病毒的载体,可以根据该载体的性质,采用本领域技术人员公知的方法,从作为试样的含病毒液中分离、回收。
例如,对于珠子等粒状载体,通过离心分离并进而除去上清,可以实现将载体从试样分离。在载体为磁珠的情况下,通过使用磁铁收集载体并除去上清,可以将载体从试样分离。在载体为薄膜、滤膜等形状的情况下,通过将载体从试样中捞起来、或者使试样通过载体后,可以将载体从试样分离。当载体被设计成由病毒来填充孔结构的内部(例如微板等)时,简单通过将试样从孔中除去,即可将载体从试样分离。
此外,视需要为了除去非特异性结合在从试样分离的载体上的物质,可以增加对分离出的载体进行洗涤的步骤。对于洗涤步骤中采用的洗涤液、温度的条件没有特殊限制,只要维持病毒与凝集素间的结合和/或凝集素与载体间的结合的条件得以保持即可。
优选地,洗涤液具有缓冲能力,可以是以pH7~8的缓冲液、例如Tris/EDTA(TE)、PBS、HEPES、TBS等为基础的缓冲液。此外,洗涤液的pH可以为6~9、优选7~8。
对于洗涤温度没有特殊限制,洗涤温度的下限可以是4℃或10℃,上限可以选自50℃、45℃、40℃、37℃、30℃、25℃和20℃。作为优选的洗涤温度,可以列举出10℃~37℃、10℃~25℃、10℃~20℃、15℃。
使用糖进行的洗脱
本发明的方法包括使用含糖的洗脱液,将通过凝集素而被载体捕捉的病毒从载体上洗脱的步骤。可以设想,因病毒的种类而异,有些情况下,凝集素与病毒结合的状态会对病毒的感染能力产生不良影响。而且,在对基因治疗中使用的病毒载体进行浓缩时,从载体洗脱并分离病毒载体是不可或缺的。
在本说明书中,从载体洗脱病毒是指:对于被载体捕捉的病毒,通过使糖链-凝集素结合解离,从而使病毒从该载体脱离,成为游离于该载体的状态。此外,在本说明书中,从载体洗脱病毒是指:成为至少一部分被载体捕捉的病毒从载体上脱离而游离出来的状态;并非一定是指成为全部被载体捕捉的病毒均游离出来的状态。
此外,在本说明书中,从载体洗脱并分离病毒中的词语“分离”是指:使被载体捕捉的病毒从该载体脱离,而成为游离于该载体的状态,且成为除去该载体的成分的状态。因此,在本说明书中,“分离的病毒”是指至少不含载体的成分,并不一定对病毒纯度的程度进行规定。
本发明人等发现:通过将与凝集素结合的病毒用合适的含糖的溶液进行处理,可以将其从载体洗脱并分离,而不丧失病毒的感染能力。因而,在本发明的方法中,通过使用糖,可以洗脱与凝集素结合的病毒。可从结合有病毒的凝集素洗脱病毒的糖选自具有该凝集素所结合的糖的单糖类、二糖类、寡糖或糖苷。
作为用于从捕捉了病毒的凝集素洗脱病毒的糖的具体例子,可以列举出例如,针对SBA使用N-乙酰基-D-半乳糖胺,针对SSA使用乳糖,针对DSA使用壳寡糖,针对WGA使用壳寡糖或N-乙酰基-D-葡糖胺,可以分别优选加以利用。
含糖的洗脱液可以是以pH7~8的缓冲液、例如Tris/EDTA(TE)、PBS、HEPES、TBS等为基础的缓冲液。此外,含糖的洗脱液的pH可以是5~9、优选7~8。
含糖的洗脱液中的糖的浓度可以是0.01~1M、优选0.05M~0.5M、更优选0.1M~0.3M。或者,可以是0.1%~5%(w/v)、更优选0.5%~2%(w/v)。
对于洗脱处理的温度没有特殊限制,可以是室温,或者洗涤温度的下限可以是4℃或10℃,上限可以选自50℃、45℃、40℃、37℃、30℃、25℃和20℃。作为优选的洗涤温度,可以列举出室温、10℃~37℃、10℃~25℃、10℃~20℃、15℃。
对于洗脱处理的时间没有特殊限制,可以是30秒~1日、优选5分钟~2小时、更优选1分钟~30分钟。
此外,对于出于洗脱病毒的目的而使用的洗脱液的量没有特殊限制,只要是少于本发明的方法中最初使用的含病毒液的容积的量即可。优选地,可以是最初的含病毒液的量的1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100或1/500。
而且,在不使用糖从载体进行洗脱时,通过使洗脱液的pH为酸性(优选pH1~5)或碱性(优选pH9~11),也可以洗脱病毒。
病毒浓缩液的获得
在使洗脱液作用于载体后,通过除去载体可以获得病毒浓缩液。
在用洗脱液进行处理后,洗脱液中的载体可以根据该载体的性质,采用本领域技术人员公知的方法从洗脱液中分离、除去。例如,对于珠子等粒状载体,通过离心分离并进而回收上清,可以获得病毒浓缩液。在载体为磁珠的情况下,通过使用磁铁收集载体并回收上清,可以获得病毒浓缩液。在载体为薄膜、滤膜等形状的情况下,通过将载体从洗脱液中捞起来、或者使试样通过载体后,也可以将载体分离。当载体被设计成由病毒来填充孔结构的内部(例如微板等)时,简单通过从孔中回收洗脱液,即可获得病毒浓缩液。
2.试剂盒
此外,本发明提供基于本发明的方法用于浓缩含病毒液中的病毒的试剂盒。
在一类实施方式中,本发明的试剂盒至少包含生物素化凝集素、结合有生物素结合蛋白质的载体、和用于洗脱的糖。凝集素、生物素结合蛋白质、载体和洗脱用的糖如上述定义。
在其它实施方式中,本发明的试剂盒至少包含结合有凝集素的纳米珠、和洗脱用的糖。凝集素、纳米珠和用于洗脱的糖如上述定义。
本发明的试剂盒中还可以包含本发明的方法中的、用于病毒与凝集素的结合的缓冲液、用于洗涤分离出的病毒结合载体的缓冲液、和/或用于从载体洗脱病毒的缓冲液。
本发明的试剂盒中,各种试剂可以封装在合适的容器中。此外,本发明的试剂盒还可以包含用于对其中所含的试剂等进行适当捆包的包装。
此外,本发明的试剂盒还可以包含合适的使用说明资料。使用说明资料包括但不限于包装上记载的使用方法或印刷品、电子记录媒体(例如磁盘、磁带、盒式存储器(cartridge)、芯片)和光学媒体(例如CD ROM)等,可向使用者传达本发明的试剂盒的使用方法的媒体。此外,连接至提供使用说明资料的互联网站点的地址的记载也包含在使用说明资料中。
实施例
以下,通过实施例对本发明进行具体说明,但这些并不是对本发明的技术范围的限定。本领域技术人员可以基于本说明书的记载容易地对本发明加以修饰、变更,这些也包含在本发明的技术范围内。
实施例1能够浓缩HHV-6的凝集素的探索
使生物素化的15种凝集素(Con A,DBA,LCA,PHA-E4,PNA,RCA120,UEA-I,WGA,ABA,DSA,Lotus,MAM,PHA-L4,SBA,SSA)与培养的HHV-6溶液反应,研究了是否能够通过结合于结合了tamavidin的磁珠来浓缩HHV-6。
1.从培养T细胞制作HHV-6溶液
使表达EGFP的重组HHV-6(专利第3923505号)感染人脐带血来源培养T细胞,制作了EGFP型HHV-6溶液。
2.tamavidin磁珠的制作
将表面用羧基包覆的磁珠(Dynabeads M-270 Carboxylic Acid,Dynal公司)300μl用0.01N氢氧化钠300μl洗涤10分钟后,再用超纯水300μl洗涤3次,每次10分钟。对于洗涤完毕的磁珠,添加用冷超纯水溶解的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(PIERCE公司)使得最终浓度为0.2M,室温振荡30分钟。然后,用冷超纯水300μl、再用50mM MES缓冲液(pH5.0)300μl洗涤磁珠,用混合0.6mg/ml的tamavidin 300μl(180μg)来替代50mM MES缓冲液(pH5.0)。通过室温振荡30分钟,使tamavidin与磁珠通过共价键结合。用磁铁回收磁珠,除去上清。接下来,用50mM TRIS缓冲液(pH7.0)300μl除去珠子的未反应羧基,然后用含0.5%BSA、0.1%Tween20的PBS缓冲液300μl封闭磁珠。用PBS缓冲液300μl悬浮磁珠,从而完成了磁珠的制作。对于链霉抗生物素蛋白,也同样制作了磁珠。
3.重组HHV-6溶液的浓缩
利用1中制作的EGFP型HHV-6溶液,以重组HHV-6的感染效价为指标,确认了是否进行了病毒浓缩。生物素化凝集素使用了J-OIL MILLS公司制造的15种凝集素(Con A,DBA,LCA,PHA-E4,PNA,RCA120,UEA-I,WGA,ABA,DSA,Lotus,MAM,PHA-L4,SBA,SSA)。
首先,在进行凝集素的探索之前,进行了作为背景的tamavidin的非特异性吸附的确认。
首先,混合EGFP重组HHV-6液100μl(病毒浓度104/mlTE)与PBS 500μl,15℃温育1小时(颠倒混合)。接着,将上述2中制作的tamavidin磁珠添加到反应液中,再次15℃温育1小时(转倒混合)。然后,将装有反应液的埃芬道夫管立于Dynabeads用磁铁台后,用PBS 2mM EDTA 0.5%BSA 200μl洗涤2次。接着,将其悬浮于培养液(RPMI1640+10%胎牛血清)500μl后,将全部与0.5ml的指示细胞(MT4细胞)一起悬浮。可以认为:如果存在EGFP型HHV-6,则EGFP型HHV-6感染指示细胞,HHV-6的DNA进入细胞中,其中重组到病毒中的EGFP基因得以表达,从而发出GFP荧光。而且,在本实验中,处于结合有珠子的状态的病毒与感染细胞一起沉入液体底部,因此,通常会成为问题的病毒与感染细胞之间的结合概率的降低已经不再是问题,反而局部的病毒浓度变得非常高,并因此可以认为感染效率提高。
上述实验的结果如图1所示,可以确认基本上没有HHV-6针对tamavidin珠子的非特异性吸附。
接下来,考察了使用各种凝集素进行病毒浓缩是否是可行的。
首先,混合EGFP重组HHV-6液100μl(病毒浓度104/mlTE)与PBS 500μl、生物素化凝集素10μg,15℃温育1小时(颠倒混合)。接着,将上述2中制作的tamavidin磁珠添加到反应液中,再次15℃温育1小时(转倒混合)。然后,将装有反应液的埃芬道夫管立于Dynabeads用磁铁台后,用PBS 2mM EDTA0.5%BSA 200μl洗涤2次。接着,将其悬浮于培养液(RPMI1640+10%胎牛血清)500μl后,将全部与0.5ml的指示细胞(MT4细胞)一起悬浮,观察了EGFP的表达。而且,可以认为:如果能够浓缩EGFP型HHV-6,则通过凝集素-生物素-tamavidin与磁珠结合在一起的EGFP型HHV-6感染指示细胞,重组到病毒中的EGFP基因得以表达,从而发出GFP荧光。
作为实验结果,在使用SBA、SSA、DSA、WGA时,观察到了比病毒原液更多的EGFP的表达。部分结果示于图2、图3。该事实表明,使用这些凝集素能够有效率地浓缩HHV-6。
实施例2唾液中HHV-6的浓缩
对于唾液中的HHV-6,尝试了利用凝集素化生物素、tamavidin磁珠进行浓缩。
1.唾液的采集
使用唾液收集管(Salivette Cotton、Sarstedt公司制造)采集来自受试者的唾液。在即将进行唾液采集之前,受试者用蒸馏水漱口2次,然后将唾液收集管的棉芯含于口腔内2分钟,采集了唾液。
2.HHV-6的定量
首先,对唾液中的HHV-6浓度进行定量。
对于如上述项目1那样采集的唾液400μl,使用BioRobot EZ1(QIAGEN公司)与EZ1 Virus Mini Kit v2.0(QIAGEN公司),按照EZ1 Virus MiniHandbook(QIAGEN公司)的规程,对唾液中的HHV-6DNA进行了纯化。
将所得DNA用于定量PCR。在定量PCR中,采用实时PCR法对HHV-6U65/66区域进行了定量。PCR中使用的引物和探针的序列是
引物:5′-GACAATCACATGCCTGGATAATG-3′(SEQ ID NO:1);和
引物:5′-TGTAAGCGTGTGGTAATGGACTAA-3′(SEQ ID NO:2);以及
TaqMan探针:FAM 5′-AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC-3′TAMRA(SEQ ID NO:3)
使用FastStart Universal Probe Master(Rox)(Roche公司)进行了反应温度95℃10分钟1次,95℃5秒+60℃31秒的循环45个的实时PCR。
而且,本试验中病毒实验由极熟练的实验者来进行。
其结果,唾液1ml中的HHV-6DNA是14616拷贝/ml。因此,可以计算出唾液5μl中所含的HHV-6是73.08拷贝(图4:纯化前)。
3.利用生物素化凝集素、tamavidin磁珠进行的HHV-6的浓缩
在如上述项目1那样采集的唾液400μl中混合44μl的10倍浓度PBS、生物素化SBA 1nmol,15℃温育1小时(颠倒混合)。接着,将实施例1中制作的tamavidin磁珠100μl添加到反应液中,再次于15℃温育1小时(颠倒混合)。然后,将装有反应液的埃芬道夫管立于Dynabeads用磁铁台上后,用PBS 500μl洗涤3次。向其中加入10μl的TE,98℃处理10分钟后,在磁铁台上回收上清,将其中的5μl用于定量PCR。定量PCR中,像本实施例的上述项目2那样对HHV-6U65/66区域采用实时PCR法进行了定量。
作为以上实验的结果,在利用生物素化SBA与tamavidin磁珠的情况下,经测定,用于定量PCR的洗脱液5μl中的HHV-6量为2934拷贝(图4)。与本实施例的上述项目2的结果相比较,通过使用生物素化SBA与tamavidin磁珠,HHV-6溶液能够浓缩约40倍。相似地,在使用生物素化SSA的情况下,浓缩效率为约15倍。另一方面,未加入生物素化凝集素的试验区中所含的HHV-6量是40拷贝以下,其未得到浓缩(图4)。
4.利用生物素化凝集素和tamavidin磁珠进行的HHV-6的浓缩以及利
用糖链进行的洗脱
在如上述项目1那样采集的唾液1ml中添加100μg的生物素化SBA或生物素化WGA后,将实施例1中制作的tamavidin磁珠50μl添加到反应液中,室温颠倒混合15分钟,从而使之结合。将其立于Dynabeads用磁铁台上后,加入0.5%牛血清白蛋白、2mM EDTA,用PBS洗涤2次后,用20μl的洗脱液(在PBS+2%胎牛血清中加入洗脱用糖链而得)进行了洗脱处理。洗脱液中的洗脱用糖,在使用生物素化SBA的体系中使用了N-乙酰基-D-半乳糖胺(0.2M),在使用生物素化WGA的体系中使用了壳寡糖(1%)。然后,将装有进行过洗脱处理的洗脱液的试管立于Dynabeads用磁铁台上,收集tamavidin磁珠,并回收上清。将这样获得的回收液5μl用于定量PCR。定量PCR中,像上述项目2那样对HHV-6U65/66区域采用实时PCR法进行了定量。
作为以上实验的结果,在利用生物素化SBA与tamavidin磁珠来收集HHV-6、并用N-乙酰基-D-半乳糖胺进行洗脱的情况下,与纯化前的病毒浓度相比较,浓缩效率为2.7倍。此外,在利用生物素化WGA与tamavidin磁珠来收集HHV-6、并用壳寡糖进行洗脱的情况下,与纯化前的病毒浓度相比较,浓缩效率为4.7倍(图5)。
实施例3使用凝集素进行慢病毒载体的浓缩
(1)浓缩
作为慢病毒,使用了在具有HIV base的基因和VSV-G的包膜的慢病毒载体中重组入EGFP基因而得到的慢病毒(独立行政法人理化学研究所三好浩之先生惠赠)。生物素化凝集素使用的是J-OIL MILLS公司制造的15种生物素化凝集素(Con A,DBA,LCA,PHA-E4,PNA,RCA120,UEA-I,WGA,ABA,DSA,Lotus,MAM,PHA-L4,SBA,SSA)。
首先,混合EGFP重组慢病毒液100μl(病毒浓度102/ml TE,而且为了观察浓缩效果,使用了效价低的病毒。)、PBS 500μl、生物素化凝集素10μg,15℃温育1小时(颠倒混合)。接着,将实施例1中制作的tamavidin磁珠添加到反应液中,再次于15℃温育1小时(颠倒混合)。然后,将装有反应液的埃芬道夫管立于Dynabeads用磁铁台上后,用PBS 2mM EDTA 0.5%BSA200μl洗涤2次。接着,将其用培养液(RPMI1640+10%胎牛血清)500μl悬浮后,用全部感染指示细胞(293细胞),通过EGFP表达测定了病毒的感染效价。
其结果,可知:在利用WGA或SBA的情况下,具有VSV-G包膜的慢病毒载体能够得到充分浓缩,且不损失感染性(图6)。而且,使用原液的病毒,基本上未见EGFP表达细胞。
(2)浓缩率的定量
接着,进行了浓缩率的定量。在1ml的EGFP重组慢病毒溶液(效价:103/ml)中添加200μg的生物素化SBA或生物素化WGA后,添加100μl的tamavidin磁珠,室温颠倒混合15分钟,从而使之结合。将其立于Dynabeads用磁铁台上后,用含0.5%牛血清白蛋白、2mM EDTA的PBS洗涤2次后,用100μl的洗脱液(在PBS+2%胎牛血清中加入洗脱用糖而得)进行了洗脱处理。洗脱液中的洗脱用糖,对于SBA使用了N-乙酰基-D-半乳糖胺(0.2M),对于WGA使用了壳寡糖(1%)。然后,将装有进行过洗脱处理的洗脱液的试管立于Dynabeads用磁铁台上,收集tamavidin磁珠,并回收上清。对于这样获得的回收液,通过使其37℃吸附于指示细胞(HeLa细胞)1小时而进行感染,并通过1日后的EGFP表达细胞数测定了感染病毒效价作为病毒效价。
其结果,能够回收病毒,且使用生物素化SBA的体系的回收率是56%,使用生物素化WGA的体系的回收率是98%。浓缩率分别为5.6倍和9.8倍(图7)。
工业实用性
本发明提供能够更简便地对低浓度的病毒溶液中的病毒、病毒载体进行浓缩的新方法,以及用于进行该方法的试剂盒。本发明的方法能够使在保持病毒、病毒载体的感染能力的同时进行浓缩变得容易,因此,可以期待其作为例如使用病毒载体的基因治疗、疫苗治疗等领域中的、安全且简便的载体浓缩技术应用。更具体地,本发明的方法是一种不需要传统方法那样的麻烦的柱操作、超离心等的简便方法,因而也可以期待其应用于自动化、高通量的系统中。
序列表
Claims (11)
1.一种浓缩病毒的方法,该方法包括以下步骤:
(1)在含病毒液中混合生物素化凝集素,并使病毒与生物素化凝集素接触,进一步添加结合有生物素结合蛋白质的载体,使与生物素化凝集素结合的病毒结合于载体;
(2)从含病毒液分离载体;
(3)用含糖的洗脱液处理回收的载体,从该载体洗脱病毒,其中,该洗脱液的量少于(1)的含病毒液的容积;以及
(4)从(3)的洗脱液分离载体,从而得到病毒浓缩液。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述病毒是具有包膜的病毒或从具有包膜的病毒来源的病毒。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述病毒是慢病毒或疱疹病毒。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述凝集素是与包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、α2-6键的唾液酸(Siaα2-6)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)中的至少一种的糖结合的凝集素。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述凝集素选自SBA(大豆来源)、SSA(无梗接骨木来源)、DSA(白曼陀罗来源)和WGA(小麦胚芽来源)。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述凝集素是WGA(小麦胚芽来源),用于病毒的洗脱的糖是壳寡糖;或者,所述凝集素是SBA(大豆来源),用于病毒的洗脱的糖是N-乙酰基-D-半乳糖胺或含N-乙酰基-D-半乳糖胺的糖。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述病毒是慢病毒,所述凝集素是WGA(小麦胚芽来源),用于病毒的洗脱的糖是壳寡糖;或者,所述病毒是慢病毒,所述凝集素是SBA(大豆来源),用于病毒的洗脱的糖是N-乙酰基-D-半乳糖胺或含N-乙酰基-D-半乳糖胺的糖。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,
所述生物素结合蛋白质是具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的蛋白质;或者具有与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有90%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列,并且具有生物素结合活性的突变体蛋白质。
9.根据权利要求1所述的方法,其中,
所述生物素结合蛋白质是具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的蛋白质;或者具有与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有90%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列,并且具有生物素结合活性的突变体蛋白质。
10.一种用于通过权利要求1所述的方法浓缩病毒的试剂盒,该试剂盒包含生物素化凝集素、生物素结合蛋白质珠和用于从载体洗脱病毒的糖。
11.一种用于通过权利要求1所述的方法浓缩病毒的试剂盒,该试剂盒包含:
(a)生物素化WGA、生物素结合蛋白质和壳寡糖;或
(b)生物素化SBA、生物素结合蛋白质和N-乙酰基-D-半乳糖胺或含N-乙酰基-D-半乳糖胺的糖。
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