JPH0297399A - ポリペプチドの製造方法並びにその方法に用いる、組換えベクターおよび組換えウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分骨〕 本発明は、成人Ｔ細胞白血病（Ａｄｕｌｔ　Ｔｃｅｌｌ
ｌｅｕｋｅｍｉａ　；以下ＡＴＬと略記する）の病因で
ある成人Ｔ細胞白血病ウィルス（Ｈｖｍａｎ　Ｔｃｅｌ
ｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ−１：以下ＨＴＬＶ−
Ｉと略記する）の、表存蛋白ｇｐ４６の抗体に対して抗
原性を有するポリペプチドの新規な製造方法並びにその
方法に用いる、組換えベクターおよび組換えウィルスに
関する。

〔従来の技術〕

ＡＴＬの病因は、ＨＴＬＶ−１の感染であることが知ら
れておシ、該ＨＴＬＶ−）のワクチン、診断薬等として
有用な、ＨＴＬＶ−ｉの抗体に対して抗原性を有するポ
リペプチドを生産するための方法の開発が望まれていた
。

従来、ＨＴＬＶ−■に対して抗原性を有するポリペプチ
ドを生産するだめに、ＨＴＬＶ−１の外皮蛋白（ｅｎｖ
ｅｌｏｐｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　；以下ｅｎｖ蛋白と略記
する）の遺伝子で組換えられた大腸菌を増殖させ、産生
ずるポリペプチドを回収する方法が試みられている。

しかしながら、上記方法によって得られるポリペプチド
は、ＨＴＬｖ−Ｉの抗体に対する抗原性が低いものであ
った。これは大腸菌等の細菌類内では産生ずるポリペプ
チドに対して、糖鎖付加反応等の修飾がないことによる
ものと推定される。

一方、有用物質である蛋白の構造遺伝子をカイコ核多角
体病ウィルスＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝子部分に組み
換えた組換えウィルスを、カイコ樹立細胞又はカイコ生
体中で増殖させるポリペプチドの製造方法が、特開昭６
２−２０８２７６号及び特開昭６１−９２８８号におい
て知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ととるが、これらの公報には、前記したＨＴＬＶ−１の
抗原蛋白であるポリペプチドの製造に対して上記の方法
を適用することに関しては何の具体的彦記載もない。か
かる方法によるＨＴＬＶ−Ｉの抗原蛋白であるポリペプ
チドを製造するには、ＨＴＬｆ　１の構造遺伝子のいか
なる部分によってカイコ核多角体病ウィルスＤＮＡの多
角体蛋白構造遺伝子を組換えるか、また、これによりポ
リペプチドの産生が可能であるか、更には２す４プチド
が得られた場合、該ポリペプチドがＨＴＬＶ−１の抗体
に対して抗原性を有するかどうかについては、更に数多
くの研究が必要であった。

一方、本発明者等は、既にＨＴＬＶ−１の多角体蛋白構
造遺伝子の一部が、ＨＴＬＶ−Ｊ　ｅｎｖ蛋白遺伝子に
由来するＤＮＡのうち、ｐ２１をコードするＤＮＡを含
み且つ該ＤＮＡの５′末端から上流の１７塩基対以内で
切断された断片で組換えられた組換えウィルスをカイコ
樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染させ、該組換えウィ
ルスを増殖させることを特徴とするポリペプチドの製造
方法を提案した。該製造方法で得られるポリペプチドは
、ＨＴＬＶ−１の膜中および膜の内側に位置し、抗原性
の高い蛋白であるｐ２１を含むため、ＡＴＬ診断薬の抗
原として有用である。

しかし々から、ＡＴＬの診断は該抗原を用いた診断薬と
検定血清との反応性を判定しただけでは十分ではない。

なぜならば、ＨＴＬＶ−■のｅｎｖ蛋白は、上記ｐ２１
の他に表裏蛋白であるｇｐ４６によ多構成されている。

そして、該ｇｐ４６は、蛋白自体の抗原性はｐ２１に比
して低いものである。しかしながら、ＡＴＬ患者の血清
の中には、いかなる理由からかｇｐ４６を抗原として反
応させた場合しか陽性を示さないものが存在する。従っ
て、　ＡＴＬの診断をよυ完全に行うためには、診断薬
の抗原としてはｐ２１だけでなく　ｇｐ４６も補足して
用い、ＨＴＬＶ−４抗体陽性および陰性を総合的に判定
しなければならない。

そして、本発明者等は、上記ｇｐ４６の抗体に対して抗
原性を有するポリペプチドの有効な製造方法を開発すべ
く研究を重ねた。その結果、Ｉ（ＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白
遺伝子に由来するＤＮＡを、該ＤＮＡの５′末端から下
流のある特定の範囲内で切断して得られる断片で、カイ
コ核多角体病ウィルス（ＢｏｍｂｙｘＮｕｃｌｅａｒ　
Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ　：以下、Ｂｍ
ＮＰＶと略記する）の多角体蛋白構造遺伝子の一部を組
換え九組換えウィルスを、カイコ樹立培養細胞又はカイ
コ幼虫に感染することによって、かかる目的を達成し得
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、ＨＴＬＶ−Ｉ　ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来する
ＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端から下流７３塩基対
以上４９３塩基対以内で切断した、該切断部位から前記
ＤＮＡの３′末端までの断片（以下、ＨＴＬＶ−ＩＳ／
、、−３７断片と略す）により、ＢｍＮＰＶの多角体蛋
白構造遺伝子の一部の組換えを行い、次いで該組換えウ
ィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染して
ポリ４プチドを発現することを特徴とするポリペプチド
の製造方法である。

本発明の製造方法に使用する上記組換えウィルスの製造
方法は特に制限されるものではない。代表的な製造方法
として、ＡＴＬ患者末梢血からリンパ球を分離し、該リ
ンパ球から抽出したＤＮＡよシＨＴＬＶ−１５’　−３
’断片を切シ出し、これをカイコ発現系ベクターのクロ
ーニング部位に挿入して組換えベクターとし、次いで該
ベクターを用いてＨＴＬＶ−ＩＳ／−３／断片をＢｍＮ
ＰＶの多核体蛋白構造遺伝子の一部と組換えることによ
り製造する方法が挙げられる。

従って、本発明は上記ポリペプチドの製造方法に使用す
る、ＨＴＩ、Ｖ−１ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡ
のうち、該ＤＮＡの５′末端から下流７３塩基対以上４
９３塩基対以内で切断した、該切断部位から前記ＤＮＡ
の３′末端までの断片により、カイコ発現系ベクターを
組換えた組換えベクター、およびＨＴＬＶ−Ｊ　ｅｎｖ
蛋白遺伝子に由来するＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末
端から下流７３塩基対以上４９３塩基対以内で切断した
、該切断部位から前記ＤＮＡの３′末端までの断片によ
り、ＢｍＮＰＶの多角体蛋白遺伝子の一部を組換えた組
換えウィルスも提供する。

以下、上記について詳細に説明する。

１０組換えウィルスの製造 Ｉ　−Ｉ　ＢｍＮＰＶ 本発明において、ＨＴＬＶ−１５’−３’断片によりて
組換えられるＢｍＮＰＶは、養蚕業者に広く知られてい
るものであり、前出、古沢らが単離した代表的な株とし
て１３株があり、この株のウィルスＤＮＡは、米国のＡ
ＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣＡ　４０１８８と
して寄託されており、容易に入手し得る。又、ＢｍＮＰ
Ｖに感染したカイコより公知の方法によって単離するこ
ともできる。

上記ＢｍＮＰＶのＤＮＡは、第１図の制限酵素地図で表
わすことができる。

こ（７）　ＢｍＮＰＶ　ＤＮＡ　（７）うち本発明にお
いて、ＨＴＬＶ−１５′−３′断片によって組換えられ
る部分は、第１図に示される多角体蛋白遺伝子のうちプ
ロモーター部分を除いた多角体蛋白構造遺伝子の一部分
である。

１−２　　ＨＴＬＶ−１５’−３’断片の取得方法ＨＴ
ＬＶ−１は遺伝子としてＲＮＡを持つレトロウィルスで
あり、感染細胞内でこの遺伝子ＲＮＡに由来して合成さ
れるＤＮＡのｅｎｖ遺伝子を中心とする塩基配列として
は、５ｅｉｋｉらが”　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８０”（１９８３）第３６２１頁で
発表しだものが知られている。

上記塩基配列のうち、ＨＴＬＶ−■ｅｎｖ蛋白遺伝子に
由来するＤＮＡとは、第３図に示す通υ５１８０番目か
ら６６４３番目の配列をいう。即ち、この配列部分は、
ＨＴＬＶ−１の表裏蛋白であるｇｐ４６をコードする５
１８０番目から６１１５番目までの配列と、ＨＴＬＶ−
ｊの膜中および膜の内側に位置する蛋白であるｐ２１を
コードする６１１６番目から６６４３番目までの配列に
よって構成されている。

本発明において、）（ＴＬＶ−Ｉ　５’−３’断片の取
得方法は特に制限されない。代表的な方法にはＡＴＬ患
者末梢血中のリンパ球に所在するＤＮＡから該Ｉ（ＴＬ
Ｖ−■５′−３′断片を取得する方法が挙げられる。

代表的な方法を例示すれば、まず、ＡＴＬ患者末梢血か
らリン・ぐ球を分離し、該リン・ぐ球からＤＮＡを抽出
し、次いで制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、約２０キロ塩
基対断片を含むＤＮＡを得、該ＤＮＡをシャロン（ｃｈ
ａｒｏｎ　）　４　ＡベクターのＥｃｏＲＩ制限酵素切
断部位に接続した後、ＨＴＬＶ−１のプロウィルスを含
むファージをスクリーニングで単離し、該プロウィルス
からｐＵＣベクターに代表される大腸菌のベクター系を
使用したサブ・クローニングおよび制限酵素による切断
によｆｉ　ＨＴＩ、Ｖ−１５’　−３’断片を得る方法
である。

ＨＴＬＶ−Ｉ　５’　−３’断片は、ＨＴＬＶ−■ｅｎ
ｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′
末端から下流７３塩基対から４９３塩基対以内で切断し
た、該切断部位から前記ＤＮＡの３′末端までの断片で
あればすべて適用できる。該ＨＴＬＶ−１５’−３’断
片を、前記５Ｉｉｋｉらが発表しているＨＴＬＶ−）　
ｅｎｖ蛋白遺伝子配列で説明すると５２５３番目から５
６７３番目以内で切断され、該切断部位から６６４３番
目までの断片に相当する。即ち、ＨＴＬＶ−１５’　−
３’断片は、ＨＴＩ、Ｖ−Ｉｅｎｖ蛋白遺伝子のうち、
ｇｐ４６をコードするＤＮＡ配列部分の特定の一部とｐ
２１をコードするＤＮＡ配列部分よυ構成されている。

上記切断部位の好適なる部位を示せば、）ＩＴＬＶ−ｌ
　ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡの５′末端から下
流へ４９４塩基対隔てた位置よりＣＧ’・″“と配列し
ているＡｃｅ）制限酵素切断部位、或いは上記ＤＮＡの
５′末端から下流へ７４−塩基対陽てた位置・＋＝７　
ｃ”。

と配列しているＰｖＪ制限酵素切断部位等が挙げられる
。

また、該ＨＴＬＶ−Ｉ　５’　−３’断片は、後述する
カイコ発現系ベクターに挿入可能な大きさである限り、
上記切断部位、およびＨＴＬＶ−１遺伝子に由来するＤ
ＮＡのうちｅｎｖ蛋白遺伝子の３′末端よシ下流に存在
する任意の制限酵素切断部位で切断した断片に含まれた
形で採取して用いるのが好適である。代表的なｅｎｖ蛋
白遺伝子の３′末端よシ下流に存在する制限酵素切断部
位としては、該３′末端から下流へ８７塩基対隔てた位
置より　ＴＧＣＡと配列しているＰａｔｌ制限酵素切断
部位等が挙げられる。

但し、本発明者等の知見によれば、組換えに用いる断片
は、上記ＨＴＬＶ−１５’　−３’断片を含んでいても
、ＨＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡの５
′末端の下流７３塩基対よシ、上流の塩基配列を含んで
いる場合、後記する方法によりとの断片を用いて得られ
たＢｍＮＰＶの組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又
はカイコ幼虫に感染してポリペプチドを産生じようとし
ても、生産量が極変に低下してしまう。例えば、ＨＴＬ
Ｖ−（ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡの全配列を用
いた場合、ポリペプチドの合成はほとんど進行しない。

まだ、組換えに用いる断片が、ＨＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白
遺伝子に由来するＤＮＡの５′末端の下流４９３塩基対
より、更に下流で切断したものである場合、得られるポ
＋）　＜プチドは、ｇｐ４６の抗体に対して抗原性を有
しなくなる。

従って、本願発明のＨＴＴ、Ｖ−１５’　−３’断片は
ＨＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡのうち
、該ＤＮＡの５′末端から下流７３塩基対以上４９３塩
基対以内で切断したものであることが極めて重要である
。

本発明において、前記ＨＴＬＶ−１５’　−３’断片は
、カイコ発現系ベクターに組換えられた後、該組換えベ
クターによりＢｍＮＰＶの多角体蛋白構造遺伝子の一部
と組換えて組換えウィルスとされる。組換えウィルス取
得のために使用するカイコ発現系ベクターとしては、ｐ
ＢＦベクターが挙げられる。ｐＢＦベクターは、第２図
の制限酵素地図により特徴づけられるものである。即ち
ｐＢＦベクターは、　ＢｍＮＰＶＤＮＡの多角体蛋白遺
伝子のプロモーター領域と多角体蛋白構造遺伝子前後付
近及び大腸菌のベクターであるｐＵＣベクターの遺伝子
とを含むベクターである。

上記ｐＢＦベクターは、Ｘｂａｌ　、　ＥｃｏＲＩ　、
　Ｓｔｕ■制限酵素切断部位のクローニング部位がある
。

かかるｐＢＦベクターは、そのクローニング部位の上流
に塩基配列ＡＴＧから始まる多角体蛋白構造遺伝子をど
の部位まで含んでいるかで糧類があり、第４図に示すよ
うなｐＢＦ４〜ｐＢＦ’１３３が存在している。

組換えベクターの製造においては、上記ベクターのうち
挿入するＨＴＬＶ−１５’　−３’断片部分とｐＢＦベ
クター上流部分とのリーディング・フレームが合うもの
であれば、どのベクターを使用してもよい。

しかし　Ｓ／　＋　ａ／断片をカイコ樹立培養細胞およ
びカイコ幼虫で効率よく発現できる組換えウィルスを作
成するためには、塩基配列ＡＴＧから開始されるＢｍＮ
ＰＶ　ＤＮＡ由来の多角体蛋白構造遺伝子の一部をコー
ドした遺伝子部分を多く含んでいるｐＢＦべフタ−、例
えばｐＢＦ１２４　、　ｐＢＦ１２９　、　ｐＢＦ１３
３等の１３ＢＦ　ベクターを使用するのが望ましい。

導入方法 上記１）ＢＦ　ベクター　へ（Ｄ　ＨＴＬＶ−１５ｔ　
−３を断片の挿入は、　ｐＢＦベクターのクローニング
部位に存在するＥｃｏＲ）　、　Ｘｂａｉ　、　５ｔｕ
ｌ制限酵素切断部位を利用して行なえばよい。ｐＢＦベ
クタークローニング部位にＨＴＬＶ−Ｉ　５’−３’断
片を挿入するには、ＤＮＡ合成又は大腸菌のベクター系
であるｐＵＣベクターへの挿入、切断等の公知の手段に
より、該断片の両端にＥｃｏＲＩ　、　Ｘｂａｉ或いは
５ｔｕＩ制限酵素切断部位を接続するか、該断片の５′
端にＥｃｏＲＴ、３′端にＳｔｕ■制限酵素切断部位を
接続するか、更には該断片の５′端にＸｂａｌ、３’端
Ｋｓｔｕｌ制限酵素切断部位を接続するかのいずれかの
操作が一般に行われる。以上のうちでも、ＨＴＬＶ−Ｊ
　５’−３’断片の両端にＥｃｏＲＩ或いはＸｂａｌ制
限酵素切断部位を接続する方法が好ましい。

そして５／　−３／断片の両端にＥｃｏＲ）制限酵素切
断部位を接続する場合、該断片はｐＢＦベクターを１ｉ
：ｃｏＲ１制限酵素で切断したものと接続する。又、Ｈ
ＴＬＶ−Ｊ　５’−３’断片の両端にＸｂａｌ制限酵素
切断部位を接続した場合も同様に、該断片はｐＢＦベク
ターをＸｂａｌで切断したものと接続する。この場合接
続に際しては、予め制限酵素で切断したｐＢＦベクター
に対し、アルカリフォスファターゼ処理を行なイ、ｐＢ
Ｆヘクターのセルフライク９−ジョン（ｓｅ　ｌｆ−１
１ｇａｔｉｏｎ）を避けることが好ましい。

又、ＨＴＬＶ−１５’−３’断片の５１端にＥｃｏＲ）
　、　　３’端に５ｔｕｌ制限酵素切断部位を接続する
場合、該断片は、ｐＢＦベクターをＥｃｏＲ（、５ｔｕ
Ｉで切断したものと接続し、ＨＴＬＶ−１５’−３’断
片の５′端にＸｂａ）　、　３’端に５ｔｕ（制限酵素
切断部位を接続する場合、該断片は、ｐＢＦベクターを
Ｘｂａｌ、　５ｔｕ）で切断したものと接続すればよい
。

かかる接続方法は、りが−ゼを用いて公知の方法により
行うことができる。例えば制限酵素で切断されたｐＢＦ
ベクターのＤＮＡの量に対して、挿入すべき５′−３′
断片のＤＮＡ量が３〜８倍量になるように調整し、例え
ばＴ　４　ＤＮＡすが一部を用いて接続する方法である
。

上記のＨＴＬＶ−Ｉ　５’−３’断片を挿入したｐＢＦ
ペクタの分離及び確認は、下記の方法により行うことが
できる。

即ち、分離は前記の接続反応液をＪＭ１０９株（宝酒造
（株）製　Ａ９０５２　）　、　ＭＶ１１８４株（宝酒
造（株）製）で代表される大腸菌のコンぎテントセルに
加え、公知の方法で大腸菌の形質転換を行ない、ｐＢＦ
ベクターがアンピシリン耐性遺伝子を含んでいることか
ら、形質転換後の液をアンピシリンを含んだＬＢ寒天培
地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば３７℃で１
２時間〜２０時間培養して出現するシングル・コロニー
を形質転換株として取得することによって行うことがで
きる。

また、ＨＴＬＶ−（５’−３’断片を挿入したｐＢＦ’
ベクターの確認は、形質転換株に存在する組換えベクタ
ーがイリング法（ｂｏｉｌｉｎｇ法）或いはアルカリ・
リンス法（ａｌｋａｌｉ　１ｙｓｉｓ法）を用いてミニ
・プレバレージョン（ｍ１ｎｔ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ　）　Ｌ、組換えベクター懸濁液を取得し、このよう
にして調製した組換えベクター懸濁液をＨＴＬＶ−１５
’−３’断片が挿入されていることが確認できる任意の
制限酵素、例えばｇｃｏＲ（、Ｘｂａ　Ｉで切断し、切
断物をアガロースダル電気泳動し、エチジウム・ブロマ
イドによる染色後、予想できる位置にバンドが存在する
が否かを確認することによって行うことができる。尚、
ｓ／−ａ／断片の両端をＥｅｏＲ）或いはＸｂａｉ制限
酵素切断部位にしたものをｐＢＦベクターのＥｃｏＲｉ
　、　Ｘｂａｌ制限酵素切断部位に挿入した組換えベク
ターの場合は、　ｐＢＦベクターの上流部分と挿入する
５′−３′断片が正しい方向に結合しているかどうか確
認できる制限酵素、例えば、ＢａｍＨＪ　、　ＸｈｏＩ
等で切断し、その切断物を同様にアガロースゲル電気泳
動し、エチジウム・ブロマイドによる染色後、予想でき
る位置にバンドが存在するか否かも同時に確認するとよ
い。

上記方法で形質転換株として分離した組換えベクターは
、該形質転換株を増殖させることＫより、その景を増加
させて使用することが好ましい。例えば該組換えベクタ
ーを所有する形質転換株をアンピシリンを含んだＬＢ液
体培地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば３７℃
で１２時間〜２０時間撮盪培養し、該培養物からアルカ
リ・リンス法（ａｌｋａｌｉ　１ｙｓｉｓ法）を用いて
ミデイアム・プレバレージョン（ｍｉｄｉｕｒｍ　ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ　）　ｌ、、組換えベクター懸濁液
を取得することによって行うことができる。

取得した組換えベクターも前記した方法と同様な方法で
再度目的の組換えベクターであるか否かを確認すること
が好ましい。

得られた組換えベクター懸濁液は、アールエヌエース処
理（ＲＮａｓｅ処理）して組換えウィルス取得用の組換
えベクター懸濁液として使用することが好ましい。

ｌ−３−（２）　　組換えウィルスの取得本発明におい
て、ＨＴＬＶ−１５’−３’断片によって、多角体蛋白
構造遺伝子の一部が組換えられた組換えＢｍＮＰＶは、
ＢｍＮＰＶ　ＤＮＡと前記組換えベクターとをカイコ樹
立細胞にカルシウム沈澱法を用いて、同時ニトランスフ
ェクション（コ・トランスフェクション）シ、組換えベ
クターとＢｍＮＰＶ　ＤＮＡ間の対立遺伝子を置き換え
ることによυ取得することができる。

上記のコ・トランスフェクションは、具体的には０．２
５Ｍ塩化カルシウムおよびキャリヤＤＮＡの存在下でＢ
ｍＮＰＶ　ＤＮＡと組換えベクターＤＮＡをモル比１　
：　Ｚｏｏになる様に混ぜ、その後、該混合液に、０．
２８Ｍ塩化ナトリウムを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｐ）（
７，１）とリン酸緩衝液の混合液を添加し、混和後、該
混和液をＢｍ培養細胞中に添加するという前日、古沢ら
の方法（特公昭６１−９２９７号）に従って行なうこと
が望ましい。

コ・トランスフェクションした後、組換えウィルスを含
む反応液は室温付近の温度、例えば２７℃で５〜６日間
培養し、培養後、培地を回収、遠心後、上清を組換えウ
ィルスのクローニングに使用する。コ・トランスフェク
ションで得られた反応液の上清からの組換えウィルスの
クローニングは、プラークアッセイ法（Ｊ、５ｅｒｉｃ
　Ｓｅｔ、　Ｊｐｎ、　５３５４７（１９８４）　’：
］やリミッティング・ダイリーーション法により組換え
ウィルスを単離することによって行えばよい。どちらの
方法を使用しても良いが、操作法の容易さ、分離回数の
少々くて済む点から、リミッティング・グイリュージョ
ン法を使用する方が良好である。

上記リミッティング・ダイリューション法ヲ使用しての
組換えウィルスのクローニングは、コ・トランスフェク
ションで得られたウィルス液を希釈し、該ウィルス希釈
液と１×１０５〜Ｉ　Ｘ　１０６力イコ細胞数／ｍＩ！
カイコ培養培地、好ましくはＴＣ−１０培地（第２表参
照）の濃度で調整しであるカイコ樹立細胞液とを】：１
で混合することによシ感染させ、この混合液をマイクロ
タイタートレー中のウェルへ注入し、室温付近の温度、
例えば２７℃で培養し、培養２〜７日後、マイクロタイ
タートレー中のウェルを検鏡し、ウェル中で見られるカ
イコ細胞の形状、形態で組換えウィルス存在の有無を判
定する。検鏡することで見い出されるカイコ細胞の形態
には、第５図に示すように３種類確認できる。

第５図におけるウィルスが感染した形態を示しているカ
イコ細胞で且つ該細胞内に多角体蛋白が検出されない細
胞のみが存在しているウェル中の培地を回収、遠心し、
その上清を回収することによシ組換えウィルス液が得ら
れる。ウェル中に野生株であるＢｍＮＰＶと組換えウィ
ルスとが混在している場合は、該ウェル中の培地を回収
し、リミッティング・ダイリーーションを繰シ返し行な
い、組換えウィルスを分離することが好ましい。

■、ポリペプチドの製造 ｎ−１カイコ樹立培養細胞 本発明において組換えウィルスを感染させるカイコ樹立
培養細胞としては、ＢｍＮＰＶが増殖できるカイコ樹立
培養細胞であれば、どの細胞でも良い。

ＢｍＮＰＶが増殖可能なカイコ樹立培養細胞には、Ｖｏ
ｌｋｍａｎ、　Ｌ、Ｅ、、　ａｎｄ　Ｇｏｌｄｓｍｉｔ
ｈ、　Ｐ、Ａ、　（１９８２）　：Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　４４．２２７−
２３３に示されているＢｍ−Ｎ、　（ＡＴＣＣＡ　ＣＲ
Ｌ−８９１０）および前日らがＢｍ−Ｎよシクローニン
グしたＢｍ−Ｎ２．Ｂｍ−Ｎ４のよう々セルラインが知
られている。ＢｍＮＰＶの増殖の良さ、扱いやすさの点
で、Ｂｍ−Ｎ４カイコ樹立培養細胞を使用するのが適当
である。又、感染に用いるカイコ樹立培養細胞は、公知
の培養条件、例えば、１０チ小牛脂児血清を含むＴＣ−
１０培地で２７℃、４日間の条件で、培養したものを使
用するのが適当である。

本発明において、目的とするポリペプチドは、前記組換
えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
させ、増殖させることによって発現される。核組換えウ
ィルスのカイコ樹立培養細胞への感染方法は、公知の方
法が特に制限なく使用される。例えば、準備したカイコ
樹立培養細胞の培養液を容器に入れ、該細胞を容器の底
面に沈着させた後、該容器の底面に付着しているカイコ
樹立培養細胞がはがれないように古い培養液を抜き取り
、安定剤としての牛胎児血清をカイコ培養培地を添加し
、該培養物に組換えウィルスを滴下する方法を用いるの
が一般的である。組換えウィルスの増殖は、組換えウィ
ルスを感染させた後、室温付近の温度、例えば、２７℃
で数日間培養することによって行うことができる。

培養後、感染したカイコ樹立細胞培養物は、遠心分離し
た後、沈澱した細胞は、後記するＨＴＬＶ−ＩＱｎＶ蛋
白の発現確認およびＩ（ＴＬＶ−）　ｅｎｖ蛋白の精製
に使用し、また、上清はカイコ幼虫に感染させる組換え
ウィルス液として使用してもよい。

また、組換えウィルスをカイコ幼虫に感染させる方法も
特に制限されない。一般に、感染させるカイコ幼虫は、
カイコ５令幼虫を使用するのが好ましい。カイコ幼虫へ
の感染は、前記のカイコ樹立細胞への感染で上清として
得られるウィルス力価を高めた組換えウィルス液又は該
操作を行なわない組換えウィルス液を経皮的に１０〜１
００μｌ程注入することで行なうことができる。組換え
ウィルスを感染させた後、感染カイコを飼育することで
、組換えウィルスを増殖させ、多角体蛋白とＨＴＬＶ−
■ｅｎｖ蛋白の特定部の融合蛋白がカイコ幼虫の脂肪体
内に蓄積される。

カイコの飼育方法は、特に制限されないが、桑の葉或い
は桑の葉をホモジェネートし、滅菌後凍結乾燥した波−
スト様試料（協同試料（株）社製等）に蒸留水を浸した
ものいずれかを与え、室温付近の温度、例えば、２７℃
で培養する一般的な方法を採用すればよい。

飼育期間は、カイコ幼虫が死亡する直前まで行なうこと
が好ましい。感染させる組換えウィルス液のウィルスの
力価で飼育期間は多少異々るが、感染して３日〜５日後
を飼育期間の目安とすることができる。

上記のカイコ幼虫から、脂肪体を取り出し、該脂肪体を
特定のＨＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白発現の確認および該ＨＴ
ＬＶ−１ｅｎｖ蛋白の精製に用いる。

上記脂肪体の取得方法は、組換えウィルスを感染したカ
イコ幼虫を中腸を切らないように注意深く表皮を切るこ
とで解剖し、中腸等の器官を除去後、ス・ぐチーラ等で
下腹部に蓄積している脂肪体をかき取ることにより取得
する方法が推奨される。

本発明において、前記方法で得られた組換えウィルス感
染カイコ樹立細胞および組換えウィルス感染カイコ幼虫
の脂肪体からポリペプチドを分離する方法は特に制限さ
れないが、例えば、ＰＢＳ緩衝液等の中性緩衝液に該カ
イコ樹立細胞又は脂肪体を顕濁し、ソニケーションによ
る分散後、尿素水溶液を添加して再度ソニケーションし
た後、遠心分離し、沈澱物を回収する方法が好適である
。

また、上記のポリペプチドはｐＢＦベクターの有す多角
体蛋白遺伝子部分の発現による多角体蛋白の一部とＨＴ
ＬＶ−Ｉ　５’−３’断片部分の発現によるＨＴＬＶ−
４ｅｎｖ蛋白の特定部の融合蛋白である。そして、ＨＴ
ＬＶ−１５’−３’断片は、前述した通りｇｐ４６（７
）特定の一部をコードするＤＮＡ配列部分とｐ２１をコ
ードするＤＮＡ配列部分によす構成されている。しかし
ながら、上記ポリペプチドの分子量は、１５〜３５　ｋ
ｄであり、上記ＤＮＡ配列から予測されるものより９２
１の分子景分だけ小さいものである。そして、後述する
実施例から明らかな様に、本発明で得られるポリペプチ
ドは、抗多角体蛋白抗体およびＨＴＬＶ−■患者血清と
は良好に抗原−抗体反応をおこすが、正常人血清および
ｐ２１に対するモノクロナール抗体とは抗原−抗体反応
をおこさ々い。即ち、核ポリペプチドにおいて含有され
るＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ蛋白は、ＨＴＬＶ−１５’−３’
断片のうち、上記ｇｐ４６に関するＤＮＡ配列部分のみ
の発現物でｓ　ｇｐ４６の抗体に対して良好な抗原性を
有するものである。

尚、得られた該ポリペプチドは場合によっては、化学的
あるいは酵素的方法を組合わせて多角体蛋白部分を除く
ことにより、更に精製して使用することができる。

多角体蛋白を除く方法を具体的に示せば、多角体蛋白と
ＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ蛋白部分の接合部付近のアミノ酸配
列を認識する蛋白質分解酵素を使用してその部分を切断
後、ケ゛ル濾過等の分子量の違いを利用した精製手段で
精製するのが良好である。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、ＨＴＬＶ−）の表裏蛋白であるｇｐ４
６の抗体に対して良好な抗原性を示すポリペプチドを効
率良く産生することが可能であシ、産業上の利用分野 価値は極めて大きいものである。また、得られたポリペ
プチドは、ＡＴＬに対するワクチンの作成およびＡＴＬ
診断薬の抗原として有用である。例えば、ＡＴＬ診断薬
への応用例として、ラテックス粒子に、抗原として該ポ
リペプチドを付着させ、この粒子にマイクロタイタープ
レート中で検定血清を反応せしめ、該粒子の凝集および
非凝集によｈ　、　ｇｐ４６抗体陽性および陰性を判定
する。ＡＴＬ患者の血清の中には、ｇｐ４６を抗原とし
て反応させた場合しか陽性を示さないものが存在するか
ら、上記結果をｐ２１の抗体に対して抗原性を有するポ
リペプチドを抗原に用いた場合の判定結果に補足させる
ことにより、よシ確実なＡＴＬの診断を行うことが可能
である。

〔実施例〕

実施例１ （ＨＴＬＶ−Ｉ　ｅｎｖ蛋白遺伝子由来のＤＮＡの取得
）ＡＴＬ患者末梢血１０ｍ１から公知の方法に従いリン
ノｆ球を分離し、該リンノ千球をゾロテインナーゼＫ（
ノグマ社製ＰＯ３９０）で処理した後、フェノール・ク
ロロホルム抽出エタノール沈澱ヲ行イＡＴＬ患者由来の
リンパ球のＤＮＡｌＩｎ９を得た。

該ＤＮＡ　１０μｇを第４表Ａ１に示す組成の溶液中で
ＥｃｏＲＩ制限酵素（宝酒造（株）製　４１０４０）に
よシ切断し、エタノール沈澱後、ＴＥ緩衝液２００μノ
に溶解した。

そして該溶液を、ショ糖密度勾配遠心（ショ糖１０〜４
０％ｗｔ／ｖｏｌ、　２６００　Ｏｒｐｍ　、　１８時
間）にかけ、アガロースデル電気泳動による確認で２０
キロ塩基対に相当するＤＮＡ断片を得た・次にこのＤＮ
Ａ断片１．０μｇをシャロン４Ａベクター（ベクターＤ
ＮＡ、末神佳之講談社１９８６参照）のＥｅｏＲＩ制限
酵素切断部位への接続を行い、シャロン４Ａベクターに
存在するＥｃ　ｏＲＩ切断部位に該ＤＮＡ断片を挿入し
た。この接続は、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株
）製Ａ２０１１）を用い、接続反応は、第５表に示すよ
うな組成の溶液中で、１５℃。

１２時間行なった。次いで、得られたＤＮＡについティ
ン・ビトロ・パッケージングを行なった後、処理液を遠
心分離（７０００ｒｐｍ　、２時間）し、上清をゾラー
クハイプリダイゼーション用の組換えファージ液とした
。該組換えファージ液を指示菌ＬＥ３９２　（宝酒造（
株）製）に感染し、ノラークを形成した後、５２ｐでラ
ベルしたＨＴＬＶ−Ｉ　ｐｏｌＤＮＡ含有断片をグロー
ブにゾラークハイプリダイゼーションを行ない、ＨＴＬ
Ｖ−Ｉ遺伝子由来のＤＮＡを含むファージを単離した。

得られた組換え７アーノを、第４表屋１に示す組成の溶
液中で、Ｈｌｎｄｌ［Ｉ　（宝酒造（株）製）、Ｅｃｏ
ＲＩ　（宝酒造（株）製　４１０４０）制限酵素により
切断し、ＨＴＬＶ−１遺伝子由来のＤＮＡのうちｅｎｖ
−ｐｘ−ＬＴＲ領域に相当し、且っＨＴＬＶ−Ｉ　ｅｎ
ｖ蛋白をコードするＤＮＡを含む約３．９キロ塩基対の
ＤＮＡ断片を４００μＩ得た。そして、大腸菌用ベクタ
ー　ｐＵｃ１９　（宝酒造（株）製　Ａ３２１９）を同
様な条件下でＨｉｎｄＩ［Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ制限酵素
により切断し、切断部位への上記ＤＮＡ断片の接続反応
を行なった。

得られた接続反応液は、後述する、ＨＴＬＶ−１５’−
３’断片を含むＡｃｃｉ　−ＸｂａＩ断片ＤＮＡと、ｐ
Ｕｃ１１８の接続反応液と同様に、大腸菌ＪＭ１０９　
（宝酒造（株）製Ａ９０５２　）ｏ形Ｊ［換、ミニ・プ
レバレージョン、ソシてミデイアム・プレバレージョン
へ、！：続＜−連の操作に使用した。以上の操作の結果
、ＨＴＬＶ−１ｅｎｖ−ｐｘ−ＬＴＲ領域遺伝子に由来
するＤＮＡ断片がｐＵＣ１９に正しい方向で挿入してい
る組換えベクターＰＨＴ　３．９Ｋｂ／ｐＵｃ１９を４
００μｙ得た。

上記組換えベクターＰＨＴ　３．９　Ｋｂ／ｐＵｃ１９
２００μｙを、第４表洗３に示す組成の溶液中で、ｐｓ
ｔｌ（宝酒造（株）製　Ａ　１０７３　）　、　Ｈｌｎ
ｄＩＩＩ　（宝酒造（株）製Ａ１０６０）を使用して、
切断し、ＨｉｎｄｌｌＩ　−ＰｓｔＩ断片（約１７００
塩基対）を得る。

一方、大腸菌ベクターｐＵｃ１９を第４表４１に示す組
成の溶液中で５ａｌＩ　（宝酒造（株）製　Ａ１０８０
）を使用して切断し、マングビーン・ヌクレアーゼ（宝
酒造（株）製　墓２４２０）処理後、接続し、Ａｃｃ（
。

５ａｉｌ　、　Ｈｌｎｃ［制限酵素切断部位のないｐＵ
ｃ１９を得た。次に、該ｐＵｃ１９を第４表洗２に示す
組成溶液中でＨｊｎｄｌｌＩ　、　Ｐｓｔｌを使用して
切断し、該ベクターのＨｉｎｄｌｌＩ　、　ＰｓｔＩ切
断部位に上記Ｈｉｎｄｌｌｌ　−Ｐｓｔｌ断片を接続し
た。

次いで、接続反応液を大腸菌ＪＭ１０９の形質転換、ミ
ニプレバレージョンと続く一連の操作に使用し、Ｈｉｎ
ｄＩ［Ｉ−Ｐｇｔｌ断片が上記ｐＵｃ１９ベクターに正
しい方向で挿入している組換えｐＵｃ１９ベクターを４
００μＩ得た。更に、第４表厘２に示す組成の溶液中で
、組換えｐＵｃ１９ベクターをＡｃｃＩ　（宝酒造（株
）製　屋１００１）　、　Ｘｂａｌ　（宝酒造（株）製
４１０９３）を使用して切断し、ＨＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋
白遺伝子に由来するＤＮＡのうち後半部分に相当するＡ
ｃｃｌ−Ｘｂａｌ断片（約１０６０塩基対）取得した。

一方、組換えベクターＰ）（’ｒ　３．９　Ｋｂ／ｐｕ
ｃ１９．２００μＩを、第４表厘５に示す組成の溶液中
でＮｃｏｌ制限酵素（宝酒造（株）製　４１１６０）を
使用して切断し、Ｎｃ　ｏ　Ｉ　−Ｎｃ　ｏ　ｌ断片（
約６１０塩基対）を得た。

一方、大腸菌ベクターｐＵｃ１８　（宝酒造（株）製　
屋３２１Ｂ）を第４表Ａ３に示す組成の溶液中でＨｉｎ
Ｊ制限酵素（宝酒造（株）製　Ａ１０５９）で切断し、
該ベクターのＨｌｎｃｌ［制限酵素部位に上記Ｎｃｏｌ
−Ｎｃｏｌ　断片’ｌ：フィルイン・ライダージョンに
よって、接続した。次いで、接続反応液を、大腸菌ＪＭ
１０９の形ａ転換、ミニ・プレバレージョン、そしてミ
デイアム・プレバレージョンと続く一連の操作に使用し
、ＮｃｏｌＩ−Ｎｅｏｌｉ断片が上記ｐＵｃ１８ベクタ
ーに正しい方向で挿入している組換えｐＵｃ１８ベクタ
ーを４００μｇ得た。該ベクターを第４表厘６に示す組
成の溶液中で、Ｘｂａｌ、Ａｃｅｉ制限酵素で切断し、
ＨＴＬＶ−）　ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡの前
半部分に相当するＸｂａ　Ｉ　−Ａｃ　ｃ　ｌ断片（約
５００塩基対）を得た。

次いで、大腸菌ベクターであるｐＵｃ１１９　（宝酒造
（株）Ｉｔ！　　４３３１９　）を第４表Ａ６に示した
組成の溶液中でＸｂａｌ制限酵素（宝酒造（株）製　ｍ
ｌ　Ｏ９３）によシ切断し、得られたベクターと上記Ａ
ｃａｌ−Ｘｂａｌ断片及びＸｂａｉ−Ａｃｃｉ断片との
接続を行なった。

そして、接続反応液を大腸菌ＪＭ１０９の形質転換、ミ
ニ・プレノぐレーション、そしてミデイアム・プレバレ
ージョンへと続く一連の操作に使用し、ＨＴＬＶ−Ｉ　
ｅｎｖ蛋白遺伝子由来のＤＮＡがｐＵＣ１１９ベクター
に正しい方向で挿入している組換えベクターｅｎｖ／ｐ
Ｕｃ１１９　、２００μｇを得た。以上の工程を第６図
に示す。

（組換えベクターの製造） 前記の方法で得られた組換えベクターｅｎｖ／ｐＵＣ１
１９，２００ｔｉｌを第４表Ａ６に示す組成の溶液に溶
解し、次いでｘｂａ　ｌ制限酵素を断続的に９時間添加
していき、切断反応を行なった。アガロースダル電気泳
動により該切断反応の終了を確認後、更にこの反応液に
Ａｃｃｌ制限酵素を断続的に４時間添加していき、切断
反応を行なった。

切断後、フェノール抽出、エタノール沈澱を順次行なっ
た後、沈澱したＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐｉ−１８，０）
に溶解し、該ＤＮＡ溶解液をアがロースグル電気泳動し
た。そしてＩ（ＴＬＶ　−（５′−３’断片を含むＡｅ
ｅｌ−ｘｂａｉ断片に相当するバンド部分の寒天片を切
り出し、電気泳導による溶出によって該断片を抽出した
。

次いで、抽出液を更にフェノール抽出し、エタノール沈
澱してＨＴＬＶ−Ｉ　５′−３’断片を含むＡｃｃ　１
−ｘｂａ　１断片を得た。

ここで、該Ａｃｅ　Ｉ　−ｘｂａ　ｌ断片に含有される
ＨＴＬＶ　−Ｉ　５’−３’断片は、ＨＴＬＶ−■ｅｎ
ｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′
末端から下流４９３塩基対で切断した、該切断部位から
前記ＤＮＡの３′末端までのものである。

一方、大腸菌用ベクターｐｖｃ　１１８　（宝酒造■製
Ａ３３１’８　）１０μｇを第４表厘１に示す組成の溶
液に溶解し、次いでＥｃｏＲ）制限酵素を断続的に９時
間添加していき、切断反応を行なった。

次いで得られた反応液をアルカリフォスファターゼ懸濁
液（宝酒造■製Ａ２１２０）１μノにより、６０℃で３
０分間反応させた。アルカリフォスファターゼ反応停止
後、該反応液をフェノール抽出、エタノール沈澱し、Ｅ
ｃｏＲＩ制限酵素で切断されたｐＵＣ１１８を得た。

そして、該ベクター　０．２　ｔｄ！と前記ＨＴＬＶ−
Ｉ　５’−３’断片を含むＡｃｅ　Ｉ−ｘｂａ　ｌ断片
０．２５　ｐｌ！を、第５表に示す溶液中で混合し、Ｔ
４ＤＮＡ　ＩＪガーゼを用いて、１６℃、３時間以上、
フィルインライダージョンを行なった。

そして該操作により得られた接続反応液２５μｌを大腸
菌ＪＭ１０９のコンピテントセル懸濁液２００μｌに添
加し、氷上で３０分放置した。その後、４２℃で２分間
ヒート・ショックし、更に、室温に戻した後、ＬＢ液体
培地８００μノを添加し、３７℃で１時間おだやかに振
盪培養した。

該液体培地１００μノを、アンピシリン１００μ９／ｍ
ｌを含むＬＢ寒天培地１５ｎｔｆ＋／プレートに接ａ後
、３７℃で１２時間培養した。培養後出現したシングル
コロニー２０個を取り出し、それぞれをアンピシリン３
０μｇ／７ｎｌ含むＬＢ液体培地１５ｒｎｌに接種し、
３７℃で８時間培養した。それぞれの液体培地から１ｄ
ずつ採取し、各採取培地中の大腸菌内に所在するプラス
ミドをミニ・プレバレージョン法によシ抽出した。得ら
れた各プラスミドのそれぞれを、Ｅ（！ＯＲＩ制限酵素
およびＢａｍＨＩ制限酵素（全酒造■製Ａｌ０ＩＯ）に
より切断反応を行った。

反応後、各反応液をアがロースダル電気泳動し、ＨＴＬ
Ｖ　−Ｉ　５’　−３’断片を含むＡｃｅ　■−ｘｂａ
　Ｉ断片ばｐＵＣ１１８に正しい方向で挿入しているプ
ラスミドを確認した。

この確認したプラスミドを所有している大腸菌が存在す
る前記液体培地から０．２　ｒｎｌを採取し、アンピシ
リン１００μｇＡｎ！、　　を含むＬＢ液体培地５０ｍ
、ｌに接種後、３７℃で１２時間培養した。

得られた液体培地中の大腸菌内に所在するプラスミドを
ミデイアム・プレバレージョン法にヨリ抽出し、組換え
ベクターＡｃｅ　Ｉ　Ｅｎｖ（１０００）／　ｐＵｃ１
１８４００μＩを得た。

該組換えベクターＡｃｃＩ　Ｅｎｖ（１０００）／ｐＵ
ｃ１１８２００μｙをＥＣ０ＲＩ制限酵素により、前記
と同様の切断条件で切断した。得られた切断物を前記ア
ガロースダル電気泳動することで、ＨＴＬＶ−１５’−
３’断片を含むＥ（！ＯＲｌ　−ＥｃｏＲＩ断片（約１
０００ｂｐ）０．１５μｇを得た。

又、カイコの発現系ベクターｐＢＦ　１２４．１０μｌ
をＥｃｏＲＩ制限酵素により、前記と同様な切断条件で
切断し、次いでアルカリフォスファターゼ処理した。

上記ＨＴＬＶ　−Ｉ　５’−３’断片を含むＥｃｏＲｉ
　−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片１．２５μｇとＢｃ　ｏＲ
Ｉ制限酵素で切断されたｐＢＦ１２４　０．２μＩを混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより前述と同様な方法で接
続反応を行なった。

そして、前記と同様な方法により、この接続反応液を用
いた大腸菌ＪＭＩ　Ｏ９の形質転換及び、該形質転換菌
の分離を行なった。次いで、分離された各培養物ごとで
一連のミニ・プレノやレーション操作を実施し、それぞ
れの液体培地の一部からシラスミドを抽出した。

次いで、谷シラスミドに対して、ＥｃｏＲＩ制限酵素お
よびＢａｍＨＩ制限酵素による切断反応を行い、アガロ
ースダル電気泳動により、ＨＴＬＶ　−Ｉ　５’−３’
断片を含むＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡがｐＢＦ
１２４に正しい方向に挿入されているプラスミドを確認
した。

この確認したプラスミドを所有している大腸菌が存在す
る液体培地から０．２　ｍＪを採取し、アンピシリン３
０１Ｉｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５０罰に接種後、３
７℃で１２時間培養した。

該液体培地中の大腸菌内に存在するプラスミドをミデイ
アム・プレｉ４レーション法により抽出し、組換えベク
ター　ＡｃｃＩ　Ｅｎｖ（１０００）／　ｐＢＦ　１２
４２００１１１１を得た。この組換えベクターＡｃｃＩ
　Ｅｎｖ（１０００）／゛ｐＢＦ　１２４はＥ、ｃｏｌ
ｉに導入し、得られる微生物をＥ、ｃｏｌｉ　Ａｃｃｌ
　Ｅｎｖ（１０００）／ｐＢＦ　１２４として工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した。寄託番号は微工研
菌寄第１０２９２号（ＦＥＲＭ−ｐ　１０２９２　）で
ある。

以上の工程を第７図に示す。

（組換えウィルスの製造） ＢｍＮＰＶ　Ｔ　３株のウィルスＤＮＡと前記組換えベ
クターＡｃｃｌ　Ｅｎｖ（１０００）／　ｐＢＦ１２４
とが１：１００のモル比に調合された第１表の組成液Ｉ
２４５μｌを、第１表の組成液■２５５μｌと混合した
。

第１表 組成液！ 組成液■ 生じた懸濁液０．５１ｒＬｌをＴＣ−１０（第２表）の
培地のカイコ樹立培養細胞ＢｍＮ４液（４刈０”　Ｂｍ
ｃｅｌｌｓ／ｍＪ）５ｍｌに加え、２７℃、２０時間の
培養により、Ａｃｃｌ　Ｅｎｖ（１０００）／ｐＢＦ１
２４とＢｍＮＰＶ　ＤＮＡのカイコ樹立細胞への導入を
行った。得られた培養物は、更にＴＣ−１０培地の交換
を行った後、２７℃で６日間培養した。次いでこの培養
物を遠心分離（１５００ｒｐｍ　、　１０分間）し、得
られた上清を組換えウィルスのクローニング用反応液と
した。

該クローニング用反応液をＴＣ−１０培地で１０−６１
０’ｌＩＯ’　に希釈し、それぞれ１０７ｒＬｌの希釈
反応液とした。該希釈反応液に対して、それぞれカイコ
樹立培養細胞ＢｍＮ４液（１０５１０５Ｂ　１１ｍｌｍ
））１０ＴＬｌを混合し、該混合液を２００μｌずつ９
６穴のマイクロタイター・トレーの中に分注し、２７℃
で４日間培書した。４日間培養後、マイクロタイター・
トレーを検鏡し、細胞表面が粗く変形しウィルスが感染
した形態を示しているカイコ樹立培養細胞で且つ該細胞
内に多角体蛋白が検出されないウェルを見い出し、そこ
から培養物を回収した。得られた培養物を遠心分離（１
５００ｒｐｍ、１０分）し、上清１５０μノを組換えウ
ィルスのポリペプチド発現用反応液とした。該ポＩＪ−
Ｊ！７’チド発現用反応液は、プラーク検定でｌＸｌ０
　　ＰＦＵ／ｍノの力価を示す組換えウィルス液であっ
た。尚、このポリペプチド発現用反応液を用い、組換え
ウィルスのカイコ樹立細胞ＢｍＮ４への感染、培養を行
い、該組換えウィルスを増殖させた。この組換えウィル
スの増殖操作は、培養物の遠心分離（１５００ｒｐｍ　
、　　１０分）による上清液４０Ｍが、プラーク検定で
３×１０８ＰＦＵ　／―の力価を有するまでくり返し行
った。以上により得られた上清液４０ｄを、３５　Ｔｏ
　（ｗ／ｗ　）ショ糖水溶液５ｍｌに静かに重層した状
態で超遠心分離（２５００Ｏｒｐｍ　、　１５℃、２時
間）し、組換えウィルスをウィルス粒子として沈澱させ
た。そして、該ウィルス粒子を蒸留水で洗浄後、ＴＥ緩
衝液（ｐＨ７，５）２００μｌに溶解し、ウィルス粒子
の懸濁液をえた。該懸濁液を更に、　ＳＤＳ存在下での
プロテアーゼに処理、フェノール処理、フェノール・ク
ロホルム処理、クロロホルム・イソアミルアルコール（
ｓｏ：１）処理し、ウィルスＤＮＡを５０μｇを得た。

上記ＴＣ−１０の培地は第２表の培地９００ｍ１を−６
，３０〜６．３５に調整し、濾過滅菌後、牛胎児血清１
００ＴｒＬｌを添加することにより調製される。

第２ 培地組成 ａＣ４ Ｃ４ ＣａＣｌ２・２Ｈ２０ ＭｇＣ１２０６Ｈ２０ ＭｇＣｌ２・７Ｈ２０ Ｔｒｙｐｔｏｓｅ デキストロース （ｇｌｕｃｏｓｅ） Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｏｌｎ　Ａ” ５ｏｌｎ　　Ｂ”傘 ａｏｌｎ　　Ｃ ＮａＨ２ＰＯ４”　２Ｈ，、，０ （０，８９１１１／１００ｄ） Ｎ　ａ　ＨＣＯ３ （０，３５１１／　１００ｍｆｆ１　）表 Ｈ２Ｏで全量９００ｍ１とする ０．５ｇ ２．８７　＆ １．３２＃ ２．２８１１ ２．７８　Ｆ ２、Ｏｌ １．１ｇ ０．３ｇ ００ｍ１ １００１ｒＬ１ ｍ１ ００ＴＬｌ ”５ｏｌｎ　Ａの組成 Ｌ−Ａｒｇｉｎｍｅ Ｌ−Ａｓｐａｔｉｃ　　ａｃｉｄ Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　争Ｈ２０ Ｌ−ＡＩ　＆１１１　ｎｅ β−Ａｌ　ａｎ　ｉ　ｎｓ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ　　ａｃｉｄ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｌ−Ｈｌｓｔｉｄｉｎｅ ＬＩｓｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−ＨＣｊ Ｌ−Ｍｅ　ｔｈ　ｉ　ｏ　ｕ　ｉ　ｎｅＬ−Ｐｒ　６１
　ｉ　ｙ１６ Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａ　　ａｎｉｎｅ ＤＬ−８ｅｒｕｎｅ Ｌ−Ｔｈ　ｒ　ｅ　ｏ　ｎｍｅ ５．７９Ｅ１ ３．５ｇ ３．９８，９ ２．２５．！ｉ＋ ２、ＯＩ ６、Ｏｙ ３、ＯＩ ６．５Ｉ ２５．０．９ ０．５Ｉ Ｏ，７５１１ ６，２５，９ ０，５Ｉ ３．５ｇ １．５ｙ １１、（１ １，７５ｇ ”５ｏｌｎ　Ｂの組成 Ｌ−Ｃｙｓｔｉｎｅ ＬＴｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ０．２５ｇ １．０ｇ ０．５ｇ ””５ｏｌｎ　Ｃの組成 Ｔｈｉａｍｉｎｅ　−ＨＣＬ Ｒｉｂｏｆ　１ａｖｉｎｅ Ｄ−Ｃａ　　ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅＰｒｙｄｏｘｉ
ｎｅ　　−ＨＣ２ Ｐａｒａ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｌｃ Ｆｏｌｉｃ　　ａｃｉｄ Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ　　ａｃｉｄ Ｉｓｏ−Ｉｕｏｇｉ　ｔｏｌ １ｏｔｉｎ ａｃｉｄ ２．０ｍｇ ２．０■ ２．０■ ２．０ｍ９ ２．０■ ２．０■ ２、Ｏｎν ２．０ｍｇ １、Ｑ７ｎｇ Ｈ２Ｏで全量１０００ｄとする （ポリペプチドの製造） 上記ポリペプチド発現用反応液１００μノをカイコ樹立
培養細胞ＢｍＮ４液（１０”Ｂｍｃｅ　１１　ｓ　／ｍ
ｌ　）　３０　ｍｌに添加し、２７℃、５日間培養した
。５日間培養後、培養物を回収し、遠心分離（１５００
ｒｐｍ。

１５分）した。

沈澱物（ウィルス成熟細胞）をＰＢＳ緩衝液で洗浄し５
０ｙｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ＰＨ７，４）　４００
μノに懸濁、ソニケーション後、遠心分離（８０００ｒ
ｐｍ　、　２０分）した。沈澱物として得られたポリ啄
プチド９０μｙにレムリ緩衝液２００μｌを添加、懸濁
したものを、煮沸し、遠心した上清をＳＤＳダル電気泳
動の試料とした。

ＳＤＳダル電気泳動の結果、この試料は、約２０ｋｄの
位置にバンドが検出された。（第８図に図示）この分子
量は、予測される、ｐＢＦ　１２４の有する多角体蛋白
遺伝子部分がコードする多角体蛋白部分（約４．５　ｋ
ｄ　）とＨＴＬＶ　−１５’−３’断片カニｆｆ−）’
ｔルＨＴＬＶ−Ｔ　ｅ　ｎｖ蛋白部分（約３５．５ｋｄ
）の合計分子量よシも、Ｐ２１の分子量分（約２０ｋｄ
）だけ小さいものである。（参考写真１）。なお、第８
図は、Ｂｍ細胞内でのＨＴＶＬ−１ｅｎｖ蛋白発現をＳ
ＤＳダル電気泳動で確認したものである。第８図におい
て１ａｎｅｌはサイズマーカー　１ａｎｅ２は非感染カ
イコ細胞の蛋白１ａｎｅ３はＡｃｅ　Ｉ　Ｅｎｖ　（１
０００）／ｐＢＦ　１２４を使用した組換えウィルスを
感染したカイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。

−次抗体として、正常人血清、抗多角体蛋白抗体、ＨＴ
ＬＶ−Ｉ　ｐ２１に対するモノクロナール抗体、及び患
者血清を使用したウェスタン・プロット実験の結果、該
２０ｋｄのポリペプチドが抗多角体蛋白抗体、患者血清
に対しては陽性で、正常人血清、ＨＴＬＶ−Ｉ　ｐ２１
に対するモノクロール抗体に対しては陰性であることを
確認した（第９図に図示）。この結果は該ポリペプチド
が、多角体蛋白部分と、ＩＦＩＴＬＶ−１ｇｐ４６の抗
体に対して抗原性を有する部分の融合蛋白であることを
示している。尚、第９図はＢｍ細胞内でのＨＴＬＶ−（
ｅｎｖ蛋白発現をウェスタン・プロット法で確認したも
のである。１　ａｎａ　１はサイズマーカ〜　１ａｎｅ
２〜１ａｎｅ５は抗原としてＡｃｃｌ　Ｅｎｖ　（１０
００）／　ｐＢＦ　１２４を使用した組換えウィルスを
感染したカイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。

ウェスタン・プロッティングは、第３表に示した一次抗
体及び二次抗体を使用して、アビジン、ビオチンを基質
としたパーオキシダーゼによる呈ビオチンを基質とした
パーオキシダーゼによる呈色反応で行なった。

実施例２ 実施例１で得たポリペプチド発現用反応液１００μノを
カイコ樹立培養細胞液（１０５１０５Ｂ　１１　ｓ　／
ｍｌ　）　３０−に添加し、２７℃、５日間培養した。

５日間培養後、培養物を回収し遠心分離（１５００ｒｐ
ｍ。

１５分）した。上清を０．１ｄずつ５令１日目のカイコ
１００匹にそれぞれ経皮的に注入し、２５℃で５日間、
桑葉のペースト片を与えて飼育後、解剖し、脂肪体を集
めた。該脂肪体にＰＢＳ緩衝液１０ｒＬｌを加え懸濁し
、ソニケーション後、遠心分離（８０００ｒｐｍ　、２
０分）し、沈澱物５ｍｌを取得した。該沈澱物を再度ソ
ニケーションし、Ｂ１０−ＲＡＤプロティン・アッセイ
により、ポリペプチド量を測定した結果７．５ｍｇであ
った。

ポリペプチド景測定後、５０μｌをレムリ緩衝液５０μ
ノに懸濁し、煮沸し、遠心した上清を５ＤＳ）ｉｋル電
気泳動の試料とした。

ＳＤＳ電気泳動の結果、分子量約２０ｋｄの位置にバン
ドが検出された。実施例１と同じウェスタン・プロット
実験を行い、この２０ｋｄのポリペプチドが多角体蛋白
部分とＨＴＬＶ−Ｔ　ｇｐ４６の抗体に対して抗原性を
有する部分とを含む融合蛋白であることを確認した。

実施例３ 実施例１の（紹換えベクターの製造）において、組換え
ベクターｅ　ｎ　ｖ／ｐＵｃ１１９のｘｂａｉ制限酵素
による切断後の更なる切断を、Ｐｖｕｌ［制限酵素（全
酒造（株）製Ａ１０７６Ｂ）によ９行ないＨＴＬＶ−１
５’−３’断片を含むＰｖｕｌ　−ｘｂａｌ断片を得た
以外は、実施例１と同様の方法を実施した。ここで、該
Ｐｖｕｌ　−ｘｂａ■断片に含有されるＩ（ＴＬＶ−１
５’−３’断片は、ＨＴＩ、Ｖ−１ｅｎｖ蛋白遺伝子に
由来するＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端から下流７
３塩基対で切断され、該切断部位から上記ＤＮＡの３′
末端までのものである。尚、ＰｖＪ制限酵素の切断反応
は、第４表Ａ４に示す組成の溶液中で行なった。また、
上記操作で得られるカイコの発現系ベクターｐＢＦ　１
２４にＨＴＬＶｉ５’−３′断片が挿入された組換えベ
クターＰｖｕｌ［Ｅｎｖ（１５００）／ｐＢＦ　１２４
は、該ベクターをＥ、ｃｏｌ　ｉに導入し、得られる微
生物をＥ、ｃｏｌｉ　Ｐｖｕｌｌ　Ｅｎｖ　（１５００
）／ｐＢＦ　１２４として工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した。寄託番号は、微工研菌寄第１０２９３
号（２Ｍ通−Ｐ１０２９３　）である。

上記操作の結果、１μｙのポリペプチドを得た。

ＳＤＳ電気泳動の結果、このポリペプチドは、分子量約
３２．５　ｋｄの位置にバンドが検出された。また、実
施例１と同じウェスタン・プロット実験を行いこのポリ
ペプチドが、多角体蛋白部分とＨＴＬＶ−Ｊｇｐ４６の
抗体に対して抗原性を有する部分の融合蛋白であること
を確認した（第１０図に図示）。

実施例４ 実施例３に於いて得られるポリペプチド発現用反応液を
用い、実施例２と同様な方法によシポリペゾチドを取得
した。得られたポリ被ゾチドは７５μｇで、ＳＤＳ電気
泳動の結果、このポリペプチドは、分子量約３２．５ｋ
ｄの位置にｉＺンドが検出された。また、実施例１と同
じウェスタン・プロット実験を行い、このポリペプチド
が、多核体蛋白部分とＨＴＬＶ−Ｉ　ｇｐ４６の抗体に
対して抗原性を有する部分の融合蛋白であることを確認
した。

第 表 Ｈｄ　　Ｉ　・＝　Ｈｌｎｄ　　Ｉ　、　Ｎ　−Ｎｅ。

Ｅｃ　−ＥｃｃＲＴ　、　５ｐ−ｓｐｈ　　ＩＨｌ　　
ＩＩ　　−Ｈｉｎｃ　　１１　　、Ｐｖ　・・・Ｐｖｕ
　　ＩＩ Ｂ　・・・　ＢａｍＨ ■ ａ Ａｃ　　・・・Ａｃｅ ・・・Ｓａｌ　　ｌ Ｘ　…　ｘｂａ ■ ■

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成人Ｔ細胞白血病ウィルス外皮蛋白遺伝子に由来す
   るＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端から下流７３塩基
   対以上４９３塩基対以内で切断した、該切断部位から前
   記ＤＮＡの３′末端までの断片により、カイコ核多角体
   病ウィルスの多角体蛋白構造遺伝子の一部の組換えを行
   い、次いで該組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又は
   カイコ幼虫に感染してポリペプチドを発現することを特
   徴とするポリペプチドの製造方法。 ２、成人Ｔ細胞白血病ウィルス外皮蛋白遺伝子に由来す
   るＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端から下流７３塩基
   対以上４９３塩基対以内で切断した、該切断部位から前
   記ＤＮＡの３′末端までの断片により、カイコ発現系ベ
   クターを組換えた組換えベクター。 ３、成人Ｔ細胞白血病ウィルス外皮蛋白遺伝子に由来す
   るＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端から下流７３塩基
   対以上４９３塩基対以内で切断した、該切断部位から前
   記ＤＮＡの３′末端までの断片により、カイコ核多角体
   病ウィルスの多角体蛋白遺伝子の一部を組換えた組換え
   ウィルス。