WO2016199550A1

WO2016199550A1 - 吸着材及び当該吸着材を用いた抗体精製装置

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Publication number: WO2016199550A1
Application number: PCT/JP2016/064646
Authority: WO
Inventors: 譲島崎; 優史丸山; 博史吉田; 啓介渋谷; 俊郎斎藤; 憲孝内田
Original assignee: 株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority date: 2015-06-12
Filing date: 2016-05-17
Publication date: 2016-12-15
Also published as: JP2018140937A

Abstract

複数の抗体群のなかから所定のパラトープを有する抗体を選択的に分離・精製する。　精製対象の抗体におけるパラトープに対応するエピトープを有する吸着部位と、温度変化によって相転移する温度応答性分子を有する温度応答部位と、前記吸着部位及び前記温度応答部位を支持する担体とを備える。

Description

吸着材及び当該吸着材を用いた抗体精製装置

　本発明は、抗体に対する吸着能を有する吸着材及び当該吸着材を用いた抗体精製装置に関する。

　抗原抗体反応とは、抗原と抗体との特異的相互作用による結合反応である。抗体が抗原と結合する際、抗体は抗原の一部分（エピトープ）の立体構造を厳密に認識して結合する。エピトープと結合する抗体側の部分をパラトープという。エピトープとパラトープの間は、水素結合、静電気力、ファンデルワールス力及び疎水結合等の相互作用により安定的な結合が形成される。

　抗体抗原反応を利用した免疫分析法は、がんを含む各種疾患の診断等に利用されている。すなわち、所定の疾患に関連する物質（バイオマーカ）を抗原とし、これを定量的に測定することで各種疾患の診断等を行っている。この免疫分析法では、バイオマーカと特異的に相互作用する標識抗体でバイオマーカを標識し、標識抗体からの信号を検出してバイオマーカの濃度を定量する。特に、初期がん等の診断においては、免疫分析法により極微量のバイオマーカを高感度に定量する技術の開発が進められている。

　また、抗体は、免疫分析法に限らず、それ自体医薬として利用されている（抗体医薬）。抗体医薬とは、病気の原因となっている物質に対する抗体であって、体内に投与されることで当該物質を排除し、疾患の予防や治療を行う抗体を意味する。さらに、抗体は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降及びELISA等の生物化学の研究においてもよく利用されている。

　以上のように幅広く利用されている抗体は、抗原を免疫した動物の血清や、マウス腹水、ハイブリドーマ細胞等から精製して得られる。抗体は、一般的なタンパク質と同様に、清澄化工程、回収工程、中間精製工程及び最終精製工程という、大別して４つの工程により精製される。すなわち、抗体産生細胞を培養し、培養液に分泌された抗体を、抗体以外のタンパク質、細胞及びその他の固形物から分離し、その後、濾過やクロマトグラフィ等の方法により精製される。すなわち、抗体を製造する場合、細胞や培養液に含まれる成分等の夾雑物が共存する状態から抗体を抽出する技術が必要となる。

　一般的に、狭雑物中から抗体を抽出する一般的な技術として、プロテインAやプロテインGをリガンドとして固定化した表面上で抗体を吸着し、ｐＨ調整により抗体の脱着を制御し、狭雑物中から抗体を抽出する技術が知られている。また、特許文献１には、夾雑物から抗体を精製する際に、プロテインAを結合した温度応答性ポリアミノ酸を利用することが開示されている。すなわち、特許文献１には、プロテインAを有する温度応答性ポリアミノ酸に精製対象の抗体を結合させ、温度変化により温度応答性ポリアミノ酸の立体構造を変化させ、抗体を温度応答性ポリアミノ酸から分離させる技術が開示されている。

特開２０１４－２１９２４５号公報

　しかしながら、特許文献１に開示された技術では、抗体と抗体以外の夾雑物とを分離して、抗体を回収することが可能であるものの、複数の抗体群のなかから所定のパラトープを有する抗体を選択的に回収することはできないといった問題があった。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、目的とする抗体を選択的に分離・回収することができる吸着材と、当該吸着材を用いた抗体精製装置を提供することを目的とする。

　上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。

　（１）精製対象の抗体におけるパラトープに対応するエピトープを有する吸着部位と、温度変化によって相転移する温度応答性分子を有する温度応答部位と、前記吸着部位及び前記温度応答部位を支持する担体とを備える吸着材。

　（２）前記温度応答性分子は、相転移温度が０℃以上６０℃以下の範囲にある化合物であることを特徴とする（１）記載の吸着材。

　（３）前記吸着部位は、精製対象の抗体が結合する抗原のエピトープを含む部分断片でることを特徴とする（１）記載の吸着材。

　（４）前記温度応答部位が、単量体として、アクリルアミド誘導体、メタクリル酸エステル等のメタクリル酸誘導体、アクリル酸エステル等のアクリル酸誘導体、ビニルアルコール誘導体、リジン誘導体、グルタミン酸誘導体、アスパラギン酸誘導体、乳酸、ジオール誘導体、カプロラクタム類、カプロラクトン類、糖類、シロキサン類からなる群より選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする（１）記載の吸着材。

　（５）前記吸着部位は、前記温度応答性分子に結合されていることを特徴とする（１）記載の吸着材。

　（６）前記吸着部位は前記担体に結合されていることを特徴とする（１）記載の吸着材。

　（７）前記（１）乃至（６）いずれか記載の吸着材を捕捉する吸着材捕捉部と、前記吸着材捕捉部に捕捉された前記吸着材を所定の温度に調節する温度調節装置とを備える抗体精製装置。

　（８）前記吸着材における担体が磁性ビーズであり、前記吸着材捕捉部は磁性材料を備えることを特徴とする（７）記載の抗体精製装置。

　（９）精製対象の抗体におけるパラトープに対応するエピトープを有する吸着部位と、温度変化によって相転移する温度応答性分子を有する温度応答部位と、前記吸着部位及び前記温度応答部位を支持する担体とを備える吸着材と、精製対象の抗体を含む溶液とを接触させる工程と、前記吸着材を洗浄する工程と、溶液の温度を昇温して前記温度応答性分子を不溶化させることで、前記吸着部位に吸着した抗体を分離する工程と、分離した抗体を回収する工程とを含む抗体の精製方法。

　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-119029号の開示内容を包含する。

　本発明によれば、目的とする抗体を選択的に分離・回収することができる吸着材と、当該吸着材を用いた抗体精製装置を提供できる。

本発明に係る吸着材の一実施形態であり、当該吸着材の構造と作用とを模式的に示す図である。（ａ）は吸着材に抗体が吸着する前の状態、（ｂ）は吸着材に抗体が吸着した状態、（ｃ）は吸着材に相転移が生じた状態、（ｄ）は相転移が生じた吸着材から抗体が脱離した状態を示す。本発明に係る吸着材の製造方法の一例を示す図である。（ａ）は温度応答性分子を担体に結合させる工程、（ｂ）は機能性分子を温度応答性分子に結合させる工程を示す。本発明に係る吸着材の他の実施形態であり、当該吸着材の構造と作用とを模式的に示す図である。（ａ）は吸着材に抗体が吸着する前の状態、（ｂ）は吸着材に抗体が吸着した状態、（ｃ）は相転移が生じた吸着材から抗体が脱離した状態を示す。本発明に係る抗体精製装置の一実施形態を模式的に示す図である。

　以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。なお、以下の各図において共通する構成については、同一の符号を付し、重複した説明を省略する。

　図１は、本発明の実施形態に係る吸着材の構造と作用とを模式的に示す図である。（ａ）は、吸着材に抗体が吸着する前の状態、（ｂ）は、吸着材に抗体が吸着した状態、（ｃ）は、吸着材に相転移が生じた状態、（ｄ）は、相転移が生じた吸着材から抗体が脱離した状態を示す。

　図１（ａ）に示すように、本実施形態に係る吸着材１は、吸着部位１０と、温度応答部位２０と、担体３０とを備えている。また、本実施形態に係る吸着材１では、吸着部位１０が温度応答部位２０に結合されている。

　特に、吸着材１において吸着部位１０は、エピトープを有している。エピトープとは、抗原と抗体との特異的相互作用（抗原抗体反応）において、抗体と結合する抗原側の部位を意味する。また、抗原抗体反応において、抗原と結合する抗体側の部位をパラトープと呼ぶ。

　吸着材１は、被処理液に含まれている精製対象の抗体Ｌの精製に用いられるものである。特に、吸着材１は、精製対象の抗体Ｌが他の夾雑物等と共に含まれている溶液（被処理液と称する場合もある）から当該抗体Ｌを分離・精製するものである。先ず、吸着材１と被処理液とを接触させると、図１（ｂ）に示すように、被処理液中の抗体Ｌは、抗体中のパラトープと吸着部位１０中のエピトープとの間に働く特異的相互作用によって吸着する。なお、このとき被処理液に含まれている夾雑物等は、吸着部位１０に対する親和性が相対的に低く、吸着しないか吸着力が弱い状態にあるため、洗浄処理によって抗体Ｌを残して除去される。

　本実施形態に係る吸着材１は、抗体Ｌを温度応答性分子（温度応答部位２０）の昇温に伴う相転移によって脱離する作用を有している。そのため、吸着材１を温度上昇させると、温度応答部位２０は、図１（ｃ）に示すように、相転移して凝集状態の立体構造に変化する。その結果、吸着部位１０と抗体Ｌとの親和性が低下し、吸着部位１０に吸着していた抗体Ｌは脱離することになる（図１（ｄ）参照）。本実施形態に係る吸着材１では、このようにして、被処理液に含まれている精製対象の抗体Ｌの分離精製が実現される。なお、吸着材１は、実際には、担体３０上に多数の吸着部位１０と温度応答部位２０とが指示された構造を有し、一回の処理で多数の抗体を分離することができる。

　吸着部位１０を構成するエピトープとしては、精製対象の抗体のパラトープと特異的相互作用する分子であれば特に制限はない。吸着部位１０を構成するエピトープの例として、抗原分子全体、すなわち抗体Ｌがバイオマーカを検出するものである場合、当該バイオマーカ分子全体を吸着部位１０とすることができる。

　また、吸着部位１０は、エピトープを含む抗原分子の部分断片とすることが好ましい。吸着部位１０を抗原分子の部分断片（エピトープを含む）とした場合には、吸着部位１０を抗原分子全体とした場合と比較して、温度応答性分子の相転移によって、吸着部位１０に吸着した抗体Ｌがより容易に脱離でき、その結果、抗体Ｌの回収効率を大幅に高めることができる。

　なお、抗原分子におけるエピトープの分子配列が既知の場合には、人為的に合成されたタンパク分子（エピトープを含む）を吸着部位１０としてもよい。この場合、人為的に合成されたタンパク質分子は、実際の抗原分子より低分子量とすることで、吸着部位１０に吸着した抗体Ｌがより容易に脱離でき、その結果、抗体Ｌの回収効率を大幅に高めることができる。

　なお、図１においては、吸着部位１０は、温度応答部位２０の側鎖に結合しているが、温度応答部位２０の末端に結合していてもよいし、温度応答部位２０の側鎖及び末端に結合していてもよい。また、吸着部位１０は、単一の温度応答部位２０や担体３０に対して、単数が結合していてもよいし、複数が結合していてもよい。また、吸着部位１０は、温度応答部位２０との間にリンカー（スペーサー）を介して結合していてもよい。リンカーは、抗体を不可逆的に吸着しない分子であることが好ましい。

　温度応答部位２０は、温度変化によって相転移する温度応答性分子からなる。温度応答性分子は、下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution Temperature；ＬＣＳＴ）を示す。すなわち、温度応答性分子は、下限臨界溶液温度よりも低い低温域では被処理液中に溶解して存在し（可溶化）、下限臨界溶液温度よりも高い高温域では不溶性の状態に相分離して存在する（不溶化）。そのため、温度応答部位２０は、下限臨界溶液温度を境界として相転移し、立体構造の顕著な変化を生じることで、吸着部位１０と吸着部位１０に結合している抗体Ｌとの親和性を可変させる。

　温度応答部位２０は、吸着部位１０に吸着している抗体Ｌを、昇温に伴う相転移によって脱離させる作用を有している。温度応答部位２０が、温度応答性分子が示す下限臨界溶液温度（相転移温度）よりも低い低温域から、下限臨界溶液温度（相転移温度）よりも高い高温域に昇温されると、相転移による立体構造の変化に伴って、吸着部位１０と吸着部位１０に吸着している抗体Ｌとの親和性が吸着時よりも低下し、吸着材１から抗体Ｌが脱離することになる。

　温度応答部位２０を構成する温度応答性分子としては、特に限定することなく、下限臨界溶液温度を示す温度応答性高分子を用いることができる。温度応答性高分子は、単量体として、アクリルアミド誘導体、メタクリル酸エステル等のメタクリル酸誘導体、アクリル酸エステル等のアクリル酸誘導体、ビニルアルコール誘導体、Ｎ－修飾ε－ポリリジン誘導体等のε－ポリリジン誘導体（リジン誘導体）、γ－グルタミン酸アミド等のγ－グルタミン酸誘導体（グルタミン酸誘導体）、δ－アスパラギン酸アミド誘導体等のδ－アスパラギン酸誘導体（アスパラギン酸誘導体）、乳酸、ジオール誘導体、カプロラクタム類、カプロラクトン類、糖類、シロキサン類等を含むことができる。温度応答性分子は、これらの単量体のいずれかによる重合体であっても、これらの単量体の組み合わせによる共重合体であってもよい。また、共重合体としては、ランダム型、ブロック型及びグラフト型のいずれであってもよい。なお、温度応答性高分子は、直鎖状高分子に限られず、分岐状高分子、デンドリマー、ゲル、架橋ゲル等であってもよい。

　アクリルアミド誘導体としては、例えば、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－ジイソプロピルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、Ｎ－ジメチルアクリルアミド等が挙げられる。また、メタクリル酸誘導体としては、例えば、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸メチル等が挙げられる。また、アクリル酸誘導体としては、例えば、アクリル酸ブチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル等が挙げられる。また、ビニルアルコール誘導体としては、例えば、ビニルアルコールメチルエーテル等が挙げられる。また、ε－ポリリジン誘導体としては、例えば、リジン吉草酸アミド、リジン酪酸アミド、リジンプロピオン酸アミド、Ｎ－ヒドロキシペンチルリジン、Ｎ－ヒドロキシブチルリジン等が挙げられる。また、γ－グルタミン酸誘導体としては、例えば、グルタミン酸ヒドロキシヘキシルアミド、グルタミン酸ヒドロキシペンチルアミド、グルタミン酸ヒドロキシブチルアミド、グルタミン酸ヒドロキシプロピルアミド等が挙げられる。また、δ－アスパラギン酸誘導体としては、例えば、アスパラギン酸ヒドロキシヘキシルアミド、アスパラギン酸ヒドロキシペンチルアミド、アスパラギン酸ヒドロキシブチルアミド、アスパラギン酸ヒドロキシプロピルアミド等が挙げられる。また、ジオール誘導体としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。

　温度応答部位２０を構成する温度応答性分子としては、下限臨界溶液温度を示す温度応答性高分子以外にも、下限臨界溶液温度を示す温度応答性低分子を用いることもできる。温度応答性低分子としては、例えば、光応答性と共に温度応答性を示す、スピロピラン、アゾベンゼン、ジアリールエテン、これらの誘導体、液晶分子等を用いることができる。

　温度応答部位２０に使用する温度応答性分子としては、その相転移温度が０℃以上６０℃以下の範囲である分子を使用することが好ましく、０℃以上４０℃以下の範囲である分子を使用することがより好ましく、１０℃以上４０℃以下の範囲である分子を使用することがさらに好ましい。温度応答部位２０の相転移温度がこのような温度範囲にあると、抗体Ｌの吸着や脱離を温和な温度条件の下で行うことができるため、抗体Ｌの劣化を避けることが可能である。温度応答部位２０の相転移温度は、被処理液の溶媒、夾雑物、ｐＨ等の影響を受けるが、温度応答部位２０が、ｐＨ６以上８以下のｐＨ条件で相転移するように分子設計することが好ましい。このような温度応答部位２０の分子設計は、温度応答性分子に各種官能基を導入することによって行うことができ、例えば、親水性基と疎水性基とのバランスや、電荷相互作用の導入等に拠り実現することができる。

　温度応答部位２０は、担体３０に固定されている。図１においては、温度応答部位２０は、側鎖を介して担体３０と結合しているが、末端を介して担体３０と結合していてもよし、側鎖と末端を介して担体３０と結合しても良い。また、温度応答部位２０は、単一の担体３０に対して、単数が結合していてもよいし、複数が結合していてもよい。また、温度応答部位２０は、担体３０との間にリンカー（スペーサー）を介して結合していてもよい。

　担体３０は、特に限定されないが、被処理液中において化学的及び物理的に高い安定性を有することが好ましく、吸着材１に機械的強度、賦形性、取扱い性等を付与する役割を果たしている。

　担体３０は、適宜の形状とすることが可能であり、多孔質及び非多孔質のいずれとしてもよい。担体３０の形状としては、具体的には、例えば、板状、ビーズ状、不織布や織物等の繊維状、膜状、モノリス状、中空糸状等が挙げられる。

　担体３０の材質は、有機材料及び無機材料のいずれであってもよく、これらを併用した複合材料であってもよい。具体的には、例えば、アガロース、セファロース、セルロース等の多糖類や、ポリスチレン、ポリアルキルメタクリレート、ポリグリシジルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリシロキサン、ポリフッ化エチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ＰＡ６、ＰＡ６６、ＰＡ１１、ＰＡ１２等の合成樹脂や、グラファイト、炭素繊維、カーボンナノチューブ、フラーレン等の炭素材料や、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化鉄等の酸化物、炭酸カルシウム等の炭酸塩、ハイドロキシアパタイト、リン酸アルミニウム等のリン酸塩、ホウケイ酸ガラス等のホウ酸塩、シリケート、珪藻土等のケイ酸塩、硫酸アルミニウム、硫酸カルシウム等の硫酸塩、炭化珪素、窒化珪素等の無機化合物や、フェライト、パーマロイ、クロム鋼、鉄－アルミ合金、金、銀、白金、パラジウム、ロジウム等の金属材料等を用いることができる。これらの中でも好ましい材料は、安定性、製造容易性等の観点から、アガロース、セファロース、セルロース、ポリスチレン、シリカや、磁性を示す酸化鉄又はフェライトである。また、担体３０としては、特に磁性ビーズを使用することが好ましい。

　担体３０は、温度応答部位２０と共有結合を形成する、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基等の適宜の反応性基を表面に有していてもよい。また、担体３０は、吸着部位１０及び温度応答部位２０以外の分子によって表面修飾されていてもよい。例えば、標的物質の非特異的な吸着を防止するブロッキングや、温度応答部位２０の配向性を制御する表面修飾や、担体３０の分散性又は吸着性を改質する表面修飾等が行われていてもよい。

　本実施形態に係る吸着材１は、従来知られている適宜の反応を利用して製造することができる。例えば、吸着部位１０を構成する機能性分子、温度応答部位２０を構成する温度応答性分子、反応性基を有する担体３０等は、公知の高分子反応等を用いて調製したり、担体表面を活性化する表面処理技術を用いたり、天然物や生化学的産物の分離精製技術を利用したりして得ることができる。また、吸着部位１０を構成する機能性分子、温度応答部位２０を構成する温度応答性分子、反応性基を有する担体３０の各結合は、例えば、吸着部位１０を構成する機能性分子と温度応答部位２０を構成する温度応答性分子とを結合させた後に担体３０と結合させる方法、温度応答部位２０を構成する温度応答性分子を担体３０に結合させた後に、吸着部位１０を構成する機能性分子を、温度応答部位２０を構成する温度応答性分子に結合させる方法、吸着部位１０を構成する機能性分子と温度応答部位２０を構成する温度応答性分子とを併せて担体３０と結合させる方法等を採ることができる。

　図２は、本発明の実施形態に係る吸着材１の製造方法の一例を示す図である。（ａ）は、温度応答性分子を担体３０に結合させる工程、（ｂ）は、エピトープを含む吸着部位１０を温度応答性分子に結合させる工程を示す。

　図２に示す吸着材１の製造方法は、温度応答部位２０を構成する温度応答性分子を担体３０に結合させた後に、吸着部位１０を、温度応答部位２０を構成する温度応答性分子に結合させる方法を例示したものである。この方法では、担体３０としてはカルボキシ末端を有する担体を使用し、吸着部位１０と温度応答部位２０との間にリンカーとしてグルタルアルデヒドを使用している。

　温度応答性分子を担体３０に結合させる工程では、図２（ａ）に示すように、はじめに、担体３０のカルボキシ末端とカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）とを反応させて、担体３０を活性化させる。この反応は、例えば、ｐＨ５．８、３７℃で２時間程度とすればよい。続いて、未反応物や副生成物を除去した後、活性化させた担体３０と温度応答部位２０とを反応させる。この反応は、例えば、ｐＨ５．８、３７℃で２時間程度とすればよい。このような反応を経ることによって、温度応答部位２０が有する求核性のアミノ基を介して、温度応答性分子２０と担体３０とを結合させることができる（図２（ａ）の右図参照）。このようなカルボジイミドを脱水縮合剤として用いる反応によると、温度条件は４℃以上４０℃以下程度、ｐＨ条件はｐＨ４以上７以下程度の範囲の温和な条件で、温度応答性分子を担体３０に結合させることも可能である。

　吸着部位１０を温度応答性分子に結合させる工程では、図２（ｂ）に示すように、はじめに、温度応答部位２０のリシン（Ｌｙｓ）のアミノ基とグルタルアルデヒドとを反応させて活性化させる。この反応は、例えば、ｐＨ９．０、３７℃で２時間程度とすればよい。続いて、未反応物を純水で除去した後、温度応答部位２０に結合したグルタルアルデヒドと吸着部位１０のリシン（Ｌｙｓ）のアミノ基とを反応させる。この反応は、例えば、ｐＨ７．４、３７℃で２時間程度とすればよい。このような反応を経ることによって、グルタルアルデヒドを介して、温度応答性分子２０と吸着部位１０とを結合させることができる。温度条件は常温から３７℃程度まで、ｐＨ条件はｐＨ６以上９以下程度の範囲であって更に中性寄りにおいても、反応を進行させることが可能である。

　このような製造方法によると、温度条件、ｐＨ条件が温和な条件で吸着材１を製造することが可能であるため、温度応答性分子２０や吸着部位１０の変性等が避けられ、吸着材１の性能を確保し易くすることができると共に、酸やアルカリの廃液の発生を低減することができる。また、図２においては、グルタルアルデヒドによる架橋を模式的に示しているが、実際の反応ではグルタルアルデヒドの多量体による架橋が形成され得るため、分子間の立体障害や相互作用が部分的に解消されることで、吸着材について一定以上の性能が確保し易くなる場合がある。

　ところで、本発明に係る吸着材１は、図１及び２に示した構成に限定されるものでは無く、例えば図３に示す構成であってもよい。すなわち、図３は、本発明の他の実施形態に係る吸着材の構造と作用とを模式的に示す図である。（ａ）は、吸着材に抗体が吸着する前の状態、（ｂ）は、吸着材に抗体が吸着した状態、（ｃ）は、吸着材に相転移が生じた結果、吸着材から抗体が脱離した状態を示す。

　図３に示す実施形態の吸着材１は、担体３０上に吸着部位１０と温度応答部位２０とが結合した構成を有している。なお、担体３０上に吸着部位１０を結合させる際には、上述した温度応答部位２０を担体３０上に結合させる場合と同様に、担体３０に対して表面処理（反応基の導入等）を行ってもよいし、担体３０との間にリンカー（スペーサー）を介して結合していてもよい。

　図３に示す実施形態の吸着材１においても、温度応答部位２０は、吸着部位１０に吸着している抗体Ｌを、昇温に伴う相転移によって脱離させる作用を有している。温度応答部位２０が、温度応答性分子が示す下限臨界溶液温度（相転移温度）よりも低い低温域から、下限臨界溶液温度（相転移温度）よりも高い高温域に昇温されると、相転移による立体構造の変化に伴って、吸着部位１０と吸着部位１０に吸着している抗体Ｌとの親和性が吸着時よりも低下し、吸着材１から抗体Ｌが脱離することになる。

　次に、本発明に係る抗体精製装置について説明する。本発明に係る抗体精製装置は、上述した吸着材１を用いて、精製対象の抗体及び夾雑物を含む溶液から当該抗体を分離・精製する装置である。すなわち、抗体精製装置は、上述した吸着材１を捕捉する吸着材捕捉部と、吸着材捕捉部に捕捉された吸着材１を所定の温度に調節する温度調節装置とを備える。抗体精製装置では、吸着材捕捉部に吸着材１を捕捉した状態で、温度調節装置が上記下限臨界溶液温度（相転移温度）よりも低い低温域から、下限臨界溶液温度（相転移温度）よりも高い高温域に昇温する。これにより、吸着材捕捉部に捕捉された吸着材１から抗体を分離することができる。

　特に、吸着材１における担体３０を磁性ビーズとした場合、磁性材料を有する吸着材捕捉部により吸着材１を磁気的に捕捉することができる。この例としては、図４に示すように、送液ユニット５０５、注入口５１４、流路５０４、磁石ユニット５１６、温調ユニット５１７を有する抗体精製装置を挙げることができる。ここで、磁石ユニット５１６は、上述した磁性材料を有する吸着材捕捉部であり、流路５０４に供給された吸着材１を捕捉するものである。磁石ユニット５１６は、支持基体５０３を介して流路５０４と対向する位置に配設されている。特に、磁石ユニット５１６は、流路５０４に対して磁力をオン・オフ制御できる構成であることが好ましい。例えば、磁石ユニット５１６としては、電磁石及び当該電磁石に対する通電を制御する装置を含む装置を使用することができる。或いは、磁石ユニット５１６としては、常磁性体と当該常磁性体を支持基体５０３に対して接離可能に制御する駆動装置とを含む装置を使用することもできる。いずれの場合でも、磁石ユニット５１６は、所望のタイミングで磁力を流路５０４に対して加えることができ、吸着材１を捕捉することができる。

　以上のように構成された抗体精製装置では、精製対象の抗体と夾雑物とを含む溶液と、吸着材１（担体３０として磁性ビーズを使用）を分散させた分散液とを、送液ユニット５０５と注入口５１４を経て混合する。これにより、精製対象の抗体におけるパラトープと吸着部位１０のエピトープとの特異的相互作用を形成させる。次に、抗体精製装置では、磁石ユニット５１６を用いて吸着材１を支持基体５０３の流路壁に捕捉する。その後、抗体精製装置では、流路５０４に対して溶剤を通液し、未吸着の抗体及び夾雑物を流路５０４から洗い流す（B/F分離）。その後、磁石ユニット５１６を流路５０４から離して吸着材１を再分散させる。そして、抗体精製装置では、温調ユニット５１７により流路５０４内部を下限臨界溶液温度（相転移温度）よりも低い低温域から、下限臨界溶液温度（相転移温度）よりも高い高温域に昇温する。これにより、吸着材１に吸着した、精製対象の抗体を分離することができる。その後、抗体精製装置では、磁石ユニット５１６を用いて吸着剤を流路壁に再び固定化し、流路５０４に溶剤を通液することにより、精製された抗体を回収することができる。

　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。

　本発明の実施例に係る吸着材として、実施例１～実施例３に係る吸着材を製造した。その後、パラトープの異なる２種類の抗体が溶解した抗体混合溶液から、１種類の抗体の分離精製を行い、吸着材の選別特性を評価した。また、抗体混合溶液は、抗ＰＳＡ（前立腺特異抗原）抗体と、抗ｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベータ）抗体をリン酸緩衝溶液中に溶解して調製した。併せて、本実施例に係る吸着材の対照として、比較例１に係る吸着材を製造し、同様に評価を行った。なお、本実施例、比較例では選別特性の評価方法の要請からビオチン化されている抗体を用いた。また、ＰＳＡ、ｔＰＡは、代表的なバイオマーカである。

　製造した実施例１～実施例３に係る吸着材、及び、比較例１に係る吸着材においては、温度応答部位２０として、下記化学式に示すε－ポリリジン誘導体を使用した。なお、式中、Ｘは、ｎ－ブトキシカルボニル基（－ｎＢｕＣＯ）であり、共重合形式は任意である。また、このε－ポリリジン誘導体の下限臨界溶液温度は２８℃である。また、担体３０として、カルボキシ末端を有するポリスチレン製マイクロプレートを使用した。

　本実施例では、担体３０に温度応答部位２０を共有結合し、その後、吸着部位１０を温度応答部位２０と共有結合して、吸着材を製造した。まず、カルボキシ末端を有するポリスチレン製マイクロプレートに水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）の１重量パーセント水溶液（ｐＨ＝５．８）を投入して、３７ ℃で２時間放置し、表面をアミノ基に対して反応活性化した。リン酸緩衝液（ｐＨ＝５．８）で表面を洗浄後、ε－ポリリジン誘導体水溶液（１重量パーセント、ｐＨ＝７．４）を投入して、３７℃で２時間放置し、ε－ポリリジン誘導体を表面に固定化した。その後、グルタルアルデヒド水溶液（１重量パーセント、ｐＨ＝１０）を投入して、表面をアミノ基に対して反応活性化した。その後、吸着部位１０を有する分子の水溶液（０．０１重量パーセント、ｐＨ＝７．４）を投入し、３７℃で２時間反応させ、吸着材を製造した。
＜実施例１＞
　実施例１では、吸着部位１０を有する分子として代表的なバイオマーカのひとつであるｔＰＡ分子を用い、吸着材を製造した。ｔＰＡ分子は抗ｔＰＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有する。また、ｔＰＡ分子の分子量は６３ｋＤａであることが知られている。
＜実施例２＞
　実施例２では、吸着部位１０を有する分子として代表的なバイオマーカのひとつであるＰＳＡ分子を用い、吸着材を製造した。ＰＳＡ分子は抗ＰＳＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有する。また、ＰＳＡ分子の分子量は３３ｋＤａであることが知られている。
＜実施例３＞
　実施例３では、吸着部位１０を有する分子としてＰＳＡ切断分子を用い、吸着材を製造した。ＰＳＡ切断分子は、タンパク質を切断する酵素であるエンドプロテアーゼＧｌｕ－Ｃ（Roche製）とＰＳＡ分子とをリン酸緩衝溶液中で２０：１の比で混合し、３７℃で１日反応させた後、得られた切断分子をサイズ分離クロマトグラフィにより分取して作成した。また、ＰＳＡ切断分子が抗ＰＳＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有することは、下記の方法で確認した。また、本実施例で用いたＰＳＡ切断分子の分子量はサイズ分離クロマトグラフィ測定から５ｋＤａであることがわかった。
＜切断分子中のエピトープ有無の確認方法＞
　カルボキシ末端を有するポリスチレン製マイクロプレートに水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）の１重量パーセント水溶液（ｐＨ＝５．８）を投入して、３７℃で２時間放置し、表面をアミノ基に対して反応活性化した。リン酸緩衝液（ｐＨ＝５．８）で表面を洗浄後、分取した切断分子の水溶液を投入して、３７℃で２時間放置し、分取した切断分子を表面に固定化した。後で投入する抗ＰＳＡ抗体の非特異吸着を抑制するために、まずＢＳＡ（牛血清アルブミン）を表面に吸着し、その後、抗ＰＳＡ抗体の水溶液を投入した。切断分子がエピトープを有する場合、抗ＰＳＡ抗体は切断分子に特異的に吸着する。その後、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼ水溶液を投入し、アビジン－ビオチン間の特異的相互作用を用いて抗ＰＳＡ抗体をペルオキシダーゼで修飾した。その後、ＴＭＢ（3,3’,5,5’-TetraMethylBenzidine）と過酸化水素が溶解した水溶液を投入した。ペルオキシダーゼは過酸化水素を分解して水酸化物ラジカルを生成し、水酸化物ラジカルはＴＭＢを酸化し呈色する。従って、ＴＭＢの呈色状態を評価することで抗ＰＳＡ抗体の吸着量を評価することができる。本実施例では、酸化されたＴＭＢの呈色有無を評価することで、抗ＰＳＡ抗体の吸着有無を評価し、切断分子中のエピトープ有無を確認した。
＜比較例１＞
　比較例１では、吸着部位１０を有する分子としてプロテインＡ分子を用い、吸着材を製造した。プロテインＡ分子は、抗体中のパラトープの種類に関係なく抗体を吸着することが知られている。

　次に、実施例１～実施例３に係る吸着材、比較例１に係る吸着材を用いて、抗体の分離精製を行った。はじめに、各吸着材の担体３０（ポリスチレン製マイクロプレート）の複数（６個）のウェルに、抗体の非特異吸着を抑制するために、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）の水溶液を投入し、ＢＳＡを吸着させた。その後、抗ＰＳＡ（前立腺特異抗原）抗体と、抗ｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベータ）抗体を混合して調製した抗体混合溶液（ｐＨ７．４）を添加し、４℃で３０分間にわたって静置させて、吸着材に抗体を吸着させた。

　続いて、吸着材の担体３０（ポリスチレン製マイクロプレート）の各ウェルを、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で洗浄し、吸着していない抗体を除去した。

　そして、一部（３個）のウェルについては、４℃から３７℃に昇温した後、１時間にわたって静置させて、吸着していた抗体を脱離させた。また、この間に、残部（３個）のウェルについては、昇温させること無く４℃で保管した。

　その後、抗体を脱離させた各ウェルと、残部の各ウェルとに対して、標識化されたストレプトアビジンを添加し、ＥＬＩＳＡ法によって吸着していた抗体量を定量した。ＥＬＩＳＡ法における測定値である吸光度は、抗体の吸着量に比例することが知られている。表１に、実施例１～実施例３に係る吸着材、及び、比較例１に係る吸着材における、抗体吸着量（吸光度）と、３７℃に昇温することにより脱離した抗体の割合（％）を示す。なお、本実施例、比較例では、抗体溶液として、(1) 抗ｔＰＡ抗体溶液（10 ng/ml）、(2)抗ｔＰＡ抗体と抗ＰＳＡ抗体との混合溶液(各成分の濃度：10 ng/ml)、及び(3) 抗ＰＳＡ抗体溶液(10 ng/ml)を用いた。いずれの溶液もリン酸緩衝液を溶剤として調製した。

　表１に示すように、実施例１の吸着材は、抗ｔＰＡ抗体を吸着し、抗ＰＳＡ抗体を吸着しないことがわかった。この理由として、実施例１の吸着材の吸着部位が、抗ｔＰＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有するｔＰＡ分子であることが考えられる。また、実施例２、実施例３の吸着材は、抗ＰＳＡ抗体を吸着し、抗ｔＰＡ抗体を吸着しないことがわかった。この理由として、実施例２、実施例３の吸着材の吸着部位が、抗ＰＳＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有するＰＳＡ分子であることが考えられる。一方、比較例１の吸着材は、抗ｔＰＡ抗体、抗ＰＳＡ抗体ともに吸着することがわかった。この理由として、プロテインＡ分子が抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを持たず、抗体毎の識別ができないことが考えられる。以上より、本実施例の吸着材は、バイオマーカとの特異吸着性の高い抗体を吸着することがわかった。

　一方、表１に示したように、実施例１～３の吸着材では、温度を３７℃に昇温することにより１０％以上の抗体の脱離が見られた。この理由として、吸着材の温度応答部位の下限臨界溶液温度（２８℃）よりも高い高温域に昇温されると、相転移による立体構造の変化に伴って、吸着部位に吸着している抗体との親和性が吸着時よりも低下したためと考えられる。また、実施例２と実施例３との比較より、吸着部位の分子量が小さい吸着材がより多くの抗体（約１．５倍）を脱離することがわかった。この理由として、分子量の低下により、吸着部位中のエピトープの分子配列が不安定化し、抗体との吸着力が低下したことが考えられる。

　以上の結果より、本実施例の吸着材は、バイオマーカとの特異吸着性の高い抗体を分離精製できることがわかった。

　次に、本実施例では、図４に示した抗体精製装置を製造し、当該抗体精製装置と、磁性を有するビーズ担体を担体３０とした吸着材（詳細は後述）とを用いて抗体精製（実施例４～６）を実施した。まず、吸着材の分散液（ｐＨ＝７．４）と、抗ｔＰＡ抗体と抗ＰＳＡ抗体との混合溶液(各成分の濃度：500 ng/ml)とを、送液ユニット５０５と注入口５１４を経て混合し、流路５０４に流入した。その後、磁石ユニット５１６を用いて吸着材を流路壁に固定化し、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を通液して未吸着の抗体を流路５０４から洗い流した（B/F分離）。その後、磁石ユニット５１６を流路５０４から離して吸着材を再分散させ、温調ユニット５１７を用いて流路の温度を３７℃とし、３０分間放置した。その後、磁石ユニット５１６を用いて吸着剤を流路壁に固定化し、流路５０４に３７℃のリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を通液し、精製された抗体溶液を得た。

　実施例４～６で使用した吸着材は下記の通り作製した。まず、定法に従い、磁性を有するビーズ担体（ＮＨＳ　Ｍａｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：ＧＥヘルスケア社製）の表面に温度応答性部位２０を固定化した。温度応答部位２０として、上記化学式に示したε－ポリリジン誘導体を使用した（下限臨界溶液温度２８℃）。その後、グルタルアルデヒド水溶液（１重量パーセント、ｐＨ＝１０）を投入して、表面をアミノ基に対して反応活性化した。その後、吸着部位１０を有する分子の水溶液（０．１重量パーセント、ｐＨ＝７．４）を投入し、３７℃で２時間反応させ、吸着材を製造した。
＜実施例４＞
　実施例４では、吸着部位１０を有する分子として、代表的なバイオマーカのひとつであるｔＰＡ分子を用いた吸着材を用いた。ｔＰＡ分子は抗ｔＰＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有する。また、ｔＰＡ分子の分子量は６３ｋＤａであることが知られている。
＜実施例５＞
　実施例５では、吸着部位１０を有する分子として、代表的なバイオマーカのひとつであるＰＳＡ分子を用いた吸着材を用いた。ＰＳＡ分子は抗ＰＳＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有する。また、ＰＳＡ分子の分子量は３３ｋＤａであることが知られている。
＜実施例６＞
　実施例６では、吸着部位１０を有する分子として、ＰＳＡ切断分子を用いた吸着材を用いた。ＰＳＡ切断分子は、タンパク質を切断する酵素であるエンドプロテアーゼＧｌｕ－Ｃ（Roche製）とＰＳＡ分子とをリン酸緩衝溶液中で２０：１の比で混合し、３７℃で１日反応させた後、得られた切断分子をサイズ分離クロマトグラフィにより分取して作成した。また、ＰＳＡ切断分子が抗ＰＳＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有することは、下記の方法で確認した。また、本実施例で用いたＰＳＡ切断分子の分子量はサイズ分離クロマトグラフィ測定から５ｋＤａであることがわかった。

　そして、精製された抗体溶液の抗ｔＰＡ抗体と抗ＰＳＡ抗体の濃度をＥＬＩＳＡ法により定量した結果を表２に示す。

　表２に示したように、実施例４では、抗ｔＰＡ抗体のみを含む溶液が得られた。この理由として、実施例４の吸着材の吸着部位が、抗ｔＰＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有するｔＰＡ分子であることが考えられる。一方、実施例５、６では、抗ＰＳＡ抗体のみを含む溶液が得られた。この理由として、実施例５、実施例６の吸着材の吸着部位が、抗ＰＳＡ抗体のパラトープと特異的に相互作用するエピトープを有するＰＳＡ分子であることが考えられる。

　以上より、本実施例で作製した抗体精製装置を用いることで、バイオマーカと特異吸着性の高い抗体を分離精製できることがわかった。

１…吸着材、１０…吸着部位、２０…温度応答部位、３０…担体、５０２…流路形成部材、５０３…支持基体、５０４…流路、５０５…送液ユニット、５１４…注入口、５１６…磁石ユニット、５１７…温調ユニット
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

精製対象の抗体におけるパラトープに対応するエピトープを有する吸着部位と、
温度変化によって相転移する温度応答性分子を有する温度応答部位と、
前記吸着部位及び前記温度応答部位を支持する担体と
を備える吸着材。
前記温度応答性分子は、相転移温度が０℃以上６０℃以下の範囲にある化合物であることを特徴とする請求項１記載の吸着材。
前記吸着部位は、精製対象の抗体が結合する抗原のエピトープを含む部分断片でることを特徴とする請求項１記載の吸着材。
前記温度応答部位が、単量体として、アクリルアミド誘導体、メタクリル酸エステル等のメタクリル酸誘導体、アクリル酸エステル等のアクリル酸誘導体、ビニルアルコール誘導体、リジン誘導体、グルタミン酸誘導体、アスパラギン酸誘導体、乳酸、ジオール誘導体、カプロラクタム類、カプロラクトン類、糖類、シロキサン類からなる群より選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１記載の吸着材。
　前記吸着部位は、前記温度応答性分子に結合されていることを特徴とする請求項１記載の吸着材。
　前記吸着部位は、前記担体に結合されていることを特徴とする請求項１記載の吸着材。
　請求項１乃至６いずれか一項記載の吸着材を捕捉する吸着材捕捉部と、
　前記吸着材捕捉部に捕捉された前記吸着材を所定の温度に調節する温度調節装置とを備える抗体精製装置。
　前記吸着材における担体が磁性ビーズであり、前記吸着材捕捉部は磁性材料を備えることを特徴とする請求項７記載の抗体精製装置。
　精製対象の抗体におけるパラトープに対応するエピトープを有する吸着部位と、温度変化によって相転移する温度応答性分子を有する温度応答部位と、前記吸着部位及び前記温度応答部位を支持する担体とを備える吸着材と、精製対象の抗体を含む溶液とを接触させる工程と、
　前記吸着材を洗浄する工程と、
　溶液の温度を昇温して前記温度応答性分子を不溶化させることで、前記吸着部位に吸着した抗体を分離する工程と、
　分離した抗体を回収する工程とを含む
　抗体の精製方法。