JPH07507458A - 単核細胞からの核酸の調製 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 単核細胞からの核酸の調製 発明の背景 本発明の分野は、研究、探索および調査のための核酸の調製である。

通常、特定の核酸の存在、例えばヒト血液細胞中のＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡまたはＲ ＮＡの存在を検出するために核酸を様々な組織から単離、精製（すなわち調製） する必要がある。この目的のために、通常は、適当な血液細胞の厳密な精製、こ れら細胞の溶解および遊離した核酸の精製を行い、後の分析法を阻害するかもし れない物質を除去した後に核酸が抽出される。特に、増幅を可能にする質および 純度の核酸を得ることが重要である。

核酸［例えば、デオキ／リボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）］の特定 配列の増幅を可能にする２つの常法があるが、１つは「ポリメラーゼ連鎖反応」 （２つのプライマーを用いて、プライマーがハイブリダイズする領域の間に位置 する核酸を合成する）と称する方法であり、もう１つはＲＮＡ５ｅＨ１逆転写酵 素およびＲＮＡポリメラーゼを使用する方法である。これら方法は、Ｍｕｌｌｉ ｓら［米国特許４゜６８３、２０２］およびＫａｃｉａｎら［ＰＣＴ／ＵＳ９０ １０３９０７コが各々開示している（これら両文献は本明細書の一部を構成する ものとする）。

発明の要旨 本発明は、核酸を調製するための方法およびキット、特にこの核酸を増幅するた めに単核細胞（例えば、１９７１球および／または単球）などの細胞からＤＮＡ またはＲＮＡを単離するための方法およびキットに関する。次いで、このように 増幅された核酸を、様々な目的に用いることができる（選択されたウィルス核酸 配列に相捕的なプローブを用いたウィルス核酸配列の存在についての核酸のスク リーニングを含む）。さらにこれは、核酸中の遺伝的異常または欠損の検出に有 用である。このように、本発明の方法およびキットは、厳密な精製法を必要とせ ずに核酸の迅速で容易な調製を可能にするよう設計されている。

即ち、第１の態様において、本発明は増幅のために細胞から核酸を調製する方法 に関する。様々な細胞を含有する試料（例えば、全血）および適当な遠心分離培 地を遠心分離機にかけて、１つの細胞型の集団を分離した層に集まるようにする 。

この層は、少量の血小板および／または脂質または他の低密度の成分あるいは他 の可溶性および懸濁性成分を除いて、試料中の残りの細胞および破片とは分離お よび独立している。驚くべきことに、血小板および他の成分の存在は本性で精製 される核酸の増幅を妨げない。

細胞の集団は全血由来の単核細胞を含むのが好ましい。しかし、細胞は単核細胞 以外の細胞であってよいし、モして／または他の供給源、例えば胸膜液、滑液、 または細胞のインビトロ供給源由来であってもよい。細胞または細胞の試料は、 分離のために遠心分離されることが可能であるかまたは溶解される状態にある（ 以下に説明する）ことのみを必要とし、次いで本発明に従い、後の反応において 有効に用いられる。遠心分離培地は細胞に対して等張および／または等密度であ ってよいが、試料中の所望の細胞と他の細胞の中間の密度であるのが好ましい。

細胞を遠心分離組成物から、例えばピペットを用いた吸引により採取し、溶解す る。このような溶解は細胞に伴われる核酸を増幅用に利用可能にする。

好ましい態様において、本方法は、鉄イオン（Ｆｅ”’）と錯体を作り、核酸を 増幅する前に該イオンを溶液からを効に除去する錯体化試薬の添加を含む。鉄（ ＩＩ＋）イオンの存在は、ある種の酵素的方法、例えば核酸増幅に用いられる方 法を妨げる。錯体化試薬は好ましくは、亜鉛イオン（Ｚｎ”）、マンガンイオン （Ｍｎ”）またはマグネシウムイオン（Ｍｇ”）と錯体を作らないよう選択され るが、これはこれらイオンが有益でありこれら酵素反応を容易にする傾向がある からである。このような試薬はキレート化試薬デフエロキサミンである（デスフ ェリオキサミンおよびデスフェリオキサミンＢとしても知られる）。

他の好ましい態様において、カルシウムイオン（Ｃａ”）または本発明の溶解物 を用いて行われる増幅反応もしくは他の反応を妨げる他のイオンと錯体を作る第 ２のまたは異なる錯体化試薬を加えてもよい。カルシウムイオンも増幅法におい て用いる酵素反応を妨げるであろう。第２の錯体化試薬は、亜鉛イオンまたはマ グネ／ラムイオンと錯体を作らないように、または望ましいイオン種（例えばＺ ｎ゛°、Ｍｎ”およびＭｇ”）よりも望ましくないイオン種（例えばＦｅ″″″ ０およびＣａ”）に対して高い親和性を宵するよう選択するのが最も好ましい。

より好ましい態様において、亜鉛イオン、マンガンイオンまたはマグネ／ラムイ オンを溶液に加えて酵素反応を容易にすることができる。

第２の関連の態様において、本発明は核酸を増幅する方法であって、増幅すべき 核酸を鉄イオンを含む溶液中で調製し、増幅が起こるように錯体化試薬の使用に よりこれら鉄イオンを６１合物から有効に除去する方法に関する。また該溶液は 、増幅が起こるように好ましくは錯体化試薬により溶液から同様に除去されるカ ルシウムイオンを含んでいてもよい。

第３の関連の態様において、本発明は完全細胞から核酸を増幅する方法に関する 。この方法において、完全細胞は強力なアルカリ、例えばＫＯＨｌＮｓＯＨまた はＬｉＯＨの使用により増幅前に溶解される。また、このような溶解は、細胞由 来のあらゆる二本鎖核酸を変性させ、これにより増幅を容易にする。溶解後に、 鉄イオン錯体化試薬を加えて懸濁物または組成物から鉄イオンを除去するのが好 ましい。

核酸が増幅されたときには、既知のハイブリダイゼーション法および検出法を使 用して、増幅した核酸をスクリーニングするための方法は当分野で既知である。

を構成するものとする）が開示している均一溶液相法（ｒＨＰＡＪ）により、標 的配列（好ましくは増幅のために標的化された配列を含む）に相捕的な核酸プロ ーブを使用し、プローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせ、そしてプローブ と標的の複合体を検出することによる方法である。このようなプローブ検出法の 使用により、ウィルス核酸、例えばＨＩＶまたはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）が 、試料中に存在する核酸に伴われているか否かを測定することができる。また、 このようなスクリーニングはあらゆる他の種類の核酸配列、例えば遺伝的異常ま たは欠損を標的とすることができる。このような増幅法の使用は、遠心分離後に 回収した試料の一部に含まれる標的核酸の１個のコピーであっても、本発明を使 用して検出することを可能にする。

本発明のさらに別の態様は、上述の本発明方法を行うのに必要な装置、培地およ び試薬を含むキットを提供することである。例えば、該キットは遠心分離培地（ および、必要なら浸透試薬）の供給、試料から細胞を溶解させるに十分な溶解試 薬の供給、および細胞から核酸を増幅させるに十分な増幅原料の供給を含んでい てもよい。また、このようなキットは鉄イオンおよび／またはカルシウムイオン 錯体化試薬および所望の核酸標的または既知の遺伝異常に対するプローブの供給 を含んでいてもよい。

本発明の他の特徴および利点は、以下に示す本発明の好ましい態様の説明および 請求の範囲から明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、６６名の異なる個体の赤血球細胞数、ヘマトクリットおよび血漿密度を 示すグラフである。

図２は、デフェロキサミンと共奏した亜鉛滴定の増幅に対する効果を示すグラフ である。

図３は、増幅に対するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびデフェロキサミンの 効果を示すグラフである。

好ましい態様の説明 請求の範囲に記載した方法は、核酸を好ましくは単核細胞から集め、単離し、調 製し、増幅してスクリーニングするための一連の工程、およびこのような方法を 実施するための装置、培地および試薬の組合せに関する。様々な工程、装置、培 地および試薬は上で一般的に説明し、以下に例を挙げる。

細胞試料の入手 細胞試料は、あらゆる適当な供給源、例えば全血から、または滑液、胸膜液また は所望の細胞を含有している他の液体から得ることができる。好ましくは、該試 料は抗凝固処理された全血中の単核細胞からなり、これはヒトを含むあらゆる動 物から入手することができる。単核細胞（または、他の所望の細胞）が液体中に 残るならば、所望により血液を前処理して、例えば赤血球および／またはフィブ リンを除去することができる。他の血液分画または所望の細胞を含有しているあ らゆる他の液体を用いることができる。

血液または細胞試料の他の供給源は、当分野で既知の方法を含むあらゆる利用可 能な方法を用いて入手することができる。同じ装置内で、該試料を入手して保ａ し、さらに遠心分離に供することができる。該試料が血液であるなら、試料を抗 凝固試薬、例えばＥＤＴＡまたはヘパリンで処理して、方法の残りの実施前、ま たはキット中の試薬および装置の残りの使用中に血液が凝固しないようにするの が望ましいであろう。

組成物の調製 試料および遠心分離培地の組成物を作成して、遠心分離の際に単核細胞が分離し たバンドに集まるようにするのが有用である。「分離したバンドに集まる」とい う用語は、所望の細胞が該組成物中を特定密度レベルへと有効に移動し、該組成 物中の残りの細胞および他の破片から十分に分離され、後の酵素反応、例えば増 幅を行い得ることを意味する。このような遠心分離培地は当分野で既知である。

例えば、「パーコール法およびＰＥＲＣＯＬＬ″勾配の較正のための応用密度マ ーカーピーズＪ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｐａｒ ａｔｉｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ■s： ｒ　５ｅｐｒａｃｅｌ　ＩＭＮ１１分離マニュアルＪ、　５ｅｐｒａｔｅｃｈ　 Ｃｏｒｐ、、　Ｏｋｌａｈｏｍａ　Ｃ１ｔｙ、　Ｏｋｌａｈ盾高■ 発行：　ｒＮｙｃｏＭＥＤｌ？密度勾配培地Ｊ、　Ｎｙｃｏ＋＊ｅｄ、　０ｓｌ ｏ、　Ｎｏｒｗａｙ発行を参照。遠心分離培地は試料の細胞に等張であってよ（ 、試料由来の細胞に通常は等密度であるが、または好ましくは所望の細胞集団と 試料中の他の細胞集団の中間の密度を有するであろう。遠心分離の前に遠心分離 培地および細胞の試料を混合して遠心分離前にいかなる密度勾配も存在しないよ うにする。「等密度」とは、遠心分離培地が試料中の細胞とほぼ同じ密度であっ て、遠心分離の際に試料由来の所望の細胞が残りの混合物（全血由来の試料の場 合には混合物の残りは赤血球および他の白血球を含有するであろう）から分離す るであろうことを意味する。また、遠心分離前または遠心分離中に組成物を密度 勾配として形成することができる。

微差カットオフ密度遠心分離を使用する好ましい態様においては、細胞試料を遠 心分離培地と混合して、得られる密度が所望の細胞集団と試料中の他の細胞集団 の浮遊密度の中間にあるようにする。例えば、混合物の密度は単核細胞の浮遊密 度より大きく、全血試料中の赤血球および顆粒球の浮遊密度より小さい。この態 様において、遠心分離混合物を遠心分離に供して単核細胞が比較的狭いバンドの メニスカスに「浮遊する」ようにする。このような時間より長い（例えば、等密 度平衡に到達するまで）このような混合物の遠心分離は、結果として所望の細胞 の比較的広いバンド（または複数のバンド）を与えるであろう。

微差カットオフ遠心分離または本発明の範囲内の他の遠心分離法を、全血由来の 単核細胞以外の細胞のために本明細書に照らして過度の実験をせずに適応させる ことができる。

一般に、遠心分離混合物の最終所望密度は、単核細胞を分離するためには液体１ ｍｌ当たり約１．０７７ｇである。しかし、遠心分離培地および混合物の密度は 、試料中の細胞の浸透性、種類および量に従って変化するであろう。

「等張」の用語は、調製されたＵ合物が試料由来の細胞に対してほぼ等張であり 、その結果、細胞が浸透圧差の作用によって破壊しないことを意味する。通常、 この等張状態は浸透試薬、例えばスクロースまたは適当な塩の使用により達成さ れる。適当な塩とは本発明方法の実施をその他の点では妨げない塩であり：従っ て、核酸の増幅を妨げない塩が望ましい。例えば浸透試薬がスクロースである場 合のように、浸透試薬が混合物中のイオン濃度を増加させないときに有利である こともある。

好ましくは、遠心分離培地を試料、例えば血液中で直接用いて試料中の細胞を溶 解させないことが可能である。いくつかの有用な遠心分離培地の例には、ＰＥＲ ＣＯＬＬ、ＳＥＰＲＡＣＥＬＬ−ＭＮおよびＮＹＣＯ−ＤＥＮＺが含まれる。Ｆ ｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅまたはＦｉｅｏｌｌ−４ｓｏｐａｑｕｅを含む他の 有用な培地は、！するのではなく層状にして用いるのが普通である。例えば、遠 心分離培地が白血球を溶解するなら、次いで核酸が時期尚早に遊離するであろう 。赤血球が溶解するなら、それらは後の増幅反応を妨げる鉄イオンの供給源であ るヘモグロビンを遊離する。遠心分離培地は、全血試料中に存在する単核細胞の 約５０％より多いかまたは等しい細胞が遠心分離後に回収されるのを可能にする のが好ましい。

逸心分簾 次いて、混合・物を遠心分離に供して、所望の細胞が有効に移動して分離細胞の 独ｉχしたバンドを形成するようにする。等密度遠心分離または所望の細胞集団 と試料中の他の細胞の中間の遠心分離培地を用いる遠心分離の場合には、所望の 細胞は回転中心に向いている遠沈管の末端に有効に移動し、遠心分離培地の上端 に」二昇して、若干の血小板および／または脂質および他の構成成分と共に分離 細胞を含Ｔｉする上部を形成する。

１つの例において、混合物を約２．９０　Ｏｒｐ＊で約２０分間（約１　、５０ ０　ｘｇ）遠心する。この遠心分離は、細胞の大部分または大きな割合の溶解を 引き起こさないよう七分穏やかなものであり、これは無傷細胞から回収される核 酸の増幅を進行させ得る十分に少数の細胞しか溶解しないことを意味する。

遠心分離は、分離バンド近くの試験管部分（例えば、等密度遠心分離における回 転の中心近くの試験管部分）が、所望の細胞（例えば、単核細胞）を含有する組 成物部分を強調するように形成される遠沈管内で行うことができる。これは、例 えば試験管の内部直径を狭くすることにより行うことができる。さらに、組成物 作成中、遠心分離実施中、および／または単離された所望の細胞の採取中の乱れ および混合を阻害する装置を用いて遠心分離を行うことができる。このような装 置の例は、所望の細胞の通過を可能にする多孔性ナイロンフィルターである。

醒望ｑ但撰±Ａ育する部分９体■ 遠心分離後に、所望の細胞を含有する液体部分（分離したバンド）を、当分野で 既知のあらゆる方法を用いて、例えばピペットを用いたその部分の吸引により混 合物の残りから採取することができる。通常、元の容量全体の約２０％より小さ い容量を採取し、例えばｆ３ｍｌ中約５０Ｏｕｌであり、好ましくはメニスカス のまたはそれに隣接した上端約１００ｕｌのみである。

叫望ｐ世陶ｐ重Ｍ 単離された所望の細胞を採取した後に、細胞を溶解して細胞からまたは細胞に結 合した核酸を遊離させる。これは所望の細胞上に結合しているがまたはその内部 に見い出されるあらゆる核酸を意味する。

例えば、強アルカリの使用、酵素試薬の使用、清浄剤の使用、浸透ショックの使 用、溶質のカオトロピズム濃度の使用または音波破砕の使用を含むあらゆる所望 の方法により細胞を溶解させることができる。好ましい態様において、水酸化カ リウムの使用により細胞を溶解させることができる。このアルカリ、または同等 のアルカリ、例えばＮａＯＨまたはＬｉＯＨは、さらに細胞性ヌクレアーゼを不 活性化し、従ってアルカリ誘導性溶解物を用いる後の酵素反応の阻害を防ぎ、さ らに二本鎖核酸を変性させ得るので特に有用である。

キレート化試薬の添加 鉄イオンおよび／またはカルシウムイオンおよび／または池の望ましくないイオ ンと錯体を作る物質を密度遠心分離培地または溶解中もしくは溶解後の溶液に加 えることができる。「錯体を作る」とは、物質がキレート化、配位、共有結合ま たはある種の他の結合もしくは結合形態により有効にそれ自体をイオンに結合し 、イオンが本発明の後の増幅反応をもはや妨げないようにすることを意味する。

これらイオンは、本発明方法の他の工程、例えば単核細胞からの核酸の増幅にお いて用いられるであろう酵素を阻害するであろうから、溶解により得られる溶液 から除去される。

好ましくは、錯体化試薬はこのようなイオンを溶液から除去するが、亜鉛イオン またはマグネシウムイオンと有意に結合しないキレート化試薬である。何故なら これらイオンは後の増幅反応において用いられるであろういくつかの試薬にとっ て有用であるからである。一般的に、ｒＤＮＡ複製および転写における亜鉛Ｊ、 　ｌｕ。

Ｆ、　Ｙ、　Ｈ，、およびＷｕ、Ｃ，Ｗ、、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｎｕｔｒ、　７ ：　２５１　（１９８７）を参照。

用いられるであろうキレート化試薬の例はデフェロキサミンおよびトランスフェ リンである。デフェロキサミンは鉄イオンに対してｉｏ”の結合定数を有する［ 「ラット赤血球血球影膜の化学的に開始された脂質過酸化におけるデスフェリオ キサミノおよびフェリオキサミンの抗酸化能力Ｊ、　Ｖｉｄｅｌａ、　Ｃ，＾、 ら、　Ｂｉｏｃｈｅａ、Ｉｎｔ’ｌ、　１６、７９９　（Ｍａｙ　１９８８）を 参照］が、亜鉛またはマグネシウムイオンと特異的に結合しない。カル／ラムイ オノ錯体化試薬の例はシュウ酸塩およびクエン酸塩である。

シｊつ酸塩およびクエン酸塩も、特に中性−アルカリｐＨでＭｇ″＃に比べて高 い安定性でＦｅ””に結合する。他の物質、例えばＥＤＴＡは他の二価陽イオン と共に亜鉛イオンおよびマグネシウムイオンに結合するから好ましいキレート化 試薬ではない。

いくつかの有用なキレート化試薬は、所望のイオン（例えば、Ｍｇ”、Ｚｎ”） に結合する能力を有しているであろうが、それらが望ましくないイオンに優先的 に結合するなら有益であろう。例えば、ＥＧＴＡはＭｇ”よりむしろＣａ”に結 合する。従って、ＥＧＴＡの濃度がＭｇ”のｆｉ［より低いときには、依然とし て遊離Ｍｇ”の望ましくかつ予測可能な活性が存在するであろうが、極めて微量 レベルのＣａ”は有効に隔離されるであろう。さらに、このようなキレート化試 薬を所望の反応に加える前に所望の種、例えばＭｇ”と混合するなら、他の供給 源から反応に与えられたＭｇ”の遊離活性は錯体化したキレート化試薬の添加に より低下しないであろうが、キレート化試薬は、結合／解離速度が比較的速いな ら、優先的に結合される種、例えばＣａ”をを効に隔離するであろう。

キレート化試薬の使用は、抗凝固試薬を本発明の方法において既に用いている場 合に特に有用であるが、これは、このような抗凝固試薬が鉄イオンの遊離を引き 起こすかまたは可能にするからである。

また、溶解物を用いる後の反応、例えば増幅は様々な多価陰イオンにより阻害さ れるかもしれない。多価陽イオン例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の有効量 の供給はこのような多価陰イオンを中和させることができる。このような多価陽 イオンの有効量は多価陰イオンによる阻害を低下させるに必要な量である。核酸 はそれ自体窓に荷電された陰イオンであるから、多価陽イオン、例えばＰＥＩが このような膏益な効果を有するであろうことは驚くへきことである。

所望の細胞からの核酸の増幅 ここで、核酸は当分野で既知のあらゆる方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応法、 またはＫａｃｉａｎ（上記）が開示しているＲＮＡ５ｅＨ，逆転写酵素およびＲ ＮＡポリメラーゼを用いる方法を用いて増幅されるであろう。好ましくは、増幅 は後記に開示するようにプローブの標的であろう核酸の同じ配列を標的とするで あろう。

核酸増幅は、溶液の化学平衡を増幅に供するために適当に調製する、例えば水酸 化カリウムなどの溶解試薬を中和することを除いて、最初に遠心分離および溶解 からの破片を除去せず、また他の場合には単離された所望の細胞を含有している 部分を「浄化」せずに所望の細胞由来の核酸上で行うことができる。

所望の核酸のスクリーニング 現在、増幅された核酸について、当分野で既知のあらゆる方法または他の関連の 方法、例えば所望の核酸配列に相補的なりＮＡまたはＲＮＡ鎖（この相補鎖は「 プローブ」として知られる）を用いるハイブリダイゼーションを用いて所望の核 酸配列についてスクリーニングすることについてはその環境が整っている。核酸 にプローブをハイブリダイズさせ、あらゆる既知の検出法、例えば通常のササン またはノーサンブロノト法、またはＡｒｎｏｌｄら（上記）が開示している均一 保護アソセイ（ｒＨＰＡＪ）を用いて検出することができる。好ましい態様にお いて、プローブはＨＩＶウィルスに関連した核酸を検出するであろう。

上記の方法を実行するためのキット 上記の方法を実行するための簡単なキットを、容易に入手可能な物質および試薬 から調製することができる。該キットは、試薬が互いに補完するように、例えば 浸透性物質がスクロースであって遠心分離培地がＰＥＲＣＯＬＬ”であるように 設計することができる。

実施例 ＰＥＲＣＯＬＬ”　＋よ製造者により１．１３０±Ｏ，ＯＯ５ｇ／ｇｅｌの密度 範囲で供給される。

正確な密度は各ロットに与えられている。Ｉ　Ｌ（１０００Ｉｌｌ）のＰＥｌＩ Ｃ０ＬＬ”懸濁液（０，２５Ｍスクロース中）を特定密度、ρ（所望）で作成す るために、必要なＰＥＲＣＯＬＬ”ストックの容ｆｆｉ（ｍｌ）を以下の方程式 から判断することかできる：または、 この実施例においては、スクロースが浸透性物質（ｏｓｍｏｔ　ｉｃｕｇ＋）で あり、混合物中に５Ｘ（１，２５Ｍ）スト、りとして導入され；従って最終濃度 は０．２５Ｍであり、加えるべき容ｆｌ（Ｖ（ｆ透性））は２００．０ｓｌであ る。１．２５Ｍスクロースの密度は１．１６０７ｇ／ｍｌである。第１方程式の 分子中の最終項の（ｔｏｏｏ−ｖ（浸透性）−ＶＰＫｌｌ（：０ＬＬ）は最終容 量をＩＬにするために加えられる水の容量を表しており、水に対して名目上の密 度を１．　ＯＯＯＯｇ／ｍｌと仮定している。従って、１）　１．１３１ｇ／ｍ ｌの密度で供給されるＰＥＲＣＯＬＬｌｌのストック溶液を使用して１゜１１０ ｇ／ｍｌの密度を有する懸濁液を作成するために、以下の成分を混合する：５９ ４　、４　ｍｌ　ＰＥＲＣＯＬＬｌ＋２０００ｓｌ　１．２５Ｍスクロース ２０５、６ｓｌ　Ｈ，０ ２）得られた懸濁液の屈折率（Ｒ１）を正確に測定する。０．２５Ｍスクロース 中にＰＥＲＣＯＬＬ”を含む（ＤＣＭ、）密度遠心分離培地（ＤＣＭ）に適した 関係（Ｐｈａｒ＠ａｃｉａが開示）を使用して密度を計算する：ρｏｃｗｙ−（ ６，６１４５ＸＲＩｏｃＭｔ）　７．８６２０従って、所望の１　、　Ｌ　Ｉ　 Ｏｇ／ｍｌ懸濁液に対して予測されるＲ＋は１．３５６４であろう。

３）所望の密度を得るのが困難であるかまたは十分に正確な容積測定のガラス製 品が利用可能でないなら、上記の式をガイドとして使用して括弧内に示す所望の 最終密度（例えば、１．１０５ｇ／ｎｌおよび１．１１５ｇ／ｍｌ）ををする２ つの懸濁液を作成するのに必要な容量を見積もる。各々のＲ１を測定し、各々の 正確な密度を計算する。混合する各々の容量［例えば、■（低）および■（高） （Ｖ（全体）−■（低））］を計算し、所望の密度および全体容量を得る、４） 同様の方法を用いて他の浸透性物質、例えば０．１５Ｍ　ＮａＣ１中にＰＥＲＣ ＯＬＬＲ懸濁１（ＩＥを作成することができる。また、ＮａＣ１溶液の密度は文 献において入手可能であり、濃度の関数として計算することができる。例えば、 上式において５Ｘスクロースの代わりにＩＯＸストックとして用い得る１、５０ ＭＮａｃｌは１゜０５８　ｇ／１ｌｌ）密度ヲ有シテイル。密度ヲコ（Ｄ　、ｋ 　ウナＰＥＲＣＯＬＬ”／食塩水ＤＣＭｔのＲ１から以下の方程式により計算す ることができる：ρｎｃｘｔ＝（６，８１６６ＸＲＩｏｃ、４ｔ）　８．０９２ ３屈折率１．３５０は、ＤＣＭ、に対して１．１１０ｇ／糊１の所望の密度に対 応するであろう。

５　）ＰＥＲＣＯＬＬ”以外の物質を用いて所望の密度を得ることができる（Ｐ ｈａｒｓａｃ　ｉａおよび）ｌｙｃｏｍｅｄ製品の文献中に概説されているよう に、密度試薬の所望の性質には次のものが含まれる。少なくとも所望の密度、そ れ自体の小さな浸透活性、および溶液中での低粘度を有する溶液を与えるに十分 な溶解度および比重）。例えば、ＮＹＣＯＤＥＮＺ”ストック溶液は、それを水 中に最終ＤＣＭ密度として所望である密度より大きな密度（例えば、≧０．３５ Ｍ）で溶解することにより作成することができる。ＮＹＣＯＤＥＮＺ”水溶液の 密度はそのモル濃度から予測することができる：ρ、Ｉｙｃ、ａ＠＋、ｔ＝（０ ，４３９１４［Ｎｙｃｏｄｅｎｚ］）＋０．９９８２８そしてそのＲ１により確 認される。

ρＮｙｅａｄ＊ｎｔ”’（３，２４２Ｘ　ＲＩ　Ｎｙｅｏａ−ｎｔ）　３．３２ ３既知の密度を有するこのようなＮＹＣＯＤＥＮＺＲストｌり溶液を適当な浸透 性物質と共に使用し、上記のＰＥＲＣＯＬＬ”について述べたものと同じ方法を 用いて所望の密度を有する等張のＤＣＭを得ることができる。得られた混合物の 密度を、以下の定数（Ｎｙｃｏｍｅｄより）を用いて屈折率から計算することが できる：ρｏｃＮ３＝（３，５５３ＸＲＩｏＣＭ１）−３，７５１（スクロース 中のＮＹＣＯＤＥＮＺ”（Ｄ　ＣＭＪｉ：ツイテ）、モシテ：ρＩ、。、＝（３ ，２８７ＸＲＩｏＣ，、）−３，３８３（食塩水中のＮＹＣＯＤＥＮＺＩｌ（Ｄ ＣＭ４）について）。

試料、例えば血液中に存在する細胞の浮遊密度は、浸透強度が変化するなら変化 することができる。通常、細胞の浮遊密度は、容量オスモル濃度の減少に伴い減 少し、容量オスモル濃度の上昇と共に上昇する。容量オスモル濃度と培地密度の 様々な組み合わせを用いて同様の結果を達成することができるが、本明細書中で 開示される生理的に近い容量オスモル濃度が本発明方法の目的（後の増幅反応の ために細胞を調製する）のために適している。さらに、赤血球（ＲＢＣ）は白血 球（ＷＢＣ）より浸透ショックに感受性であるのが普通であり、最も適した試料 処理条件はＲＢＣ溶解の可能性を最小にする条件である。

本明細書中で開示するように、１．１１０ｇ／ｍｌという密度は、全血から単核 細胞を分離するための最終混合物密度１．０７７ｇ／ｍｌを得るために全面と混 合するＤＣＭにとって好ましい。ＤＣＭに対するこの密度は、回収された細胞数 、所望の分画の純度、すなわちライト染色により測定した低い顆粒球汚染の調査 、および回収された細胞中のライト染色により測定したリンパ球対単球の典型的 な比の観察による調査を含むいくつかの実験結果を基にして経験的に選択された 。また、このＤＣＭ密度は単核細胞の通常の浮遊密度（通常は＜　１．０７７ｇ ／ｍｌであると考えられる）および血液組成の正常範囲に基づく好ましい密度で ある。大部分の成人個体についてのＲＢＣの充填容量は、通常、全血液容量の少 なくとも３５％であるが、これは有意な貧血を有する個体についてはさらに低い 可能性がある。ＤＣＭおよび全血を混合した場合に、得られる液相の密度は各々 の供給源、すなわちＤＣＭおよび血漿から与えられる部分容量の組み合わせであ るはずであり、それら各々の密度は： １．１１０ｇ／■ｌの密度を有するＤＣＭと血液の等しい容量を混合し、血液容 量の６５％が１．０２６８／ｍｌの密度を有する血漿であるなら、得られる液相 の密度は１０７７ｇ／ｍｌであり、これは他の血液細胞から単核細胞を分離する ための理想的な密度である。このような混合物において、単核細胞の大部分は多 （の血小板と共に混合物の上端へ浮遊し：ＲＢＣおよび顆粒球は沈殿するであろ う。このアプローチを用いて、好ましい密度は血液細胞試料（例えば血液）およ びＤＣＭ内の条件に従い変化するであろうことは明らかである。上記の因子を用 いた適当な密度の測定は過度の実験を必要としない。

大多数の個体から得られる血液は、全血液容量の３５％より大きい充填ＲＢＣ容 量（ヘマトクリット法により測定した場合）を有するであろう。ゆえに血液およ び１．１１０ｇ／＋ａｌ　ＤＣＭの等しい容量を混合して、はとんどの血液試料 について＞　１．０７７ｇ／ａｌｌの密度を有する液相が得られる。標的単核細 胞分画はこのような混合物の上端にさらに容易に浮遊するであろう。図１は６６ 名の異なる個体から得た血液について測定したＲＢＣ数およびヘマトクリットを 示す。第２のｙ軸はＤＣＭの特定容量と第１ｙ軸上でまっすぐ向かい側のへマド クリットを有する血液の等しい容量の混合から得られるであろうＤＣＭ−血漿混 合物の対応する密度を示す。ごの実施例は、本明細書中で開示する方法が大多数 の個体について１゜０７６ｇ／ｍ１〜１．０８２ｇ／−１の間の密度を有するＤ ＣＭ／血漿混合物を与えるであろうことを示す。混合物密度の上昇により、単核 細胞（ＭＭＣ）分画中にいくらかの顆粒球汚染が予ｉｌ＋１されよう。しかし、 顆粒球の浮遊密度は通常は平均１．０８６ｇ／ｍｌであって小さな分画のみが浮 遊密度＜１．０８２ｇ／請ｌを有しているから、この密度範囲中の混合物はＭＮ Ｃと顆粒球を分離する際に非常に有効であろう。

さらに、本発明のいくつかの態様、例えば核酸標的増幅および／またはハイブリ タイゼーション分析のためには、実質的でさえある顆粒球汚染は有意な問題では ない。この理由はこれら方法が非標的配列の非常に過剰なレベルの存在において でさえ所望の標的配列に特異的であるように設計されているからである。例えば 、１（ＩＶ感染に対する標的細胞でない顆粒球に対して、ＨＩＶ感染に対する標 的細胞を含んでいるＭＭＣに非常に富む細胞集団を回収することは有利であるが 、これは絶対的に必要なことではない。このような場合において、高度に精製さ れたＭＮＣを回収することよりも大部分のＭＮＣを回収する結果を与える条件を 用いることがさらに重要である。

上記の方法を用いて、所望の密度±Ｏ，ＯＯ２ｇ／ｍｌを有するＤＣＭを再現性 および信頼性を伴い作成することが可能であった。

本発明は、血液およびＤＣＭを等しい容量で混合することまたはＤＣＭ密度が１ 、　ｌ　ｌ　Ｏｇ／ｍｌであるよう強いられることを必要としないことに注意す べきである。過度の実験を行わずに、成分の部分容量およびそれら各々の上記の ような密度に基づく広範囲のＤＣＭ密度について混合する適当な容量を計算する ことは当分野の技術範囲内にある。逆に、所望の容量および最終的な混合物密度 の列挙に合わせるために、用いる適当なりＣＭ密度を計算することができる。

単核細胞を回収するための血液分画化の例１）ねじ蓋試験管中で３．０ＩＩｌｌ のＥＤＴＡ抗凝固全血を３．０ｍｌの等浸透性ＰＥＲＣＯＬＬＩｌ／スクロース ＤＣＭ（密度＝　１．１１０ｇ／ｍｌ）と混合する。蓋をしっかり締め、数回反 転させて十分に混合する。

２）揺動バケツローター中、１６００ｘｇで２０分間遠心する。ＲＢＣがペレッ ト化する。顆粒球はＲＢＣと共にペレット化し、ＲＢＣの頂部にバンド化するで あろう。ＭＮＣはこの混合物の頂部に浮き上がるであろう。他の遠心条件を用い ることもできる。例えば、さらに大きなｇ力を比較的短時間で用いることができ るが、その時にはＭＮＣがメニスカス（凹凸）下にバンド化することがあるので 、ｇ力が完全な等密度平衡が得られるレベルを越えないのが好ましい。また、試 験管の形状が遠心の時間と力に影響を与えることもある。例えば、比較的短い液 体カラムは、より早く等密度平衡に到達するはずである。さらに、メニスカスお よび／またはＭＮＣバンドを安定化する装置を用いることもできる。このような 異　゛なる条件用に、または異なる細胞種もしくは試料供給源用に遠心条件を適 切に適合させるのは、当業者にとって過大な実験を必要とすることではない。ま た本発明は、少なくとも１つの洗浄工程を含む遠心法を包含することができる。

このような方法は当分野で既知である。ＭＮＣバンドの外観は、実際の遠心法お よび遠心装置、例えば使用する試験管の直径、血液量などに依存してわずかに変 化するが、通常はメニスカスの最も高い位置に集まるであろう。

３）完全なＭＮＣバンドを、ピペット中に吸引することによって、即ちその先端 が濃密な細胞集積領域中に残るようにピペットを操作することによって回収する ことができる。ＭＮＣの大部分が回収されるまで続ける。通常、この操作によっ て３００〜７００μｌのＭＮＣ／ＤＣＭ／血漿懸濁液が集められることになるで １　）　２５０　μＩノＭＮ　Ｃｔ％濁液を２５０μ１７）０．１４Ｎ　ＫＯＨ と混合する。これを十分に渦巻き撹拌する。９５℃で３０分間加熱する。

２）以下の成分： ０．６５Ｎ　酢酸（ＨＯＡｃ） ０．０６６Ｍ　トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、塩基０．０８４Ｍ　 トリス・ＨＣＩ からなる溶液５０μｍを加えることによって、上で得られた加水分解物のｐＨを ８０±０．５（通常）に調節する。

３）例えば渦巻き撹拌によって十分に混合する。

また、溶解を引き起こす他の方法、例えば他の塩基性溶液、次いで中和用の酸溶 液、または酵素もしくは穏やかな清浄剤の組合せを用いることもできる。単核細 胞および他の細胞のためのこのような方法は当分野で既知である。

増幅反応における溶解液の使用 上記の溶解液は生物学的に導かれる分子の粗混合物がらなり、その多くは元の試 料構成成分の低分子貴加水分解産物である。これら溶解物中に存在するＤＮＡは 、細胞内でのその元の構造と比較すると断片化および変性されているが、それて もなお種々の化学反応および生化学反応のための適当な反応物質である（核酸標 的増幅のための鋳型としてのものを含む）。実際的がり常法通りに標的増幅を使 用して血液由来の核酸を分析する際に付随する操作および複雑さを最少にするた めに、本発明の１つの態様においては、さらに精製することな（溶解液を分析物 の供給源として増幅反応液に直接加える。しかし、生物学的に導かれる試料がイ ンビトロ生化学反応（酵素反応を念む）に対して阻害性である成分を含有するこ とが多いことは周知である。例えば、本明細書中に記載した方法によって得た溶 解液よりもさらに高度に精製された核酸調製物であっても、ポリメラーゼ連鎖反 応増幅の強力な阻害物質を含有することが報告されている［Ｒ，ｄｅＦｒａｎｃ ｈｉｓ、　Ｎ、Ｃ，Ｐ。

Ｃｒｏｓｓ、　Ｎ、Ｓ、ＦｏｕｌｋｅｓおよびＴ、Ｍ、Ｃｏｘ、　ｒＴａｑポリ メラーゼの強力な阻害物質がヒトＤＮＡと同時精製されるＪ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６：１０３５５　（１９８ｇ）コ。

多くの金属イオン（特に、多価の種）は、種々の機序（必須の金属補助因子の移 動または置換を含む）によって、または感受性の部分（触媒活性に必要なアミノ 酸側鎖、または酵素において有害な立体的変化の結果を与えるアミノ酸側鎖を含 む）と安定な錯体を形成することによって、または有害な酸化還元反応を促進す るこ特表千７−５０７４５８　（８） とによって、酵素活性を阻害することができる。時には、キレート化試薬を用い て望ましくない金属を隔離することもある。しかし、例えば必要な補助因子を錯 体化することによって、あるいは酵素から結合金属をはがすことによって、それ 自体が酵素活性を阻害することのない効果的なキレート化試薬を同定し得ること はいずれの特定の場合でも自明ではない。Ｆｅ（ＩＩＩ）に極めて高い親和性を 有する、生物学的に導かれる天然産物であるデフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘ ａｓｉｎｅ）は、増幅反応時に血液分画の溶解液によって負荷される阻害を中和 するのに極めて効果的であることがわかり、少なくとも０．００１〜ｌ■Ｍの１ 度範囲で反応においてよく耐えることがわかった。デフェロキサミンの使用例を 以下に記載し、有益な効果を図２および図３に示す。

試験し、そして溶解液試料の増幅阻害を中和するのに効果的であることがわかっ た試薬の１つはＺｎ（ＯＡｃ）＊である。逆転写酵素がＺｎ金属酵素であると報 告されているが（ＴＶ　ＲＮＡポリメラーゼなどであるが、これはもはやそれに 当たるとは考えられていない）、これに関連してＺｎ”の有益な活性が反応中の １またはそれ以上の酵素の正常なＺｎ”結合部位に関係しているのかどうかはわ かっていない（または、そのことは断言されていない）。Ｚｎ”が酵素（群）上 の他の部位（群）と好都合な方法で相互作用することが可能であるか、またはそ れがこの種類の反応において阻害物質の１つに直接もしくは間接的に干渉するこ とが可能である。

正味の有益な効果が観察される条件を同定し得たことは自明ではなかった。図２ は、増幅反応においてＺｎ”によって可能な増強の例を示すものである（特に、 無視し得るデフェロキサミンのレベルにおいて）。デフェロキサミンの利点は高 レベルのＺｎ”によってわずかに拮抗されることがあるが、有効な増幅の安定な ブラットホーム（場）を支持する混合物がそれぞれのかなり広い濃度範囲にわた って同定され得ることか明らかである。

多くの核酸反応性酵素が種々のポリアニオンによって阻害される。ポリアニオン を中和する１つの方法は、反応中にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリカ チオン性の種を含有させることである。核酸はそれ自体が濃密に荷電されたアニ オンであるので、増強された増幅を内生の鋳型活性の検出し得る損失を伴わずに 観察することができる条件を同定することができたことは驚くべきことであった 。

増幅反応中の≦３ｘｌＯ−’％（ｖ／ｖ）のＰＥＩ濃度が、これらの点において 一定して有益であった。可能な増強の例を図３に示す。

以下に記載する例は、１またはそれ以上のこれら抗阻害′性化合物を含有する増 幅の実施を説明するものである。

１）以下の成分を含有する溶液４０μｍを調製および調合する。ここに挙げた濃 度は、完全な１００μｌの反応液中のそれぞれの濃度を示す。

５０　ｍＭ　トリス・ＨＣＩ（室温でｐＨ８，０）１７　、５　＋＊Ｍ　ＭｇＣ Ｉｔ ５　ｍＭ　ＤＴＴ ２　ｍＭ　スペルミジン ６．２５搗Ｍ　それぞれＧＴＰおよびＡＴＰ２．５　ｍＭ　それぞれｔＪＴＰお よびＣＴＰｏ、２　ｍＭ　それぞれｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰｏ 、３　μＭ　それぞれプライマーｒＡＪおよびプライマーｒＢＪ２）所望により 、デフエロキサミンメシレートを０〜１ｍＭの最終１度で含有させる。所望によ り、Ｚｎ（ＯＡｃ）、をＯ〜０．１ｍＭの最終濃度で含有させる。所望により、 ＰＥＩを０〜３ｘｌＯ−’％の最終４度で含有させる。

３）この混合物に、上記のように調製した加水分解ＭＮＣ懸濁液４０μｌを加え る。所望により、異なる条件によって付与される増幅の成果を比較するための基 礎として、目的の標的配列（群）を含有する既知量の精製核酸を加える。

４）この混合物を９５℃まで加熱し、５分間維持する。この混合物を３７℃まで 冷却する。

５）６００ＵのＭｏ１ｏｎｅｙ　ＭｕＬ　Ｖ逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）を含 有する溶液１０μｌを加える（取扱い中の酵素の安定性を維持するに十分な組成 の緩衝溶液中であるのが好ましい）。この混合物を３７℃で１０〜１５分間イン キュベートする。

６）この混合物を９５℃まで加熱し、５分間この温度に維持する。次いで、この 混合物を３７℃まで冷却する。

７）６００ＵのＭＭＬＶ−ＲＴおよび４００Ｕ（７）ＴＶ　ＲＮＡポリメラーゼ を含有する溶液　１０μｌを加える（取扱い中の酵素の安定性を維持するに十分 な組成の緩衝溶液中であるのが好ましい）。

８）この混合物を短時間撹拌し、３７°Ｃで１〜２時間インキュベートする。

９）ハイブリダイゼーシッン保護検定などの特異的なハイブリダイゼーシ腸ン法 を用いて、目的の標的配列のフピーとして生成した増幅産物の量を測定する。

例えば、Ａｒｎｏｌｄら（上記）を参照。

他の形態のデフェロキサミンならびに他の亜鉛供給物質（例えば、ＺｎＣＬまた はＺｎ５Ｏ，）を用いることもできる。また、他のポリカチオン性ポリマー［例 えば、ポリアリルアミンまたはポリブレンｌＩ（ヘキサジメスリンプロミド）］ を、ＰＥＩと共に、またはＰＥＩの代わりに用いることもできる。

本発明のこの態様は全ての点で説明のためのものであり、限定のためのものでは ないと考えるべきである。本発明の範囲は、上記説明によって示されるのではな く、添付の請求の範囲によって示される。即ち、その意味するところの範囲内の 全ての変化および各請求項の等価な範囲は、本発明に包含されることが意図され ている。

血漿／ＤＣＭ密度（ｇ／ｍｌ） へマドクリット（％血液容量） Ｆ／Ｇ、　２゜ ｈθ、３ フロントページの続き ＦＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．増幅のための核酸を調製する方法であって、以下の工程からなる方法：・単 核細胞および遠心培地を含有する血液細胞試料からなる組成物を遠心し：ここで 、該遠心培地の密度および遠心力は、該組成物中の単核細胞の大部分が該組成物 において分離したバンドに集まるように選択される；次いで、・該分離したバン ドを該組成物から分離し；次いで、・該分離したバンド中の単核細胞を溶解し、 該単核細胞に伴われる核酸を増幅に対して利用可能にする溶解試薬と、該分離し たバンドを接触させ；次いで、・試核酸を増幅する。 ２．接触および／または増幅を、分離したバンドおよび溶解試薬を含有する溶液 中の鉄（ＩＩＩ）イオンを錯体化し得る第１の措体化試薬の存在下で行う請求項 １の方法。 ３．第１の錯体化試薬がキレート化試薬である請求項２の方法。 ４．キレート化試薬が鉄（ＩＩＩ）イオンを錯体化するが、亜鉛、マンガンまた はマグネシウムイオンを錯体化しない請求項３の方法。 ５．キレート化試薬がデフェロキサミンまたは鉄結合性のシゲラミン（ｓｉｄｅ ｒａｍｉｎｅ）、シデラマイシン（ｓｉｄｅｒａｍｙｃｉｎ）もしくはフェリマ イシン（ｆｅｒｒｉｍｙｃｉｎ）である請求項４の方法。 ６．増幅および／または接触を、溶液中のカルシウムイオンを錯体化し得る第２ の錯体化試薬の存在下で行う請求項２の方法。 ７．第２の錯体化試薬が第１の錯体化試薬と異なる請求項６の方法。 ８．第２の錯体化試薬が、亜鉛またはマグネシウムイオンを錯体化してそれらの 作用または増幅を抑制することがない請求項６または７の方法。 ９．第１または第２の錯体化試薬の一方または両方が、所望のイオンより優先し て非所望イオンを錯体化する請求項３または６の方法。 １０．第１または第２の錯体化試薬の一方または両方が、第１または第２の錯体 化試薬と１またはそれ以上の所望のイオンからなる錯体または塩として供される 請求項９の方法。 １１．第２の錯体化試薬がＥＧＴＡ、クエン酸塩またはシュウ酸塩からなる請求 項７の方法。 １２．第２の錯体化試薬がＭｇ、Ｍｎ、Ｚｎ錯体またはＥＧＴＡ、クエン酸もし くはシュウ酸の塩からなる請求項１０の方法。 １３．亜鉛イオンが接触または増幅工程において供される請求項１、２または６ のいずれかの方法。 １４．組成物が単核細胞と等張であり、該組成物が溶解試薬の添加前に２０％未 満の該単核細胞の溶解を引き起こす請求項１または２の方法。 １５．組成物が遠心前に混合される請求項２の方法。 １６．分離したバンドが組成物のメニスカスの近くに位置する請求項１５の方法 。 １７．遠心が等密度遠心である請求項１、２または１５のいずれかの方法。 １８．分離したバンドが、組成物からの単核細胞の少なくとも３０％を含有する 請求項１、２または１５のいずれかの方法。 １９．分離したバンドが、混合物容量の多くとも２０％を含有する請求項１、２ または１５のいずれかの方法。 ２０．分離したバンドが、混合物容量の多くとも１０％を含有する請求項１９の 方法。 ２１．分離したバンドが血小板を含有する請求項１、２または１５のいずれかの 方法。 ２２．遠心培地が、単核細胞との等張性を与えるようにスクロース、ソルビトー ル、マンニトール、塩化ナトリウムまたはグルタミン酸ナトリウムから選ばれる 浸透試薬を含有する請求項１、２または１５のいずれかの方法。 ２３．浸透試薬が混合物のイオン濃度を増加させない請求項２２の方法。 ２４．遠心が約１６００ｘｇの力で行われる請求項１、２または１５のいずれか の方法。 ２５．遠心培地が、コロイド状シリカまたはポリビニルビロリドンで被覆された コロイド状シリカを含有する請求項１、２または１５のいずれかの方法。 ２６．遠心培地が、ヨウ素化した安息香酸誘導体を有する化合物から調製される 請求項１、２または１５のいずれかの方法。 ２７．血液細胞が、動物から採取した全血または血清中のものである請求項１、 ２または１５のいずれかの方法。 ２８．試料中の血液細胞の少なくとも８０％が、分離したバンドの接触前に無傷 のままである請求項１、２または１５のいずれかの方法。 ２９．核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応法を用いて行われる請求項１、２または １５のいずれかの方法。 ３０．核酸増幅が、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で行われる請 求項１、２または１５のいずれかの方法。 ３１．溶解試薬が、アルカリ、酵素、清浄剤および音波破壊からなる群から選択 される請求項１、２または１５のいずれかの方法。 ３２．アルカリがＫＯＨ、ＮａＯＨ、（ＣＨ３）４ＮＯＨ、ＬｉＯＨまたはＲｂ ＯＨである請求項３１の方法。 ３３．血液が、本方法の使用前に、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩またはヘ パリンからなる抗凝固薬と共に保存される請求項１、２または１５のいずれかの 方法。 ３４．遠心培地が１．１０５〜１．１１５ｇ／ｍｌの密度にある請求項１、２ま たは１５のいずれかの方法。 ３５．分離したバンドの近くに装置を配置して、該分離したバンドを集める効率 またはそれを分離する容易性を高める請求項１、２または１５のいずれかの方法 。 ３６．分離バンドの混合物の残りからの分離を増強するように調製された試験管 中で遠心を行う請求項１、２または１５のいずれかの方法。 ３７．接触および／または増幅を、増幅を容易にするための有効量のポリカチオ ン性ポリマーの存在下で行う請求項１、２または１５のいずれかの方法。 ３８．ポリカチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンまた はヘキサジメスリンプロミドである請求項３７の方法。 ３９．錯体化試薬を、接触工程後であって増幅工程前に、分離バンドに加える請 求項２の方法。 ４０．実質的に請求項１に記載の各工程からなる請求項１の方法。 ４１．実質的に請求項２に記載の各工程からなる請求項２の方法。 ４２．血液細胞がヒト血液由来であり、ヒト免疫不全ウイルスまたはＢ型肝炎ウ イルスを含んでいる可能性があり、増幅が該ヒト免疫不全ウイルスまたはＢ型肝 炎ウイルス由来のウイルス核酸の一部の増幅を引き起こす請求項１、２、４０ま たは４１のいずれかの方法。 ４３．鉄（ＩＩＩ）イオンを含有する増幅混合物中の核酸を増幅するための方法 であって、該増幅混合物中の十分な鉄（ＩＩＩ）イオンを錯体化し得る第１の錯 体化試薬を供して、該第１の錯体化試薬を用いずに達成される増幅と比較して該 増幅を増強することからなる方法。 ４４．錯体化試薬がキレート化試薬である請求項４３の方法。 ４５．キレート化試薬が亜鉛またはマグネシウムイオンを錯体化しない請求項４ ３の方法。 ４６．キレート化試薬がデフェロキサミンまたは鉄結合性のシデラミン、シデロ マイシンもしくはフェリマイシンである請求項４１の方法。 ４７．増幅混合物がカルシウムイオンをさらに含有し、第２の錯体化試薬を用い ずに達成される増幅と比較して該増幅を増強するに十分な量でカルシウムイオン を錯体化し得る第２の錯体化試薬を供する請求項４３の方法。 ４８．第２の錯体化試薬が第１の錯体化試薬と異なる請求項４７の方法。 ４９．第２の錯体化試薬が、亜鉛またはマグネシウムイオンと錯体化しない請求 項４７の方法。 ５０．第１または第２の錯体化試薬の一方または両方が、所望のイオンより優先 して非所望イオンを錯体化する請求項４３または４７の方法。 ５１．第１または第２の錯体化試薬の一方または両方が、第１または第２の錯体 化試薬と１またはそれ以上の所望のイオンからなる錯体または塩として供される 請求項５０の方法。 ５２．第１または第２の錯体化試薬の一方または両方がクエン酸塩、シュウ酸塩 またはＥＧＴＡからなる請求項４３または４７の方法。 ５３．亜鉛イオンが増幅の前にまたは増幅を行ないながら増幅混合物に供される 請求項４３または４７の方法。 ５４．全細胞由来の核酸の増幅方法であって、以下の工程からなる方法：・該核 酸を含有する全細胞試料を該増幅前にアルカリと接触させ：ここで、該アルカリ は、該全細胞の溶解を引き起こして該核酸を放出させ、該核酸を変性するに十分 な量で供される；次いで、 ・該試料中の全細胞の残骸を除去することなく該核酸を増幅する。 ５５．鉄（ＩＩＩ）イオンを錯体化し得る錯体化試薬を、アルカリおよび全細胞 試料に加える請求項５４の方法。 ５６．錯体化試薬がデフェロキサミンである請求項５５の方法。 ５７．全細胞が血液細胞からなる請求項５４または５５の方法。 ５８．全細胞が単核細胞からなる請求項５４または５５の方法。 ５９．アルカリがＫＯＨ、（ＣＨ３）４ＮＯＨ、ＮａＯＨまたはＬｉＯＨである 請求項５４または５５の方法。 ６０．単核細胞由来の核酸を調製するための方法であって、以下の工程からなる 方法： ・単核細胞および遠心培地を含有する組成物を遠心し：ここで、該遠心培地の密 度および遠心力は、該組成物中の単核細胞の少なくとも３０％が、分離したバン ドに集まるように選択される；そして、・遠心後に該分離したバンドを該組成物 の残りから単離し；次いで、該分離したバンド由来の単核細胞を溶解する溶解試 薬と、該分離したバンドを接触させ：そして、 該分離したバンドに、鉄（ＩＩＩ）イオンを錯体化し得る錯体化試薬を供する。 ６１．残留物からの分離バンドの除去の容易性または分離の効率を増強するよう に調製された試験管中に組成物を入れる請求項６０の方法。 ６２．分離したバジドの近くに装置を配置して、該分離したバンドを集める効率 またはそれを分離する容易性を高める請求項６０の方法。 ６３．分離したバンドが試料中に存在する単核細胞の５０％に等しいか、または 少なくとも５０％からなる請求項６０の方法。 ６４．接触を有効量のポリカチオン性ポリマーの存在下で行う請求項６０の方法 。 ６５．ポリカチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンまた はヘキサジメスリンプロミドである請求項６４の方法。 ６６．試料が全血からなる請求項６０の方法。 ６７．試料がヒト血液からなる請求項６０または６６の方法。 ６８．実質的に請求項６０に挙げた各工程からなる請求項６０の方法。 ６９．組成物が遠心前に混合される請求項６０の方法。 ７０．単核細胞由来の核酸を、特定の核酸配列についてスクリーニングする請求 項６０の方法。 ７１．単核細胞に関連した核酸を、溶解および錯体化試薬の供給の後に増幅する 請求項６０の方法。 ７２．核酸を、特定の核酸配列についてスクリーニングする請求項７１の方法。 ７３．単核細胞に関連したウイルスの存在をスクリーニングするための方法であ って、以下の工程からなる方法： ・血液および遠心培地を含有する混合物を遠心し：ここで、該遠心培地の密度お よび遠心力は、該混合物中の単核細胞の少なくとも３０％が、遠心後の該混合物 のメニスカス近くの上部に集まるように選択される；・遠心後の該混合物の上部 を、該単核細胞を溶解する溶解試薬と、鉄（ＩＩＩ）イオンをキレート化するキ レート化試薬と、および有効量のポリカチオン性ポリマーと接触させ； ・該核酸を増幅し；次いで、 ・該核酸を該ウイルスについてスクリーニングする。 ７４．遠心が等密度遠心である請求項７３の方法。 ７５．上部が混合物容量の多くとも２０％からなる請求項７３の方法。 ７６．溶解がＫＯＨを用いて行われる請求項７３の方法。 ７７．キレート化試薬がデフェロキサミンまたは鉄結合性のシデラミン、シデロ マイシンもしくはフェリマイシンである請求項７３の方法。 ７８．増幅が逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いて行われる請求項７３ の方法。 ７９．ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである請求項７３の方法。 ８０．増幅用の核酸を調製するためのキットであって、以下の成分を含有するキ ット： ａ．遠心培地を含有する第１の容器：ここで、該遠心培地の密度は、該培地を含 有する組成物中の所望の細胞の少なくとも３０％が、遠心により分離したバンド に集まるように選択される； ｂ．該核酸を含有する細胞を溶解し得る溶解試薬を含有する第２の容器；および ｃ．該分離したバンド中の鉄（ＩＩＩ）イオンを錯体化し得る錯体化試薬を含有 する第３の容器。 ８１．増幅原料を含有する第４の容器をさらに含む請求項８０のキット。 ８２．哺乳動物由来の全血を採取および貯蔵するための装置をさらに含む請求項 ８０のキット。 ８３．混合物を全血に対して実質的に等張にするに十分な浸透試薬の供給をさら に含む請求項８０のキット。 ８４．増幅原料が、ポリメラーゼ連鎖反応法を実施するのに必要な原料からなる 請求項８１のキット。 ８５．増幅原料が、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを含有する請求項８０ のキット。 ８５．ポリカチオン性ポリマーを含有する第４の容器をさらに含む請求項８０の キット。 ８７．単核細胞由来の核酸をウイルスについてスクリーニングするためのプロー ブを含有する第４の容器をさらに含む請求項８０のキット。 ８８．プローブがヒト免疫不全ウイルスをスクリーニングするためのものである 請求項８７のキット。 ８９．全血試料をウイルスについてスクリーニングするためのキットであって、 以下の成分を含有するキット： ａ．ヒト由来の血液を採取および貯蔵するための第１の装置；ｂ．遠心培地を含 有する遠心に適した第１の容器：ここで、該遠心培地の密度は、該全血試料中の 単核細胞の少なくとも２０％が、遠心後に分離したバンドに集まるように選択さ れ、また、該遠心培地は、それが該全血試料に有効に等張であるように浸透試薬 をさらに含有する；ｃ．該分離したバンドを除去するための第２の装置；ｄ．該 全血試料由来の単核細胞を溶解し得るアルカリを含有する第２の容器；ｅ．鉄（ ＩＩＩ）イオンをキレート化し得るキレート化試薬を含有する第３の容器；ｆ． ポリカチオン性ポリマーを含有する第４の容器；ｇ．核酸を増幅するのに必要な 原料を含有する第５の容器；および、ｈ．該ウイルスをスクリーニングし得るプ ローブを含有する第６の容器。 ９０．ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである請求項８９のキット。