JP2001352979A

JP2001352979A - カチオン性固相担体を用いる核酸回収方法

Info

Publication number: JP2001352979A
Application number: JP2001115966A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Katayose; 聡片寄; Mitsuhiro Murata; 充弘村田; Ichiro Ozaki; 一郎尾崎; Mikio Hikata; 幹雄日方; Kakun Han; 可君范; Shozo Nishida; 昌三西田
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2001-04-13
Publication date: 2001-12-25
Anticipated expiration: 2021-04-13
Also published as: JP4967196B2

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中の核酸を高純度でしかも効率的且つ簡便
に回収することができ、かつ核酸増幅等の後工程に供し
ても妨害物質を含まない核酸回収方法を提供する【解決手段】カチオン性固相担体を核酸が含まれる試料
と接触させて核酸を該カチオン性固相担体に捕捉させる
段階、核酸を補足したカチオン性固相担体を前記試料か
ら分離する段階、こうして分離された固相担体をアニオ
ン性物質で処理し、捕捉された前記核酸を前記カチオン
性固相担体から分離する段階、を有することを特徴とす
る核酸回収方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の回収方法に
関し、試料中の核酸の分離、回収、濃縮、精製等に有用
である回収方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸を含有する液体試料から核酸を回収
する方法としては、フェノールにより夾雑物を変性させ
て沈殿させた後、水相中の核酸を回収するフェノール-
クロロホルム抽出法、カオトロピックイオン溶液を利用
して夾雑物を水相に可溶化した後、核酸をシリカビーズ
に吸着させて固相に回収し、その後核酸の吸着した固相
に水を加えて核酸を固相から水相に分離し回収するブー
ム(Boom)法などが知られている。しかし、それらの方法
では、核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やリガー
ゼ、制限酵素等の酵素反応に供する場合、核酸溶液にフ
ェノールやカオトロピックイオンが混入すると酵素反応
を阻害するため、エタノール沈殿や限外ろ過、カラムク
ロマトグラフィー等より核酸の精製操作を施す必要があ
った。

【０００３】また、フェノールや、カオトロピックイオ
ン溶液を用いない核酸の調製法として、特開平８−１７
３１５９に示された様に、核酸を含有する溶液にカチオ
ン性の高分子であるポリエチレンイミンを添加して、核
酸との水不溶性の塩を形成させ、沈殿物を回収する方法
が提案されている。しかし、この方法で得られた沈殿物
から核酸を回収する方法として、水酸化ナトリウム溶液
などの強塩基性溶液を沈殿に加えてポリエチレンイミン
と核酸とを解離させる操作、ポリエチレンイミンと核酸
との再結合を防ぐためにアニオン界面活性剤の溶液を添
加する操作、溶液のpHを中和する操作が必要であり、簡
便であるとは言い難い。また、水酸化ナトリウム溶液な
どのアルカリの添加は核酸の加水分解を招く危険があ
る。さらに、混在するポリエチレンイミン、アニオン界
面活性剤はPCR反応などの酵素反応を阻害するが、これ
らを除去することは困難であるので、PCR反応に供する
場合にはその阻害効果が無視できるまで希釈する必要が
ある。しかし、核酸含量が少ない場合は希釈により検出
が困難になることがある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の課題
は、試料中の核酸を高純度でしかも効率的且つ簡便に回
収することができ、得られた核酸を核酸増幅、酵素反
応、ハイブリダイゼーション法などによる核酸の分析等
の後工程に供しても何らの問題も生じない核酸回収方法
を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記の課題の
解決手段として、カチオン性固相担体を核酸が含まれる
試料と接触させて核酸を該カチオン性固相担体に捕捉さ
せる段階、核酸を補足したカチオン性固相担体を前記試
料から分離する段階、こうして分離された固相担体をア
ニオン性物質水溶液で処理し、捕捉された前記核酸を前
記カチオン性固相担体から分離する段階、を有すること
を特徴とする核酸回収方法を提供する。

【０００６】本発明は、後段階で、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ又は増幅法のようなさらなる処理に供され
る核酸を単離して提供するための迅速、簡便且つ効果的
な核酸回収方法を提供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の方法では、第一に、カチ
オン性固相担体を核酸が含まれる試料と接触させて核酸
を該カチオン性固相担体に捕捉させる。 −核酸を含む試料− ここで核酸とは、DNA、RNA、またはこれらのハイブリッ
ド結合物である。その長さに特に制限されるものではな
い。試料を予め酵素等で処理したものでも良い。

【０００８】また試料は核酸を含んでいさえすれば特に
制限されず、本発明の方法を適用することができる。例
えば、通常の生物、細菌等の微生物、培養細胞由来の生
物学的試料、具体的には、血液、全血、血漿、血清等の
体液、組織の溶解液が挙げられる。これらはライセット
して、核酸溶出させた状態であれば、本発明の対象試料
となる。勿論、人工的に化学合成、または酵素合成より
得られた核酸も対象となる。 −カチオン性固相担体− 本発明の方法に用いられるカチオン性固相担体とは、固
相担体にカチオン性基が結合したものである。

【０００９】カチオン性基：本明細書においてカチオン
性基とは、それ自体カチオンを形成している基及びそれ
自体カチオンを形成していないが中性付近（約ｐＨ６〜
８）においてプロトンの結合により容易にカチオンを形
成するアミン系及びイミン系の基を意味する。例えば１
級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモ
ニウム基、並びにイミノ基（−ＮＨ−基及び＝ＮＨ基）
があげられる。これらのカチオン性基の存在形態は多様
であって何ら制限されず、例えば化合物中に、アミジノ
基、イミジノ基、ヒドラジノ基、ピリジル基などの状態
で存在していてもよい。

【００１０】カチオン性基を固相担体に結合させるに
は、カチオン性基を有する物質（カチオン性物質とい
う）を固相担体に結合させることにより行う。このよう
なカチオン性物質としては、例えば生物試料由来の、プ
トレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、
1,3-ジアミノプロパン、カルジン、ホモスペルミン、3-
アミノプロピルカダベリン、ノルスペルミン、テルモス
ペルミン、カルドペンタミン等のポリアミンおよびそれ
らの重合生成物、ヒストンおよびプロタミンに分類され
る塩基性タンパク質とそれらの重合体、ポリリシン、ポ
リアルギニン、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミン、
ポリプロピレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリル
アミン、ポリジエチルアミノエチルメタクリレート、ポ
リジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリピニルピ
リジン４級化物、ポリブレン、キトサン、グリコールキ
トサン、メチルグリコールキトサン、ポリジアリルジメ
チルアンモニウム等の合成、天然、半合成（発酵、遺伝
子組み替えを含む）高分子、エチレンジアミン、トリメ
チレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ペンタメチ
レンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等のジアミン
類；3-アミノプロピルトリエトキシシランなどのシラン
カップリング剤が挙げられる。

【００１１】これらのカチオン性物質は通常の状態では
水溶性であり、試料中の核酸とイオン結合を含む相互作
用することができる。また、水溶解性が低い場合でも、
pH、温度、塩濃度を適切に調整することにより、水溶化
することができる。 −固相担体− 固相担体はカチオン性基の担体として用いられる。ま
た、上記したアニオン性物質も固相担体に担持させて用
いることもできる。

【００１２】固相担体にカチオン性基またはアニオン性
基を導入するには、固相担体に対して、上記カチオン性
物質またはカチオン性物質を練り込む、コーティング、
プラズマ処理、共重合、グラフト重合、カップリング等
の操作によって、物理的、化学的に導入することができ
る。導入効率等を考えれば、化学的に導入することが好
ましい。

【００１３】固相担体としては、膜、フィルター、プレ
ート、粒子、繊維状、チュ−ブ等の形状が挙げられる。
固相担体の使い易さ、単位質量当たりの表面積を考えれ
ば、粒子状であることが好ましい。

【００１４】固相担体の材質は特に限定するものではな
い。ポリエステル、ポリオレフィン、ポリウレタン、ポ
リイミド、ポリアミド等の有機材料、ガラス、シリカ、
金属等の無機材料が挙げられ、またはこれらの複合体で
あってもよい。通常の使用状態において、水不溶性であ
る必要がある。カチオン性基を担体に導入するには、一
つの方法として、上述のようにカチオン性物質を担体に
結合する方法が挙げられる。この場合、カチオン性物質
と担体との結合性を良好にするには、少なくとも担体物
質の表面の一部が有機ポリマーであることが好ましい。

【００１５】該有機ポリマーとしては、例えば、スチレ
ン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ハロゲ
ン化スチレン等の芳香族ビニル単量体；アクリロニトリ
ル等の不飽和ニトリル；メチルアクリレート、メチルメ
タクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレ
ート、シクロヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキ
シルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレー
ト、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、
グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、
２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエ
チルメタクリレート等のアクリル酸エステルおよびメタ
クリル酸エステル；ブタジエン等のジオレフィン；酢酸
ビニル等のカルボン酸ビニルエステル；塩化ビニル、ジ
ビニルベンゼン、エチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、
テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プ
ロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピ
レングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレ
ングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレ
ングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリントリ
（メタ）アクリレート、トリメチロールブロパントリ
（メタ）アクリレート、トリビニル系モノマー及びテト
ラビニル系モノマーの重合体を挙げることができる。

【００１６】上記のモノマーには必要に応じて他の官能
基含有モノマーをコモノマーとして共重合させることが
できる。このようなコモノマーの例としては、例えばア
クリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イタコン酸フマ
ル酸、マレイン酸等を挙げる事ができる。

【００１７】これらモノマーの重合（共重合を含む）
は、所要のモノマーを含む重合成分を水系分散媒中で重
合開始剤の存在下、乳化重合、懸濁重合などにより重合
させればよい。

【００１８】重合開始剤としては、過硫酸塩類、あるい
は過酸化水素−塩化第一鉄、クメンヒドロペルオキシド
−アスコルビン酸ナトリウム等のレドックス系の水溶性
重合開始剤、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペル
オキシド、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノ
エート、アゾビスイソブチロニトリル、ビス（３，５，
５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイドなどの油
溶性重合開始剤が例示される。重合系には必要に応じて
界面活性剤、分散安定剤などを添加することもできる。

【００１９】本発明に用いられる固相担体は必要に応じ
て、粒子の内部および／または表面に磁性体を含有して
いる。この磁性体は該粒子の内部のみに含有され、表面
に露出していないことが好ましい。粒子に磁性体を含有
させることにより、磁気作用で粒子の固液分離すること
が可能となる。磁性体としては、例えば四三酸化鉄（Ｆ
ｅ₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）等の各種
フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金
属またはこれら金属の合金などを用いることができる。
磁性体の粒径は30nm以下、好ましくは20ｎｍ以下であ
る。これら磁性体の使用により、固相担体は実質的に超
常磁性を有するものとなる。

【００２０】粒子中の磁性体の含有量は、粒子全体に占
める割合は良好な磁気分離性が得られる点で10重量％以
上、特に20〜80重量％であることが好ましい。磁気分離
性が悪いと、分離に相当に長い時間を要するので好まし
くない。また、磁性体の含有量が多すぎると粒子表面に
磁性体の露出が多くなることがある。

【００２１】本発明の方法に用いられるカチオン性固相
担体が粒子状である場合、粒子の粒径は、特に制限され
るものではないが、例えば血液、体液等由来の試料から
核酸を分離、回収する際の磁気分離力がより良好となる
点で、通常0.5μm〜300μm、好ましくは1μm〜100μm、
より好ましくは1μm〜80μmである。粒径が小さくなる
ほど分離に時間がかかる。また、粒径が過大であると、
単位質量当りの表面積が低下し、核酸抽出の効率が低下
する。また、粒子の形状は球状である必要はなく、異形
粒子であってもかまわない。なお球状でない粒子の粒径
としては、それぞれの粒子の最長径と最短径との平均値
をとるものとする。

【００２２】本発明の方法では、第二に、核酸を補足し
たカチオン性固相担体を試料から分離する。この分離は
通常この種の分離に用いられる公知の方法を利用するこ
とができ何ら限定されない。例えば通常の遠心分離によ
る固液分離を利用することができる。使用されるカチオ
ン性固相担体が磁性体を含有するものである場合は、永
久磁石、電磁石による磁気的に分離で実施することもで
きる。固相担体の状態等に応じて選択すればよい。

【００２３】本発明の方法では、第三に、試料から分離
され、核酸を捕捉しているカチオン性担体をアニオン性
基物質で処理する。該処理により、捕捉された前記核酸
を前記カチオン性固相担体から分離する。

【００２４】−アニオン性物質− アニオン性物質とはアニオン性基を表面に有する物質で
ある。アニオン性基としては、硫酸基、スルホン酸基、
カルボキシル基等が挙げられる。

【００２５】アニオン性物質としては、例えばドデシル
硫酸ナトリウム、N-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム
等のアニオン性界面活性剤、ヘパリン、デキストラン硫
酸、セルロース硫酸、ガードラン硫酸、コンドロイチン
硫酸、ヘパラン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸、デル
マタン硫酸、アミロペクチン硫酸、ケタラン硫酸、キシ
ラン硫酸、カロニン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫
酸、アルギン酸硫酸、グリコーゲン硫酸、ポリラクトー
ス硫酸、カラゲニン硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコー
ス硫酸、ラミナリン硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫
酸、メペサルフェート、フコイダンなどの硫酸化多糖
類；エチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、スチ
レンスルホン酸、ビニル硫酸、スルホエチルアクリレー
ト、2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、
スルホン化ジシクロペンタジエン、グルコシルオキシエ
チルメタクリレート等のスルホン化モノマー単位を有す
る（共）重合体；ポリスチレン、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチ
レン共重合体、ポリビニルアルコール、ポリエステル、
ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタンなどの主鎖また
は側鎖にスルホン化可能な官能基を持つ高分子化合物を
スルホン化した高分子化合物；アスパラギン酸、グルタ
ミン酸などのアミノ酸の（共）重合体；メタクリル酸、
アクリル酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、クロ
トン酸などのカルボキシル基を分子中に有する重合性単
量体の（共）重合体を挙げることができる。これらは一
種単独でも二種以上を組合わせてもしようすることがで
きる。

【００２６】この段階では試料から分離された核酸を捕
捉しているカチオン性固相担体をアニオン性基物質で処
理するが、そのときアニオン性物質は遊離の状態で使用
することもできるし、固相担体に結合させて使用するこ
ともできる。いずれの場合でも水性液中において両者を
接触させることにより処理を行う。アニオン性物質を遊
離の状態で用いるか固相担体に結合させて使用するかの
その使い分けは、回収した核酸の使用方法ないしは目的
により選定することができる。例えば、精製される核酸
をPCR等の用途に供する場合に、回収核酸の量をわずか
で良いので、固相担体に結合されているカチオン性基に
比べて少ないアニオン性物質を遊離の状態で系に添加し
使用することができる。また、回収核酸量を重視する場
合、アニオン性物質を固相担体に結合させ、固相担体に
結合されているカチオン性基に比べて過剰のアニオン性
基固相担体を添加し、核酸の解離を行い、固液分離によ
り核酸を分離精製することができる。いずれの場合に
も、回収される核酸にアニオン性基物質の混入がなく、
そうまま再度の精製なしに次のステップに使用できる。

【００２７】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、「部」は特記しない限り「重量部」を意味する。

【００２８】実施例１： −−カチオン性基水不溶担体粒子-１の調製−− 油性磁性流体「マーポマグナＦＶ−５５」［松本油脂製
薬（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた
後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面
を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：15nm）を
得た。

【００２９】ついで、超常磁性体４０部にシクロヘキシ
ルメタクリレート９０部、トリメチルアミノエチルメタ
クリレートの塩化物１０部およびビス（３，５，５−ト
リメチルヘキサノイル）パーオキサイド（重合開始剤）
３部を添加し、この系を混合攪拌することにより超常磁
性体を均一に分散させてモノマー組成物を調製した。

【００３０】一方、ポリビニルアルコール１０部、およ
びポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．１
部を水１０００部に溶解して水分散体を調製した。得ら
れた水性媒体（水相）中に上記のモノマー組成物を添加
し、超音波分散機で分散処理することにより平均粒子径
が１μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散されてなる懸
濁液（油滴分散体）を調製した。

【００３１】次に、得られた懸濁液を容量２リットルの
攪拌機付き三つ口フラスコに仕込み、この系を７５℃に
昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しながら５時間にわ
たり油滴中のモノマーを重合（懸濁重合）させることに
より、本発明のカチオン性基水不溶担体粒子-１を得
た。このように得られた磁性ポリマー粒子の大きさは1
μｍで、固定化されたアミノ基量は40μｍｏｌ／ｇであ
った。

【００３２】実施例２ −−カチオン性基水不溶担体粒子-2の調製−− （１）実施例１においてシクロヘキシルメタクリレート
の使用量を7５部とし、トリメチルアミノエチルメタク
リレートの塩化物１０部の代わりにメタクリル酸2５部
を使用した以外は実施例１と同様にして磁性ポリマー粒
子を製造した。（２）得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子１ｇ
（乾燥重量）を２０ｍｌの１０ｍＭ PBS緩衝溶液（ｐ
Ｈ7.3）に添加し、ポリエチレンイミン（数平均分子量
７万）の３０％水溶性０.１ｍＬおよびカルボジイミド
試薬であるＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライ
ド）０.０２ｇを添加し、２０℃、２時間反応させ、本
発明のカチオン性基水不溶担体粒子-2を得た。このよう
に得られた磁性ポリマー粒子の大きさは3μｍに結合し
た総アミノ基量は30μｍｏｌ／ｇであった。

【００３３】実施例３： −−核酸の抽出−− pBR322プラスミドDNAをウシ胎児血清(FBS,SIGMA社製 F2
442)に溶解し、 pBR322プラスミドDNAの10μｇ／ｍＬ F
BS溶液を調製した。この溶液1mLを1.5mL用のマイクロテ
ストチューブに取り分け、それぞれに固形分濃度５％に
調整した実施例１、２で得られた粒子の生理食塩水溶液
20μＬを添加し、ボルテックスで攪拌してDNAを粒子に
吸着させた。チューブを磁気分離スタンドにセットし、
粒子と上清を分離し、上清を捨てた。粒子を洗浄する操
作として、1mLの Tris-HCl緩衝液(pH7.4)を加え、ボル
テックスで攪拌したあと、再度チューブを磁気分離スタ
ンドにセットして粒子と上清を分離し、上清を捨てる操
作を行い、これを２回繰り返した後、濃度17.6μｇ／
ｍＬのデキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万、和
光純薬工業）のTris-HCl緩衝液溶液を100μＬ加えて、3
0分間、室温で穏やかに振とうして粒子に吸着したDNAを
脱吸着させた。磁気分離スタンドにチューブをセットし
て粒子と上清を分離し、100μＬの上清を回収した。 pB
R322プラスミドDNAの回収量を、260nmの紫外吸光度(A26
0)から算出し、純度の目安として260nmと280nmの吸光度
の比(A260/A280)を測定した。結果を表１に示した。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【発明の効果】本発明の核酸回収方法によれば、試料中
の核酸を高純度でしかも効率的且つ簡便に回収すること
ができ、しかも、有機溶媒、カオトロピックイオン溶
液、あるいは核酸と結合するポリエチレンイミンなどの
核酸の回収後のさらなる処理の妨げとなる成分を一切含
まない形で核酸を回収することができる。

フロントページの続き (72)発明者尾崎一郎東京都中央区築地二丁目11番24号ジェイエスアール株式会社内 (72)発明者日方幹雄東京都中央区築地二丁目11番24号ジェイエスアール株式会社内 (72)発明者范可君東京都中央区築地二丁目11番24号ジェイエスアール株式会社内 (72)発明者西田昌三東京都中央区築地二丁目11番24号ジェイエスアール株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カチオン性固相担体を核酸が含まれる試料
と接触させて核酸を該カチオン性固相担体に捕捉させる
段階、核酸を補足したカチオン性固相担体を前記試料から分離
する段階、こうして分離された固相担体をアニオン性物質で処理
し、捕捉された前記核酸を前記カチオン性固相担体から
分離する段階、を有することを特徴とする核酸回収方
法。
【請求項２】前記アニオン性物質が水溶性である請求項
１記載の方法。
【請求項３】前記固相担体が磁性体を含有する、請求項
１記載の方法。
【請求項４】前記アニオン性物質が水溶性であり、かつ
固相担体に結合されている請求項１記載の方法。
【請求項５】前記固相担体が磁性体を含有する、請求項
４に記載の方法。