JP2002017400A - アミン化合物を固定化した磁性粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】アミン化合物の生物化学的反応性を応用して混
合物より目的物を吸着し、適当な液中で検出限界以上の
濃度で脱着させて検出を行うことができ、かつ正確な検
出結果を得ることができるアミン化合物固定化基材を提
供することにある。 【解決手段】アミン化合物を固定化した磁性粒子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はアミン化合物を固定
化した磁性粒子に関し、例えばウイルス等の検出対象を
混合物から分離し検出するのに有用な磁性粒子に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、基材にアミン化合物を固定化した
ものでウィルスの除去、金属イオンの除去などを行うこ
とは知られている（例えば、特開平6-114250、特表平10
-501827）。これらはいずれも、アミン化合物を固定化
した基材上にウィルスを吸着させて除去することを主目
的としているが、アミン化合物固定化基材に吸着したウ
ィルスを基材から脱着して検出するという考えはなかっ
た。たとえ検出に供したとしても、基材に吸着した物質
を検出限界以上の濃度で適当な液中へ脱着させることは
困難であった。

【０００３】特開平 8-173159には、ポリエチレンイミ
ンを溶液中で核酸と反応させて水不溶物を形成させた後
に分離し、次にポリエチレンイミンから核酸を単独で溶
解させて核酸増幅過程及び検出過程に供する方法が開示
されている。この方法では、ポリエチレンイミンと核酸
が分離された後もポリエチレンイミンは核酸と同一溶液
内に存在しているため、ポリエチレンイミンが核酸増幅
過程に悪影響を及ぼし、定量測定はおろか希薄な場合に
は検出さえもできないことがある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の課題
は、アミン化合物の生物化学的反応性を応用して混合物
より目的物を吸着し、適当な液中で検出限界以上の濃度
で脱着させて検出を行うことができ、かつ正確な検出結
果を得ることができるアミン化合物固定化基材を提供す
ることにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題が、アミン化合物を固定化した磁性粒子により達成す
ることができることを見出した。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアミン化合物を固定化した磁性粒子（以下、
「アミン化合物固定磁性粒子」又は単に「固定化粒子」
ともいう）の粒径は、特に制限されるものではないが、
通常0.08μm〜300μm、好ましくは0.1μm〜100μmであ
る。理由としては、医療診断薬用途として使用した場
合、固定化粒子を目的物、例えばウイルスを含む試料液
に添加するとウイルスが該粒子の表面に存在するアミン
化合物により該粒子に結合し、その結果、血漿や血清等
の検体中のウイルスを高い効率で濃縮する。その際使用
法として通常、カラムクロマトグラフ法ではなくバッチ
法にて使用されるため、前述の粒径範囲が好ましい。粒
径がこの範囲内であれば粒径が均一でなくてもよい。粒
径が小さすぎると、血液または体液から固定化粒子を分
離する際の遠心分離の回転数や回転時間の増加を招き、
装置が大型になったり、高い時間的効率が得られず好ま
しくない。また、磁気分離の場合、血液または体液から
ウィルス濃縮用粒子を分離する際の磁気分離性が劣り、
分離操作に長時間を要し、高い時間的効率が得られず好
ましくない。また、粒径が大きすぎると、固定化粒子が
ウイルスを捕獲する効率が低下し、ウイルス濃縮が十分
に行えないことがある。

【０００７】本発明のアミン化合物固定磁性粒子の粒子
形状はまったく限定されず、球状などの一定形状でもよ
いし、不定形の粒子の集まりであってもよい。なお球状
でない粒子の粒径は各粒子の最長径と最短径との平均値
をとるものとする。本発明のアミン化合物固定磁性粒子
は基材材料とその少なくとも表面に存在するアミン化合
物から構成されている。基材材料は水不溶性の材料であ
れば特に限定されない。

【０００８】本発明において「アミン化合物」とは、１
級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、第４級アン
モニウム基、並びにイミノ基（−ＮＨ−及び＝ＮＨ）
（これらの基はそれ自体カチオンとして存在するか、そ
れ自体カチオンとして存在しないが中性付近（約ｐＨ６
〜８）においてプロトンの結合により容易にカチオンを
形成するので、以下、「カチオン性基」ともいう。）を
含有する化合物、特に好ましくはイミノ基を有する化合
物を意味する。上記のカチオン性基の存在形態は多様で
あって何ら制限されず、例えば化合物中にアミジノ基、
イミジノ基、ヒドラジノ基、ピリジル基等の状態で存在
してもよい。

【０００９】本発明においてアミン化合物は、医療診断
薬用途に使用した場合、水や緩衝液、血液、体液中に溶
出するとＰＣＲ法などの核酸増幅法を阻害することがあ
るため、粒子に化学的に結合されている必要がある。そ
の存在量は、カチオン性基として粒子１ｇ当り平均で１
×１０^-10mol以上であり、代表的には１×１０^-10〜１
×１０^-2molであり、好ましくは１×１０^-9〜１×１０
^-3molであり、より好ましくは１×１０^-8〜１×１０^-3m
olである。アミン化合物の存在量が少な過ぎるとウイル
ス濃縮能力が不十分である。本発明の作用、効果の観点
からは、アミン化合物の存在量の上限は特に限定されな
いが、製造技術的には１×１０^-2molを超える量で存在
せしめることは通常困難なことが多い。

【００１０】アミン化合物固定磁性粒子は、例えば
（１）重合性アミン化合物を（必要に応じて他の共重合
性モノマーとともに）重合する方法、（２）アミン化合
物を基材材料に結合させる方法などにより製造すること
ができる。

【００１１】（１）重合性アミン化合物を重合する方法 この方法に使用することのできる重合性アミン化合物と
しては、例えば２−（ジメチルアミノ）エチル（メタ）
アクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチル（メタ）
アクリレート、２−（ジメチルアミノ）プロピル（メ
タ）アクリレート、３−（ジメチルアミノ）プロピル
（メタ）アクリレート等のアミノアルキル（メタ）アク
リル酸エステル類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメ
チル、硫酸ジエチル等による４級塩；２−（ジメチルア
ミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、２−（ジ
エチルアミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、
３−（ジメチルアミノエトキシ）プロピル（メタ）アク
リレート等のアミノアルコキシアルキル（メタ）アクリ
ル酸エステル類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチ
ル、硫酸ジエチル等による４級塩；Ｎ−（２−ジメチル
アミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジ
エチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−
（２−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミ
ド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アク
リルアミド等のＮ−アミノアルキル基含有（メタ）アク
リルアミド類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチ
ル、硫酸ジエチル等による４級塩等が挙げられる。なか
でも、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレー
ト、Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）（メタ）アクリ
ルアミド、及びこれらの塩化メチレンによる４級塩が好
ましい。これらは、１種単独であるいは２種以上を組み
合わせて使用することができる。

【００１２】重合性アミン化合物と共重合するモノマー
としては、下記に示すような架橋性モノマーならびに非
架橋性かつ非イオン性モノマーを挙げることができる。

【００１３】架橋性モノマーとしては、ジビニルベンゼ
ン、ジビニルビフェニル、エチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレ
ート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、
ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリ
プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラ
プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１,４
−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１,６−ヘ
キサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチル
グリコールジ（メタ）アクリレート、２，２'−ビス
〔４−（メタ）アクリロイルオキシプロピオキシフェニ
ル〕プロパン、２，２'−ビス〔４−（メタ）アクリロ
イルオキシジエトキジフェニル〕プロパン、グリセリン
トリ（メタ）アクリレート、トリメチロールブロパント
リ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ
（メタ）アクリレート等のジビニル系モノマー、トリビ
ニル系モノマー及びテトラビニル系モノマーが挙げられ
る。なかでも、ジビニルベンゼン、エチレングリコール
ジメタクリレートおよびトリメチロールプロパントリメ
タクリレートが好ましい。これらは１種単独であるいは
２種以上を組み合わせて使用することができる。

【００１４】共重合可能な非架橋性かつ非イオン性モノ
マーは、重合性アミン化合物あるいは架橋性モノマーの
いずれかと共重合可能であって、非架橋性かつ非イオン
性のモノマーである。

【００１５】このようなモノマーとして、スチレン、α
−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ハロゲン化ス
チレン等の芳香族ビニル単量体；アクリロニトリル等の
不飽和ニトリル；メチルアクリレート、メチルメタクリ
レート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、
ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、シクロヘ
キシルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレー
ト、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアク
リレート、ラウリルメタクリレート、グリシジルアクリ
レート、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエ
チルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト等のアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステ
ル；ブタジエン、イソプレン等のジオレフィン；酢酸ビ
ニル等のカルボン酸ビニルエステル；塩化ビニル、塩化
ビニリデン等のハロゲン化ビニリデン等を挙げることが
できる。なかでも、スチレン、α−メチルスチレン、ア
クリロニトリル、メチルメタクリレート、ブチルメタク
リレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、シクロ
ヘキシルメタクリレートが好ましい。これらのモノマー
は、１種単独であるいは２種以上を組み合わせて使用す
ることができる。

【００１６】上記重合性アミン化合物を含むモノマー成
分は水系分散媒中で重合開始剤の存在下、乳化重合、懸
濁重合、分散重合などにより重合される。

【００１７】重合開始剤としては、過硫酸塩類、あるい
は過酸化水素−塩化第一鉄、クメンヒドロペルオキシド
−アスコルビン酸ナトリウム等のレドックス系の水溶性
重合開始剤、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペル
オキシド、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノ
エート、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）
２塩基酸塩、アゾビスイソブチロニトリル、ビス（３，
５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイドなど
の油溶性重合開始剤が例示される。また、必要に応じて
界面活性剤、分散安定剤などを使用することもできる。

【００１８】（２）アミン化合物を基材材料に結合させ
る方法 粒子表面にカルボキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ
基、アミノ基、アミド基、アルデヒド基、カルボキシル
基、酸クロライド基などなど官能基をこれら官能基を有
するモノマーを共重合やシード重合法などで重合させる
ことにより導入し、次にそれら官能基を反応点としてア
ミン化合物を反応させることにより、材料表面に導入す
ることができる。上記の官能基を有するモノマーの例と
して、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イタコ
ン酸フマル酸、マレイン酸、ハイドロキシエチルメタア
クリレート、２−ハイドロキシエチルアクリレート、２
−ハイドロキシエチルメタクリレート、グリシジルメタ
アクリレート、グリシジルアクリレート、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミ
ド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを挙げる事ができ
る。

【００１９】上記のようにして基材表面に導入された官
能基と反応させるアミン化合物としては、例えば、生物
試料由来の、プトレッシン、カダベリン、スペルミジ
ン、スペルミン、1,3-ジアミノプロパン、カルジン、ホ
モスペルミン、3-アミノプロピルカダベリン、ノルスペ
ルミン、テルモスペルミン、カルドペンタミン等のポリ
アミンおよびそれらの重合生成物、ヒストンおよびプロ
タミンに分類される塩基性タンパク質とそれらの重合
体、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリエチレ
ンイミン、ポリプロピレンイミンなどのポリアルキルア
ミン、ポリアルキルイミンなどに分類されるポリアミン
化合物、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン
などのポリアミノ酸類、その他ポリジエチルアミノエチ
ルメタクリレート、ポリジメチルアミノエチルメタクリ
レート、ポリビニルピリジン４級化物、ポリブレン、キ
トサン、グリコールキトサン、メチルグリコールキトサ
ン、ポリジアリルジメチルアンモニウム等の合成、天
然、半合成（発酵、遺伝子組み替えを含む）高分子、エ
チレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレ
ンジアミン、ペンタメチレンジアミン、ヘキサメチレン
ジアミン等のジアミン類；3-アミノプロピルトリエトキ
シシランなどのシランカップリング剤等が挙げられる。
また、前述のアミン化合物を有するモノマーを共重合し
たポリマーなどを挙げることができる。

【００２０】本発明のアミン化合物固定磁性粒子は、そ
の粒子の内部または表面に磁性体を含有している。この
磁性体は該粒子の内部のみに含有され、表面に露出して
いないことが好ましい。本発明においては、粒子に磁性
体を含有させることにより、該粒子の磁気を作用させて
収集、分離することが可能となる。該当粒子を診断薬用
途として、医療検査・診断分野に使用した場合、従来の
遠心分離等による操作が不要で検査時間を短縮させるこ
とが可能となるほか、検査・診断の自動化への対応も容
易となる。このような磁性体は、例えば四三酸化鉄（Ｆ
ｅ₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）等の各種
フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金
属またはこれら金属の合金などを用いることができる。

【００２１】磁性体の含有量は、アミン化合物固定磁性
粒子全体に対し10重量％以上、特に20〜100重量％であ
ることが好ましい。この量が少なすぎると、良好な磁気
分離性が得られず、その結果、医療検査・診断分野に使
用した場合、一例として後述するウイルスの分離・濃縮
方法において、血液または体液等の検体からアミン化合
物固定磁性粒子を分離するために相当に長い時間を要す
るので、高い時間的効率が得られないことがあり、好ま
しくない。高分子は基本的に水不溶であればよく、特に
制限はない。

【００２２】アミン化合物固定磁性粒子は、上記の磁性
体および高分子を主成分として次のような方法で製造す
る。 （ａ）上記（１）の方法により重合を行う際に、モノマ
ーを含む重合成分に磁性体を混合して重合を行う。 （ｂ）高分子を構成するモノマーを含む重合成分を通常
の高分子粒子水分散体を得る方法で重合し、高分子粒子
水分散体を得る。この高分子粒子表面に磁性体層を形成
する。 （ｃ）高分子を実質的に水不溶で水より沸点の低い溶媒
に溶解し、磁性体をこの溶液に分散する。これを適当な
乳化剤ないしは分散剤を用いて水に分散させ、溶媒を蒸
留により除去する。

【００２３】また磁性体の表面露出を防ぐために、上記
の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で得られた高分子粒子水
分散体をシードとしてモノマーを添加して重合し、粒子
表面に高分子層を形成する事も可能である。 （ｂ）または（ｃ）の方法により磁性体を導入したポリ
マー粒子の表面にアミン化合物を結合させるには、前述
の（２）の方法を行えばよい。

【００２４】このようにして得られるアミン化合物固定
磁性粒子は、その分散媒に乳化剤、分散剤、未反応モノ
マー、水溶性ポリマー、重合開始剤の分解物などを含ん
でいる場合がある。これらの物質は、例えば医療診断薬
に使用した場合、核酸増幅検査段階において反応阻害物
となる可能性が高いため、例えばAdv.Colloid Interfac
e Sci.,81,77〜165(1999)などに示される方法によりア
ミン化合物固定磁性粒子の分散媒から除去することが好
ましい。後述するアミン化合物の定量に滴定を採用する
場合には、最終的に混床型イオン交換樹脂などを用いて
ウイルス濃縮用粒子を精製することが好ましい。

【００２５】［有用性］本発明のアミン化合物固定磁性
粒子は、ウィルスを容易に吸着することができるので、
血液や体液からのウィルスの除去、ウィルスの不活化、
ワクチンの精製など種々の用途に用いることができる。
なかでも、医療診断薬用途に用いられた場合、粒子表面
のアミン化合物が血液や体液等の検体中のウイルスを吸
着した後、磁気により分離・濃縮する事が可能な粒子で
ある。当該粒子により分離・濃縮されたウイルスは核酸
抽出・検査・診断、特に核酸増幅を伴う検査・診断に用
いる事もできる。

【００２６】また、本発明のアミン化合物固定磁性粒子
は試料中のウイルス外皮蛋白の検出にも使用することが
できる。具体的には、本発明のアミン化合物固定磁性粒
子を試料と混合し、吸着されたウイルス外皮蛋白を標識
抗体で検出する方法をあげることができる。この方法で
は、標識抗体の種類を変えることにより各種のウイルス
外皮蛋白を検出することができる。

【００２７】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、「部」は特記しない限り重量部を意味する。以下の
実施例において、得られたアミン化合物固定磁性粒子に
存在するアミン化合物の量および粒径は、下記の方法で
測定した。

【００２８】・アミン化合物の存在量： 電導度滴定法：アミン化合物固定磁性粒子を遠心分離
あるいは磁気分離により純水で２回洗浄し、粒子１gあ
たり混床型イオン交換樹脂５ｇを添加し、混合後１時間
攪拌した後、混床型イオン交換樹脂を濾去した。この混
床型イオン交換樹脂による精製を２回繰り返した。得ら
れた精製粒子のカチオン性基を硫酸規定液を滴定液とし
て滴定しアミン化合物含有量とした。この方法は下記実
施例１〜６に適用した。

【００２９】非水滴定法：上記と同様にアミン化合
物固定磁性粒子を精製後、乾燥しクロロホルムに溶解
し、クロロホルムに不溶分を濾去した後、過塩素酸／酢
酸溶液の規定液を用いて滴定しアミン化合物量を定量し
た。この方法は下記実施例７〜１０に適用した。

【００３０】・粒径の測定：光学顕微鏡、走査型電子顕
微鏡または透過型電子顕微鏡により写真撮影を行い２０
０個の粒子の粒径を測定し、その平均値を求めた。

【００３１】実施例１ 油性磁性流体「マーポマグナＦＶ−５５」［松本油脂製
薬（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた
後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面
を有するフェライト系の超常磁性体粒子（粒子径：０．
０１μｍ）を得た。ついで、超常磁性体粒子４０部にシ
クロヘキシルメタクリレート９０部、トリメチルアミノ
エチルメタクリレートの塩化物１０部およびビス（３，
５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（重
合開始剤）３部を添加し、この系を混合攪拌することに
より超常磁性体を均一に分散させてモノマー組成物を調
製した。

【００３２】一方、ポリビニルアルコール１０部、およ
びポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．１
部を水１０００部に溶解して水分散体を調製した。得ら
れた水性媒体（水相）中に上記のモノマー組成物を添加
し、超音波分散機で分散処理することにより平均粒子径
が１μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散されてなる懸
濁液（油滴分散体）を調製した。次に、得られた懸濁液
を容量２リットルの攪拌機付き三つ口フラスコに仕込
み、この系を７５℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪
拌しながら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合（懸
濁重合）させることにより、本発明のアミン化合物固定
磁性粒子を製造した。

【００３３】実施例２ 実施例１において油性磁性流体「マーポマグナＦＶ−５
５」［松本油脂製薬（株）製］を「フェリコロイドHC5
0」［タイホー工業（株）製］に代えた以外は実施例１
と同様にして、本発明のアミン化合物固定磁性粒子を製
造した。

【００３４】実施例３ 実施例１において重合開始剤をビス（３，５，５−トリ
メチルヘキサノイル）パーオキサイドからベンゾイルペ
ルオキシドに代えた以外は実施例１と同様にして、本発
明のアミン化合物固定磁性粒子を製造した

【００３５】実施例４ 実施例１においてトリメチルアミノエチルメタクリレー
トの塩化物１０部をジメチルアミノエチルメタクリレー
ト１０部に代えた以外は実施例１と同様にして、本発明
のアミン化合物固定磁性粒子を製造した。

【００３６】実施例５ 実施例１においてシクロヘキシルメタクリレートの使用
量を１００部とし、トリメチルアミノエチルメタクリレ
ートの塩化物を使用せず、ビス（３，５，５−トリメチ
ルヘキサノイル）パーオキサイド（重合開始剤）３部の
代りに２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）２
塩基酸塩５部を使用した以外は実施例１と同様にして、
本発明のアミン化合物固定磁性粒子を製造した。

【００３７】実施例６ 実施例１において分散処理に超音波微分散機を使用せ
ず、高速剪断ミルタイプのホモジナイザーを使用するこ
とにより平均粒子径が４μｍの油滴（油相）が水性媒体
に分散されてなる懸濁液（油滴分散体）を調製した以外
は実施例１と同様にして、本発明のアミン化合物固定磁
性粒子を製造した。

【００３８】実施例７ （１）実施例１においてシクロヘキシルメタクリレート
の使用量を９５部とし、トリメチルアミノエチルメタク
リレートの塩化物１０部の代わりにメタクリル酸５部を
使用した以外は実施例１と同様にして磁性ポリマー粒子
を製造した。 （２）上記（１）で得られた磁性ポリマー粒子を５ｍM
水酸化ナトリウム水溶液に分散し、８０℃で１２時間処
理してカルボキシ変性磁性ポリマー粒子とした。 （３）得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子１ｇ
（乾燥重量）を２０ｍLの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液
（ｐＨ６）に添加し、ポリエチレンイミン（数平均分子
量７万）の３０％水溶液0.５ｍｌおよびカルボジイミド
試薬であるＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライ
ド）０．２ｇを添加し、２０℃で２時間反応させ、本発
明のアミン化合物固定磁性粒子を得た。

【００３９】実施例８ （１）実施例７（２）と同様にして得られたカルボキシ
変性磁性ポリマー粒子１ｇ（乾燥重量）を２０ｍLの１
０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液に添加し、ポリ−Ｌ−リジン臭
化水素物（数平均分子量３０万）の１％水溶液１ｍLお
よび水溶性カルボジイミド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩
（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドヒドロクロライド）０．２ｇを添加し、２０
℃で２時間反応させ、ポリ−Ｌ−リジン固定磁性粒子か
らなる本発明のアミン化合物固定磁性粒子を得た。

【００４０】実施例９ （１）実施例７（２）と同様にして得られたカルボキシ
変性磁性ポリマー粒子１ｇ（乾燥重量）を２０ｍLの１
０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液に添加し、ポリアリルアミン
（ＰＡＡ；数平均分子量１０万）の１％水溶液１ｍLお
よび水溶性カルボジイミド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩
（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドヒドロクロライド）０．２ｇを添加し、２０
℃で２時間反応させ、ポリアリルアミン固定磁性粒子か
らなる本発明のアミン化合物固定磁性粒子を得た。

【００４１】実施例１０ （１）実施例１においてシクロヘキシルメタクリレート
の使用量を９０部のまま、トリメチルアミノエチルメタ
クリレートの塩化物の代わりにグリシジルメタクリレー
ト１０部を用いた以外は実施例１と同様にしてグリシジ
ル変性磁性粒子を得た。 （２）得られたグリシジル変性磁性粒子１ｇ（乾燥重
量）を１％のピリジンを含有する蒸留水２０ｍLに懸濁
し、ポリエチレンイミン（数平均分子量７万）の３０％
水溶液０.５ｍｌを添加し、６０℃で２４時間反応さ
せ、ポリエチレンイミン固定磁性粒子からなる本発明の
アミン化合物固定磁性粒子を得た。 （３）得られたポリエチレンイミン固定磁性粒子を得ら
れた磁性粒子を分散してなる液（（２）の状態）に混床
型イオン交換樹脂５ｇ添加した後、前記混床型イオン交
換樹脂をろ過により除去する操作を２回行って精製した
後、乾燥し、１０ｍLクロロホルムに溶解し、磁性体を
濾別した後、０．０１mol／Lの過塩素酸／酢酸溶液を用
いてポリエチレンイミンを非水滴定したところ、上記
（２）で得られたアミン化合物固定磁性粒子に結合した
総アミノ窒素量は２０μｍｏｌ／ｇであった。

【００４２】比較例１ 実施例１においてトリメチルアミノエチルメタクリレー
トの塩化物１０部を使用せず、モノマー成分は全量（１
００部）シクロヘキシルメタクリレートに代えた以外は
実施例１と同様にして、アミン化合物を固定していない
磁性粒子を製造した。

【００４３】比較例２ 実施例７において項（１）の操作のみ実施し、項（２）
〜（３）の操作を実施せずアミン化合物を固定していな
い磁性粒子を製造した。即ち実施例１においてシクロヘ
キシルメタクリレートの使用量を９５部とし、トリメチ
ルアミノエチルメタクリレートの塩化物１０部の代わり
にメタクリル酸５部を使用した以外は実施例１と同様に
して磁性粒子を製造した。実施例１〜１０及び比較例
１、２で得られた磁性粒子について前述の方法で粒径お
よびカチオン性基量を滴定してアミン化合物の量を測定
した。結果を表１に示す。

【００４４】

【表１】

【００４５】ウイルスの濃縮及びＰＣＲ試験結果 （１）実施例１〜１０及び比較例１，２で得られた粒子
の水分散体を精製後、生理食塩水で固形分濃度５重量％
に調整した。 （２）ＨＢＶを１０⁵コピー／mL含有するヒト血漿を、
ウイルスＤＮＡ陰性血漿を用いて段階的に希釈し、 Ｈ
ＢＶを１０⁴〜１０¹コピー／mLで含有する試料を調製し
た。この試料５ｍＬに上記（１）で調製した粒子懸濁液
（５重量％）100μＬを加え、室温で１０分間回転撹拌
し、ウイルス吸着処理を行った。

【００４６】ウイルス吸着処理後、磁気分離スタンドに
セットし、粒子と上清を分離し、上清を捨て、 Tris-HC
l緩衝液(pH7.4)を加え、100μLの粒子分散液を調製し
た。この粒子分散液から、DNA抽出キット（和光純薬工
業株式会社）を用いて、付属の手順書に従い核酸を抽出
した。比較として、 ＨＢＶを１０⁴〜１０¹コピー／mＬ
で含有する血漿検体100μＬから、DNA抽出キットを用い
て核酸を抽出した。得られた抽出物をPCR法により、３
５回の増幅過程によりDNAを増幅した。PCRのプライマー
配列は、Hiroaki Okamoto, Igaku no ayumi, (1992),16
2(9),544-549.に従った。得られたPCRの増幅産物を3%ア
ガロースを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイ
ド染色によりDNAを可視化しポラロイド（登録商標）写
真に撮影した。得られた目的DNAの量をバンドの蛍光強
度から、-,+,++,+++の４段階で判定した。結果を表２−
表１１に示す。

【００４７】比較例３ 上記の（１）、（２）の操作で本発明のウイルス濃縮粒
子を添加しない他は、同様の操作を行い評価した。結果
を表１４に示す。

【００４８】

【表２】 （実施例１）

【００４９】

【表３】 （実施例2）

【００５０】

【表４】 （実施例3）

【００５１】

【表５】 （実施例４）

【００５２】

【表６】 （実施例５）

【００５３】

【表７】 （実施例６）

【００５４】

【表８】 （実施例７）

【００５５】

【表９】 （実施例８）

【００５６】

【表１０】 （実施例９）

【００５７】

【表１１】 （実施例１０）

【００５８】

【表１２】 （比較例１）

【００５９】

【表１３】 （比較例２）

【００６０】

【表１４】 （比較例３）

【００６１】アミン化合物を固定化していない磁性粒子
で実施した表１２、１３，比較例１、２及び本発明の粒
子を用いずに実施した表１４，比較例３の実験からは、
ウイルス核酸の検出には1×10³ copies/mL以上のウイル
ス濃度が必要であり、1×10²copies/mL以下の検体から
はウイルスを検出することは出来なかった。一方、本発
明の粒子を用いて、検体を５０倍濃縮して実施した表２
〜１１、実施例１〜１０の実験の結果、少なくとも1×1
0¹ copies/mL以上のウイルス濃度の検体からウイルス核
酸が検出でき、本発明の粒子は、高感度のウイルス検出
において有効であった。

【００６２】実施例１１ 〈免疫化学的測定への応用〉実施例７のアミン化合物固
定磁性粒子の水分散体を精製後、生理食塩水で固形分濃
度５％に調整したもの１００μＬを濃度既知のＨＢｓＡ
ｇ陽性検体の希釈サンプル画１００μＬに添加し、チュ
ーブミキサーで１５分間撹拌した。撹拌後、磁気分離ス
タンドにて粒子を分離し、上清を除去し続いてトリス緩
衝生理食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．５で洗浄し、ペルオキ
シダーゼ標識ＨＢｓ抗体（特殊免疫研究所製）を１００
μＬを添加して反応させ、ＴＢＳで洗浄し、基質液１０
０μＬを添加して発色反応を３０分間行い硫酸を添加し
て反応を停止させ、各々吸光度を測定した。結果を表１
５に示す。

【００６３】

【表１５】

【００６４】実施例１２ 〈DNA含有溶液からのDNAの抽出〉pBR322プラスミドDNA
をウシ胎児血清(FBS,SIGMA社製 F2442)に溶解し、 pBR3
22プラスミドDNAの10μg/mL FBS溶液を調製した。この
溶液1mLを1.5mL用のマイクロテストチューブに取り分
け、それぞれに固形分濃度５％に調整した実施例１〜１
０、比較例１、２で得られた粒子の生理食塩水溶液20μ
Lを添加し、ボルテックスで攪拌してDNAを粒子に吸着さ
せた。チューブを磁気分離スタンドにセットし、粒子と
上清を分離し、上清を捨てた。粒子を洗浄する操作とし
て、1mLの Tris-HCl緩衝液(pH7.4)を加え、ボルテック
スで攪拌したあと、再度チューブを磁気分離スタンドに
セットして粒子と上清を分離し、上清を捨てる操作を行
い、これを２回繰り返した後、 濃度17.6μg/mLのデキ
ストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万、和光純薬工
業）のTris-HCl緩衝液溶液を100μL加えて、30分間、室
温で穏やかに振とうして粒子に吸着したDNAを脱吸着さ
せた。磁気分離スタンドにチューブをセットして粒子と
上清を分離し、100μLの上清を回収した。 pBR322プラ
スミドDNAの回収量を、260nmの紫外吸光度(A260)から算
出し、純度の目安として260nmと280nmの吸光度の比(A26
0/A280)を測定した。結果を表１６に示した。

【００６５】

【表１６】

【００６６】実施例１〜１０により、本粒子を用いて、
DNAを含有するFBS溶液から、 A260/A280が1.80以上と
いう高純度でDNAを抽出することが出来た。同時に、従
来の、エタノール沈殿や、フェノール・クロロホルム抽
出の様な操作をすることなく、DNAの濃縮も達成でき
た。

【００６７】

【発明の効果】本発明のアミン化合物固定化磁性粒子を
用いることにより、アミン化合物の生物化学的反応性を
利用して混合物や試料からより目的物を容易に吸着し濃
縮することができる。さらに吸着した目的物を適当な液
中に濃縮された状態で離脱させることができ、しかもア
ミン化合物固定磁性粒子は容易に目的物から分離するこ
とが出来るので、目的物の分析に悪影響を与えない。そ
のため、正確に微量分析が可能である。さらに具体的に
は、ウイルスの濃縮、ＰＣＲに代表される試験、免疫化
学的測定への応用、DNA含有溶液からのDNAの抽出等，遠
心分離や磁気を作用させる簡便な手段により、同時に多
数の検体を簡便に処理することができる。

フロントページの続き (72)発明者 片寄 聡 東京都中央区築地二丁目11番24号 ジェイ エスアール株式会社内 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ10 QR54 QS02 QS14 QS15 QS25 QS28 QS36 QS39 QX01 4G066 AA27C AB10B AB13A AB13B AC17A AC17B AC17D AC27B AC27D AC33B BA09 CA20 DA11 DA12 EA13 FA03 FA09

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミン化合物を固定化した磁性粒子。
2. 【請求項２】前記アミン化合物が、１級アミノ基、２級
   アミノ基、３級アミノ基、第４級アンモニウム基、イミ
   ノ基、アミジノ基、イミジノ基、ヒドラジノ基、及び含
   窒素環式基からなる群から選ばれる基を含有する化合物
   である、請求項１に記載の磁性粒子。