JP4443762B2 - 改良化磁性粒子、その生産法、及び分子を分離するためのその使用 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、０．０５から１０μｍの間の所定のサイズを有する熱感受性磁性粒子に関し、該粒子は、一方で内部複合コアを、他方で少なくとも一つの生物学的分子と相互作用可能なポリマーに基づく外部層を含む。本発明はまた、上記粒子の生産法及び使用に関する。
【０００２】
以下の説明において、用語「複合」は、フェライトのような単純な磁性化合物、またはポリマーマトリックス中に配置され、取り込まれ、または皮膜されたフェライトのような複合体と同義である。
【０００３】
この内部複合コアは、２０ｎｍから１０μｍの間の直径を有する。
【０００４】
【従来の技術】
生物学的診断は、生物学的サンプル（尿、血液、脳脊髄液、沈渣、唾液等）の分析を使用して、疾患を検出することより成る。研究の過程において、調子の悪い患者における特異的なタンパク質またはＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在を測定するために、特定のタンパク質または核酸の活性アッセイと適合的な条件の下で、抽出及び濃縮することが特に可能であることが望ましい。タンパク質の場合には、現在使用されている方法は、タンパク質の沈降を実施する大量の塩を媒体中に導入し、次いで遠心分離によってタンパク質と塩を分離することより成る。しかしながらこれらの方法は非常に手間がかかり、さらにかくして抽出されたタンパク質はしばしば変性する、即ちそれらはその生物学的特性を失ってしまう。このことは、近年生物医学的分野において、磁性ラテックスについて興味が示されていることを説明する。
【０００５】
特に、ラテックスの形態のポリマー支持体は、多くの利点、特に粒子のグラム当たり大きな特異的表面領域（数十平方メートル）を提供するという利点を示すために、顕著に使用されている。
【０００６】
従来技術は、文献EP-A-0,106,873及びEP-A-0,446,260によって定義でき、それらは磁性酸化鉄の粒子が取り込まれたポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーベースの多孔性コア、及び核酸プローブと相互作用可能な官能化外部層を含む、超パラ磁性単一分散粒子を記載する。
【０００７】
これらの文献に記載された粒子を調製するための方法に従って、磁性酸化鉄は相当する塩の沈降によって取り込まれ、該沈降は取り込まれる磁性フィラーの割合を制限し、表面単一層にのみ磁性フィルターを得ることを可能にし、該表面単一層は生物学的分子の活性の阻害の現象を誘発する。
【０００８】
同様に、文献EP-A-0,585,868は、第一のポリマー、及びフェライトベースの磁性材料を配置する第二のポリマーより成るコアを包む磁性層より成る磁性粒子を記載し、該磁性層は抗原または抗体と相互作用可能であり、該磁性材料は鉄塩の沈降によって沈着される。
【０００９】
取り込まれた磁性材料は、該粒子の引き続く処理に直接さらされ、それ故該粒子の使用の間、フィラーの損失が生じ、そのことは特に生物学的分子の酵素的阻害及び変性という問題を生じ得る。
【００１０】
文書WO-A-94/09368の主題は、我々が提唱するような、アクリルアミン誘導体に基づくポリマーの代わりにゼラチンを使用することである。しかしながらこの文献は、架橋剤を提案している。
【００１１】
しかしながらゼラチンは、請求項に記載されたポリマーのものとは全く異なる機能を有する。それ故ゼラチンは、必ずしも熱感受性ではなく、熱感受性アクリルアミン誘導体の架橋が、内部コアに存在する磁性内包物のトラッピングを導くことは全く証明されなかった。
【００１２】
A. Kondo, (A. Kondo, H. Kamura及びK. Higashitani (1994) Appl. Microbiol, Biotechnol., 41, 99-150)による文献に従って、ポリスチレンより成る第一のポリマーに基づき、磁性材料を配置する磁性粒子で、親水性層がポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)より成る熱感受性ポリマーに基づくコアを覆っている磁性粒子を得るための方法は周知である。記載された方法は、以下の二工程を含む。磁性コアを得るための第一の工程に従って、磁性材料を、重合開始剤の存在下でスチレンと接触させる。親水性層を得るための第二の工程に従って、得られたコアを、上述の重合開始剤の存在下でN-イソプロピルアクリルアミド及びメタクリル酸と接触させる。サンプル中に存在するウシ血清アルブミンに対して向けられた抗体を後に単離するために、ウシ血清アルブミンをかくして得られた粒子に結合する。
【００１３】
この文献は、内部コア及び／または外部層に存在する磁性材料の包含物を含む磁性粒子を提案する。もちろん、もし上記外部層が包含物を含むのであれば、それらは、反応媒体中に放出され、特異的反応を必要とする生物学的及び／または診断用の液体における考慮される応用及び使用を害するであろう。さらに、架橋剤の使用は存在せず、それ故中間層の形成も存在しない。もし上記粒子が溶媒と共に配置されるのであれば、これらの封入物が内部コアのみに存在する場合でさえ、包含物は反応媒体中に遊離するであろう。さらに上記粒子は、タンパク質に対してのみ有効である。核酸の分離は、考慮することができない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
かくして、サンプル中のこれらの粒子をできるだけ効率的に分離することを確実にするために、本出願人は、サンプルの温度が増大する熱凝集を利用し、これは磁場の機能を完全化する効果を有する。文献WO-A-97/45202は、超パラ磁性であり、非常に均一に配置された磁性フィラーを有する粒子を提案し、該磁性フィラーの割合は、該粒子を構成するポリマーに対して１から８０重量％の間、特に２５から８０重量％の間で変化し得る。特に使用される方法が、磁性フィラーをいくつかの層に配置することが可能なため、この文献により、取り込まれた磁性フィラーの高い割合に到達することが可能である。考慮される利点、即ち凝集のような別の分離法の組み合わせた機能に頼る必要なく、本発明の粒子をサンプルから効率的に分離できることは、そこから導かれる。
【００１５】
この発明は、本発明のものとは異なる目的を有する。さらに、磁性ではない内部コアを覆う磁性中間層が存在する。さらに、非磁性中間層が存在しないことに注意すべきである。この構成は、中間層から反応媒体中への磁性包含物の放出を妨げない。
【００１６】
これらの粒子は生物学者の期待のほとんどを満足する一方で、特定数の欠点を含む。かくしてこれらの粒子は、第一に、実施される作業に依存して特に貴重である核酸からのタンパク質の分離（抗体の同定、配列の増幅等）、及び第二に、核酸の分離が可能ではない。かくして核酸の分離の場合、本発明に従った粒子は、使用されるであろう各種の増幅法（ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ）を阻害しない。最後に、該粒子に対して抽出された物質（タンパク質または核酸）を放出させることは必ずしも必要ではなく、同定または増幅アッセイが、磁性分離の後に直接的に実施できる。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
この効果のために、本発明は、０．０５から１０μｍの間の所定のサイズを有する熱感受性磁性粒子に関し、各粒子は以下のものを含む：
− 固体の有機または無機粒子より成り、その内部に磁性フィラーを含む内部複合コア、並びに
− 少なくとも一つの生物学的分子と相互作用可能なポリマーに基づく外部層であり、外部ポリマーは熱感受性であり、１０から１００℃の間、好ましくは２０から６０℃の間の所定の下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有し、中間層が内部コアと外部層の間に存在し、それが上記官能化外部層に対して上記内部コアの磁性フィラーを隔離することを特徴とする。
【００１８】
【発明の実施の形態】
好ましい実施態様に従って、中間層は、少なくとも以下のものより成る：
− ポリマーを与えるために重合可能である、一つの官能性または非官能性モノマー、並びに
− 一つの架橋剤。
【００１９】
別の好ましい実施態様に従って、外部層は、少なくとも以下のものより成る：
− ポリマーを与えるために重合可能である、一つの官能性モノマー、並びに
− 一つの開始剤。
【００２０】
一つの実施態様の変形例に従って、官能性モノマーは、2-アミノエチルメタクリラートクロリドのようなカチオン性モノマーより成る。
【００２１】
別の実施態様の変形例に従って、官能性モノマーは、カルボン酸または硫酸モノマーのようなアニオン性モノマーより成る。
【００２２】
該実施態様または実施態様の変形例の何れも、該ポリマーは親水性ポリマー、特にアクリルアミン誘導体、好ましくはN- イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）の重合によって得られるポリ（ＮＩＰＡＭ）より成る。
【００２３】
第一の好ましい実施態様に従って、架橋剤は、N,N'-メチレンビスアクリルアミドより成る。
【００２４】
第二の好ましい実施態様に従って、開始剤は、アゾビス(2-アミジノプロパン)クロリドのような少なくとも一つのカチオン性開始剤より成る。
【００２５】
また第二の好ましい実施態様に従って、開始剤は、過硫酸カリウムのような少なくとも一つのアニオン性開始剤より成る。
【００２６】
全ての上述の実施態様において、外部層は、プロトン化アミンまたはアミジン基で官能化することが可能である。
【００２７】
全ての上述の実施態様において、外部層は、カルボン酸または硫酸基で官能化することが可能である。
【００２８】
本発明はまた、上述の粒子を得るための方法に関し、該方法は：
− 固体の有機または無機粒子より成り、その中に磁性フィラーを含む複合コア、
− ポリマーを与えるために重合可能な官能性または非官能性モノマー、並びに
− 架橋剤、
を、内部コアを構成する複合コアが、ポリマーと架橋剤の混合物によってカプセル化され隔離されるまで、並びに少なくとも一つの生物学的分子と相互作用可能なポリマーに基づく外部層が形成されるまで、共に接触させ、且つ反応させることより成る。
【００２９】
好ましい実施態様に従って、カチオン性磁性粒子は、アゾビス(2-アミジノプロパン)クロリドの存在下で、アクリルアミド及び／またはアクリルアミド誘導体の水溶性モノマーの、複合コアに対する重合によるカプセル化によって調製される。
【００３０】
有利には、該重合は、N,N'-メチレンビスアクリルアミド及び／または2-アミノエチルメタクリラートクロリドの存在下で実施される。
【００３１】
別の好ましい実施態様に従って、アニオン性磁性粒子は、過硫酸カリウムの存在下で、アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の水溶性モノマーの、複合コアに対する重合によるカプセル化によって調製される。
【００３２】
有利には、該重合は、N,N'-メチレンビスアクリルアミド及び／またはカルボン酸モノマーの存在下で実施される。
【００３３】
使用される方法が何であれ、重合の前に、吸着または重合によって得られる磁性粒子は、ポリスチレン及び／またはメチルポリメタクリラートのような、磁性フィラーを隔離する少なくとも一つの物質で覆われる。
【００３４】
好ましくは該方法は、該方法によって得られる粒子の全質量に対して、以下の割合で試薬を使用することより成る：
− １０から３０％のアクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の水溶性モノマー、
− 多くても１０％の少なくとも一つの架橋剤、並びに
− １から５％の少なくとも一つの安定剤。
【００３５】
本発明はまた、核酸またはいずれかのポリ電解質分子を固定化または抽出し、磁性分離の後、上記核酸または物質を分子及び／または分析するための、上述のカチオン性粒子の使用に関し、使用される温度はＬＣＳＴより常に低い。
【００３６】
最後に本発明は、温度がＬＣＳＴより高い場合、該粒子に結合することによってタンパク質を抽出し、温度がＬＣＳＴより低い場合、磁性分離の後に上記タンパク質を放出及び／または分析するための、上述のアニオン性粒子の使用に関する。
【００３７】
【実施例】
Ｉ − 商業的磁性粒子または複合コアのカプセル化：
多くの磁性粒子が販売されている。これらの粒子の表面は、アニオン性またはカチオン性である。これに対してその組成は、詳細にされていない。これらの粒子は、可変的なポリ分子性インデックスを有する。特に、Seradyn、Spherotec及びDynal粒子は単分散性であり、その一方で１ｍの平均径を有するがEstaporから得られるものは、非常に多分散性である。
【００３８】
全てのこれらの粒子を、核酸増幅法において試験し、それらは阻害反応を生ずる。それ故、核酸に対して作用することができるように、その表面を修飾する必要が存する。
【００３９】
Ａ／ カチオン性親水性磁性ラテックスの調製：
カプセル化反応を、窒素環境下で７０℃で実施した。
【００４０】
１ｇの種となる粒子を、沸騰して予備加熱し、窒素の下で脱気した４０ｍｌのmilliQ水で希釈した。
【００４１】
種となる粒子が疎水性である場合に限り、スチレンを加えた。それを合成の開始前に単独で加え、磁性複合コアと接触させて例えば３０から６０分間の特定の時間放置した。
【００４２】
モノマーを以下の割合で導入した：
− ＮＩＰＡＭ：０．３２５４ｇ、即ち３２．５％／種（もし種が６０％のフェライトを含むのであれば８０％／ポリマー）、
− ＭＢＡ：０．０２７４ｇ、即ち６．１８モル％／ＮＩＰＡＭ、
− ＡＥＭ：０．０７４０ｇ、即ち１５．５モル％／ＮＩＰＡＭ、並びに
− Ｖ５０：０．００６１ｇ、即ち０．８０モル％／ＮＩＰＡＭ。
【００４３】
例えば、０．１４ｇのトリトンＸ４０５といった界面活性剤を加えることが必要である。
【００４４】
開始剤を１ｍｌの水で導入する。引き続きモノマーを加える。それらを９ｍｌに希釈し、それらを反応器中に段階的、即ち１５分間かけて導入し、またはそれらを開始剤を加えるや否や一度に導入する。
【００４５】
本発明の文脈に従って、Estapor複合コアをカプセル化した。アニオン性粒子(EM1 100/20及びEM1 100/30粒子）及びカチオン性粒子(R95-07粒子）を使用した。
【００４６】
EM1 100/20及びEM1 100/30ラテックスから調製される粒子は、使用される重合法に依存して（密封反応器、延期的なまたは継続的な付加）、ラテックスのグラム当たり５から３００ミリモルのＮＨ₂（ｍｍｏｌ ＮＨ₂）のフィラー密度を得ることが可能であった。
【００４７】
R95-07ラテックスから調製された粒子は、重合法に依存して、ラテックスのグラム当たり５０から３００ｍｍｏｌ ＮＨ₂のフィラー密度を得ることが可能であった。
【００４８】
反応系にモノマーを加えるためのプロトコールに従って、いくつかの重合法が区別できる。
【００４９】
１ − 「バッチ」と称される密封反応器重合：
反応の開始前に、モノマーを他の成分と共に、且つ後に添加せずに反応器に加える。
【００５０】
モノマーの反応性の差異のため、この方法はしばしば組成物中にドリフトの出現を導く。これは変換の関数として顕著に変化する組成を有するマクロ分子の生産によって顕在化する。機能的なモノマーの顕著な部分が、粒子の内部または水溶性ポリマーの形態中で損失する危険を有するため、この方法は表面取り込みについて比較的不十分であることがわかる。共存重合を極性のモノマーで「バッチ」によって実施する場合、より小さい粒子が大量に得られるが、限られた変換しか有さない。この挙動は、これらのモノマーの水中への顕著な可溶性に結びついており、それは均質な有核機構の優勢に寄与する。
【００５１】
２ − 半継続的重合：
該モノマーの少なくとも一部は、反応の開始及び終結の間の期間で反応器中に加えられる。この添加は、固定された速度でまたは以下の所定のプロフィールで実施できる。目的は、制御された組成物のコポリマーを得るような方法で、モノマー混合物の添加を制御することである；それは、添加条件がしばしば重合速度が添加速度よりも早いように得られる態様である。これは、均質な組成を有するコポリマーを得ることを可能にする。
【００５２】
３ − 「ショート」と称される延期的な添加による重合：
共存重合の間、及び一度反応が進行したら、機能的モノマーを単独で、またはベースモノマーの存在下で、制御された方法で該系に導入する。かくして倍化の成功は、共存重合の速度論の従来の知見の度合に依存する。それは、表面取り込みを促進するための効率的な方法である。実験条件（添加の時間での変換の度合、モノマー混合物の組成及び濃度）の選択により、表面収率を最適化することが可能である。
【００５３】
４ − 種への重合：
それは、既に構成され完全に特徴付けされたラテックスを含む系に、機能的モノマーを導入することより成る。機能的モノマーは、一段階または半継続的に、種のベースモノマーと、純粋なまたは混合物として加えることができる。
【００５４】
上述の各種の重合法の中で、密封反応器重合及び種への重合のみが使用された。
【００５５】
Ｂ／ アニオン性親水性磁性ラテックスの調製：
使用されるラテックスは、磁性特性を与えるポリスチレン及び／またはフェライトのコアより成る。それらはまた、重合によってN-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）で皮膜される。架橋剤、N,N'-メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）が加えられる。使用される開始剤は過硫酸カリウム（Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₈）であり、それはラテックスの表面の硫酸基の存在、及びそれ故アニオン性質を説明する。
【００５６】
ＩＩ − 核酸分離：
本発明の目的は、患者における感染性遺伝子の存在を非常に迅速に検出可能な、新規な診断試験モデルを開発することである。それは、それらをアッセイすることができるような方法で、ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に抽出し、同時にサンプル媒体中に大量に存在するタンパク質を前もって除去するためのプロトコールを確立することを含む。選択された支持体は、第一の工程において、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、またはＴＭＡのようなＤＮＡ及びＲＮＡについての増幅法を阻害する反応を引き起こすべきではない。この工程が可能である場合、支持体は十分な量で核酸を特異的に単離することが可能でなければならないであろう。
【００５７】
かくして支持体は親水性であり、増幅反応を阻害する物質を放出するべきではない。
【００５８】
この研究は、N-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）より成り、2-アミノエチルメタクリラート（ＡＥＭ）クロリドで官能化される、親水性柔毛コートで皮膜されたカチオン性磁性ラテックスを得ることより成る。
【００５９】
商業的な粒子または複合コアの表面を修飾し、コアまたは粒子をカプセル化した。入手可能な主な粒子は、Dynal、Seradyn、BioMag、SpherotecまたはEstapor（登録商標）から得た粒子である。
【００６０】
本出願人により1996年4月9日に提出された特許出願FR96/04691は、上記核酸分離に関する。かくしてその内容は、本特許出願に包含される。
【００６１】
ＩＩＩ − タンパク質分離：
該ラテックスの利点は、それらが熱感受性であるというだけでなく、磁性でもあるという点にあり、そのことから遠心分離工程を避けることができる。単純な研究室の磁石により、媒体の残余物から磁性粒子を分離することが可能である。かくしてこの方法は、考え得る産業上の使用に照らして、より迅速な且つより容易な自動化という利点を有する。
【００６２】
第一に、モデルタンパク質であるヒトアルブミン（ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン）を含む溶液を濃縮するための物理化学的条件を最適化することが必要である。第二に、尿中に存在する全てのタンパク質を濃縮可能な条件を見出さなければならない。
【００６３】
ＨＳＡ単独から調製される溶液に対する試験を、EM1 070/60コアを使用して実施し、一方で尿に対する応用を、EM1 100/20コアで実施した。
【００６４】
窒素環境下で１時間、沸騰脱気milliQ水で複合コアを洗浄した後、４０ｃｍ³の水中の溶液中に１ｇのEstaporラテックスを反応器に導入し、それを実験を通して窒素のフローの下で７０℃で維持する。２００ｍｌのスチレンを加えた後、それを２時間膨潤するために放置する。
【００６５】
０．００６１ｇのＫＰＳを、１ｍｌの水中に溶解する。次いで毎分、０．３２５ｇのＮＩＰＡＭ、０．０２７ｇのＭＢＡ及び０．１４ｇのトリトン（Ｘ−４０５）の１ｍｌの溶液を、９ｍｌの水中に加える；この混合物を少なくとも１０時間攪拌して放置する。
【００６６】
次いでラテックスの洗浄を実施する。
【００６７】
この方法の目的は、界面活性剤、並びに溶液中に遊離した電解質及びポリマー鎖を除去することである。特に界面活性剤は、Bradford試薬（タンパク質をアッセイするために使用される化学的方法）の破壊を導き、該ラテックスの吸着能力を減少するであろう。
【００６８】
使用されるラテックスは磁性であるため、上清を取り出し、それを新たに交換されたmilliQ水で置換し、次いでボルテックスを使用してそれを強烈に攪拌することは、磁石を使用して非常に容易に可能である。この洗浄は、上清が透明になるまで繰り返される（最終洗浄の後に該ラテックスの伝導性が、milliQ水の伝導性（〜０．０２ｍＳ）と実践的に同程度低いことを確認することが可能である）。
【００６９】
Ａ／ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）：
ＨＳＡは、タンパク質を最大に濃縮可能な、ｐＨまたはイオン強度のような各種のパラメーターを研究するためのモデルタンパク質である。
【００７０】
それは約４×４×１４ｎｍの寸法を有し、６２，０００ｇ／ｍｏｌの近傍の分子量を有する楕円形タンパク質である。
【００７１】
そのゼータポテンシャル（粒子の表面での電荷密度に関する物理化学的測定値）は、ｐＨと共に変化する：ＨＳＡタンパク質は、ｐＨ＜ｐＩ（等電点：ネット電荷が０であるｐＨ値；ＨＳＡについてｐＩ＝４．８）の場合カチオン性であり、ｐＨ＞ｐＩの場合アニオン性である。
【００７２】
Ｂ／ タンパク質濃度を測定するための方法：
例えばＨＳＡといったタンパク質をアッセイすることは、Bradford試薬を使用して実施される。このアッセイは、タンパク質と複合体を形成するクマシーブルー（Ｇ２５０）の使用を通じて可能である（最初に茶色、タンパク質の濃度が増大するにつれて次第に青色が濃くなる）。タンパク質／色素複合体は、非常に高い吸光係数を有し、それが非常に高感度の方法にしている。さらに、色素形成は視覚的に瞬間的であり、それが迅速なアッセイを可能にする。
【００７３】
Bradfordアッセイは全て、同じ条件で実施される：タンパク質濃度の測定が所望される１５μｌの溶液、＋１３５μｌの適切な緩衝液（所望のｐＨ及びイオン強度）、＋１５０μｌのクマシー試薬。
【００７４】
１ − 吸着される量の測定：
吸着されるタンパク質の量Ｎｓは、以下の式によって与えられる：
Ｎｓ（ｍｇ．ｇ^-1）＝Ｖ（Ｃ_i−Ｃ_f）／ｍ
式中、
Ｃ_i（ｍｇ／ｍｌ）＝ラテックスと接触される溶液の初期タンパク質濃度；
Ｃ_f＝吸着後の上清中の最終ＨＳＡ濃度；
Ｖ（ｍｌ）＝溶液の全容量；
ｍ（ｇ）＝溶液中のラテックスの質量。
【００７５】
２ − 吸着された量の測定：
もしタンパク質がラテックスの質量ｍ（ｇ）に最初に吸着され、且つ容量Ｖ（ｍｌ）中への吸着の後、タンパク質濃度ｃ（ｍｇ．ｍｌ^-1）がBradfordアッセイによって測定されたならば、吸着された量は、以下の式によって与えられる：
Ｎｓ（ｍｇ．ｇ^-1）＝Ｖ^★Ｃ／ｍ
【００７６】
Ｃ／ パラメーターの最適化：
１ − ＨＳＡタンパク質の吸着：
この項では、ラテックス粒子へのタンパク質の最大の吸着のためのｐＨ、イオン強度、並びに温度に関する値を測定する。
【００７７】
ａ． 方法：
実験を、エッペンドルフチューブで実施する（最大含有量：１．５ｍｌ）。
ラテックスの容量： １００μｌ（即ち２．１ｍｇ）
ＨＳＡ溶液の容量： ２００μｌ（可変的な体積）
緩衝液の容量： ７００μｌ
【００７８】
所定の濃度のＨＳＡ溶液の０．２ｍｌを１ｍｌの全容量について導入した場合、ラテックスと接触するＨＳＡ溶液の真の濃度を、０．２の希釈因子による補正の後に得る。
【００７９】
ｂ． 温度の影響：
吸着に対する温度の影響は、ｐＨと独立して顕著である。図１は、ｐＨ＝４．７及び０．０１ｍｏｌ／ｌのイオン強度について、二つの異なる温度での初期タンパク質濃度の関数として、吸着されたタンパク質の量の変化を示す。
【００８０】
同じ傾向を、ｐＨ５．７（２０℃、吸着は４０℃より３０％低い）及びｐＨ８．６で観察する。
【００８１】
ラテックスの親水性／疎水性性質のみが、温度に関して変化するため、この研究は、吸着に関する疎水性相互作用の影響を示すことが可能である。
【００８２】
曲線が第一の点について吸収されるという事実は、該方法のためであろう。４０℃での吸着を試験するために、ラテックス、タンパク質及び緩衝液を室温で混合し、次いで４０℃に加熱した。それ故、低ＨＳＡ濃度について、吸着は４０℃で生ずると考慮される一方、タンパク質はＴ＜３２℃のため加水分解形態でラテックスに吸着するであろう。
【００８３】
ｃ． 吸着の時間の影響：
吸着に最適であると判断される条件の下で、インキュベーション時間の関数として吸着される量の速度論研究を実施する。図２は、３０分後、実質的に最大の考え得る量が既に吸着されたことを示す。
【００８４】
ｄ． ｐＨの影響：
吸着を、０から０．２ｇ．ｌ^-1の間のＨＳＡ濃度で、４．７，５．７及び８．６のｐＨについて実施した。ｐＨ＝８．６での吸着について、（ＨＳＡ）＞０．０６ｇ．ｌ^-1のため曲線が引けず、吸着された量は非常に低く、（Ｃ_i−Ｃ_f）は事実上０であり、該測定法はこの小さい変数を検出するためには正確ではない。
【００８５】
得られた３種の曲線を重ね合わせることによって、以下のことを示す図３のグラフを得る：
ｉ）ラテックスのｇ当たり５０ｍｇのタンパク質の吸着について定常期の存在（吸着部位の飽和）；
ｉｉ）ｐＨ＝４．７について最大の吸着。
【００８６】
この結果は、静電気的相互作用の影響に一致する：ｐＨ＜ｐＩについて、タンパク質はカチオン性でラテックスはアニオン性であり、そのため静電気的引力及び好ましい吸引が生じ、一方でｐＨ＞ｐＩについて、タンパク質及びラテックスはアニオン性であり、吸着されたＨＳＡの量を減少する静電気的斥力が生じる。かくしてこの研究は、吸着に対する静電気力の影響を示す。
【００８７】
ｅ． イオン強度の影響：
同じ初期タンパク質濃度について、イオン強度の関数として吸着された量を与える曲線が、図４に再生産される。
【００８８】
ｉ） ｐＨ＝４．７及び（ＨＳＡ）＝０．１４ｍｇ．ｍｌ^-1及びＴ＝４０℃
この曲線は、吸着が低イオン強度で最大であることを示す；これは、媒体の塩濃度が減少するにつれて一層静電気的相互作用がより少なく遮られて、吸着を促進する、吸引性静電気的相互作用と一致する。
【００８９】
ｉｉ）ｐＨ＝８．６及び（ＨＳＡ）＝０．０４ｍｇ．ｍｌ^-1及びＴ＝４０℃
この曲線は、吸着が高イオン強度で最大であることを示す；塩基性ｐＨで、静電気的相互作用は反発的であり、それ故吸着はこれらの相互作用が遮られるほど大きい。
【００９０】
ｆ． ラテックスの量の影響：
図５は、０．１４ｍｇのＨＳＡ及び２．１％の固体含有量のラテックスについて、吸着される量の定常期が、０．１２５ｍｌのラテックス（即ち２．６ｍｇ）の容量について到達することを示す。この定常期は、ラテックスのグラム当たり約５０ｍｇのタンパク質、即ちラテックス粒子が１ｍｍ近傍の寸法及び１．８５ｇ／ｃｍ³の密度を有すると仮定して、ポリマーのｍ²当たり１５ｍｇのＨＳＡ、に相当する。この結果は、予測された範囲内にある。
【００９１】
かくして、以下で使用されるであろうものは、この割合である（０／１ｍｇのタンパク質について約２ｍｇのラテックス）。
【００９２】
ｇ． 吸着についての結果：
かくして、吸着についての最適なパラメーターは、以下のものである：
ｐＨ＝４．７
Ｆｉ＝０．０１ｍｏｌ／ｌ
Ｔ＝４０℃
ｔ＝１０分
【００９３】
Ｄ／ ＨＳＡタンパク質の脱着
吸着を、上述の最適な条件の下で実施し、次いで脱着を左右するパラメーターを研究する。
【００９４】
第一の脱着試験を、エッペンドルフチューブ中で実施した。初めに、吸着を上述の条件の下で実施する（媒体中に存在する実質的に全てのタンパク質が吸着されることが証明される）。次に、上清を取り出し、脱着を促進する能力の研究で望ましい１ｍｌの溶液と交換する。
【００９５】
各種の脱着時間の後、この新しい上清の光学密度の測定により、脱着されるＨＳＡの量を減少し、それ故脱着時間の影響を減少することが可能である。
【００９６】
脱着は、酸性ｐＨよりも塩基性ｐＨで、且つ４０℃よりも２０℃でよりよい効果を生じ、それはｐＨ及び温度の影響に従って予測可能であった。さらに、短い吸着時間は、実質的に全てのタンパク質を吸着するのに十分であり、より多くのタンパク質がラテックスと接触したままであり、脱着が比較的少ないために、短い吸着時間（〜１０分）が選択された。
【００９７】
他のパラメーターの影響は明らかではなく、得られた結果が以下に記載される。
【００９８】
１ − イオン強度の影響：
図６は、脱着に関する緩衝液のイオン強度の影響を示す。
【００９９】
この曲線は、０．１ｍｏｌ．ｌ^-1に近いイオン強度について最大の脱着の存在を示す。この結果は、非常に驚くべきものである。塩基性ｐＨで、該ラテックス及びＨＳＡはアニオン性であり、そのため静電気力は反発的である。脱着を増大するために、それらは遮られるべきではない；アプリオリに、低イオン強度が必要である。しかしながらそれに反して、イオン強度が増大する場合、ポリＮＩＰＡＭの羊毛状コートは、妥当でない溶媒中に見出され、それ故結合し、タンパク質は互いにより近接する。それらは同じ負の電荷を有するため、静電気的斥力は、特定の量のタンパク質の脱着を導く。二つの反する影響の現象の存在は、最大値の存在を明らかにする。
【０１００】
２ − 脱着時間の影響：
図７は、脱着時間が増大する場合、脱着された量がわずかに増大することを示す。しかしながら、かなり短い脱着時間（２時間）が、実質的な理由のため選択された：かくして、得られたものより約１５％少ないものが脱着される。
【０１０１】
３ − 脱着についての結果：
かくして、脱着についての最適なパラメーターは、以下のものである：
ｐＨ＞８．６
Ｆｉ＝０．１ｍｏｌ／ｌ
Ｔ＝２０℃
ｔ＞２ｈ
【０１０２】
Ｅ／ 結果：ＨＳＡを含む溶液の濃度：
「Ｆａｌｃｏｎ」チューブ中で、最適な条件下で、１０ｍｌの全容量について脱着を実施する。このため、ｐＨ＝４．７及び０．０１ｍｏｌ／ｌのイオン強度の緩衝液中で、ラテックスと真に接触するタンパク質濃度が、希釈を考慮して０．１ｇ／ｌ^-1であるような濃度を有するＨＳＡ溶液の調製の後、２７ｍｇのラテックスを導入する。
【０１０３】
吸着された量は、約０．０９５ｍｇ．ｍｌ^-1である（即ち、初期に存在するタンパク質の９５％）。磁石を使用した分離の後、ｐＨ＝８．６、次いでｐＨ＝１０．８の１ｍｌの緩衝液を導入することによって、脱着を実施する。得られた溶液は、第一のケースで０．２３ｍｇ．ｍｌ^-1のＨＳＡ濃度を有し（吸着された量の２４％が脱着する）、第二のケースで０．３７ｍｇ／ｍｌ^-1を有する（３９％が脱着する）。かくしてこれらの条件の下で、初期濃度は３．７の最大値によって倍化されるであろう。
【０１０４】
ＩＶ − 尿への応用：
Ａ／ 一般的コメント：
全てのパラメーターが決定されている緩衝媒体中に、周知の濃度の単一のタンパク質を含む、極端に単純な媒体について予備実験を実施した。
【０１０５】
これに対して、尿は、異なる分子量の数十のタンパク質を含み、塩が豊富である非常に複雑な媒体を構成する。しかしながら、光学密度から尿のタンパク質濃度を確立するために、ＨＳＡについて確立された較正曲線を使用した；かくして得られた結果は、定量的である。さらに、尿のｐＨ及びタンパク質濃度は、患者及びその食事に依存する。かくして、使用される尿の各バッチについてこれらの値を測定することが必要である。
【０１０６】
Ｂ／ 陰性対照の尿についての結果：
実験の第一のシリーズを、予備試験の条件を使用して実施した。第二のシリーズにおいて、第一のシリーズの結果の関数として特定の工程を修飾した。
【０１０７】
１ − 方法：
１０ｍｌ「Ｆａｌｃｏｎ」チューブ中に、濃縮された尿と２７ｍｇのラテックスを導入した後、混合物を各種の時間４０℃で水浴中に配置する。次に上清を取り出し、ほぼ瞬間的に取り出したｐＨ＝４．７の１ｍｌの緩衝液で置換する：この方法の目的は、実際上脱着することなくラテックスを洗浄することである。
【０１０８】
ｐＨ＝１０．６及び０．０１Ｍのイオン強度の１ｍｌの緩衝液を加えた後、時間ｔ_Dの間２０℃で脱着させるため放置する。上清のBradfordアッセイにより、脱着されたタンパク質の全濃度を測定することが可能である。
【０１０９】
２ − タンパク質アッセイ（Bradfordによる）
研究される尿のｐＨは７近傍であり、初期タンパク質濃度（使用されるバッチについて）は、０．０２ｇ．ｌ^-1のオーダーである。上清の分析により、以下のことが示される：
１） 酸性の尿であることが必要である；７近傍の中性のｐＨでは、脱着は存在するタンパク質の５０％に到達せず、一方でｐＨ＝４．６に酸性化された尿では８０％に到達する；
２） 洗浄工程は、吸着されたタンパク質の約２０％の損失を生ずる；かくしてこの工程は、後の実験において排除された。
【０１１０】
吸着時間及び脱着時間の影響の研究は、ＨＳＡについての予備研究で得られた結果と異なり、吸着定常期に到達するために少なくとも６０分の吸着が必要であることを示す。１ｍｌの容量における６０分の脱着時間の後、得られた溶液を、開始時の尿よりタンパク質濃度において４倍濃縮する。ＨＳＡ単独の濃度アッセイと一致するため、この結果は非常に満足するものであるが、理論的には、１０ｍｌを１ｍｌに濃縮するため、１０倍の濃度で倍化することが望ましい。
【０１１１】
しかしながら、最終的な目的は、全てのタンパク質を濃縮することではなく、興味あるタンパク質を単離することである。それ故、各種のタンパク質を測定するために、電気泳動ゲルでかくして得られた各種のサンプルを分析する値が重要である。
【０１１２】
Ｖ − 結論：
予備的実験により、熱感受性磁性ラテックス粒子の使用は、各種の物理的パラメーター（ｐＨ、温度、イオン強度）を変化することによって、ヒトアルブミン（ＨＳＡ）を吸着し脱着することが可能であることを確認できた。かくして、約４倍に濃縮された１ｍｌの溶液を通過させるために、このタンパク質の希釈された１０ｍｌ溶液から開始することができる。
【０１１３】
パラメーターを最適化することによって、該タンパク質の９５％までを吸着することができる。より濃縮することができないという事実は、不完全な脱着のためである。脱着のこの度合を増大するために、吸着タンパク質と交換可能である界面活性剤を加えることが考慮できる。
【０１１４】
ＨＳＡに対する最適な濃度条件を尿へ応用することにより、同様な結果を得ることができる。適切な緩衝液への脱着により、４倍まで尿のバッチのタンパク質濃度を倍化することができる。かくして濃縮されたサンプルの凍結乾燥により、１００の倍化因子が得られ、それは硫酸アンモニア沈降で得られる濃縮の度合に近い。しかしながら、凍結乾燥の後得られた溶液は、塩水中にあまりに濃縮されている。かくしてもしほぼ０のイオン強度の媒体中で脱着することが決定されず、より少ない量のタンパク質のみが脱着される場合でさえ、０．１ｍｏｌ／ｌのイオン強度の緩衝液をより少ない塩濃度の媒体に変換する透析工程が必要であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｐＨ＝４．７及び０．０１ｍｏｌ／ｌのイオン強度について、二つの異なる温度での初期タンパク質濃度の関数として、吸着されたタンパク質の量の変化を示すグラフである。
【図２】 図２は、３０分後、実践的に最大の考え得る量が既に吸着されたことを示すグラフである。
【図３】 図３は、ｉ）ラテックスのｇ当たり５０ｍｇのタンパク質の吸着について定常期の存在（吸着部位の飽和）；
ｉｉ）ｐＨ＝４．７について最大の吸着
を示すグラフである。
【図４】 図４は、同じ初期タンパク質濃度について、イオン強度の関数として吸着された量を与える曲線を示す図である。
【図５】 図５は、０．１４ｍｇのＨＳＡ及び２．１％の固体含有量のラテックスについて、吸着される量の定常期が、０．１２５ｍｌのラテックス（即ち２．６ｍｇ）の容量について到達することを示すグラフである。
【図６】 図６は、脱着に関する緩衝液のイオン強度の影響を示すグラフである。
【図７】 図７は、脱着時間が増大する場合、脱着された量がわずかに増大することを示すグラフである。

Claims (21)

1. − 固体の有機または無機粒子より成り、その内部に磁性フィラーを含む内部複合コア、並びに
   − 少なくとも一つの生物学的分子と相互作用可能なポリマーに基づく官能化外部層
   を含む、０．０５から１０μｍの間の所定のサイズを有する熱感受性磁性粒子であり、該外部ポリマーは熱感受性であり、１０から１００℃の間の所定の下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有し、内部コアと外部層の間に中間層が存在し、上記官能化外部層に対して上記内部コアの磁性フィラーが隔離されていること、ならびに
   前記中間層が、
   − ポリマーを与えるために重合可能な少なくとも一つの官能性または非官能性モノマー、並びに
   − 少なくとも一つの架橋剤
   より成ることを特徴とする粒子（ただし、架橋剤が前記外部層に含まれる粒子を除く）。
2. 外部層が、２０から６０℃の間のＬＣＳＴを有することを特徴とする、請求項１記載の粒子。
3. 外部層が：
   − ポリマーを与えるために重合可能な少なくとも一つの官能性モノマー、並びに
   − 少なくとも一つの開始剤
   より成ることを特徴とする、請求項１または２記載の粒子。
4. 官能性モノマーが、2-アミノエチルメタクリラートクロリドのようなカチオン性モノマーより成ることを特徴とする、請求項２または３記載の粒子。
5. 官能性モノマーが、カルボン酸または硫酸モノマーのようなアニオン性モノマーより成ることを特徴とする、請求項２または３記載の粒子。
6. 該ポリマーが、親水性ポリマーより成ることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項記載の粒子。
7. 該親水性ポリマーがアクリルアミン誘導体であることを特徴とする、請求項６記載の粒子。
8. 該アクリルアミン誘導体が、N-イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）の重合によって得られるポリ（ＮＩＰＡＭ）より成ることを特徴とする、請求項７記載の粒子。
9. 架橋剤が、N,N'-メチレンビスアクリルアミドより成ることを特徴とする、請求項２記載の粒子。
10. 開始剤が、アゾビス(2-アミジノプロパン)クロリドのような少なくとも一つのカチオン性開始剤より成ることを特徴とする、請求項３記載の粒子。
11. 開始剤が、過硫酸カリウムのような少なくとも一つのアニオン性開始剤より成ることを特徴とする、請求項３記載の粒子。
12. 外部層が、プロトン化アミンまたはアミジン基で官能化されることを特徴とする、請求項１から３、および６から１０のいずれか一項記載の粒子。
13. 外部層が、カルボン酸または硫酸基で官能化されることを特徴とする、請求項１から３、５から９、および１１のいずれか一項記載の粒子。
14. − 固体の有機または無機粒子より成り、その内部に磁性フィラーを含む複合コア、及び内部複合コアの周りに中間層の構成するポリマーを得るために重合可能な官能性または非官能性モノマーを反応させること、並びに
    − 該ポリマーを架橋するために架橋剤を反応させること、並びに
    − 外部層を構成するポリマーを得るために重合可能な官能性モノマーと、重合化架橋中間層を反応させること
    より成ることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項記載の粒子を得るための方法。
15. カチオン性磁性粒子が、アゾビス(2-アミジノプロパン)クロリドの存在下で、アクリルアミド及び／またはアクリルアミド誘導体の水溶性モノマーの、重合によって調製されることを特徴とする、請求項１４記載の粒子を得るための方法。
16. 重合が、N,N'-メチレンビスアクリルアミド及び／または2-アミノエチルメタクリラートクロリドの存在下で実施されることを特徴とする
    、請求項１５記載の方法。
17. アニオン性磁性粒子が、過硫酸カリウムの存在下で、アクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体の水溶性モノマーの、重合によって調製されることを特徴とする、請求項１４記載の粒子を得るための方法。
18. 重合が、N,N'-メチレンビスアクリルアミド及び／または
    カルボン酸モノマーの存在下で実施されることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
19. 中間層が、ポリスチレン及び／またはメチルポリメタクリラートより選択される少なくとも一つの物質より成ることを特徴とする、請求項１４から１８のいずれか一項記載の方法。
20. 核酸またはいずれかのポリ電解質分子を固定化または抽出し、磁性分離の後、上記核酸または分子を放出及び／または分析するための、使用される温度がＬＣＳＴより常に低い、請求項１から４、６から１０、または１２のいずれか一項記載のカチオン性粒子の使用。
21. 温度がＬＣＳＴより高い場合に粒子に結合することによってタンパク質を抽出し、且つ磁性分離の後、温度がＬＣＳＴより低い場合に上記タンパク質を放出及び／または分析するための、請求項１から３、５から９、１１または１３のいずれか一項記載のアニオン性粒子の使用。

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