DE69925241T2

DE69925241T2 - Perfektionierte magnetische teilchen, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer anwendungen zum trennen von molekülen

Info

Publication number: DE69925241T2
Application number: DE69925241T
Authority: DE
Inventors: Abdelhamid Elaissari; Christian Pichot; Bernard Mandrand
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1998-01-06
Filing date: 1999-01-06
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2019-01-07
Also published as: WO1999035500A1; FR2773416B1; JP2002501175A; EP1046037A1; FR2773416A1; CA2316824A1; ATE295540T1; JP4443762B2; ES2242374T3; AU1973499A; EP1046037B1; US6521341B1; DE69925241D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft wärmeempfindliche magnetische Teilchen mit einer vorbestimmten Größe zwischen 0,05 und 10 μm, die zum einen einen inneren Verbundkern und zum anderen eine äußere Schicht auf Basis eines zur Wechselwirkung mit mindestens einem biologischen Molekül befähigten Polymers enthalten. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung und Anwendungen derartiger Teilchen.
Im folgenden ist der Begriff Verbund synonym mit einer einfachen magnetischen Verbindung, wie Ferrit, oder einer komplexen magnetischen Verbindung, wie in einer Polymermatrix verteiltem, eingearbeitetem oder umhülltem Ferrit.
Dieser innere Verbundkern kann einen Durchmesser zwischen 20 nm und 10 μm aufweisen.
Bei der biologischen Diagnose wird ausgehend von der Analyse biologischer Proben (Urin, Blut, Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Sediment, Speichel usw.) eine Erkrankung nachgewiesen. Im Rahmen der Forschung besteht insbesondere der Wunsch, zum Nachweis des Vorliegens eines bestimmten Proteins oder einer bestimmten DNA- oder RNA-Sequenz bei Kranken unter Bedingungen, die mit den Aktivitätstests für bestimmte Proteine oder Nucleinsäuren verträglich sind, extrahieren oder aufkonzentrieren zu können. Im Fall von Proteinen geht man hierzu gegenwärtig so vor, daß man in das Medium eine große Menge von Salzen einträgt, die zur Ausfällung von Proteinen führen, und dann die Proteine und die Salze mittels Zentrifugation trennt. Diese Methoden sind jedoch sehr arbeitsaufwendig, und außerdem sind die so extrahierten Proteine häufig denaturiert, d.h. sie haben ihre biologischen Eigenschaften verloren. Dies erklärt das Interesse, das in der Biomedizin seit einigen Jahren magnetischen Latices entgegengebracht wird.
Polymere Träger in Latexform finden nämlich umfangreiche Anwendung, da sie zahlreiche Vorteile aufweisen; insbesondere bieten sie eine große spezifische Oberfläche (mehrere Dutzend m²) pro Gramm Teilchen.
Der Stand der Technik kann durch die Druckschriften EP-A-0.106.873 und EP-A-0.446.260 definiert werden, in denen monodisperse superparamagnetische Teilchen mit einem porösen Kern auf Basis von Polystyrol/Divinylbenzol-Copolymer, in den Körner von magnetischem Eisenoxid eingearbeitet sind, und einer funktionalisierten äußeren Schicht, die zur Wechselwirkung mit Nucleinsäuresonden befähigt sind, beschrieben werden.
Gemäß dem dort beschriebenen Teilchenherstellungsverfahren werden die magnetischen Eisenoxide durch Fällung entsprechender Salze hergestellt, was den Anteil an eingearbeitetem magnetischem Füllstoff beschränkt und wobei man den magnetischen Füllstoff nur in einer Oberflächenmonoschicht, die die Aktivität der Biomoleküle inhibieren kann, erhält.
Ganz ähnlich werden in der EP-A-0.585.868 magnetische Teilchen beschrieben, die aus einem Kern auf Basis eines ersten Polymers und einer den Kern bedeckenden magnetischen Schicht aus einem zweiten Polymer, in dem das auf Ferrit basierende magnetische Material verteilt ist und das zur Wechselwirkung mit einem Antigen oder einem Antikörper befähigt ist, besteht, wobei das magnetische Material durch Fällung von Eisensalzen abgeschieden wird.
Da das eingearbeitete magnetische Material den nachfolgenden Behandlungen der Teilchen direkt ausgesetzt ist, ergibt sich im Lauf der Verwendung der Teilchen ein Füllstoffverlust, was zu Problemen, insbesondere der enzymatischen Inhibierung und Denaturierung von biologischen Spezies, führen kann.
Die WO-A-94/09368 betrifft die Verwendung von Gelatine anstelle des von uns empfohlenen Polymers auf Acrylaminderivat-Basis. Dort wird dennoch ein Vernetzer vorgeschlagen.
Trotzdem hat Gelatine ganz andere Funktionen als ein Polymer in der beanspruchten Form. So ist Gelatine überhaupt nicht wärmeempfindlich, und es wurde überhaupt nicht bewiesen, daß die Vernetzung von wärmeempfindlichen Acrylaminderivaten zur Einsperrung von magnetischen Einschlüssen, die im inneren Kern vorliegen, führt.
Gemäß dem Aufsatz von A. Kondo, (A. Kondo, H. Kamura und K. Higashitani (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol., 41, 99-105) ist ein Verfahren zur Herstellung von magnetischen Teilchen bekannt, die einen Kern auf Basis eines ersten Polymers, das aus einem Polystyrol besteht und in dem ein magnetisches Material verteilt ist, und eine den Kern bedeckende hydrophile Schicht auf Basis eines wärmeempfindlichen Polymers, das aus Poly(N-isopropylacrylamid) besteht, enthält. Das beschriebene Verfahren umfaßt die folgenden zwei Schritte. Gemäß einem ersten Schritt zur Herstellung des magnetischen Kerns bringt man das magnetische Material in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators mit Styrol in Berührung. Gemäß einem zweiten Schritt zur Herstellung der hydrophilen Schicht bringt man den erhaltenen Kern in Gegenwart des obigen Polymerisationsinitiators mit N-Isopropylacrylamid und Methacrylsäure in Berührung. Auf den so erhaltenen Teilchen wird Rinderserumalbumin fixiert, um danach in einer Probe vorliegende Rinderserumalbumin-Antikörper isolieren zu können.
In dieser Druckschrift werden magnetische Teilchen vorgeschlagen, die Einschlüsse von magnetischem Material im inneren Kern und/oder in der äußeren Schicht enthalten. Wenn die äußere Schicht Einschlüsse enthält, können diese natürlich in das Reaktionsmedium abgegeben werden und möglichen Anwendungen in der Biologie und/oder Diagnostik, die spezifische Reaktionen erfordern, abträglich sein. Darüber hinaus wird kein Vernetzer verwendet und daher auch keine Zwischenschicht gebildet. Werden derartige Teilchen mit einem Lösungsmittel zusammengegeben, so werden die Einschlüsse im Reaktionsmedium freigesetzt, selbst wenn diese Einschlüsse nur im inneren Kern vorliegen. Des weiteren sind die Teilchen nur für Proteine effektiv. Die Abtrennung von Nucleinsäuren ist nicht denkbar.
Daher haben die Anmelder zur Gewährleistung einer möglichst effizienten Abtrennung dieser Teilchen in der Probe auf eine thermische Ausflockung zurückgegriffen, gemäß der die Temperatur der Probe erhöht wird, was die Wirkung eines Magnetfelds ergänzt. Es handelt sich um die WO-A-97/45202, in der Teilchen vorgeschlagen werden, die superparamagnetisch sind und einen sehr homogen verteilen magnetischen Füllstoff aufweisen, dessen Anteil zwischen 1 und 80 Gew.-% und inbesondere 25 und 80 Gew.-%, bezogen auf das Polymer bzw. die Polymere, aus dem bzw. denen die Teilchen bestehen, variieren kann. Gemäß dieser Druckschrift kann man hohe Anteile an eingearbeitetem magnetischem Füllstoff erzielen, insbesondere da das angewandte Verfahren die Verteilung des magnetischen Füllstoffs auf mehreren Ebenen ermöglicht. Daraus ergibt sich ein erheblicher Vorteil, nämlich die Möglichkeit der effizienten Abtrennung der erfindungsgemäßen Teilchen aus der Probe, ohne auf die Kombinationswirkung einer anderen Trenntechnik, wie Ausflockung, zurückgreifen zu müssen.
Diese Erfindung hat eine andere Aufgabe als die vorliegende Erfindung. Darüber hinaus gibt es eine magnetische Zwischenschicht, die einen nicht magnetischen inneren Kern bedeckt. Außerdem ist das Fehlen einer nicht magnetischen Zwischenschicht hervorzuheben. Diese Konfiguration verhindert die Freigabe von magnetischen Einschlüssen aus der Zwischenschicht in das Reaktionsmedium nicht.
Diese Teilchen erfüllen zwar die meisten Erwartungen der Biologen, sind aber mit einer bestimmten Zahl von Nachteilen behaftet. So ist es mit diesen Teilchen nicht möglich, erstens Proteine von Nucleinsäuren abzutrennen, was je nach den durchgeführten Arbeiten (Identifizierung von Antikörpern, Amplifikation von Sequenzen usw.) besonders lohnend wäre, und zweitens Nucleinsäuren abzutrennen. So inhibieren die erfindungsgemäßen Teilchen im Fall der Abtrennung von Nucleinsäuren die verschiedenen anwendbaren Amplifikationstechniken (PCR, NASBR, TMA) nicht. Schließlich ist es nicht unbedingt notwendig, die extrahierten Substanzen (Proteine oder Nucleinsäuren) aus den Teilchen freizugeben, wobei die Identifikations- oder Amplifikationstests direkt nach der magnetischen Abtrennung durchgeführt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher wärmeempfindliche magnetische Teilchen mit einer vorbestimmten Größe zwischen 0,05 und 10 μm, enthaltend:

– einen inneren Verbundkern, der aus einem festen organischen oder anorganischen Teilchen besteht, das in seinem Inneren eine magnetische Ladung enthält, und
– eine äußere Schicht auf Basis eines zur Wechselwirkung mit mindestens einem biologischen Molekül befähigten Polymers, wobei das äußere Polymer wärmeempfindlich ist und eine vorbestimmte untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST) zwischen 10 und 100°C und vorzugsweise zwischen 20 und 60°C aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen dem inneren Kern und der äußeren Schicht eine Zwischenschicht befindet, die die magnetische Ladung des inneren Kerns gegenüber der funktionalisierten äußeren Schicht isoliert.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die äußere Schicht durch Polymerisation von mindestens

– einem zu einem Polymer polymerisierbaren funktionellen oder nichtfunktionellen Monomer und
– einem Vernetzer hergestellt.

Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die äußere Schicht durch Polymerisation von mindestens

– einem zu einem Polymer polymerisierbaren funktionellen Monomer und
– einem Inititator

Nach einer Ausführungsvariante besteht das funktionelle Monomer aus einem kationischen Monomer, wie 2-Aminomethylmethacrylatchlorid.
Nach einer anderen Ausführungsvariante besteht das funktionelle Monomer aus einem anionischen Monomer, wie einem Carboxyl- oder Sulfatmonomer.
Unabhängig von der Ausführungsform oder Ausführungsvariante besteht das Polymer aus hydrophilen Polymeren, insbesondere Acrylaminderivaten und vorzugsweise durch Polymerisation von N-Isopropylacrylamid (NIPAM) erhaltenem Poly(NIPAM).
Nach der ersten bevorzugten Ausführungsform besteht der Vernetzer aus N,N'-Methylenbisacrylamid.
Nach der zweiten bevorzugten Ausführungsform besteht der Initiator aus mindestens einem kationischen Initiator, wie Azobis(2-amidinopropan)chlorid.
Immer noch gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform besteht der Initiator aus mindestens einem anionischen Initiator, wie Kaliumpersulfat.
Bei allen oben dargelegten Ausführungsformen kann die äußere Schicht mit einer protonierten Amin- oder Amidingruppe funktionalisiert sein.
Bei allen oben dargelegten Ausführungsformen kann die äußere Schicht mit einer Carbonsäure- oder Sulfatgruppe funktionalisiert sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Teilchen gemäß obiger Definition, dadurch gekennzeichnet, daß man:

– einen Verbundkern, der aus einem festen organischen oder anorganischen Teilchen besteht, das in seinem Inneren eine magnetische Ladung enthält,
– ein zu einem Polymer polymerisierbares funktionelles oder nichtfunktionelles Monomer und
– einen Vernetzer zusammengibt und zur Reaktion bringt, bis der den inneren Kern bildende Verbundkern, durch eine Mischung von Polymer und Vernetzer verkapselt und isoliert ist und sich eine äußere Schicht auf Basis des zur Wechselwirkung mit mindestens einem biologischen Molekül befähigten Polymers bildet.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden durch Verkapselung durch Polymerisation von wasserlöslichen Acrylamid- und/oder Acrylamidderivat-Monomeren in Gegenwart von Azobis(2-amidinopropan)chlorid auf Verbundkernen kationische magnetische Teilchen hergestellt.
Vorteilhafterweise führt man die Polymerisation in Gegenwart von N,N'-Methylenbisacrylamid und/oder 2-Aminomethylmethacrylatchlorid durch.
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden durch Verkapselung durch Polymerisation von wasserlöslichen Acrylamid- und/oder Acrylamidderivat- Monomeren in Gegenwart von Kaliumpersulfat anionische magnetische Teilchen herstellt.
Vorteilhafterweise führt man die Polymerisation in Gegenwart von N,N'-Methylenbisacrylamid und/oder Carbonxylmonomeren durch.
Unabhängig vom angewandten Verfahren werden die durch Adsorption oder Polymerisation erhaltenen magnetischen Teilchen vor der Polymerisation mit mindestens einer Substanz, die die magnetische Ladung isoliert, wie Polystyrol und/oder Polymethylmethacrylat, beschichtet.
Vorzugsweise geht man bei dem Verfahren so vor, daß man die Reagenzien in einem Anteil von:

– 10 bis 30% wasserlöslichem Acrylamid- oder Acrylamidderivat-Monomer,
– höchstens 10% mindestens eines Vernetzers und
– 1 bis 5% mindestens eines Stabilisators, bezogen auf die Gesamtmasse des nach dem Verfahren erhaltenen Teilchens, verwendet.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von kationischen Teilchen gemäß obiger Beschreibung zur Immobilisierung oder Extraktion von Nucleinsäuren oder beliebigen Polyelektrolyten und zur Freigabe und/oder Analyse der Nucleinsäuren oder Polyelektrolyte nach magnetischer Abtrennung, wobei die Verwendungstemperatur ständig unter der LCST liegt.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung von anionischen Teilchen gemäß obiger Beschreibung zur Extraktion von Proteinen durch Fixierung an den Teilchen bei einer über der LCST liegenden Temperatur und zur Freigabe und/oder Analyse dieser Proteine nach magnetischer Abtrennung bei einer unter der LCST liegenden Temperatur.
I - Verkapselung von handelsüblichen magnetischen Teilchen oder Verbundkernen
Zahlreiche magnetische Teilchen sind im Handel erhältlich. Die Oberfläche dieser Teilchen ist anionisch oder kationisch. Dagegen wird ihre Zusammensetzung niemals genau angegeben. Diese Teilchen besitzen einen variablen Polymolekularitätsindex. So sind Seradyn-, Spherotec- und Dynal-Teilchen monodispers, wohingegen Teilchen von Estapor trotz eines mittleren Durchmessers von 1 mm sehr polydispers sind.
Alle diese Teilchen wurden bei Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren geprüft und ergeben Inhibierungsreaktionen. Daher muß ihre Oberfläche modifiziert werden, um mit Nucleinsäuren arbeiten zu können.
A. Herstellung von kationischem hydrophilem magnetischem Latex
Die Verkapselungsreaktionen werden unter Stickstoffatmosphäre bei 70°C durchgeführt.
1 g Saatteilchen wurde mit 40 ml MilliQ-Wasser, das zuvor zum Sieden erhitzt und unter Stickstoff entgast worden war, verdünnt.
Bei hydrophoben Saatteilchen wurde das Styrol einfach zugegeben. Es wurde vor Beginn der Synthese für sich alleine zugegeben und eine bestimmte Zeit, beispielsweise zwischen 30 und 60 Minuten, in Kontakt mit dem magnetischen Verbundkern stehen gelassen.
Die Monomere wurden in den folgenden Anteilen eingetragen:

– NIPAM: 0,3254 g, d.h. 32,5%/Saat (80%/Polymer, wenn die Saat 60% Ferrit enthält),
– MAB: 0,0274 g, d.h. 6,18 mol%/NIPAM,
– AEM: 0,0740 g, d.h. 15,5 mol%/NIPAM, und
– V50: 0,0061 g, d.h. 0,80 mol%/NIPAM.

Die Zugabe eines Tensids, beispielsweise 0,14 g Triton X405, ist notwendig.
Der Initiator wird mit 1 ml Wasser eingetragen. Danach werden die Monomere zugegeben. Sie werden in 9 ml Wasser verdünnt und nach und nach, d.h. über einen Zeitraum von 15 Minuten, oder in einem Guß nach der Zugabe des Initiators in den Reaktor eingetragen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Estapor-Verbundkerne verkapselt. Es wurden anionische Teilchen (EM1 100/20 und EM1 100/30) und kationische Teilchen (R95-07) verwendet.
Mit den aus den EM1-100/20- und EM1-100/30-Latices hergestellten Teilchen war je nach verwendetem Polymerisationsmodus (geschlossener Reaktor, verzögerte oder kontinuierliche Zugabe) eine Füllstoffdichte zwischen 50 und 300 Millimol NH₂ (mmol NH₂) pro Gramm Latex erhältlich.
Mit den aus dem R95-07-Latex hergestellten Teilchen war je nach Polymerisationsmodus eine Füllstoffdichte zwischen 50 und 300 mmol NH₂ pro Gramm Latex erhältlich.
Gemäß der Vorschrift für die Zugabe der Monomere zum Reaktionssystem sind mehrere Polymerisationsmethoden zu unterscheiden.
1. Diskontinuierliche Polymerisation im geschlossenen Reaktor
Die Monomere werden vor Beginn der Reaktion mit den anderen Bestandteilen und ohne spätere Zugabe in den Reaktor eingetragen.
Infolge des Reaktivitätsunterschieds der Monomere kommt es bei diesem Verfahren häufig zum Auftreten einer Verschiebung der Zusammensetzung. Diese manifestiert sich durch den Erhalt von Makromolekülen mit Zusammensetzungen, die sich in Abhängigkeit vom Umsatz erheblich unterscheiden. Dieses Verfahren erweist sich als wenig effizient für die Oberflächeneinarbeitung, da die Gefahr besteht, daß ein großer Teil des funktionellen Monomeres entweder im Inneren der Teilchen oder in Form von wasserlöslichem Polymer verloren geht. Bei der diskontinuierlichen Copolymerisation mit polaren Monomeren erhält man kleinere Moleküle in großer Zahl, aber mit begrenztem Umsatz. Dieses Verhalten hängt mit der hohen Wasserlöslichkeit dieser Monomere zusammen und wird dem Vorherrschen eines homogenen Nukleierungsmechanismus zugeschrieben.
2. Halbkontinuierliche Polymerisation
Mindestens ein Teil der Monomere wird über einen Zeitraum zwischen dem Beginn und dem Ende der Reaktion eingetragen. Diese Zugabe kann mit einer festgelegten Geschwindigkeit oder gemäß einem gegebenen Profil erfolgen. Dadurch soll die Zugabe der Monomerenmischung so gesteuert werden, daß man ein Copolymer mit kontrollierter Zusammensetzung erhält; auf diese Weise erhält man häufig solche Zugabebedingungen, daß die Polymerisationsgeschwindigkeit größer ist als die Zugabegeschwindigkeit. Dadurch sind Copolymere mit homogener Zusammensetzung erhältlich.
3. „Shot"-Polymerisation durch verzögerte Zugabe
Bei einer Copolymerisation und wenn die Reaktion einmal im Gange ist, wird das funktionelle Monomer für sich alleine oder in Gegenwart des Grundmonomers in das System eindosiert. Der Erfolg der Arbeitsweise hängt daher davon ab, wieviel man vorher über die Copolymerisationskinetik weiß. Es handelt sich hierbei um ein effizientes Verfahren zur Begünstigung der oberflächlichen Einarbeitung. Durch die Wahl der Versuchsbedingungen (Umsatzgrad zum Zeitpunkt der Zugabe, Zusammensetzung und Konzentration der Monomerenmischung) können die Oberflächenausbeuten optimiert werden.
4. Saatpolymerisation
Hierbei trägt man das funktionelle Monomer in das einen bereits hergestellten und vollständig charakterisierten Latex enthaltende System ein. Das funktionelle Monomer kann rein oder im Gemisch mit dem Grundmonomer der Saat in einem Schritt oder halbkontinuierlich zugegeben werden.
Unter den verschiedenen obigen Polymerisationstechniken wurden nur die Polymerisation im geschlossenen Reaktor und die Saatpolymerisation verwendet.
B. Herstellung von anionischem hydrophilem Latex
Die verwendeten Latices bestehen aus einem Kern aus Polystyrol und Ferrit, welcher ihnen magnetische Eigenschaften verleiht. Sie werden außerdem durch Polymerisation von N-Isopropylacrylamid (NIPAM) beschichtet. Es wird N,N'-Methylenbisacrylamid (MBA) als Vernetzer zugegeben. Als Initiator dient Kaliumpersulfat (K₂S₂O₈), was das Vorliegen von Sulfatgruppen an der Oberfläche des Latex und damit dessen anionischen Charakter erklärt.
II. Abtrennung von Nucleinsäuren
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Diagnosetestmodells, mit dem schon sehr früh das Vorliegen von infektiösen Genen in einem Individuum nachgewiesen kann. Es handelt sich dabei um die Erstellung einer Vorschrift, nach der man DNA oder RNA derart spezifisch extrahieren kann, daß man sie quantitativ bestimmen kann, wobei gleichzeitig vorher die in großer Menge im Probemedium vorliegenden Proteine entfernt worden sind. Der gewählte Träger darf in einem ersten Schritt keine Reaktion hervorrufen, die die DNA- und RNA-Amplifikation vom PCR-, NASBA- oder TMA-Typ inhibiert. Wenn dieser Schritt positiv ist, muß der Träger zur spezifischen Isolierung von Nucleinsäuren in ausreichender Menge in der Lage sein.
Daher muß der Träger hydrophil sein und darf keine Amplifikationsreaktion inhibierenden Substanzen freigeben.
Diese Studie beststeht aus der Herstellung von kationischen magnetischen Latices, die von aus N-Isopropylacrylamid (NIPAM) bestehenden und mit 2-Aminoethylmethacrylat (AEM) funktionalisierten Haaren bedeckt ist.
Die Oberfläche der handelsüblichen Teilchen oder Verbundkerne wurde modifiziert, und die Kerne oder Teilchen wurden verkapselt. Die bedeutendsten verfügbaren Teilchen sind Teilchen von Dynal, Seradyn, BioMag, Spherotec oder Estapor (eingetragenes Warenzeichen).
Die eigene, am 9. April 1996 eingereichte Patentanmeldung FR 96/04691, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, betrifft eine derartige Abtrennung von Nucleinsäuren.
III. Abtrennung von Proteinen
Der Vorteil der Latices besteht darin, daß sie nicht nur wärmeempfindlich, sondern auch magnetisch sind, so daß man auf Zentifugationsschritte verzichten kann. Die magnetischen Teilchen können mit einem einfachen Labormagneten vom Rest des Mediums abgetrennt werden.
Vorteilhaft ist daher bei dieser Technik, daß sie schneller und im Hinblick auf eine eventuelle technische Anwendung leichter automatisierbar ist.
Erstens ist es notwendig, die physikochemischen Bedingungen, unter denen das Modellprotein Humanalbumin (HSA: Humanserumalbumin) enthaltende Lösungen aufkonzentriert werden können, zu optimieren. Zweitens sind die Bedingungen zu ermitteln, unter denen alle in Urin vorliegenden Proteine auf konzentriert werden können.
Die Tests der aus HSA alleine hergestellten Lösungen wurden mit einem EM1-070/60-Kern durchgeführt, die Anwendungen auf Urin dagegen mit einem EM1-100/20-Kern.
Nach Waschen der Verbundkerne mit 1 Stunde unter Stickstoff gekochtem und entgastem MilliQ-Wasser wird 1 g Estapor-Latex in Lösung in 40 cm³ Wasser in den Reaktor eingetragen, welcher über den gesamten Versuch hinweg bei 70°C und unter Stickstoffstrom gehalten wird. Nach Zugabe von 200 ml Styrol wird 2 Stunden quellen gelassen.
0,0061 g KPS werden in 1 ml Wasser gelöst. Danach wird jede Minute 1 ml einer Lösung von 0, 325 g NIPAM, 0, 027 g MBA und 0,14 g Triton (X-405) in 9 ml Wasser zugegeben; diese Mischung wird mindestens 10 Stunden rühren gelassen.
Danach wird der Latex gewaschen.
Dieser Arbeitsgang dient zur Entfernung des Tensids sowie der Elektrolyte und der in Lösung vorliegenden freien Polymerketten. Das Tensid kann nämlich das Bradford-Reagenz (chemische Methode zur quantitativen Bestimmung von Proteinen) stören und das Adsorptionsvermögen der Latices verringern.
Da der verwendete Latex magnetisch ist, kann man unter Verwendung eines Magneten den Überstand leicht entfernen und durch frisch ausgetauschtes MilliQ-Wasser ersetzen und dann unter Verwendung eines Vortex kräftig rühren. Dieses Waschen wird wiederholt, bis der Überstand klar ist (man kann auch verifizieren, daß die Leitfähigkeit des Latex nach dem letzten Waschen praktisch so niedrig ist wie die Leitfähigkeit von MilliQ-Wasser (≈ 0,02 mS)).
A. Humanserumalbumin (HSR)
HSA ist ein Modellprotein für die Untersuchung verschiedener Parameter, wie des pH-Werts oder der Ionenstärke, mit denen eine maximale Aufkonzentrierung des Proteins möglich ist.
Es handelt sich dabei um ein ellipsoides Protein mit den ungefähren Abmessungen 4 × 4 × 14 nm und einem Molekulargewicht in der Nähe von 62.000 g/mol.
Sein Zeta-Potential (physikochemisches Maß für die Ladungsdichte an der Teilchenoberfläche) variiert mit dem pH-Wert: das HSA-Protein ist kationisch für pH < PI (isoelektrischer Punkt: pH-Wert, bei dem die Nettoladung gleich Null ist; PI = 4,8 für HSA) und anionisch für pH > PI.
B. Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration
Dia quantitative Bestimmung von Proteinen, beispielsweise HSA, wird unter Verwendung von Bradford-Reagenz durchgeführt. Möglich ist diese quantitative Bestimmung dank der Verwendung von Coomassie-Blau (G 250), das mit den Proteinen einen Komplex bildet (der anfangs braun ist und sich dann blau färbt, das mit zunehmender Proeteinkonzentration immer intensiver wird). Der Protein-Farbstoff-Komplex hat einen sehr großen Extinktionskoeffizienten, so daß die Methode sehr empfindlich ist. Darüber hinaus tritt die Färbung praktisch sofort auf, was eine schnelle quantitative Bestimmung ermöglicht.
Alle quantitativen Bestimmungen nach Bradford werden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt:
15 μl der Lösung, deren Proteinkonzentration bestimmt werden soll
+ 135 μl geeigneter Puffer (gewünschter pH-Wert und gewünschte Ionenstärke)
+ 150 μl Coomassie-Reagenz.
1. Bestimmung der adsorbierten Menge
Die Menge der adsorbierten Proteine Ns ist durch die folgende Formel gegeben: Ns (mg·g–1) = V (Ci–Cf)/mmit.

C_i: (mg/ml) = Anfangskonzentration an Proteinen in der Lösung in Kontakt mit dem Latex;
C_f: = HSA-Endkonzentration im Überstand nach Adsorption;
V: (ml) = Gesamtvolumen der Lösung;
m: (g) = Latexmasse in in der Lösung.

2. Bestimmung der desorbierten Menge
Wenn die Proteine anfangs an einer Latexmasse m (in g) adsorbiert wurden und man nach Desorption in einem Volumen V (ml) durch quantitative Bestimmung nach Bradford eine Proteinkonzentration C (mg·ml^–1) ermittelt, ist die desorbierte Menge durch die folgende Formel gegeben: Ns (mg·g–1) = V·C/m
C. Parameteroptimierung
1. Adsorption von HSA-Protein
In diesem Teil werden die pH-Werte, die Ionenstärke und die Temperatur für die Adsorption des Maximums an Proteinen an den Latexteilchen bestimmt.
a. Vorgehensweise
Die Versuche werden in Eppendorf-Röhrchen (Maximalinhalt: 1,5 ml) durchgeführt.

Latexvolumen: 100 μl (d.h. 2,1 mg)

Volumen der HSA-Lösung: 200 μl (variable Masse)

Puffervolumen: 700 μl
Da 0,2 ml HSA-Lösung mit einer gegebenen Konzentration für ein Gesamtvolumen von 1 ml eingetragen werden, ergibt sich die wirkliche Konzentration der HSA-Lösung in Kontakt mit dem Latex nach Korrektur um einen Verdünnungsfaktor von 0,2.
b. Einfluß der Temperatur
Der Einfluß der Temperatur auf die Adsorption ist unabhängig vom pH-Wert beträchtlich. 1 zeigt die Änderung der Menge an absorbierten Proteinen als Funktion der Proteinanfangskonzentration bei zwei verschiedenen Temperaturen für pH 4,7 und eine Ionenstärke von 0,01 mol/l.
Die gleiche Tendenz findet man bei pH 5,7 (bei 20°C ist die Adsorption 30% geringer als bei 40°C) und bei pH 8,6.
Da mit der Temperatur nur die Hydrophilie/Hydrophobie des Latex variiert, kann man mit dieser Studie den Einfluß von hydrophoben Wechselwirkungen auf die Adsorption belegen.
Die Tatsache, daß die Kurven in den ersten Punkten miteinander verschmelzen, kann auf die Vorgehensweise zurückzuführen sein. Zur Prüfung der Adsorption bei 40°C wurden Latex, Proteine und Puffer bei Umgebungstemperatur vermischt und dann auf 40°C erhitzt. Es kann daher sein, daß für geringe HSA-Konzentrationen die Adsorption der Proteine an den Latex in hydratisierter Form erfolgt, da T < 32°C, obwohl an eine Adsorption bei 40°C gedacht war.
c. Einfluß der Adsorptionszeit
Unter den für die Adsorption als optimal erachteten Bedingungen wird eine kinetische Studie der adsorbierten Menge als Funktion der Inkubationszeit durchgeführt. Wie 2 zeigt, ist bereits nach 30 Minuten praktisch die maximal mögliche Menge adsorbiert.
d. Einfluß des pH-Werts
Die Adsorption wurde für die pH-Werte 4,7, 5,7 und 8,6 für HSA-Konzentrationen zwischen 0 und 0,2 g·l^–1 durchgeführt. Für die Adsorption bei pH 8,6 kann die Kurve für (HSA) > 0,06 g·l^–1 nicht gezeichnet werden, da infolge der sehr kleinen adsorbierten Menge (Ci – C_f) praktisch gleich Null ist und die Meßmethode nicht genau genug ist, um diese kleinen Variationen nachzuweisen.
Durch Überlagerung der drei erhaltenen Kurven erhält man das Diagramm gemäß 3, das folgendes belegt:

i) das Vorliegen eines Adsorptionsplateaus von 50 mg Proteinen pro g Latex (Sättigung der Adsorptionsstellen);
ii) eine maximale Adsorption bei pH 4,7.

Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem Einfluß elektrostatischer Wechselwirkungen: Für pH < PI ist das Protein kationisch und der Latex anionisch, so daß sich eine elektrostatische Anziehung und eine begünstigte Adsorption ergibt, wohingegen für pH > PI das Protein und der Latex anionisch sind, so daß sich eine elektrostatische Abstoßung ergibt, die die adsorbierte HSA-Menge verringert. Diese Studie belegt den Einfluß elektrostatischer Wechselwirkungen auf die Adsorption.
e. Einfluß der Ionenstärke
Die Kurven, die die adsorbierte Menge als Funktion der Ionenstärke für eine gleiche Proteinanfangskonzentration angeben, sind in 4 wiedergegeben.

i) pH = 4, 7 und (HSA) = 0, 14 mg·ml^–1 und T = 40°C

Diese Kurve zeigt, daß die Adsorption für eine kleine Ionenstärke maximal ist; dies steht im Einklang mit attraktiven elektrostatischen Wechselwirkungen, die die Adsorption um so mehr begünstigen, je weniger sie mit abnehmendem Salzgehalt abgeschirmt werden.

ii) pH = 8, 6 und (HSA) = 0, 04 mg·ml^–1 und T = 40°C

Diese Kurve zeigt, daß die Adsorption für eine große Ionenstärke maximal ist; bei basischem pH-Wert sind die elektrostatischen Wechselwirkungen repulsiv, so daß die Adsorption um so größer ist, je mehr diese Wechselwirkungen abgeschirmt werden.
f. Einfluß der Latexinenge
Wie 5 zeigt, erreicht man für 0,14 mg HSA und einen Latex mit 2,1% Feststoffgehalt ein Plateau für die adsorbierte Menge für ein Volumen von 0,125 ml Latex (d.h. 2,6 mg). Dieses Plateau entspricht ungefähr 50 mg Proteinen pro Gramm Latex, d.h. unter der Annahme, daß die Latexteilchen einen Durchmesser in der Nähe von 1 mm und eine Dichte von 1,85 g/cm³ (Σ = 3,24 m²/g) aufweisen, 15 mg HAS pro m² Polymer. Dieses Ergebnis liegt im erwarteten Bereich.
Dieses Verhältnis (ungefähr 2 mg Latex für 0,1 mg Proteine) wird daher im folgenden verwendet.
g. Bilanz für die Adsorption
Die optimierten Parameter für die Adsorption sind daher:
pH = 4,7
Fi = 0,01 mol/l
T = 40°C
t = 10 min
D. Desorption des HSA-Proteins
Die Adsorption wird unter den oben bestimmten optimalen Bedingungen durchgeführt, wonach die die Desorption steuernden Parameter untersucht werden.
Die ersten Desorptionstests wurden in Eppendorf-Röhrchen durchgeführt. Zunächst wird die Adsorption unter den oben definierten Bedingungen durchgeführt (wobei man verifiziert, daß praktisch alle im Medium vorliegenden Proteine adsorbiert werden). Dann wird der Überstand abgezogen und durch 1 ml der Lösung, die auf das Vermögen zur Begünstigung der Desorption hin untersucht werden soll, ersetzt.
Nach einer variablen Desorptionszeit kann man aus der Messung der optischen Dichte dieses neuen Überstands die Menge an desorbiertem HSA und damit den Einfluß der Adsorptionszeit ableiten.
Die Desorption verläuft besser bei basischem pH-Wert als bei saurem pH-Wert und besser bei 20°C als bei 40°C, was gemäß dem Einfluß des pH-Werts und der Temperatur vorhersehbar war. Außerdem wurde eine kurze Adsorptionszeit (≈ 10 min) gewählt, da dieser Zeitraum zur praktisch vollständigen Adsorption der Proteine ausreicht und die Desorption weniger stark ist, je mehr Proteine in Kontakt mit dem Latex bleiben.
Der Einfluß anderer Parameter war weniger offensichtlich, und die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.
1. Einfluß der Ionenstärke
6 zeigt den Einfluß der Ionenstärke des Puffers auf die Desorption.
Diese Kurve zeigt das Vorliegen eines Desorptionsmaximums für eine Ionenstärke in der Nähe von 0,1 mol·1^–1. Dieses Ergebnis ist ziemlich überraschend. Bei basischem pH-Wert sind der Latex und HSA anionisch und die elektrostatischen Kräfte daher repulsiv. Zur Verstärkung der Desorption sollten sie nicht abgeschirmt werden; a priori ist eine kleine Ionenstärke erforderlich. Andererseits finden sich bei zunehmender Ionenstärke die PolyNIPAM-Haare in einem schlechten Lösungsmittel wieder und ziehen sich daher zusammen, so daß die Proteine sich einander annähern. Da sie die gleiche negative Ladung tragen, führt die elektrostatische Abstoßung zur Desorption einer bestimmten Proteinmenge. Das Vorliegen dieser beiden Phänomene mit entgegengesetztem Einfluß rechtfertigt das Vorliegen eines Maximums.
2. Einfluß der Desorptionszeit
Wie 7 zeigt, nimmt die desorbierte Menge mit zunehmender Desorptionszeit geringfügig zu. Aus praktischen Gründen wurde jedoch eine ziemlich kurze Desorptionszeit (2 h) gewählt, so daß ungefähr 15% weniger als der erzielbare Wert desorbiert werden.
3. Bilanz für die Desorption
Die optimierten Parameter für die Desorption lauten daher:
pH > 8,6
Fi = 0,1 mol/l
T = 20°C
t > 2h
E. Bilanz: Konzentration von HSA enthaltenden Lösungen
Die Adsorption wurde für ein Gesamtvolumen von 10 ml unter den optimalen Bedingungen in „Falcon"-Röhrchen durchgeführt. Hierzu wurden nach Herstellung einer HSA-Lösung in einem Puffer mit einem pH-Wert von 4,7, einer Ionenstärke von 0,01 mol/L und einer solchen Konzentration, daß die Konzentration an wirklich mit dem Latex in Kontakt stehenden Proteinen unter Berücksichtigung der Verdünnung 0, 1 g·l^–1 beträgt, 27 mg Latex eingetragen.
Die adsorbierte Menge beträgt ungefähr 0,095 mg·ml^–1 (d.h. 95% der anfänglich vorhandenen Proteine). Nach Trennung unter Verwendung eines Magneten wird dann durch Eintragen von 1 ml Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 und dann 10,8 die Desorption durchgeführt. Im ersten Fall hat die erhaltene Lösung eine HSR-Konzentration von 0,23 mg·ml^–1 (24% der adsorbierten Menge werden desorbiert) und im zweiten Fall von 0, 37 mg·ml^–1 (39% werden desorbiert). Die Anfangskonzentration kann daher unter diesen Bedingungen mit maximal 3,7 multipliziert werden.
IV. ANWENDUNG AUF URIN
A. Allgemeine Bemerkung
Die Vorstudien wurden an einem extrem einfachen Medium durchgeführt: einem einzigen Protein bekannter Konzentration in einem gepufferten Medium, dessen Parameter alle bestimmt worden waren.
Urin stellt dagegen ein sehr komplexes Medium dar, das mehrere Dutzend Proteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht enthält und reich an Salzen ist. Zur Ermittlung der Proteinkonzentration in Urin aus der optischen Dichte wurden hier jedoch die für HSA erstellten Kalibrierkurven verwendet; die erhaltenen Ergebnisse sind somit nur qualitativ. Darüber hinaus hänge der pH-Wert und die Proteinkonzentration des Urins von den Personen und ihrer Ernährung ab. Daher müssen diese Werte für jede verwendete Urincharge bestimmt werden.
B. Ergebnisse für Negativkontrollen-Urin
Die erste Versuchsreihe wurde unter den Bedingungen der Vortests durchgeführt. Bei der zweiten Reihe wurden je nach den Ergebnissen der ersten Reihe bestimmte Schritte abgeändert.
1. Vorgehensweise
Nach Eintragen von 10 ml aufzukonzentrierendem Urin und 27 mg Latex in „Falcon"-Röhrchen wird die Mischung über verschiedene Zeiträume in ein 40°C warmes Wasserbad gestellt. Danach wird der Überstand abgezogen und durch 1 mL Puffer mit pH 4,7 ersetzt, der fast sofort abgezogen wird: Dieser Arbeitsgang dient zum Waschen des Latex, im Prinzip ohne Desorption.
Nach Zugabe von 1 mL Puffer mit einem pH-Wert von 10, 6 und einer Ionenstärke von 0,01 M wird über einen Zeitraum t_D bei 20°C desorbieren gelassen. Durch quantitative Analyse des Überstands nach Bradford kann die Gesamtkonzentration an desorbierten Proteinen bestimmt werden.
2. Quantitative Proteinbestimmung (nach Bradford)
Der pH-Wert des untersuchten Urins liegt in der Nähe von 7, und die Proteinanfangskonzentration (für die verwendete Charge) in der Größenordnung von 0,02 g·l^–1. Die Analyse des Überstands zeigt, daß:

1) der Urin angesäuert werden muß; bei dem natürlichen pH-Wert in der Nähe von 7 erreicht die Adsorption keine 50% der vorliegenden Proteine, in dem auf pH 4,6 angesäuerten Urin geht sie dagegen gegen 80%;
2) der Waschschritt führt zum Verlust von ungefähr 20% der adsorbierten Proteine; daher wird in den folgenden Versuchen auf diesen Schritt verzichtet.

Aus der Studie des Einflusses der Adsorptions- und Desorptionszeit geht hervor, daß im Gegensatz zu den beim Vorversuch an HSA erhaltenen Ergebnissen eine Adosprtionszeit von mindestens 60 min erforderlich ist, um das Adsorptionsplateau zu erreichen. Nach einer Desorptionszeit von 60 min in einem Volumen von 1 ml weist die erhaltene Lösung eine 4 mal so hohe Proteinkonzentration auf wie der Ausgangsurin. Dieses Ergebnis ist recht zufriedenstellend, da es im Einklang mit den Aufkonzentrierungsversuchen mit HSA alleine steht, wenngleich theoretisch eine 10fache Erhöhung der Konzentration zu erhoffen war, da 10 ml auf 1 ml aufkonzentriert werden.
Das Endziel besteht jedoch nicht darin, alle Proteine aufzukonzentrieren, sondern das interessierende Protein zu isolieren. Daher ist es wichtig, die verschiedenen so erhaltenen Proben gelelektrophoretisch zu analysieren, um das oder die verschiedenen Proteine nachzuweisen.
V. SCHLUSSFOLGERUNGEN
Durch eine Vorstudie konnte verifiziert werden, daß die Verwendung von wärmeempfindlichen magnetischen Latex teilchen es durch Variation verschiedener physikalischer Parameter (pH, Temperatur, Ionenstärke) ermöglicht, Humanalbumin (HSA) zu adsorbieren und zu desorbieren. Somit kann man von einer verdünnten 10-ml-Lösung dieses Proteins auf eine ungefähr 4 mal so konzentrierte 1-ml-Lösung übergehen.
Durch Optimierung der Parameter können bis zu 95% der Proteine adsorbiert werden. Die Tatsache, daß nicht weiter auf konzentriert werden kann, ist auf eine unvollständige Desorption zurückzuführen. Zur Erhöhung des Desorptionsgrads ist es denkbar, Tenside zuzugeben, die zum Austausch mit den adsorbierten Proteinen befähigt sind.
Durch Anwendung der optimalen Aufkonzentrierungsbedingungen für HSA auf Urin sind ähnliche Ergebnisse erhältlich. Durch Desorption in einem geeigneten Puffer kann man die Proteinkonzentration in einer Urincharge vervierfachen. Durch Lyophilisierung der so aufkonzentrierten Proben kann man einen Multiplikationsfaktor von 100 erreichen, der dem durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat erhaltenen Aufkonzentrierungsgrad nahekommt. Die nach Lyophilisierung erhaltene Lösung weist jedoch eine zu hohe Salzkonzentration auf. Daher wäre zum Ersatz des Puffers mit einer Ionenstärke von 0,1 mol/l durch ein weniger salzhaltiges Medium ein Dialyseschritt erforderlich, es sei denn, man entscheidet sich für eine Desorption bei einer nahe Null liegenden Ionenstärke, selbst wenn man dadurch Gefahr läuft, daß nur eine kleinere Proteinmenge desorbiert wird.

Claims

Wärmeempfindliches magnetisches Teilchen mit einer vorbestimmten Größe zwischen 0,05 und 10 μm, enthaltend: – einen inneren Verbundkern, der aus einem festen organischen oder anorganischen Teilchen besteht, das in seinem Inneren eine magnetische Ladung enthält, und – eine äußere Schicht auf Basis eines zur Wechselwirkung mit mindestens einem biologischen Molekül befähigten Polymer, wobei das äußere Polymer wärmeempfindlich ist und eine vorbestimmte untere kritische Löslichkeitstemperatur (LCST) zwischen 10 und 100°C und vorzugsweise zwischen 20 und 60°C aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen dem inneren Kern und der äußeren Schicht eine Zwischenschicht befindet, die die magnetische Ladung des inneren Kerns gegenüber der funktionalisierten äußeren Schicht isoliert und aus einem aus mindestens einem zu einem Polymer polymerisierbaren funktionellen oder nichtfunktionellen Monomer, und einem Vernetzer hergestellten vernetzten Polymer besteht.
Teilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die äußere Schicht durch Polymerisation von mindestens – einem zu einem Polymer polymerisierbaren funktionellen Monomer und – einem Inititator hergestellt wird.
Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das funktionelle Monomer aus einem kationischen Monomer, wie 2-Aminomethylmethacrylatchlorid, besteht.
Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das funktionelle Monomer aus einem anionischen Monomer, wie einem Carbonsäure- oder Sulfatmonomer, besteht.
Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer aus hydrophilen Polymeren, insbesondere Acrylaminderivaten und vorzugsweise durch Polymerisation von N-Isopropylacrylamid (NIPAM) erhaltenem Poly(NIPAM), besteht.
Teilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vernetzer aus N,N'-Methylenbisacrylamid besteht.
Teilchen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Initiator aus mindestens einem kationischen Initiator, wie Azobis(2-amidinopropan)chlorid, besteht.
Teilchen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Initiator aus mindestens einem anionischen Initiator, wie Kaliumpersulfat, besteht.
Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die äußere Schicht mit einer protonierten Amin- oder Amidingruppe substituiert ist.
Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die äußere Schicht mit einer Carbonsäure- oder Sulfatgruppe substituiert ist.
Verfahren zur Herstellung von Teilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man: – einen Verbundkern, der aus einem festen organischen oder anorganischen Teilchen besteht, das in seinem Inneren eine magnetische Ladung enthält, und ein zu einem Polymer polymerisierbares funktionelles oder nichtfunktionelles Monomer zur Reaktion bringt, wobei man ein eine Zwischenschicht um den inneren Verbundkern herum bildendes Polymer erhält, – zur Vernetzung des Polymers einen Vernetzer zur Reaktion bringt und – die vernetzte polymerisierte Zwischenschicht mit einem polymerisierbaren Monomer zu einem eine äußere Schicht bildenden Polymer umsetzt.
Verfahren zur Herstellung von Teilchen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Polymerisation von wasserlöslichen Acrylamid- und/oder Acrylamidderivat-Monomeren in Gegenwart von Azobis(2-amidinopropan)chlorid kationische magnetische Teilchen herstellt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation in Gegenwart von N,N'-Methylenbisacrylamid und/oder 2-Aminomethylmethacrylatchlorid durchführt.
Verfahren zur Herstellung von Teilchen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Polymerisation von wasserlöslichen Acrylamid- und/oder Acrylamidderivat-Monomeren in Gegenwart von Kaliumpersulfat anionische magnetische Teilchen herstellt.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation in Gegenwart von N,N'-Methylenbisacrylamid und/oder Carbonsäuremonomeren durchführt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenschicht aus mindestens einer Substanz, die die magnetische Ladung isoliert, wie Polystyrol und/oder Polymethylmethacrylat, besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man dabei die Reagenzien in einem Anteil von: – 10 bis 30% wasserlöslichem Acrylamid- oder Acrylamidderivat-Monomer, – höchstens 10% mindestens eines Vernetzers und – 1 bis 5% mindestens eines Stabilisators, bezogen auf die Gesamtmasse des nach dem Verfahren erhaltenen Teilchens, verwendet.
Verwendung von kationischen Teilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 bis 7 oder 9 zur Immobilisierung oder Extraktion von Nucleinsäuren oder beliebigen Polyelektrolyten und zur Freigabe und/oder Analyse der Nucleinsäuren oder Polyelektrolyte nach magnetischer Abtrennung, wobei die Verwendungstemperatur ständig unter der LCST liegt.
Verwendung von anionischen Teilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, 4 bis 6, 8 oder 10 zur Extraktion von Proteinen durch Fixierung an den Teilchen bei einer über der LOST liegenden Temperatur und zur Freigabe und/oder Analyse dieser Proteine nach magnetischer Abtrennung bei einer unter der LCST liegenden Temperatur.