DE60109272T2

DE60109272T2 - Verfahren zur reinigung von proteinen oder mischungen von proteinen und nukleinsäuren und so geschaffene zusammesetzungen von partikeln und proteinen

Info

Publication number: DE60109272T2
Application number: DE60109272T
Authority: DE
Inventors: Abdelhamid Elaissari; Bernard Mandrand; Thierry Delair; Doran Spencer; Ahmed Arkis
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2021-01-23
Also published as: US8093026B2; DE60109272D1; US7060804B2; WO2001052612A3; WO2001052612A2; US7700744B2; ATE290433T1; US20060105326A1; FR2804117A1; FR2804117B1; US20100209987A1; ES2237554T3; EP1248679B1; CA2412536A1; US20030175691A1; AU2001235580A1; EP1248679A2

Description

Eines der häufig auftretenden Probleme betrifft die Extraktion, Reinigung, Konzentrierung und Konservierung von biologischem Material für dessen spätere Verwendung.
Eine der zur Reinigung von Proteinen verwendeten Methoden ist die Reinigung durch Präzipitation, in dem Präzipitationsagenzien, wie Amoniumsulfat oder Acrylpolysäuren, verwendet werden (H. Morawetz und W. L. Hughes, J. Phys. Chem., 56, 64–69 (1952)).
Eine weitere Methode betrifft die Extraktion von biologischem Material mittels kolloidaler Suspensionen. Hier kann die Patentanmeldung WO-A-98/01482 von Krupey zitiert werden, die eine Extraktion von Proteinen in einem wässrigen Milieu beschreibt, in dem Kolloide auf der Basis von vernetzten Maleinsäureanhydridcopolymeren verwendet werden. Nach der Komplexierung der Proteine auf den Kolloiden, werden die Komplexe aus dem Milieu durch Zentrifugation extrahiert. Eine solche Methode hat den Nachteil, dass diese einen relativ diffizilen Zentrifugationsschritt erfordert und eine schwere, aufwändige Apparatur verwendet wird, die nicht immer einfach zugänglich ist.
Eine mögliche Lösung besteht darin, Kolloide aus magnetischen Eisenoxiden zu verwenden, wie beschrieben in Rao VC et al. (Appl. Environ. Microbiol., 1981, Sep, 42(3): 421–426). Aller dings ist bekannt, dass Eisenoxide inkompatibel sind mit Techniken der enzymatischen Amplifizierung von Nucleinsäuren, da diese die Enzyme inhibieren.
Um dieses Problem zu lösen, ist vorgeschlagen worden (Patentanmeldung WO-A-99/35500) Magnetpartikel mit einem kationischen oder anionischem hydrophilen Polymer zu umhüllen, das die Eisenoxide maskiert und so die Inhibierung der enzymatischen Amplifizierungsreaktion nach einem Schritt zur Extraktion der Nucleinsäure aufhebt. Dieses Polymer ist ein thermosensibles Polymer, das, wenn es auf eine Temperatur oberhalb von 32°C erwärmt wird, hydrophob wird und Proteine durch hydrophobe Wechselwirkungen binden kann. Für eine große Anzahl von Proteinen sind hydrophobe Wechselwirkungen allerdings denaturierend.
Die in Rede stehenden Erfinder haben nun magnetische kolloidale Partikel aufgefunden, die sämtliche oben erwähnten Nachteile reduzieren und insofern ubiquitärer sind, als sie die Isolierung von Proteinen und Zusammenschlüssen von Proteinen und Nucleinsäuren ausgehend von einem komplexen Milieu auf einfache, effiziente und schnelle Art und Weise ermöglichen und keine aufwändige Apparatur erfordern und mit Techniken der enzymatischen Amplifizierung kompatibel sind. Sie erfordern weder eine schwere Apparatur, noch viele Handgriffe. Diese Partikel sind also unabhängig von der Umgebung, in der diese sich befinden, verwendbar und ermöglichen u.a. die Extraktion von Zusammenschlüssen von Proteinen und Nucleinsäuren, jedoch gleichermaßen die Extraktion von Proteinen.
Unter Proteinen werden Holoproteine und Heteroproteine oder deren Fragmente verstanden, d.h., Lipoproteine, Glykoproteine, Hämoproteine, Phosphoproteine, Flavoproteine, Metalloproteine, Polypeptide, Antigene, Immunogene, Antikörper, Enzyme.
Unter Zusammenschluss von Proteinen und Nucleinsäuren werden insbesondere komplexe Nukleoproteinstrukturen verstanden, wie Chromosomen, Histone und auch Viren, Bakterien, Pilze.
Solche Partikel sind insbesondere in Regionen interessant, in denen hämorrhagische Fieberviren endemisch sind.
Insbesondere können die Partikel der Erfindung ohne Lyophilisierungsschritt und ohne Einfrieren transportiert werden, was ohne Zweifel Vorteile mit sich bringt, insbesondere in Bezug auf die Sicherheit während des Transportes von infektiösen Proben. Eine kürzlich aufgetretene Epidemie im Kongo hat Schwierigkeiten hinsichtlich des Geländes, auf das getroffen werden kann, aufgezeigt, als Proben menschlichen Ursprungs, die ein sehr hohes Kontaminationsrisiko darstellten, für eine Diagnose nach Südafrika transportiert wurden (Weltgesundheitsorganisation, 1999: http://www.who.int/emc/outbreak_news/n1999/may/n28may1999.html).
Außerdem ermöglichen es die kolloidalen Partikel der Erfindung, sofern gewünscht, in Kultur gebrachte Zellen durch ein infektiöses Agens zu infizieren, das so isoliert, gereinigt, konzentriert und ggf. transportiert wurde. Darüber hinaus finden die kolloidalen Partikel der Erfindung zahlreiche Anwendungen und Verwendungen.
Beispielsweise im Falle von Viren ist ein Schritt der Lyse mittels chaotropher Agenzien, Hitze oder anderer Mittel vor dem Schritt der enzymatischen Amplifizierung unentbehrlich, was die Verwendung von stabilen Kolloiden unter stark stringenten Bedingungen erfordert. Die Methode zur Herstellung dieser stabilen Kolloide ist illustrativ in die Beispiele der vorliegenden Patentanmeldung mit einbezogen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Proteinen und/oder eines Zusammenschlusses von Proteinen und Nucleinsäuren in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass:

– die Probe mit kolloidalen magnetischen Partikeln in Kontakt gebracht wird, die einen Kern und eine Umhüllung aufweisen, wobei: der Kern magnetisch ist und von mindestens einem Polymer umhüllt ist, das funktionelle Gruppen X aufweist, die ausgewählt sind aus Amin-, Hydroxyl-, Thiol-, Aldehyd-, Ester-, Anhydrid-, Säurechlorid-, Carbonat-, Carbamat-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen oder deren Gemischen, von denen mindestens eine Fraktion mit anderen funktionellen Gruppen der Umhüllung reagiert hat, und die Umhüllung aus einem Polymer gebildet ist, das ionisierbare funktionelle Gruppen Z und Z' trägt, die identisch oder verschieden sind und ausgewählt sind aus den Amin-, Carbonsäure-, Ester-, Anhydrid-, Aldehyd-, Thiol-, Disuifid-, α-Halogencarbonyl-, Sulfonsäure-, Maleinimid-, Isocyanat- und Isothiocyanatgruppen, die teilweise mit den funktionellen Gruppen X des Kerns reagiert haben; um ein Gemisch herzustellen,
– das Gemisch unter bestimmten Bedingungen inkubiert wird, und
– die Proteine und/oder die Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren, die auf den kolloidalen Partikeln komplexiert sind, durch Anlegen eines Magnetfeldes von dem Gemisch abgetrennt werden.

Der magnetische Kern ist insbesondere fest und aus Metalloxidpartikeln gebildet oder besteht aus einer Emulsion, die Metalloxidpartikel oder die Emulsion aus Metalloxidpartikeln aufweist.
Unter einer teilweisen Reaktion der funktionellen Gruppen Z, Z' mit X wird verstanden, dass Z- und/oder Z'-Gruppen frei verfügbar bleiben. Sämtliche oder zumindest ein Teil dieser freien Z- und/oder Z'-Gruppen werden durch ionische Wechselwirkung mit den ionischen Gruppen der Proteine und/oder der Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren reagieren.
Die unten stehende Tabelle 1 fasst die Komplementarität zwischen den verschiedenen funktionellen Gruppen X, Z und Z' zusammen.
Tabelle 1
Der Kern der kolloidalen Partikel weist mindestens ein organisches Polymer auf, das ausgewählt ist aus mindestens einem Homopolymer oder einem Copolymer oder ihren Gemischen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen, das ausgewählt ist aus Acrylamid- und Acrylatmonomeren, insbesondere N-Alkylacrylamid und N,N-Dialkylacrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N-isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid; Alkylacrylaten und -methacrylaten, in denen der Alkylrest 3 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist; Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, Tertio-Butylstyrol, Chlormethylstyrolvinyltoluol; ihren Derivaten und den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Comonomeren, und weist Metalloxidpartikel auf, die ausgewählt sind aus den Partikeln von Metalloxiden von Eisen, Titan, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Nickel; Magnetit; Hämatit, Ferriten, wie Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink; Kobalt-Nickel-Legierungen.
Das Polymer der Umhüllung ist ausgewählt aus mindestens einem hydrophilen Homopolymer oder Copolymer, das aus den folgenden Homopolymeren oder Copolymeren ausgewählt ist:

– aus solchen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen, das ausgewählt ist aus den Acrylamid- oder Methacrylamidderivaten; Acrylsäure, Methacrylsäure; Acrylat- und Methacrylatderivaten; Allylamin, Styrolderivaten, mit der Maßgabe, dass, wenn es sich um ein Homopolymer handelt, dieses ionisierbare funktionelle Gruppen trägt, insbesondere Copolymere oder Homopolymere von Maleinsäureanhydrid und Homopolymere oder Copolymere von Acryloxysuccinimid,
– aus Polysacchariden, wie Chitosan und Polygalacturonsäure,
– aus Polypeptiden, wie Polylysin und Polyarginin,
– aus linearem oder verzweigtem Polyethylenimin, und
– aus Dendrimeren;

Die Mischung wird einer Inkubation bei einer Temperatur, die bei 15 bis 60°C, vorzugsweise bei 20 bis 35°C liegt, für eine Inkubationsdauer, die bei 5 bis 60 Minuten, vorzugsweise bei 10 Minuten liegt, unterworfen.
Die Probe kann eine biologische Probe sein, bspw. eine Entnahme, wie eine Gewebeentnahme, Gesamtblut oder Serum oder ein Kulturüberstand oder auch eine Nahrungsmittelentnahme, die Proteine und/oder Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren aufweist, insbesondere einen Virus, ein Bakterium, eine Hefe, eine Zelle, ggf. eine Mischung von diesen. Unter Nahrungsmittelentnahme wird jede Nahrungsmittelprobe verstanden, die durch ein infektiöses Agens infiziert werden kann oder infiziert worden ist.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen und/oder einem Zusammenschluss von Proteinen und Nucleinsäuren, gemäß dem aus einer Probe, bspw. einer Nahrungsmittelentnahme oder einer biologischen Probe, wie einer Entnahme oder einem Kulturüberstand, ein Virus und/oder ein Bakterium und/oder eine Hefe und/oder eine Zelle oder eine Mischung von diesen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren isoliert werden, und, wenn nötig, das Virus, das Bakterium, die Hefe, die Zelle oder ihr Gemisch einem Schritt der Aussalzung und/oder der partiellen oder vollständigen Denaturierung zur Extraktion der Proteine und/oder der Nucleinsäuren unterzogen werden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Detektion und/oder Quantifizierung von Proteinen und/oder eines Zusammenschlusses von Proteinen und Nucleinsäuren und/oder Nucleinsäuren, nach dem aus einer Probe, bspw. einer Entnahme oder einem Kulturüberstand, ein Virus und/oder ein Bakterium und/oder eine Hefe und/oder eine Zelle und/oder eine Mischung von diesen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren isoliert werden, und, wenn nötig, das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die Zelle und/oder ihr Gemisch einem Schritt der Aussalzung und/oder der partiellen oder vollständigen Denaturierung zur Extraktion der Proteine und/oder der Nucleinsäuren unterzogen werden, und die Proteine durch Immunbestimmung und/oder die Nucleinsäuren durch Amplifizierung der Letzteren und/oder durch Hybridisierung mit mindestens einer für die zu identifizierenden und/oder zu detektierenden und/oder zu quantifizierenden Nucleinsäuren spezifischen Nucleotidsonde identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert werden.
Unter Immunbestimmung wird die Detektion und/oder die Quantifizierung von mindestens einem Protein oder mindestens einem Antigen durch Nachweis eines Protein- oder Antigen/Antikörperkomplexes, insbesondere durch sog. Western Blot-, Kompetitions- oder Sandwich-Techniken, verstanden.
Unter Amplifizierung werden sämtliche Techniken verstanden, die zur Amplifizierung von DNA oder von RNA geeignet sind, insbesondere die PCR, die RT-PCR, NASBA, TMA. Es kann sich außerdem um eine quantitative Amplifizierung handeln. Außerdem können die zu identifizierenden und/oder zu detektierenden und/oder zu quantifizierenden Nucleinsäuren mit zumindest einer mit jeglichem geeigneten Marker markierten Nucleotidsonde hybridisiert werden, vorzugsweise wird das Ziel an eine Fängersonde und eine Detektionssonde hybridisiert. Es können beispielhaft und nicht einschränkend die dem Fachmann bekannten Techniken des Southern Blots, Northern Blots und die ELOSA-Technik (Enzyme Linked Oligosorbent Assay) zitiert werden (Katz JB et al., Am. J. Vet. Res., Dez. 1993; 54 (12): 2021–6 und François Mallet et al., Journal of Clinical Microbiology, Juni 1993, S. 1444–1449).
Bei den Proteinen handelt es sich um Oberflächenproteine oder intrazelluläre Proteine eines Virus, eines Bakteriums, einer Hefe oder einer Zelle, und bei den Nucleinsäuren handelt es sich um DNA und/oder um RNA. Die Proteine werden entweder (i) direkt, ohne Aussalzungs- und/oder Denaturierungsschritt, ausgehend von dem isolierten Virus und/oder dem isolierten Bakterium und/oder der isolierten Hefe und/oder der isolierten Zelle oder in einem Kulturüberstand, oder (ii) indirekt, nach einem Aussalzungs- und/oder partiellen oder vollständigen Denaturierungsschritt, der bspw. durch Modifikation des pH-Wertes (Absenkung oder Erhöhung des pH-Wertes durch Zugabe einer sauren oder basischen Lösung) durchgeführt wird, identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert. Die Nucleinsäuren werden nach einem Aussalzungs- und/oder partiellen oder vollständigen Denaturierungsschritt des isolierten Virus und/oder des isolierten Bakteriums und/oder der isolierten Hefe und/oder der isolierten Zelle, der bspw. durch chemische und/oder physikalische Behandlung durchgeführt wird, identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert. Eine chemische Behandlung umfasst bspw. die Verwendung von Tensio-aktiven Agenzien, wie SDS, LLS, die Verwendung von chaotrophen Agenzien, wie Guanidiniumthiocyanat, die Verwendung von Enzymen, wie Proteanen (Proteinase K), oder anderer geeigneter Agenzien. Eine physikalische Behandlung umfasst bspw. die Sonifizierung, die Erwärmung, Ultraschall, mechanisches Rühren (bspw. mit harten Kugeln vom Glastyp) oder Analoges.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Kultivierung eines Virus und/oder eines Bakteriums und/oder einer Hefe und/oder von Zellen, nach dem ausgehend von einer Probe, bspw. einer Entnahme oder einem Kulturüberstand, das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die Zellen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren isoliert werden, das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die so isolierten Zellen in einem Kulturmedium und unter geeigneten Bedingungen in Kultur gebracht werden, und, wenn gewünscht, das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die Zellen gemäß dem Fachmann bekannten Techniken identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer biologischen Probe, wie eine Entnahme oder ein Kulturüberstand oder eine Nahrungsmittelentnahme, nach dem aus der Probe die Proteine und/oder die Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren gemäß dem obigen Verfahren isoliert werden und/oder eine Kultur gemäß einem wie zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt wird.
Die Erfindung betrifft ferner einen Komplex, der aus kolloidalen magnetischen Partikeln und/oder einem Zusammenschluss von Proteinen und Nucleinsäuren gebildet ist, wobei die Proteine und/oder Nucleinsäuren durch elektrostatische Wechselwirkungen und/oder durch Adsorption immobilisiert sind. Die kolloidalen Partikel weisen einen Kern und eine Umhüllung auf, wobei:
der Kern magnetisch ist und von mindestens einem Polymer umhüllt ist, das funktionelle Gruppen X aufweist, die ausgewählt sind aus den Amin-, Hydroxyl-, Thiol-, Aldehyd-, Ester-, Anhydrid-, Säurechlorid-, Carbonat-, Carbamat-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen oder deren Gemischen, von denen mindestens eine Fraktion mit anderen funktionellen Gruppen der Umhüllung reagiert hat, und
die Umhüllung aus einem Polymer gebildet ist, das ionisierbare funktionelle Gruppen Z und Z' trägt, die identisch oder verschieden sind und ausgewählt sind aus den Amin-, Carbonsäure-, Ester-, Anhydrid-, Aldehyd-, Thiol-, Disulfid-, α-Halogencarbonyl-, Sulfonsäure-, Maleinimid-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen, von denen zumindest ein Teil mit funktionellen Gruppen X des Kernes reagiert hat, und
die Proteine und/oder Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren aus einer biologischen Probe, bspw. einer Entnahme, wie einer Gewebeentnahme, Gesamtblut, Serum oder einem Kulturüberstand oder aus einer Nahrungsmittelentnahme stammen.
Insbesondere ist der Kern der kolloidalen Partikel fest und besteht aus Metalloxidpartikeln, oder ist im Wesentlichen fest und besteht aus einer Emulsion, die Metalloxidpartikel aufweist.
Die Entnahme oder der Kulturüberstand sind vorzugsweise durch mindestens ein Virus, ein Bakterium, eine Hefe oder deren Gemisch aus diesen infiziert.
Der Kern weist zumindest ein organisches Polymer auf, das aus mindestens einem Homopolymer oder einem Copolymer oder ihren Gemischen ausgewählt ist, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen, das ausgewählt ist aus Acrylamid- und Acrylatmonomeren, insbesondere N-Alkylacrylamid und N,N-Dialkylacrylamid, wie N-Isopropylacrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacryl amid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N-isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid; Alkylacrylaten und -methacrylaten, in denen die Alkylgruppe 3 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist; Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, Tertio-Butylstyrol, Chlormethylstyrolvinyltoluol; ihren Derivaten und den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Comonomeren, und weist Metalloxidpartikel auf, die ausgewählt sind aus Partikeln aus Metalloxiden von Eisen, Titan, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Nickel, Magnetit, Hämatit, Ferriten, wie Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink, Kobalt-Nickel-Legierungen.
Das Polymer der Umhüllung ist ausgewählt aus mindestens einem hydrophilen Homopolymer oder Copolymer, das aus den folgenden Homopolymeren oder Copolymeren ausgewählt ist:

– aus solchen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen, das ausgewählt ist aus den Acrylamid- oder Methacrylamidmonomerderivaten; Acrylsäure, Methacrylsäure; Acrylat- und Methacrylatderivaten; Allylamin; Styrolderivaten; mit der Maßgabe, dass, wenn es sich um ein Homopolymer handelt, dieses ionisierbare funktionelle Gruppen trägt; insbesondere Copolymere oder Homopolymere von Maleinsäureanhydrid und Homopolymere oder Copolymere von Acryloxysuccinimid,
– aus Polysacchariden, wie Chitosan und Polygalacturonsäure,
– aus Polypeptiden, wie Polylysin und Polyarginin,
– aus linearem oder verzweigtem Polyethylenimin, und
– aus Dendrimeren;

Der Komplex wird zur Überführung und/oder dem Transport und/oder zur Aufbewahrung von infektiösen Partikeln, insbesondere einem Virus und/oder einem Bakterium und/oder einer Hefe in getrocknetem Zustand oder in einem geeigneten Puffer verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein Reagenz zur Extraktion und/oder Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von Proteinen und/oder Zusammenschlüssen von Proteinen und Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es, unter anderem, Folgendes aufweist:
einen wie oben definierten Komplex oder wie oben definierte kolloidale Partikel, die es ermöglichen, einen erfindungsgemäßen Komplex zu erhalten, und
ggf. mindestens ein Mittel zur Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung der Proteine oder Nucleinsäuren, insbesondere mindestens einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper zur Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von mindestens einem Protein, mindestens einen Primer, vorzugsweise mindestens zwei Primer und/oder mindestens eine Nucleotidsonde, vorzugsweise mindestens zwei Nucleotidprimer, die für mindestens eine Nucleinsäure für deren Identifizierung und/oder Detektion und/oder Quantifizierung spezifisch sind.
Schließlich betrifft die Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens einen wie zuvor definierten erfindungsgemäßen Komplex, ggf. in Verbindung mit einem Träger und/oder einem Exzipienten und/oder einem Adjuvans und/oder einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, aufweist.
Unter „pharmazeutisch akzeptablem Träger" werden Grundmaterialien und Träger verstanden, die einem menschlichen Wesen oder einem Tier verabreicht werden können, wie bspw. beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th ed., Mack Publishing Co. Der pharmazeutisch akzeptable Träger ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder weist eine schwache Hypertonie auf und hat eine relativ niedrige Ionenstärke. Definitionen von pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und Adjuvantien sind gleichermaßen in dem vorherigen Remington's Pharmaceutical Sciences angegeben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein für eine Impfstoffzusammensetzung pharmazeutisch akzeptablen Träger, der aus einem magnetischen Partikel besteht, der der Definition der vorliegenden Erfindung entspricht.
Beispiel 1: Erhalt von magnetischem Carboxyllatex
Das Poly(maleinsäureanhydridmethylvinylether) (AMVE) wird in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst (2 g/l). 50 μl dieser AMVE-Lösung werden in 1 ml Phosphatpuffer (pH 6,8; 10 mM) gelöst, anschließend für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 1 ml einer Dispersion von magnetischem Aminlatex (0,5% in Wasser, 1 × der kritischen mizellaren Konzentration (CMC) von Triton X-405), die bspw. gemäß dem in der PCT-Patentanmeldung WO 99/35500 beschriebenen Protokoll hergestellt wurde, mit 125 μl der zuvor hergestellten Mischung (AMVE-DMSO-Puffer) gemischt. Die Mischung wird bei 37°C für 3 Stunden inkubiert. Die Partikel können anschließend so wie sie sind oder nach einem Reinigungsschritt, bspw. durch Zentrifugation, gelöst werden.
Beispiel 2: Selektive Extraktion von viralen Partikeln ausgehend von Serum, Plasma oder Kulturüberstand.
– Reinigung von viralen Partikeln:
Zu 5 μl durch das AMVE-Copolymer funktionalisiertem magnetischem Latex, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 3% Festigkeitsgrad, werden direkt 100 bis 150 μl positives Serum hinzugegeben, d.h. ein solches, das virale Partikel aufweist. Die Probe wird nicht gepuffert.
Die Serum-Latex-Mischung wird durch 10-sekündiges Vortexen homogenisiert, anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten belassen, um die Bindung der viralen Partikel durch das magnetische Latex zu ermöglichen. Auf diesen Einfangschritt folgt die Wiedergewinnung der Komplexe aus Latex und viralen Partikeln in Form eines Pellets, das durch einfache Magnetisierung für 30 Sekunden von dem Überstand befreit wurde.
Das Pellet muss nicht, kann aber einmal mit 100 μl HEPES, pH 6,5 gewaschen, wie zuvor magnetisiert und anschließend in 50 μl sterilem Wasser dispergiert werden.
– Extraktion von Nucleinsäuren nach der Lyse der viralen Partikel durch Wärme:
Die in Wasser dispergierten Komplexe aus viralen Partikeln und Latex werden bei 95°C für 5 Minuten inkubiert, um die viralen Partikel zu lysieren. Die Nucleinsäuren werden in dem Überstand wiedergewonnen, der durch Magnetisierung von dem Latex befreit wurde.
Beispiel 3: Einfangen des Hepatitis-G-Virus durch erfindungsgemäß funktionalisiertes magnetisches Latex.
Reinigung von viralen Partikeln
Zu 5 μl durch das AMVE-Copolymer funktionalisiertem magnetischem Latex, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 3% Festigkeitsgrad, werden zunehmende Volumina, d.h. 25 μl und 50 μl nicht-verdünntes humanes Serum hinzugegeben, das positiv für das Hepatitis-G-Virus ist, wobei dessen viraler Titer unbekannt ist.
Die Serum-Latex-Mischung wird durch 10-sekündiges Vortexen homogenisiert, anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten belassen, um die Bindung der viralen Partikel durch das magnetische Latex zu ermöglichen. Auf diesen Einfangschritt folgt die Wiedergewinnung der Komplexe aus Latex und viralen Partikeln in Form eines Pellets, das durch einfache Magnetisierung für 5 Minuten von dem Überstand befreit wurde.
Das Pellet wird anschließend einmal mit 50 μl HEPES-Tween (0,25%, pH 6,5) gewaschen, wie zuvor magnetisiert und anschließend in 50 μl sterilem Wasser dispergiert.
– Extraktion von Nucleinsäuren:
Anschließend wird ein Schritt der Lyse der viralen Partikel mit Hilfe des Kits QIAmp Viral RNA Mini Kit (Handelsname) durchgeführt, das von der Firma QIAGEN vertrieben wird, um die viralen Nucleinsäuren freizusetzen.
– Amplifizierung von Nucleinsäuren:
Danach werden die viralen Nucleinsäuren in einem Schritt (1) durch RT-PCR (Life Technologies) und durch verschachtelte PCR (2) amplifiziert, in dem folgende Primerpaare verwendet werden (Smith DB et al., Discrimination of hepatitis G virus/GBV-C geographical variants by analysis of the 5' non-coding region, J. Gen. Virol., 1997, 78: 1533–1542):
Nach der zweiten PCR zeigen die Ergebnisse nach dem Lauf durch ein 1%iges Agarosegel und der Anfärbung mit Ethidiumbromid eine Bande mit der erwarteten Größe von 343 Basenparen. Der als Referenz verwendete Molekulargewichtsmarker ist der Smartladder-Marker (Handelsname) (Vielfache von 200 Basenpaare) der Firma Eurogentec. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das erfindungsgemäße funktionalisierte Latex in der Lage ist virale Partikel von Hepatitis B einzufangen und diese bei den Waschschritten zurückzuhalten.
Ferner wurden 10 μl humanes Serum, das positiv für HGV und dessen Titer unbekannt war, in 3 ml negativem humanem Serum verdünnt und in Gegenwart von 10 μl erfindungsgemäßem Latex gebracht, das gemäß Beispiel 1 erhalten wurde. Die Schritte der Reinigung der viralen Partikel, der Extraktion und der Amplifizierung der Nucleinsäuren wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen nach dem Lauf der Amplifizierungsprodukte durch ein 1%iges Agarosegel und der Anfärbung mit Ethidiumbromid die Bande mit der erwarteten Größe von 342 Basenpaaren, was die Kapazität des erfindungsgemäßen Latex bestätigt, Viruspartikel ausgehend von einer in einem großen Volumen verdünnten Probe einzufangen und zurückzuhalten.
Beispiel 4: Einfangen des Hepatitis-C-Virus durch erfindungsgemäß funktionalisiertes magnetisches Latex
– Reinigung von viralen Partikeln:
Zu 5 μl des durch das AMVE-Copolymer funktionalisiertem magnetischem Latex, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 3% Festigkeitsgrad, werden 50 μl eines nicht-verdünnten humanen Serums zugegeben, das für das Hepatitis-C-Virus positiv ist, wobei dessen viraler Titer unbekannt ist.
Die Serum-Latex-Mischung wird durch 10-sekündiges Vortexen homogenisiert, anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten belassen, um die Bindung der viralen Partikel durch das magnetische Latex zu ermöglichen. Auf diesen Einfangschritt folgt die Wiedergewinnung der Komplexe aus Latex und viralen Partikeln in Form eines Pellets, das durch einfache Magnetisierung für 5 Minuten von dem Überstand befreit wurde.
Das Pellet wird anschließend einmal durch 50 μl HEPES-Tween (0,25%, pH 6,5) gewaschen, wie zuvor magnetisiert und anschließend in 50 μl sterilem Wasser dispergiert.
– Extraktion von Nucleinsäuren:
Anschließend wird ein Schritt zur Extraktion von Nucleinsäuren mittels des Kits QIAmp Viral RNA Mini Kit (Handelsname) durchgeführt, das von der Firma QIAGEN vertrieben wird, um die viralen Nucleinsäuren freizusetzen.
– Amplifizierung der Nucleinsäuren:
Danach werden die viralen Nucleinsäuren in einem Schritt (1) durch RT-PCR (Life Technologies) und durch halbverschachtelte PCR (2) amplifiziert, in dem folgende Primerpaare verwendet werden (Li JS et al., Identification of the third major genotype of hepatitis C in France, BBRC, 1994, 3: 1474–1481):
Nach der zweiten PCR zeigen die Ergebnisse nach dem Lauf durch ein 1%iges Agarosegel und der Anfärbung mit Ethidiumbromid eine Bande mit der erwarteten Größe von 240 Basenparen. Der als Referenz verwendete Molekulargewichtsmarker ist der Smartladder-Marker (Handelsname) (Vielfache von 200 Basenpaare) der Firma Eurogentec. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das erfindungsgemäße funktionalisierte Latex in der Lage ist virale Partikel von Hepatitis C einzufangen und diese bei den Waschschritten zurückzuhalten.
Beispiel 5: Detektion des Maservirus.
Ausgehend von zuvor titrierten viralen Proben wird eine Extraktion von Nucleinsäuren mit Hilfe des von der Firma QIAGEN vertriebenen Kits (QIAmp. Viral RNA Mini Kit (Handelsnamen)) durchgeführt, entsprechend dem Protokoll der Lieferfirma. Die Nucleinsäuren werden anschließend durch RT-PCR mit Hilfe des TITAN Kits (Handelsname – Roche) in Gegenwart von 1 μl RNAse-Inhibitor (RNAsin, Handelsname – Promega) oder durch verschachtelte PCR amplifiziert.

– Titration der viralen Proben (Edmonston-Stamm): Es werden sukzessive Verdünnungen des Virus hergestellt (von 10^–1 bis 10^–7). 200 μl dieser Verdünnungen werden in 6 Vertiefungen einer Platte verteilt, die Vero-Zellen (Nierenzellen der grünen Meerkatze) enthalten, die in einem 199 Medium kultiviert werden, das Glutamax (Gibco-BRL), 1% Antibiotika (Gibco-BRL) und 1% fötales Kälberserum enthält. Die Vero- Zellen sind zu 80% konfluent. Es erfolgt eine Inkubation für eine Stunde bei 37°C unter CO₂ (5%). 200 μl des Mediums, das das Virus enthält, sind entfernt und durch 200 μl virusfreies Medium ersetzt worden. Es erfolgt eine Inkubation unter gleichen Bedingungen für 72 bis 96 Stunden. Die Zellen werden anschließend untersucht und die Lyseplaques werden visualisiert und gezählt. 60 ml der Kultur mit einem Titer von 5,5 × 10⁶ PBE/ml (Lyse-Plaque-bildende Einheit/ml) wurden erhalten, aliquotiert und bei –80°C gelagert.
– Extraktion von Nucleinsäuren: die Nucleinsäuren werden von der Kultur (5,5 × 10³ PBE/μl) mit Hilfe des vorherigen Kits der Firma QIAGEN extrahiert.
– Amplifizierungen: die Nucleinsäureextrakte werden durch RT-PCR amplifiziert, indem die nachfolgenden PCR-Primerpaare verwendet werden:
ggf. gefolgt von einer verschachtelten PCR, indem die folgenden Primerpaare verwendet werden:

Die Amplifizierungsprodukte laufen anschließend durch ein 2%iges Agarosegel (TBE + Gelstar). Bei dem als Referenz verwendeten Molekulargewichtsmarker handelt es sich um den Smartlad der-Marker (Handelsname) (Vielfache von 100 Basenpaaren) der Firma Eurogentec. Die Ergebnisse zeigen eine Bande der erwarteten Größe von 384 Basenpaare für die RT-PCR und von 309 Basenpaaren für die verschachtelte PCR, was die gute Extraktion von viralen RNAs und die Wirksamkeit sowohl der RT-PCR als auch der verschachtelten PCR bestätigt.
Beispiel 6: Einfangen des Masernvirus durch das erfindungsgemäß funktionalisierte Latex.
Nach dem Erhalt der titrierten viralen Proben, wie in Beispiel 8 beschrieben, erfolgt die quantitative Bestimmung des Einfangniveaus und der viralen Detektion durch das Latex aus Beispiel 1. Es wird ein Bereich des viralen Titers hergestellt, in dem die Stammlösung in dem negativen humanen Plasma verdünnt wird. Es werden 1:10-Verdünnungen in einem Endvolumen von 1000 μl hergestellt. Die Menge von Latex beträgt 35 μl (945 μg) pro Probe. Nach dem Einfangen wird eine Extraktion der viralen RNAs mit Hilfe des vorherigen QIAGEN Kits durchgeführt. Die Extrakte der viralen RNAs werden anschließend durch RT-PCR, gefolgt von einer verschachtelten PCR, amplifiziert, indem die Primerpaare verwendet werden, die in Beispiel 5 beschrieben sind. Die Amplifizierungsprodukte laufen anschließend durch ein 2%iges Agarosegel (TBR + Gelstar). Ein Molekulargewichtsmarker (Vielfache von 200 Basenpaaren) (Smartladder – Eurogentec) wird als Referenz verwendet. Die Positivkontrolle wird durch Extrakte von Gesamt-RNA repräsentiert und die Negativkontrolle wird durch Negativplasma gebildet. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 wiedergegeben.
Das Symbol (+) bedeutet das Vorhandensein des Amplifizierungsproduktes mit erwarteter Größe (309 Basenpaare), und das Symbol (–) bedeutet die Abwesenheit des Amplifizierungsproduktes.
Die Ergebnisse zeigen, dass die verschachtelte PCR ein spezifisches Amplifizierungsprodukt bei bis zu 1 PBE pro Röhrchen (100 μl) ergibt. Die Abwesenheit des Amplifizierungsproduktes bei einer Verdünnung von 0,1 PBE zeigt, dass es zu keiner Detektion von nicht-infektiösen viralen Partikeln kommt.
Beispiel 7: Untersuchung der Stabilität des Komplexes aus Latex und Masernvirus.
Um die Stabilität der Latex/Viruskomplexe hinsichtlich der Detektion von viralen RNAs durch RT-PCR zu untersuchen, wurden die Komplexe über die Zeit nachgewiesen. Es wurden mehrere infektiöse Titer getestet sowie andere Probenbehandlungen, jeweils mit dem Zweck, die Proben durch Reduzierung der Anzahl von Handhabungen zu erhalten. Die Proben wurden unter einem Laminarfluss-Abzug bei Raumtemperatur konserviert.

Die behandelten oder nicht-behandelten Komplexe wurden an den Tagen 0, 1, 2, 3, 7 bzw. 14 getestet:

Behandlung A:	Plasmaprobe, die Virus und Latex enthält, die als Basiskontrolle dient (ohne Behandlung).
Behandlung B:	Latex-Virus-Komplex, nach Entfernung des Plasmas, ohne Waschen und Trocknenlassen.
Behandlung C:	Latex-Virus-Komplex, nach Entfernung des Plasmas und einem Waschschritt und Trocknenlassen.
Behandlung D:	Latex-Virus-Komplex, nach Entfernung des Plasmas und einem Waschschritt und Konservieren in Gegenwart des Waschpuffers.

Die infektiösen Titer der getesteten Probe betragen für jede Behandlung 50, 500 bzw. 5000 PBE pro Probe.
Die Komplexe werden anschließend durch Hitze lysiert, um die Nucleinsäuren freizusetzen, und die Nucleinsäuren laufen durch 2%ige Agarosegele (TBE + Gelstar) mit einem als Referenz verwendeten Molekulargewichtsmarker (Smartladder – Eurogentec).
Die Ergebnisse unter diesen experimentellen Bedingungen zeigen, dass die Behandlung B es nicht erlaubt, die Viruspartikel stabil zu halten. Es sollte jedoch festgehalten werden, dass bei Durchführung eines Waschschrittes vor dem Schritt der Extraktion der Nucleinsäuren das erfindungsgemäße Latex die Partikel stabil hält, wie dies die Erfinder in einem weiteren Experiment gezeigt haben. Hingegen ermöglichen es die Komplexe C und D, die einem Waschschritt unterzogen werden, die Proben ohne Degradierung der RNAs zu konservieren, wie dies durch RT-PCR demonstriert wurde. Dies bedeutet, dass ein Waschschritt in dem Puffer für die Konservierung der eingefangenen Probe notwendig ist, dass Letztere im Puffer oder trocken konserviert wird, wenn in dem Extraktionsröhrchen der Lyseschritt durchgeführt wird, wobei jedoch ein Mittel zur Vermeidung dieses Waschschrittes darin besteht, das Röhrchen zu wechseln. Es versteht sich, dass eine Trockenkonservierung vorteilhafter ist, denn diese ermöglicht es die eingefangenen Proben an einen Analyseort zu transportieren, wobei jedes Risiko von Kontamination und Verschmutzung vermieden wird.
Beispiel 8: Einfangen des Masernvirus ausgehend von Gesamtblut.
Es wurden Versuche ausgehend von Gesamtblut durchgeführt. Im humanen Gesamtblut und Plasma des gleichen Ursprungs wurde ein Virusbereich mit der gleichen Menge von Latex erstellt. Die Komplexe aus Latex und viralen Partikeln wurden einer Wärmebehandlung unterzogen, um die Nucleinsäuren zu extrahieren. Die freigesetzten Nucleinsäuren wurden durch RT-PCR mit Hilfe der zuvor beschriebenen Primer amplifiziert.
Die Ergebnisse, die nach dem Lauf der Amplifizierungsprodukte durch ein 2%iges Agarosegel (TBE + Gelstar) erhalten wurden, zeigen ausgehend von einem viralen Titer von 5 × 10³ PBE in Gesamtblut und ausgehend von 50 PBE in Plasma eine Bande von der erwarteten Größe von 384 Basenpaaren. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, virale Partikel ausgehend von Gesamtblut zu isolieren, obwohl dies deutlich weniger effektiv gelingt, als ausgehend von Plasma. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3
Beispiel 9: In-Kultur-Bringen des eingefangenen Masernvirus.
Es wurde ein Virusbereich ausgehend von humanem Plasma, wie beschrieben in Beispiel 2 (s. Tabelle 2), erstellt und getestet. Die Komplexe aus magnetischem Latex und Masernvirus wurden in Gegenwart von Vero-Zellen, die in einem 199 Medium kultiviert wurden, das Glutamax (Gibco-BRL), 1% Antibiotika (GIBCO-BRL) und 10% fötales Kälberserum enthält, in Kultur gegeben. Die Kultivierungsbedingungen wurden wie in Beispiel 5 eingestellt. Am selben Tag des In-Kultur-Bringens wurde auf diesen Virusbereich eine RT-PCR durchgeführt, um das Vorhandensein des Virus in der in Kultur gebrachten Probe zu bestätigen. Die Zellen der Kultur wurden anschließend unter dem Mikroskop beobachtet, um einen zytopathischen Effekt nachzuweisen, der durch das infektiöse Virus in der Kultur induziert wurde. Ein zytopathischer Effekt wurde am Ende des dritten Tages für Proben beobachtet, deren infektiöser Titer 5 × 10⁴ und 5 × 10³ PBE/ml betrug, und nach 5 Tagen für Proben, deren infektiöser Titer 500 und 50 PBE/ml betrug.
Beispiel 10: Einfangen des Virus der erworbenen Immunschwäche (HIV-1) durch das erfindungsgemäße funktionalisierte Latex ausgehend von einem Kulturüberstand und Untersuchung der viralen Lebensfähigkeit.
– Viruseinfang:
Ein HIV-1-Virusstamm der Gruppe M, Untertyp G, wurde in Gegenwart von PBMCs (periphere mononukleare Blutzellen) in einem RPMI-Kultivierungsmedium, versetzt mit 10% fötalem Kälberserum, kultiviert. Das Vorhandensein des Virus wurde am 14. Kultivierungstag durch eine P24-Antigendetektion (31637,8 pg/ml, 1:100 Verdünnung) in dem Kulturüberstand mit Hilfe des immunoenzymatischen Tests VIDAS HIV P24 II bestätigt, der mit der VIDAS-Vorrichtung (eingetragene Marke – bioMérieux) durchgeführt wurde. 150 μl dieses Kulturüberstandes wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur und unter Rühren in Gegenwart von 10 μl magnetischem Latex gebracht, das wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurde. Dem Einfangschritt folgt ein Magnetisierungsschritt, um das Pellet von dem Kulturüberstand zu trennen und das so erhaltene Pellet (Latex-Virus-Komplex) wurde mit ungefähr 100 μl RPMI-Kulturmedium gewaschen, anschließend erneut magnetisiert und in 10 μl RPMI-Medium resuspendiert.
– Lebensfähigkeit:
10 μl des wie oben beschriebenen Latex-Virus-Komplexes wurden in Gegenwart eines frisch präparierten PBMC-Pellets (25 × 10⁶ Zellen) gebracht. Der gesamte Ansatz wurde homogenisiert, anschließend für den Schritt der Infektion der PBMCs bei 37°C unter CO₂-Atmosphäre (5%) inkubiert. Anschließend wurden 15 ml des RPMI-Mediums zugegeben. Der gesamte Ansatz wurde homogenisiert und 5 ml des Mediums wurden am Tag T0 entnommen und einer Zentrifugation bei 1100 upm für 10 Minuten unterzogen. 1 ml des Überstandes dient der Bestimmung des P24 und der Rest wird in das entsprechende Kulturmedium gegeben. Parallel wurden die frisch präparierten PBMCs unter denselben Bedingungen in Gegenwart von 10 μl alleinigem Latex (ohne Virus) gegeben, um die Negativkontrolle zu bilden. Die Bestimmung des P24-Antigens erfolgte mittels des immunenzymatischen Tests (VIDAS HIV P24 II) mit der VIDAS-Vorrichtung in dem Kontroll- und infizierten Kulturüberstand jeweils an den Tagen T0, T2, T4, T7, T9, T11, T14, T16 und T18. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen einen signifikanten Anstieg des P24-Antigens in dem Kulturüberstand des 14. Kultivierungstages, was einerseits bestätigt, dass das Virus gut durch das erfindungsgemäße Latex eingefangen wurde, und dass andererseits dieses nach dem Einfangen dessen Lebensfähigkeit und dessen Replikationsvermögen (Infektiosität) erhält.
Beispiel 11: Einfangen des Hepatitis-B-Virus (HBV).
Ausgehend von HBV-positivem Serum wurden 1:10-Verdünnungen in einem Endvolumen von 150 ml hergestellt, die 10 000 bis 10 Viruskopien enthalten. Das Einfangen des Virus und die Extraktion der viralen DNA wurden gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Die Detektion der Anzahl der viralen Kopien erfolgte durch verschachtelte PCR, indem Primer verwendet wurden, die in dem S-Bereich des HBV-Genoms definiert sind, um ein Fragment von 440 Basenpaaren zu amplifizieren.
1. Runde:
2. Runde:
Die Amplifizierungsprodukte laufen anschließend durch ein 1%iges Agarosegel und werden mit Ethidiumbromid angefärbt. Bei einer Verdünnung von 10^–3 wird ein Signal detektiert, das einer Detektionsschwelle von 10 HBV-Kopien entspricht, was eine gute Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Einfangsystems repräsentiert.
Ferner wurde positives humanes Serum in negativem humanem Serum derart verdünnt, so dass 100 HBV-Kopien in zwei verschiedenen Volumina von 100 und 1000 μl erhalten wurden, um einen potentiellen Effekt der Konzentration des erfindungsgemäßen Latex zu untersuchen. Nach dem Einfangen der in den beiden verdünnten Proben enthaltenen viralen Partikel durch 10 μl Latex wurden die Nucleinsäuren durch Lyse über Hitze extrahiert und durch verschachtelte PCR amplifiziert, indem die oben beschriebenen Primer benutzt wurden. Die erhaltenen Amplifizierungsprodukte liefen anschließend durch ein 1%iges Agarosegel und wurden mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Ergebnisse zeigen für die Produkte, die ausgehend von den beiden verdünnten Proben erhalten wurden, eine Bande mit der erwarteten Größe von 440 Basenpaaren. Die Intensität der Anfärbung der beiden amplifizierten Fragmente, die jeweils aus den oben genannten verdünnten Proben stammen, erweisen sich als identisch, was ein Effekt der Konzentration des erfindungsgemäßen magnetischen Latex demonstriert.

Claims

Verfahren zur Isolierung von Proteinen und/oder eines Zusammenschlusses von Proteinen und Nucleinsäuren in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass: – die Probe mit kolloidalen magnetischen Partikeln in Kontakt gebracht wird, die einen Kern und eine Umhüllung aufweisen, wobei: der Kern magnetisch ist und von mindestens einem Polymer umhüllt ist, das funktionelle Gruppen X aufweist, die ausgewählt sind aus Amin-, Hydroxyl-, Thiol-, Aldehyd-, Ester-, Anhydrid-, Säurechlorid-, Carbonat-, Carbamat-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen oder deren Gemischen, von denen mindestens eine Fraktion mit anderen funktionellen Gruppen der Umhüllung reagiert hat, und die Umhüllung aus einem Polymer gebildet ist, das ionisierbare funktionelle Gruppen Z und Z' trägt, die identisch oder verschieden sind und ausgewählt sind aus den Amin-, Carbonsäure-, Ester-, Anhydrid-, Aldehyd-, Thiol-, Disulfid-, α-Halogencarbonyl-, Sulfonsäure-, Maleinimid-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen, die teilweise mit den funktionellen Gruppen x des Kerns reagiert haben, um ein Gemisch herzustellen, – das Gemisch unter bestimmten Bedingungen inkubiert wird, und – die Proteine und/oder die Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren, die auf den kolloidalen Partikeln komplexiert sind, durch Anlegen eines Magnetfeldes von dem Gemisch abgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern mindestens ein organisches Polymer aufweist, das ausgewählt ist aus mindestens einem Homopolymer oder einem Copolymer oder ihren Gemischen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen, das ausgewählt ist aus Acrylamid- und Acrylatmonomeren, insbesondere N-Alkylacrylamid und N,N-Dialkylacrylamid, wie N-Isopropylacrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N-isopropylacrylamid, N-Methyl-, N-n-propylacrylamid; Alkylacrylaten und -methacrylaten, in denen der Alkylrest 3 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist; Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, Tertio-Butylstyrol, Chlormethylstyrolvinyltoluol; ihren Derivaten und den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Comonomeren, und dass er Metalloxidpartikel aufweist, die ausgewählt sind aus den Partikeln von Metalloxiden von Eisen, Titan, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Nickel; Magnetit; Hämatit, Ferriten, wie Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink; Kobalt-Nickel-Legierungen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer der Umhüllung aus mindestens einem hydrophilen Homopolymer oder Copolymer ausgewählt ist, das aus den folgenden Homopolymeren oder Copolymeren ausgewählt ist: – aus solchen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen, das ausgewählt ist aus den Acrylamid- oder Methacrylamidmonomerderivaten; Acrylsäure, Methacrylsäure; Acrylat- und Methacrylatderivaten; Allylamin; Styrolderivaten, mit der Maßga be, dass, wenn es sich um ein Homopolymer handelt, dieses ionisierbare funktionelle Gruppen trägt, insbesondere Copolymere oder Homopolymere von Maleinsäureanhydrid und Homopolymere oder Copolymere von Acryloxysuccinimid, – aus Polysacchariden, wie Chitosan und Polygalacturonsäure, – aus Polypeptiden, wie Polylysin und Polyarginin, – aus linearem oder verzweigtem Polyethylenimin, und – aus Dendrimeren.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer der Umhüllung Poly(maleinsäureanhydridvinylether), Poly(N-Vinylmorpholin-N-acryloxysuccinimid) oder Poly(N-Vinylpyrrolidin-N-acryloxysuccinimid) ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch einer Inkubation bei einer Temperatur von 15 bis 60°C, vorzugsweise von 20 bis 35°C, für eine Inkubationsdauer von 5 bis 60 Minuten, vorzugsweise von 10 Minuten, unterworfen wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Entnahme oder ein Kulturüberstand ist, der Proteine und/oder Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren, insbesondere einen Virus, ein Bakterium, eine Hefe, eine Zelle, gegebenenfalls in einer Mischung, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine biologische Probe, wie eine Gewebeentnahme, Gesamtblut, Plasma, Serum oder ein Kulturüberstand, oder eine Nahrungsmittelentnahme ist.
Verfahren zur Extraktion von Proteinen und/oder Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass: – aus einer Probe, beispielsweise einer Entnahme oder einem Kulturüberstand, ein Virus und/oder ein Bakterium und/oder eine Hefe und/oder eine Zelle und/oder eine Mischung von diesen gemäß dem in den Ansprüchen 1 bis 7 beschriebenen Verfahren isoliert werden, und, – wenn nötig, das Virus, das Bakterium, die Hefe, die Zelle oder ihr Gemisch einem Schritt der Aussalzung und/oder der partiellen oder vollständigen Denaturierung zur Extraktion der Proteine und/oder der Nucleinsäuren unterzogen werden.
Verfahren zur Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von Proteinen und/oder eines Zusammenschlusses von Proteinen und Nucleinsäuren und/oder Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass: – aus einer Probe, beispielsweise einer Entnahme oder einem Kulturüberstand, ein Virus und/oder ein Bakterium und/oder eine Hefe und/oder eine Zelle und/oder eine Mischung von diesen gemäß dem in den Ansprüchen 1 bis 7 beschriebenen Verfahren isoliert werden, und, – wenn nötig, das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die Zelle oder ihr Gemisch einem Schritt der Aussalzung und/oder der partiellen oder vollständigen Denaturierung zur Extraktion der Proteine und/oder der Nucleinsäuren unterzogen werden, und – die Proteine durch Immunbestimmung und/oder die Nucleinsäuren durch ihre Amplifizierung und/oder durch Hybridisierung mit mindestens einer für die zu identifizierenden und/oder zu detektierenden und/oder zu quantifizierenden Nucleinsäuren spezifischen Nucleotidsonde identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine Oberflächenproteine oder intrazelluläre Proteine eines Virus, eines Bakteriums, einer Hefe oder einer Zelle sind, und dadurch, dass die Nucleinsäuren DNA und/oder RNA sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine entweder (i) direkt, ohne Aussalzungs- und/oder Denaturierungsschritt, ausgehend von dem isolierten Virus und/oder dem isolierten Bakterium und/oder der isolierten Hefe und/oder der isolierten Zelle oder in einem Kulturüberstand, oder (ii) indirekt, nach einem Aussalzungs- und/oder partiellen oder vollständigen Denaturierungsschritt, der beispielsweise durch Modifikation des pH-Wertes durchgeführt wird, identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäuren nach einem Aussalzungs- und/oder partiellen oder vollständigen Denaturierungsschritt des isolierten Virus und/oder des isolierten Bakteriums und/oder der isolierten Hefe und/oder der isolierten Zelle, der beispielsweise durch eine chemische und/oder physikalische Behandlung durchgeführt wird, identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert werden.
Verfahren zur Kultivierung eines Virus und/oder eines Bakteriums und/oder einer Hefe und/oder von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass: – ausgehend von einer Probe das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die Zellen gemäß dem in den Ansprüchen 1 bis 7 beschriebenen Verfahren isoliert werden, das so isolierte Virus und/oder das so isolierte Bakterium und/oder die so isolierte Hefe und/oder die so isolierten Zellen in einem Kulturmedium und unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, und, wenn gewünscht, – das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die Zellen identifiziert und/oder nachgewiesen und/oder quantifiziert werden.
Verfahren zur Herstellung einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass: – aus der Probe die Proteine und/oder die Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren gemäß dem in den Ansprüchen 1 bis 7 beschriebenen Verfahren isoliert werden, und/oder – eine Kultur, wie im Anspruch 13 beschrieben, hergestellt wird.
Komplex, dadurch gekennzeichnet, dass er aus kolloidalen magnetischen Partikeln und Proteinen und/oder einem Zusammenschluss von Proteinen und Nucleinsäuren gebildet ist, wobei die kolloidalen Partikel einen Kern und eine Umhüllung aufweisen, wobei: der Kern magnetisch ist und von mindestens einem Polymer umhüllt ist, das funktionelle Gruppen X aufweist, die ausgewählt sind aus den Amin-, Hydroxyl-, Thiol-, Aldehyd-, Ester-, Anhydrid-, Säurechlorid-, Carbonat-, Carbamat-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen oder deren Gemischen, von denen mindestens eine Fraktion mit anderen funktionellen Gruppen der Umhüllung reagiert hat, und die Umhüllung aus einem Polymer gebildet ist, das ionisierbare funktionelle Gruppen Z und Z' trägt, die identisch oder verschieden sind und ausgewählt sind aus den Amin-, Carbonsäure-, Ester-, Anhydrid-, Aldehyd-, Thiol-, Disulfid-, α-Halogencarbonyl-, Sulfonsäure-, Maleinimid-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen, von denen zumindest ein Teil mit den funktionellen Gruppen X des Kerns reagiert hat; und – die Proteine und/oder die Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren aus einer biologischen Probe, beispielsweise einer Entnahme, wie einer Gewebeentnahme, Gesamtblut, Serum oder einem Kulturüberstand, oder aus einer Nahrungsmittelentnahme stammen.
Komplex nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Entnahme oder der Kulturüberstand durch mindestens ein Virus, ein Bakterium, eine Hefe oder deren Gemisch infiziert sind.
Komplex nach den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern mindestens ein organisches Polymer aufweist, das aus mindestens einem Homopolymer oder einem Copolymer oder ihren Gemischen ausgewählt ist, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen, das ausgewählt ist aus Acrylamid- und Acrylatmonomeren, insbesondere N-Alkylacrylamid und N,N-Dialkylacrylamid, wie N-Isopropylacrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N-isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid; Alkylacrylaten und -methacrylaten, in denen die Alkylgruppe 3 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist; Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, Tertio-Butylstyrol, Chlormethylstyrolvinyltoluol; ihren Derivaten und den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Comonomeren, und dass er Metalloxidpartikel aufweist, die ausgewählt sind aus Partikeln aus Metalloxiden von Eisen, Titan, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Nickel; Magnetit; Hämatit, Ferriten, wie Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink; Kobalt-Nickel-Legierungen.
Komplex nach den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer der Umhüllung aus mindestens einem hydrophilen Homopolymer oder Copolymer ausgewählt ist, das aus den folgenden Homopolymeren oder Copolymeren ausgewählt ist: – aus solchen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen, das ausgewählt ist aus den Acrylamid- oder Methacrylamidmonomerderivaten; Acrylsäure, Methacrylsäure; Acrylat- und Methacrylatderivaten; Allylamin; Styrolderivaten; mit der Maßgabe, dass, wenn es sich um ein Homopolymer handelt, dieses ionisierbare funktionelle Gruppen trägt, ins besondere Copolymere oder Homopolymere von Maleinsäureanhydrid und Homopolymere oder Copolymere von Acryloxysuccinimid, – aus Polysacchariden, wie Chitosan und Polygalacturonsäure, – aus Polypeptiden, wie Polylysin und Polyarginin, – aus linearem oder verzweigtem Polyethylenimin, und – aus Dendrimeren.
Komplex nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer der Umhüllung Poly(maleinsäureanhydridvinylether), Poly(N-Vinylmorpholin-N-acryloxysuccinimid) oder Poly(N-Vinylpyrrolidon-N-acryloxysuccinimid) ist.
Verwendung eines Komplexes nach den Ansprüchen 15 bis 19 zur Überführung und/oder zum Transport und/oder zur Aufbewahrung von infektiösen Agenzien, insbesondere einem Virus und/oder einem Bakterium und/oder einer Hefe.
Reagenz zur Extraktion und/oder Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von Proteinen und/oder Zusammenschlüssen von Proteinen und Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es unter anderem einen Komplex, wie in den Ansprüchen 15 bis 19 definiert, aufweist.
Reagenz zur Extraktion und/oder Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von Proteinen und/oder Zusammenschlüssen von Proteinen und Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es kolloidale Partikel, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, aufweist, welche den Erhalt eines Komplexes, wie in einem der Ansprüche 15 und 16 definiert, gestatten.
Reagenz nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem mindestens ein Mittel zur Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung der Proteine oder Nucleinsäuren aufweist, insbesondere mindestens einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper zur Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von mindestens einem Protein, mindestens einen Primer, vorzugsweise mindestens zwei Primer und/oder mindestens eine Nucleotidsonde, vorzugsweise mindestens zwei Nucleotidsonden, die für mindestens eine Nucleinsäure, für deren Identifizierung und/oder Detektion und/oder Quantifizierung spezifisch sind.
Impfstoffzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff mindestens einen Komplex nach den Ansprüchen 15 bis 19, gegebenenfalls in Verbindung mit einem Träger und/oder einem Exzipienten und/oder einem Adjuvans und/oder einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel aufweist.
Träger, der für eine Impfstoffzusammensetzung pharmazeutisch akzeptabel ist, dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem Partikel besteht, das einen Kern und eine Umhüllung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, aufweist.