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Eines
der häufig
auftretenden Probleme betrifft die Extraktion, Reinigung, Konzentrierung
und Konservierung von biologischem Material für dessen spätere Verwendung.
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Eine
der zur Reinigung von Proteinen verwendeten Methoden ist die Reinigung
durch Präzipitation,
in dem Präzipitationsagenzien,
wie Amoniumsulfat oder Acrylpolysäuren, verwendet werden (H.
Morawetz und W. L. Hughes, J. Phys. Chem., 56, 64–69 (1952)).
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Eine
weitere Methode betrifft die Extraktion von biologischem Material
mittels kolloidaler Suspensionen. Hier kann die Patentanmeldung
WO-A-98/01482 von Krupey zitiert werden, die eine Extraktion von
Proteinen in einem wässrigen
Milieu beschreibt, in dem Kolloide auf der Basis von vernetzten
Maleinsäureanhydridcopolymeren
verwendet werden. Nach der Komplexierung der Proteine auf den Kolloiden,
werden die Komplexe aus dem Milieu durch Zentrifugation extrahiert.
Eine solche Methode hat den Nachteil, dass diese einen relativ diffizilen
Zentrifugationsschritt erfordert und eine schwere, aufwändige Apparatur
verwendet wird, die nicht immer einfach zugänglich ist.
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Eine
mögliche
Lösung
besteht darin, Kolloide aus magnetischen Eisenoxiden zu verwenden,
wie beschrieben in Rao VC et al. (Appl. Environ. Microbiol., 1981,
Sep, 42(3): 421–426).
Aller dings ist bekannt, dass Eisenoxide inkompatibel sind mit Techniken
der enzymatischen Amplifizierung von Nucleinsäuren, da diese die Enzyme inhibieren.
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Um
dieses Problem zu lösen,
ist vorgeschlagen worden (Patentanmeldung WO-A-99/35500) Magnetpartikel
mit einem kationischen oder anionischem hydrophilen Polymer zu umhüllen, das
die Eisenoxide maskiert und so die Inhibierung der enzymatischen
Amplifizierungsreaktion nach einem Schritt zur Extraktion der Nucleinsäure aufhebt.
Dieses Polymer ist ein thermosensibles Polymer, das, wenn es auf
eine Temperatur oberhalb von 32°C
erwärmt
wird, hydrophob wird und Proteine durch hydrophobe Wechselwirkungen
binden kann. Für
eine große
Anzahl von Proteinen sind hydrophobe Wechselwirkungen allerdings
denaturierend.
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Die
in Rede stehenden Erfinder haben nun magnetische kolloidale Partikel
aufgefunden, die sämtliche oben
erwähnten
Nachteile reduzieren und insofern ubiquitärer sind, als sie die Isolierung
von Proteinen und Zusammenschlüssen
von Proteinen und Nucleinsäuren
ausgehend von einem komplexen Milieu auf einfache, effiziente und
schnelle Art und Weise ermöglichen
und keine aufwändige
Apparatur erfordern und mit Techniken der enzymatischen Amplifizierung
kompatibel sind. Sie erfordern weder eine schwere Apparatur, noch
viele Handgriffe. Diese Partikel sind also unabhängig von der Umgebung, in der
diese sich befinden, verwendbar und ermöglichen u.a. die Extraktion
von Zusammenschlüssen
von Proteinen und Nucleinsäuren,
jedoch gleichermaßen
die Extraktion von Proteinen.
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Unter
Proteinen werden Holoproteine und Heteroproteine oder deren Fragmente
verstanden, d.h., Lipoproteine, Glykoproteine, Hämoproteine, Phosphoproteine,
Flavoproteine, Metalloproteine, Polypeptide, Antigene, Immunogene,
Antikörper,
Enzyme.
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Unter
Zusammenschluss von Proteinen und Nucleinsäuren werden insbesondere komplexe
Nukleoproteinstrukturen verstanden, wie Chromosomen, Histone und
auch Viren, Bakterien, Pilze.
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Solche
Partikel sind insbesondere in Regionen interessant, in denen hämorrhagische
Fieberviren endemisch sind.
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Insbesondere
können
die Partikel der Erfindung ohne Lyophilisierungsschritt und ohne
Einfrieren transportiert werden, was ohne Zweifel Vorteile mit sich
bringt, insbesondere in Bezug auf die Sicherheit während des
Transportes von infektiösen
Proben. Eine kürzlich
aufgetretene Epidemie im Kongo hat Schwierigkeiten hinsichtlich
des Geländes,
auf das getroffen werden kann, aufgezeigt, als Proben menschlichen
Ursprungs, die ein sehr hohes Kontaminationsrisiko darstellten,
für eine
Diagnose nach Südafrika
transportiert wurden (Weltgesundheitsorganisation, 1999: http://www.who.int/emc/outbreak_news/n1999/may/n28may1999.html).
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Außerdem ermöglichen
es die kolloidalen Partikel der Erfindung, sofern gewünscht, in
Kultur gebrachte Zellen durch ein infektiöses Agens zu infizieren, das
so isoliert, gereinigt, konzentriert und ggf. transportiert wurde.
Darüber
hinaus finden die kolloidalen Partikel der Erfindung zahlreiche
Anwendungen und Verwendungen.
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Beispielsweise
im Falle von Viren ist ein Schritt der Lyse mittels chaotropher
Agenzien, Hitze oder anderer Mittel vor dem Schritt der enzymatischen
Amplifizierung unentbehrlich, was die Verwendung von stabilen Kolloiden
unter stark stringenten Bedingungen erfordert. Die Methode zur Herstellung
dieser stabilen Kolloide ist illustrativ in die Beispiele der vorliegenden
Patentanmeldung mit einbezogen.
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Somit
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung
von Proteinen und/oder eines Zusammenschlusses von Proteinen und
Nucleinsäuren
in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass:
- – die Probe
mit kolloidalen magnetischen Partikeln in Kontakt gebracht wird,
die einen Kern und eine Umhüllung
aufweisen, wobei:
der Kern magnetisch ist und von mindestens
einem Polymer umhüllt
ist, das funktionelle Gruppen X aufweist, die ausgewählt sind
aus Amin-, Hydroxyl-, Thiol-, Aldehyd-, Ester-, Anhydrid-, Säurechlorid-,
Carbonat-, Carbamat-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen oder deren
Gemischen, von denen mindestens eine Fraktion mit anderen funktionellen
Gruppen der Umhüllung
reagiert hat, und
die Umhüllung
aus einem Polymer gebildet ist, das ionisierbare funktionelle Gruppen
Z und Z' trägt, die identisch
oder verschieden sind und ausgewählt
sind aus den Amin-, Carbonsäure-,
Ester-, Anhydrid-, Aldehyd-, Thiol-, Disuifid-, α-Halogencarbonyl-, Sulfonsäure-, Maleinimid-,
Isocyanat- und Isothiocyanatgruppen, die teilweise mit den funktionellen
Gruppen X des Kerns reagiert haben;
um ein Gemisch herzustellen,
- – das
Gemisch unter bestimmten Bedingungen inkubiert wird, und
- – die
Proteine und/oder die Zusammenschlüsse von Proteinen und Nucleinsäuren, die
auf den kolloidalen Partikeln komplexiert sind, durch Anlegen eines
Magnetfeldes von dem Gemisch abgetrennt werden.
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Der
magnetische Kern ist insbesondere fest und aus Metalloxidpartikeln
gebildet oder besteht aus einer Emulsion, die Metalloxidpartikel
oder die Emulsion aus Metalloxidpartikeln aufweist.
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Unter
einer teilweisen Reaktion der funktionellen Gruppen Z, Z' mit X wird verstanden,
dass Z- und/oder Z'-Gruppen
frei verfügbar
bleiben. Sämtliche
oder zumindest ein Teil dieser freien Z- und/oder Z'-Gruppen werden durch ionische Wechselwirkung
mit den ionischen Gruppen der Proteine und/oder der Zusammenschlüsse von
Proteinen und Nucleinsäuren
reagieren.
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Die
unten stehende Tabelle 1 fasst die Komplementarität zwischen
den verschiedenen funktionellen Gruppen X, Z und Z' zusammen.
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Der
Kern der kolloidalen Partikel weist mindestens ein organisches Polymer
auf, das ausgewählt
ist aus mindestens einem Homopolymer oder einem Copolymer oder ihren
Gemischen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer
stammen, das ausgewählt
ist aus Acrylamid- und Acrylatmonomeren, insbesondere N-Alkylacrylamid
und N,N-Dialkylacrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid,
N-n-Propylmethacrylamid,
N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid,
N-Methyl-N-isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid; Alkylacrylaten
und -methacrylaten, in denen der Alkylrest 3 bis 20 Kohlenstoffatome
aufweist; Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, Tertio-Butylstyrol,
Chlormethylstyrolvinyltoluol; ihren Derivaten und den Copolymeren
dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Comonomeren,
und weist Metalloxidpartikel auf, die ausgewählt sind aus den Partikeln
von Metalloxiden von Eisen, Titan, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan,
Nickel; Magnetit; Hämatit,
Ferriten, wie Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink; Kobalt-Nickel-Legierungen.
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Das
Polymer der Umhüllung
ist ausgewählt
aus mindestens einem hydrophilen Homopolymer oder Copolymer, das
aus den folgenden Homopolymeren oder Copolymeren ausgewählt ist:
- – aus
solchen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer
stammen, das ausgewählt
ist aus den Acrylamid- oder Methacrylamidderivaten; Acrylsäure, Methacrylsäure; Acrylat-
und Methacrylatderivaten; Allylamin, Styrolderivaten, mit der Maßgabe, dass,
wenn es sich um ein Homopolymer handelt, dieses ionisierbare funktionelle
Gruppen trägt,
insbesondere Copolymere oder Homopolymere von Maleinsäureanhydrid
und Homopolymere oder Copolymere von Acryloxysuccinimid,
- – aus
Polysacchariden, wie Chitosan und Polygalacturonsäure,
- – aus
Polypeptiden, wie Polylysin und Polyarginin,
- – aus
linearem oder verzweigtem Polyethylenimin, und
- – aus
Dendrimeren;
vorzugsweise Poly(maleinsäureanhydridvinylether), Poly(N-Vinylmorpholin-N-acryloxysuccinimid)
oder Poly(N-Vinylpyrrolidon-N-acryloxysuccinimid).
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Die
Mischung wird einer Inkubation bei einer Temperatur, die bei 15
bis 60°C,
vorzugsweise bei 20 bis 35°C
liegt, für
eine Inkubationsdauer, die bei 5 bis 60 Minuten, vorzugsweise bei
10 Minuten liegt, unterworfen.
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Die
Probe kann eine biologische Probe sein, bspw. eine Entnahme, wie
eine Gewebeentnahme, Gesamtblut oder Serum oder ein Kulturüberstand
oder auch eine Nahrungsmittelentnahme, die Proteine und/oder Zusammenschlüsse von
Proteinen und Nucleinsäuren
aufweist, insbesondere einen Virus, ein Bakterium, eine Hefe, eine
Zelle, ggf. eine Mischung von diesen. Unter Nahrungsmittelentnahme
wird jede Nahrungsmittelprobe verstanden, die durch ein infektiöses Agens
infiziert werden kann oder infiziert worden ist.
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Die
Erfindung betrifft gleichermaßen
ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen und/oder einem Zusammenschluss
von Proteinen und Nucleinsäuren,
gemäß dem aus
einer Probe, bspw. einer Nahrungsmittelentnahme oder einer biologischen
Probe, wie einer Entnahme oder einem Kulturüberstand, ein Virus und/oder
ein Bakterium und/oder eine Hefe und/oder eine Zelle oder eine Mischung
von diesen gemäß dem zuvor
beschriebenen Verfahren isoliert werden, und, wenn nötig, das
Virus, das Bakterium, die Hefe, die Zelle oder ihr Gemisch einem
Schritt der Aussalzung und/oder der partiellen oder vollständigen Denaturierung
zur Extraktion der Proteine und/oder der Nucleinsäuren unterzogen
werden.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Detektion und/oder Quantifizierung
von Proteinen und/oder eines Zusammenschlusses von Proteinen und
Nucleinsäuren
und/oder Nucleinsäuren,
nach dem aus einer Probe, bspw. einer Entnahme oder einem Kulturüberstand,
ein Virus und/oder ein Bakterium und/oder eine Hefe und/oder eine
Zelle und/oder eine Mischung von diesen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren
isoliert werden, und, wenn nötig,
das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die
Zelle und/oder ihr Gemisch einem Schritt der Aussalzung und/oder
der partiellen oder vollständigen
Denaturierung zur Extraktion der Proteine und/oder der Nucleinsäuren unterzogen
werden, und die Proteine durch Immunbestimmung und/oder die Nucleinsäuren durch
Amplifizierung der Letzteren und/oder durch Hybridisierung mit mindestens
einer für
die zu identifizierenden und/oder zu detektierenden und/oder zu quantifizierenden
Nucleinsäuren
spezifischen Nucleotidsonde identifiziert und/oder detektiert und/oder
quantifiziert werden.
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Unter
Immunbestimmung wird die Detektion und/oder die Quantifizierung
von mindestens einem Protein oder mindestens einem Antigen durch
Nachweis eines Protein- oder Antigen/Antikörperkomplexes, insbesondere
durch sog. Western Blot-, Kompetitions- oder Sandwich-Techniken,
verstanden.
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Unter
Amplifizierung werden sämtliche
Techniken verstanden, die zur Amplifizierung von DNA oder von RNA
geeignet sind, insbesondere die PCR, die RT-PCR, NASBA, TMA. Es
kann sich außerdem
um eine quantitative Amplifizierung handeln. Außerdem können die zu identifizierenden
und/oder zu detektierenden und/oder zu quantifizierenden Nucleinsäuren mit
zumindest einer mit jeglichem geeigneten Marker markierten Nucleotidsonde
hybridisiert werden, vorzugsweise wird das Ziel an eine Fängersonde
und eine Detektionssonde hybridisiert. Es können beispielhaft und nicht
einschränkend
die dem Fachmann bekannten Techniken des Southern Blots, Northern
Blots und die ELOSA-Technik (Enzyme Linked Oligosorbent Assay) zitiert
werden (Katz JB et al., Am. J. Vet. Res., Dez. 1993; 54 (12): 2021–6 und François Mallet
et al., Journal of Clinical Microbiology, Juni 1993, S. 1444–1449).
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Bei
den Proteinen handelt es sich um Oberflächenproteine oder intrazelluläre Proteine
eines Virus, eines Bakteriums, einer Hefe oder einer Zelle, und
bei den Nucleinsäuren
handelt es sich um DNA und/oder um RNA. Die Proteine werden entweder
(i) direkt, ohne Aussalzungs- und/oder Denaturierungsschritt, ausgehend von
dem isolierten Virus und/oder dem isolierten Bakterium und/oder
der isolierten Hefe und/oder der isolierten Zelle oder in einem
Kulturüberstand,
oder (ii) indirekt, nach einem Aussalzungs- und/oder partiellen
oder vollständigen
Denaturierungsschritt, der bspw. durch Modifikation des pH-Wertes
(Absenkung oder Erhöhung
des pH-Wertes durch Zugabe einer sauren oder basischen Lösung) durchgeführt wird,
identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert. Die Nucleinsäuren werden
nach einem Aussalzungs- und/oder partiellen oder vollständigen Denaturierungsschritt
des isolierten Virus und/oder des isolierten Bakteriums und/oder
der isolierten Hefe und/oder der isolierten Zelle, der bspw. durch
chemische und/oder physikalische Behandlung durchgeführt wird,
identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert. Eine chemische
Behandlung umfasst bspw. die Verwendung von Tensio-aktiven Agenzien,
wie SDS, LLS, die Verwendung von chaotrophen Agenzien, wie Guanidiniumthiocyanat,
die Verwendung von Enzymen, wie Proteanen (Proteinase K), oder anderer
geeigneter Agenzien. Eine physikalische Behandlung umfasst bspw.
die Sonifizierung, die Erwärmung,
Ultraschall, mechanisches Rühren
(bspw. mit harten Kugeln vom Glastyp) oder Analoges.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Kultivierung eines Virus
und/oder eines Bakteriums und/oder einer Hefe und/oder von Zellen,
nach dem ausgehend von einer Probe, bspw. einer Entnahme oder einem
Kulturüberstand,
das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die
Zellen gemäß dem zuvor
beschriebenen Verfahren isoliert werden, das Virus und/oder das
Bakterium und/oder die Hefe und/oder die so isolierten Zellen in
einem Kulturmedium und unter geeigneten Bedingungen in Kultur gebracht
werden, und, wenn gewünscht,
das Virus und/oder das Bakterium und/oder die Hefe und/oder die
Zellen gemäß dem Fachmann
bekannten Techniken identifiziert und/oder detektiert und/oder quantifiziert
werden.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
einer biologischen Probe, wie eine Entnahme oder ein Kulturüberstand
oder eine Nahrungsmittelentnahme, nach dem aus der Probe die Proteine
und/oder die Zusammenschlüsse
von Proteinen und Nucleinsäuren
gemäß dem obigen
Verfahren isoliert werden und/oder eine Kultur gemäß einem
wie zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt wird.
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Die
Erfindung betrifft ferner einen Komplex, der aus kolloidalen magnetischen
Partikeln und/oder einem Zusammenschluss von Proteinen und Nucleinsäuren gebildet
ist, wobei die Proteine und/oder Nucleinsäuren durch elektrostatische
Wechselwirkungen und/oder durch Adsorption immobilisiert sind. Die
kolloidalen Partikel weisen einen Kern und eine Umhüllung auf,
wobei:
der Kern magnetisch ist und von mindestens einem Polymer
umhüllt
ist, das funktionelle Gruppen X aufweist, die ausgewählt sind
aus den Amin-, Hydroxyl-, Thiol-, Aldehyd-, Ester-, Anhydrid-, Säurechlorid-,
Carbonat-, Carbamat-, Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen oder
deren Gemischen, von denen mindestens eine Fraktion mit anderen
funktionellen Gruppen der Umhüllung
reagiert hat, und
die Umhüllung
aus einem Polymer gebildet ist, das ionisierbare funktionelle Gruppen
Z und Z' trägt, die
identisch oder verschieden sind und ausgewählt sind aus den Amin-, Carbonsäure-, Ester-,
Anhydrid-, Aldehyd-, Thiol-, Disulfid-, α-Halogencarbonyl-, Sulfonsäure-, Maleinimid-,
Isocyanat- und Isothiocyanat-Gruppen, von denen zumindest ein Teil
mit funktionellen Gruppen X des Kernes reagiert hat, und
die
Proteine und/oder Zusammenschlüsse
von Proteinen und Nucleinsäuren
aus einer biologischen Probe, bspw. einer Entnahme, wie einer Gewebeentnahme,
Gesamtblut, Serum oder einem Kulturüberstand oder aus einer Nahrungsmittelentnahme
stammen.
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Insbesondere
ist der Kern der kolloidalen Partikel fest und besteht aus Metalloxidpartikeln,
oder ist im Wesentlichen fest und besteht aus einer Emulsion, die
Metalloxidpartikel aufweist.
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Die
Entnahme oder der Kulturüberstand
sind vorzugsweise durch mindestens ein Virus, ein Bakterium, eine
Hefe oder deren Gemisch aus diesen infiziert.
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Der
Kern weist zumindest ein organisches Polymer auf, das aus mindestens
einem Homopolymer oder einem Copolymer oder ihren Gemischen ausgewählt ist,
die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer stammen,
das ausgewählt
ist aus Acrylamid- und Acrylatmonomeren, insbesondere N-Alkylacrylamid und
N,N-Dialkylacrylamid, wie N-Isopropylacrylamid, N-Methylacrylamid,
N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid,
N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacryl amid, N,N-Diethylacrylamid,
N-Methyl-N-isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid;
Alkylacrylaten und -methacrylaten, in denen die Alkylgruppe 3 bis
20 Kohlenstoffatome aufweist; Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol,
Tertio-Butylstyrol, Chlormethylstyrolvinyltoluol; ihren Derivaten
und den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen
Comonomeren, und weist Metalloxidpartikel auf, die ausgewählt sind
aus Partikeln aus Metalloxiden von Eisen, Titan, Kobalt, Zink, Kupfer,
Mangan, Nickel, Magnetit, Hämatit,
Ferriten, wie Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink, Kobalt-Nickel-Legierungen.
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Das
Polymer der Umhüllung
ist ausgewählt
aus mindestens einem hydrophilen Homopolymer oder Copolymer, das
aus den folgenden Homopolymeren oder Copolymeren ausgewählt ist:
- – aus
solchen, die aus der Polymerisation von mindestens einem Monomer
stammen, das ausgewählt
ist aus den Acrylamid- oder Methacrylamidmonomerderivaten; Acrylsäure, Methacrylsäure; Acrylat-
und Methacrylatderivaten; Allylamin; Styrolderivaten; mit der Maßgabe, dass,
wenn es sich um ein Homopolymer handelt, dieses ionisierbare funktionelle
Gruppen trägt;
insbesondere Copolymere oder Homopolymere von Maleinsäureanhydrid
und Homopolymere oder Copolymere von Acryloxysuccinimid,
- – aus
Polysacchariden, wie Chitosan und Polygalacturonsäure,
- – aus
Polypeptiden, wie Polylysin und Polyarginin,
- – aus
linearem oder verzweigtem Polyethylenimin, und
- – aus
Dendrimeren;
insbesondere aus Poly(maleinsäureanhydridvinylether),
Poly(N-Vinylmorpholin-N-acryloxysuccinimid) oder Poly(N-Vinylpyrroli-don-N-acryloxysuccinimid).
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Der
Komplex wird zur Überführung und/oder
dem Transport und/oder zur Aufbewahrung von infektiösen Partikeln,
insbesondere einem Virus und/oder einem Bakterium und/oder einer
Hefe in getrocknetem Zustand oder in einem geeigneten Puffer verwendet.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Reagenz zur Extraktion und/oder Identifizierung
und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von Proteinen
und/oder Zusammenschlüssen
von Proteinen und Nucleinsäuren, dadurch
gekennzeichnet, dass es, unter anderem, Folgendes aufweist:
einen
wie oben definierten Komplex oder wie oben definierte kolloidale
Partikel, die es ermöglichen,
einen erfindungsgemäßen Komplex
zu erhalten, und
ggf. mindestens ein Mittel zur Identifizierung
und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung der Proteine oder
Nucleinsäuren,
insbesondere mindestens einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper zur
Identifizierung und/oder zur Detektion und/oder zur Quantifizierung
von mindestens einem Protein, mindestens einen Primer, vorzugsweise
mindestens zwei Primer und/oder mindestens eine Nucleotidsonde,
vorzugsweise mindestens zwei Nucleotidprimer, die für mindestens
eine Nucleinsäure
für deren
Identifizierung und/oder Detektion und/oder Quantifizierung spezifisch
sind.
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Schließlich betrifft
die Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens
einen wie zuvor definierten erfindungsgemäßen Komplex, ggf. in Verbindung
mit einem Träger
und/oder einem Exzipienten und/oder einem Adjuvans und/oder einem
pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel,
aufweist.
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Unter „pharmazeutisch
akzeptablem Träger" werden Grundmaterialien
und Träger
verstanden, die einem menschlichen Wesen oder einem Tier verabreicht
werden können,
wie bspw. beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed., Mack Publishing Co. Der pharmazeutisch
akzeptable Träger
ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder weist eine schwache
Hypertonie auf und hat eine relativ niedrige Ionenstärke. Definitionen
von pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten und Adjuvantien sind
gleichermaßen
in dem vorherigen Remington's
Pharmaceutical Sciences angegeben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein für eine Impfstoffzusammensetzung
pharmazeutisch akzeptablen Träger,
der aus einem magnetischen Partikel besteht, der der Definition
der vorliegenden Erfindung entspricht.
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Beispiel 1: Erhalt von
magnetischem Carboxyllatex
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Das
Poly(maleinsäureanhydridmethylvinylether)
(AMVE) wird in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst (2 g/l).
50 μl dieser
AMVE-Lösung
werden in 1 ml Phosphatpuffer (pH 6,8; 10 mM) gelöst, anschließend für 10 Minuten
bei 37°C
inkubiert. Anschließend
werden 1 ml einer Dispersion von magnetischem Aminlatex (0,5% in
Wasser, 1 × der
kritischen mizellaren Konzentration (CMC) von Triton X-405), die
bspw. gemäß dem in
der PCT-Patentanmeldung WO 99/35500 beschriebenen Protokoll hergestellt
wurde, mit 125 μl
der zuvor hergestellten Mischung (AMVE-DMSO-Puffer) gemischt. Die
Mischung wird bei 37°C
für 3 Stunden
inkubiert. Die Partikel können
anschließend
so wie sie sind oder nach einem Reinigungsschritt, bspw. durch Zentrifugation,
gelöst
werden.
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Beispiel 2: Selektive
Extraktion von viralen Partikeln ausgehend von Serum, Plasma oder
Kulturüberstand.
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– Reinigung von viralen Partikeln:
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Zu
5 μl durch
das AMVE-Copolymer funktionalisiertem magnetischem Latex, wie in
Beispiel 1 beschrieben, mit 3% Festigkeitsgrad, werden direkt 100
bis 150 μl
positives Serum hinzugegeben, d.h. ein solches, das virale Partikel
aufweist. Die Probe wird nicht gepuffert.
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Die
Serum-Latex-Mischung wird durch 10-sekündiges Vortexen homogenisiert,
anschließend
bei Raumtemperatur für
10 Minuten belassen, um die Bindung der viralen Partikel durch das
magnetische Latex zu ermöglichen.
Auf diesen Einfangschritt folgt die Wiedergewinnung der Komplexe
aus Latex und viralen Partikeln in Form eines Pellets, das durch
einfache Magnetisierung für
30 Sekunden von dem Überstand
befreit wurde.
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Das
Pellet muss nicht, kann aber einmal mit 100 μl HEPES, pH 6,5 gewaschen, wie
zuvor magnetisiert und anschließend
in 50 μl
sterilem Wasser dispergiert werden.
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– Extraktion von Nucleinsäuren nach
der Lyse der viralen Partikel durch Wärme:
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Die
in Wasser dispergierten Komplexe aus viralen Partikeln und Latex
werden bei 95°C
für 5 Minuten inkubiert,
um die viralen Partikel zu lysieren. Die Nucleinsäuren werden
in dem Überstand
wiedergewonnen, der durch Magnetisierung von dem Latex befreit wurde.
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Beispiel 3: Einfangen
des Hepatitis-G-Virus durch erfindungsgemäß funktionalisiertes magnetisches
Latex.
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Reinigung
von viralen Partikeln
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Zu
5 μl durch
das AMVE-Copolymer funktionalisiertem magnetischem Latex, wie in
Beispiel 1 beschrieben, mit 3% Festigkeitsgrad, werden zunehmende
Volumina, d.h. 25 μl
und 50 μl
nicht-verdünntes humanes
Serum hinzugegeben, das positiv für das Hepatitis-G-Virus ist,
wobei dessen viraler Titer unbekannt ist.
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Die
Serum-Latex-Mischung wird durch 10-sekündiges Vortexen homogenisiert,
anschließend
bei Raumtemperatur für
10 Minuten belassen, um die Bindung der viralen Partikel durch das
magnetische Latex zu ermöglichen.
Auf diesen Einfangschritt folgt die Wiedergewinnung der Komplexe
aus Latex und viralen Partikeln in Form eines Pellets, das durch
einfache Magnetisierung für
5 Minuten von dem Überstand
befreit wurde.
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Das
Pellet wird anschließend
einmal mit 50 μl
HEPES-Tween (0,25%, pH 6,5) gewaschen, wie zuvor magnetisiert und
anschließend
in 50 μl
sterilem Wasser dispergiert.
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– Extraktion von Nucleinsäuren:
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Anschließend wird
ein Schritt der Lyse der viralen Partikel mit Hilfe des Kits QIAmp
Viral RNA Mini Kit (Handelsname) durchgeführt, das von der Firma QIAGEN
vertrieben wird, um die viralen Nucleinsäuren freizusetzen.
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– Amplifizierung von Nucleinsäuren:
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Danach
werden die viralen Nucleinsäuren
in einem Schritt (1) durch RT-PCR (Life Technologies) und durch
verschachtelte PCR (2) amplifiziert, in dem folgende Primerpaare
verwendet werden (Smith DB et al., Discrimination of hepatitis G
virus/GBV-C geographical variants by analysis of the 5' non-coding region,
J. Gen. Virol., 1997, 78: 1533–1542):
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Nach
der zweiten PCR zeigen die Ergebnisse nach dem Lauf durch ein 1%iges
Agarosegel und der Anfärbung
mit Ethidiumbromid eine Bande mit der erwarteten Größe von 343
Basenparen. Der als Referenz verwendete Molekulargewichtsmarker
ist der Smartladder-Marker (Handelsname) (Vielfache von 200 Basenpaare)
der Firma Eurogentec. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das erfindungsgemäße funktionalisierte
Latex in der Lage ist virale Partikel von Hepatitis B einzufangen
und diese bei den Waschschritten zurückzuhalten.
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Ferner
wurden 10 μl
humanes Serum, das positiv für
HGV und dessen Titer unbekannt war, in 3 ml negativem humanem Serum
verdünnt
und in Gegenwart von 10 μl
erfindungsgemäßem Latex
gebracht, das gemäß Beispiel
1 erhalten wurde. Die Schritte der Reinigung der viralen Partikel,
der Extraktion und der Amplifizierung der Nucleinsäuren wurden
wie oben beschrieben durchgeführt.
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Die
erhaltenen Ergebnisse zeigen nach dem Lauf der Amplifizierungsprodukte
durch ein 1%iges Agarosegel und der Anfärbung mit Ethidiumbromid die
Bande mit der erwarteten Größe von 342
Basenpaaren, was die Kapazität
des erfindungsgemäßen Latex
bestätigt,
Viruspartikel ausgehend von einer in einem großen Volumen verdünnten Probe
einzufangen und zurückzuhalten.
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Beispiel 4: Einfangen
des Hepatitis-C-Virus durch erfindungsgemäß funktionalisiertes magnetisches
Latex
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– Reinigung von viralen Partikeln:
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Zu
5 μl des
durch das AMVE-Copolymer funktionalisiertem magnetischem Latex,
wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 3% Festigkeitsgrad, werden 50 μl eines nicht-verdünnten humanen
Serums zugegeben, das für das
Hepatitis-C-Virus positiv ist, wobei dessen viraler Titer unbekannt
ist.
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Die
Serum-Latex-Mischung wird durch 10-sekündiges Vortexen homogenisiert,
anschließend
bei Raumtemperatur für
10 Minuten belassen, um die Bindung der viralen Partikel durch das
magnetische Latex zu ermöglichen.
Auf diesen Einfangschritt folgt die Wiedergewinnung der Komplexe
aus Latex und viralen Partikeln in Form eines Pellets, das durch
einfache Magnetisierung für
5 Minuten von dem Überstand
befreit wurde.
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Das
Pellet wird anschließend
einmal durch 50 μl
HEPES-Tween (0,25%, pH 6,5) gewaschen, wie zuvor magnetisiert und
anschließend
in 50 μl
sterilem Wasser dispergiert.
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– Extraktion von Nucleinsäuren:
-
Anschließend wird
ein Schritt zur Extraktion von Nucleinsäuren mittels des Kits QIAmp
Viral RNA Mini Kit (Handelsname) durchgeführt, das von der Firma QIAGEN
vertrieben wird, um die viralen Nucleinsäuren freizusetzen.
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– Amplifizierung
der Nucleinsäuren:
-
Danach
werden die viralen Nucleinsäuren
in einem Schritt (1) durch RT-PCR (Life Technologies) und durch
halbverschachtelte PCR (2) amplifiziert, in dem folgende Primerpaare
verwendet werden (Li JS et al., Identification of the third major
genotype of hepatitis C in France, BBRC, 1994, 3: 1474–1481):
-
-
-
Nach
der zweiten PCR zeigen die Ergebnisse nach dem Lauf durch ein 1%iges
Agarosegel und der Anfärbung
mit Ethidiumbromid eine Bande mit der erwarteten Größe von 240
Basenparen. Der als Referenz verwendete Molekulargewichtsmarker
ist der Smartladder-Marker (Handelsname) (Vielfache von 200 Basenpaare)
der Firma Eurogentec. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das erfindungsgemäße funktionalisierte
Latex in der Lage ist virale Partikel von Hepatitis C einzufangen
und diese bei den Waschschritten zurückzuhalten.
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Beispiel 5: Detektion
des Maservirus.
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Ausgehend
von zuvor titrierten viralen Proben wird eine Extraktion von Nucleinsäuren mit
Hilfe des von der Firma QIAGEN vertriebenen Kits (QIAmp. Viral RNA
Mini Kit (Handelsnamen)) durchgeführt, entsprechend dem Protokoll
der Lieferfirma. Die Nucleinsäuren
werden anschließend
durch RT-PCR mit Hilfe des TITAN Kits (Handelsname – Roche)
in Gegenwart von 1 μl
RNAse-Inhibitor
(RNAsin, Handelsname – Promega)
oder durch verschachtelte PCR amplifiziert.
- – Titration
der viralen Proben (Edmonston-Stamm): Es werden sukzessive Verdünnungen
des Virus hergestellt (von 10–1 bis 10–7).
200 μl dieser
Verdünnungen
werden in 6 Vertiefungen einer Platte verteilt, die Vero-Zellen
(Nierenzellen der grünen
Meerkatze) enthalten, die in einem 199 Medium kultiviert werden,
das Glutamax (Gibco-BRL), 1% Antibiotika (Gibco-BRL) und 1% fötales Kälberserum
enthält.
Die Vero- Zellen sind
zu 80% konfluent. Es erfolgt eine Inkubation für eine Stunde bei 37°C unter CO2 (5%). 200 μl des Mediums, das das Virus
enthält,
sind entfernt und durch 200 μl
virusfreies Medium ersetzt worden. Es erfolgt eine Inkubation unter
gleichen Bedingungen für
72 bis 96 Stunden. Die Zellen werden anschließend untersucht und die Lyseplaques
werden visualisiert und gezählt.
60 ml der Kultur mit einem Titer von 5,5 × 106 PBE/ml
(Lyse-Plaque-bildende Einheit/ml) wurden erhalten, aliquotiert und
bei –80°C gelagert.
- – Extraktion
von Nucleinsäuren:
die Nucleinsäuren
werden von der Kultur (5,5 × 103 PBE/μl)
mit Hilfe des vorherigen Kits der Firma QIAGEN extrahiert.
- – Amplifizierungen:
die Nucleinsäureextrakte
werden durch RT-PCR amplifiziert, indem die nachfolgenden PCR-Primerpaare verwendet
werden: ggf. gefolgt
von einer verschachtelten PCR, indem die folgenden Primerpaare verwendet
werden:
-
Die
Amplifizierungsprodukte laufen anschließend durch ein 2%iges Agarosegel
(TBE + Gelstar). Bei dem als Referenz verwendeten Molekulargewichtsmarker
handelt es sich um den Smartlad der-Marker (Handelsname) (Vielfache
von 100 Basenpaaren) der Firma Eurogentec. Die Ergebnisse zeigen
eine Bande der erwarteten Größe von 384
Basenpaare für
die RT-PCR und von 309 Basenpaaren für die verschachtelte PCR, was
die gute Extraktion von viralen RNAs und die Wirksamkeit sowohl
der RT-PCR als auch der verschachtelten PCR bestätigt.
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Beispiel 6: Einfangen
des Masernvirus durch das erfindungsgemäß funktionalisierte Latex.
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Nach
dem Erhalt der titrierten viralen Proben, wie in Beispiel 8 beschrieben,
erfolgt die quantitative Bestimmung des Einfangniveaus und der viralen
Detektion durch das Latex aus Beispiel 1. Es wird ein Bereich des
viralen Titers hergestellt, in dem die Stammlösung in dem negativen humanen
Plasma verdünnt
wird. Es werden 1:10-Verdünnungen
in einem Endvolumen von 1000 μl
hergestellt. Die Menge von Latex beträgt 35 μl (945 μg) pro Probe. Nach dem Einfangen
wird eine Extraktion der viralen RNAs mit Hilfe des vorherigen QIAGEN
Kits durchgeführt.
Die Extrakte der viralen RNAs werden anschließend durch RT-PCR, gefolgt
von einer verschachtelten PCR, amplifiziert, indem die Primerpaare
verwendet werden, die in Beispiel 5 beschrieben sind. Die Amplifizierungsprodukte
laufen anschließend
durch ein 2%iges Agarosegel (TBR + Gelstar). Ein Molekulargewichtsmarker
(Vielfache von 200 Basenpaaren) (Smartladder – Eurogentec) wird als Referenz
verwendet. Die Positivkontrolle wird durch Extrakte von Gesamt-RNA
repräsentiert
und die Negativkontrolle wird durch Negativplasma gebildet. Die
Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 wiedergegeben.
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-
Das
Symbol (+) bedeutet das Vorhandensein des Amplifizierungsproduktes
mit erwarteter Größe (309 Basenpaare),
und das Symbol (–)
bedeutet die Abwesenheit des Amplifizierungsproduktes.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass die verschachtelte PCR ein spezifisches
Amplifizierungsprodukt bei bis zu 1 PBE pro Röhrchen (100 μl) ergibt.
Die Abwesenheit des Amplifizierungsproduktes bei einer Verdünnung von
0,1 PBE zeigt, dass es zu keiner Detektion von nicht-infektiösen viralen
Partikeln kommt.
-
Beispiel 7: Untersuchung
der Stabilität
des Komplexes aus Latex und Masernvirus.
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Um
die Stabilität
der Latex/Viruskomplexe hinsichtlich der Detektion von viralen RNAs
durch RT-PCR zu untersuchen, wurden die Komplexe über die
Zeit nachgewiesen. Es wurden mehrere infektiöse Titer getestet sowie andere
Probenbehandlungen, jeweils mit dem Zweck, die Proben durch Reduzierung
der Anzahl von Handhabungen zu erhalten. Die Proben wurden unter
einem Laminarfluss-Abzug bei Raumtemperatur konserviert.
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Die
behandelten oder nicht-behandelten Komplexe wurden an den Tagen
0, 1, 2, 3, 7 bzw. 14 getestet:
| Behandlung
A: | Plasmaprobe,
die Virus und Latex enthält,
die als Basiskontrolle dient (ohne Behandlung). |
| Behandlung
B: | Latex-Virus-Komplex,
nach Entfernung des Plasmas, ohne Waschen und Trocknenlassen. |
| Behandlung
C: | Latex-Virus-Komplex,
nach Entfernung des Plasmas und einem Waschschritt und Trocknenlassen. |
| Behandlung
D: | Latex-Virus-Komplex,
nach Entfernung des Plasmas und einem Waschschritt und Konservieren
in Gegenwart des Waschpuffers. |
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Die
infektiösen
Titer der getesteten Probe betragen für jede Behandlung 50, 500 bzw.
5000 PBE pro Probe.
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Die
Komplexe werden anschließend
durch Hitze lysiert, um die Nucleinsäuren freizusetzen, und die Nucleinsäuren laufen
durch 2%ige Agarosegele (TBE + Gelstar) mit einem als Referenz verwendeten
Molekulargewichtsmarker (Smartladder – Eurogentec).
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Die
Ergebnisse unter diesen experimentellen Bedingungen zeigen, dass
die Behandlung B es nicht erlaubt, die Viruspartikel stabil zu halten.
Es sollte jedoch festgehalten werden, dass bei Durchführung eines Waschschrittes
vor dem Schritt der Extraktion der Nucleinsäuren das erfindungsgemäße Latex
die Partikel stabil hält,
wie dies die Erfinder in einem weiteren Experiment gezeigt haben.
Hingegen ermöglichen
es die Komplexe C und D, die einem Waschschritt unterzogen werden,
die Proben ohne Degradierung der RNAs zu konservieren, wie dies
durch RT-PCR demonstriert wurde. Dies bedeutet, dass ein Waschschritt
in dem Puffer für die
Konservierung der eingefangenen Probe notwendig ist, dass Letztere
im Puffer oder trocken konserviert wird, wenn in dem Extraktionsröhrchen der
Lyseschritt durchgeführt
wird, wobei jedoch ein Mittel zur Vermeidung dieses Waschschrittes
darin besteht, das Röhrchen
zu wechseln. Es versteht sich, dass eine Trockenkonservierung vorteilhafter
ist, denn diese ermöglicht
es die eingefangenen Proben an einen Analyseort zu transportieren,
wobei jedes Risiko von Kontamination und Verschmutzung vermieden
wird.
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Beispiel 8: Einfangen
des Masernvirus ausgehend von Gesamtblut.
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Es
wurden Versuche ausgehend von Gesamtblut durchgeführt. Im
humanen Gesamtblut und Plasma des gleichen Ursprungs wurde ein Virusbereich
mit der gleichen Menge von Latex erstellt. Die Komplexe aus Latex
und viralen Partikeln wurden einer Wärmebehandlung unterzogen, um
die Nucleinsäuren
zu extrahieren. Die freigesetzten Nucleinsäuren wurden durch RT-PCR mit
Hilfe der zuvor beschriebenen Primer amplifiziert.
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Die
Ergebnisse, die nach dem Lauf der Amplifizierungsprodukte durch
ein 2%iges Agarosegel (TBE + Gelstar) erhalten wurden, zeigen ausgehend
von einem viralen Titer von 5 × 103 PBE in Gesamtblut und ausgehend von 50
PBE in Plasma eine Bande von der erwarteten Größe von 384 Basenpaaren. Diese
Ergebnisse zeigen, dass es möglich
ist, virale Partikel ausgehend von Gesamtblut zu isolieren, obwohl
dies deutlich weniger effektiv gelingt, als ausgehend von Plasma.
Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 3 zusammengefasst.
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Beispiel 9: In-Kultur-Bringen
des eingefangenen Masernvirus.
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Es
wurde ein Virusbereich ausgehend von humanem Plasma, wie beschrieben
in Beispiel 2 (s. Tabelle 2), erstellt und getestet. Die Komplexe
aus magnetischem Latex und Masernvirus wurden in Gegenwart von Vero-Zellen,
die in einem 199 Medium kultiviert wurden, das Glutamax (Gibco-BRL),
1% Antibiotika (GIBCO-BRL)
und 10% fötales
Kälberserum
enthält,
in Kultur gegeben. Die Kultivierungsbedingungen wurden wie in Beispiel
5 eingestellt. Am selben Tag des In-Kultur-Bringens wurde auf diesen
Virusbereich eine RT-PCR durchgeführt, um das Vorhandensein des
Virus in der in Kultur gebrachten Probe zu bestätigen. Die Zellen der Kultur
wurden anschließend
unter dem Mikroskop beobachtet, um einen zytopathischen Effekt nachzuweisen, der
durch das infektiöse
Virus in der Kultur induziert wurde. Ein zytopathischer Effekt wurde
am Ende des dritten Tages für
Proben beobachtet, deren infektiöser
Titer 5 × 104 und 5 × 103 PBE/ml betrug, und nach 5 Tagen für Proben,
deren infektiöser
Titer 500 und 50 PBE/ml betrug.
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Beispiel 10: Einfangen
des Virus der erworbenen Immunschwäche (HIV-1) durch das erfindungsgemäße funktionalisierte
Latex ausgehend von einem Kulturüberstand
und Untersuchung der viralen Lebensfähigkeit.
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– Viruseinfang:
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Ein
HIV-1-Virusstamm der Gruppe M, Untertyp G, wurde in Gegenwart von
PBMCs (periphere mononukleare Blutzellen) in einem RPMI-Kultivierungsmedium,
versetzt mit 10% fötalem
Kälberserum,
kultiviert. Das Vorhandensein des Virus wurde am 14. Kultivierungstag
durch eine P24-Antigendetektion (31637,8 pg/ml, 1:100 Verdünnung) in
dem Kulturüberstand
mit Hilfe des immunoenzymatischen Tests VIDAS HIV P24 II bestätigt, der
mit der VIDAS-Vorrichtung (eingetragene Marke – bioMérieux) durchgeführt wurde.
150 μl dieses Kulturüberstandes
wurden für
10 Minuten bei Raumtemperatur und unter Rühren in Gegenwart von 10 μl magnetischem
Latex gebracht, das wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurde.
Dem Einfangschritt folgt ein Magnetisierungsschritt, um das Pellet
von dem Kulturüberstand
zu trennen und das so erhaltene Pellet (Latex-Virus-Komplex) wurde
mit ungefähr
100 μl RPMI-Kulturmedium
gewaschen, anschließend
erneut magnetisiert und in 10 μl
RPMI-Medium resuspendiert.
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– Lebensfähigkeit:
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10 μl des wie
oben beschriebenen Latex-Virus-Komplexes wurden in Gegenwart eines
frisch präparierten
PBMC-Pellets (25 × 106 Zellen) gebracht. Der gesamte Ansatz wurde
homogenisiert, anschließend
für den
Schritt der Infektion der PBMCs bei 37°C unter CO2-Atmosphäre (5%)
inkubiert. Anschließend
wurden 15 ml des RPMI-Mediums zugegeben. Der gesamte Ansatz wurde
homogenisiert und 5 ml des Mediums wurden am Tag T0 entnommen und
einer Zentrifugation bei 1100 upm für 10 Minuten unterzogen. 1
ml des Überstandes
dient der Bestimmung des P24 und der Rest wird in das entsprechende
Kulturmedium gegeben. Parallel wurden die frisch präparierten
PBMCs unter denselben Bedingungen in Gegenwart von 10 μl alleinigem
Latex (ohne Virus) gegeben, um die Negativkontrolle zu bilden. Die
Bestimmung des P24-Antigens erfolgte mittels des immunenzymatischen
Tests (VIDAS HIV P24 II) mit der VIDAS-Vorrichtung in dem Kontroll-
und infizierten Kulturüberstand
jeweils an den Tagen T0, T2, T4, T7, T9, T11, T14, T16 und T18.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen einen signifikanten Anstieg des
P24-Antigens in dem Kulturüberstand
des 14. Kultivierungstages, was einerseits bestätigt, dass das Virus gut durch
das erfindungsgemäße Latex
eingefangen wurde, und dass andererseits dieses nach dem Einfangen
dessen Lebensfähigkeit
und dessen Replikationsvermögen
(Infektiosität)
erhält.
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Beispiel 11: Einfangen
des Hepatitis-B-Virus (HBV).
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Ausgehend
von HBV-positivem Serum wurden 1:10-Verdünnungen in einem Endvolumen
von 150 ml hergestellt, die 10 000 bis 10 Viruskopien enthalten.
Das Einfangen des Virus und die Extraktion der viralen DNA wurden
gemäß dem in
Beispiel 2 beschriebenen Protokoll durchgeführt.
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Die
Detektion der Anzahl der viralen Kopien erfolgte durch verschachtelte
PCR, indem Primer verwendet wurden, die in dem S-Bereich des HBV-Genoms
definiert sind, um ein Fragment von 440 Basenpaaren zu amplifizieren.
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Die
Amplifizierungsprodukte laufen anschließend durch ein 1%iges Agarosegel
und werden mit Ethidiumbromid angefärbt. Bei einer Verdünnung von
10–3 wird
ein Signal detektiert, das einer Detektionsschwelle von 10 HBV-Kopien
entspricht, was eine gute Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Einfangsystems
repräsentiert.
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Ferner
wurde positives humanes Serum in negativem humanem Serum derart
verdünnt,
so dass 100 HBV-Kopien in zwei verschiedenen Volumina von 100 und
1000 μl
erhalten wurden, um einen potentiellen Effekt der Konzentration
des erfindungsgemäßen Latex
zu untersuchen. Nach dem Einfangen der in den beiden verdünnten Proben
enthaltenen viralen Partikel durch 10 μl Latex wurden die Nucleinsäuren durch
Lyse über Hitze
extrahiert und durch verschachtelte PCR amplifiziert, indem die
oben beschriebenen Primer benutzt wurden. Die erhaltenen Amplifizierungsprodukte
liefen anschließend
durch ein 1%iges Agarosegel und wurden mit Ethidiumbromid angefärbt. Die
Ergebnisse zeigen für
die Produkte, die ausgehend von den beiden verdünnten Proben erhalten wurden,
eine Bande mit der erwarteten Größe von 440
Basenpaaren. Die Intensität
der Anfärbung
der beiden amplifizierten Fragmente, die jeweils aus den oben genannten
verdünnten
Proben stammen, erweisen sich als identisch, was ein Effekt der
Konzentration des erfindungsgemäßen magnetischen
Latex demonstriert.
