EP2655616A1 - Extraktion von nukleinsäuren - Google Patents

Extraktion von nukleinsäuren

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Publication number
EP2655616A1
EP2655616A1 EP11802388.6A EP11802388A EP2655616A1 EP 2655616 A1 EP2655616 A1 EP 2655616A1 EP 11802388 A EP11802388 A EP 11802388A EP 2655616 A1 EP2655616 A1 EP 2655616A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
sample
ion exchange
pvpp
supernatant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11802388.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Steffen Mergemeier
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Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to EP11802388.6A priority Critical patent/EP2655616A1/de
Publication of EP2655616A1 publication Critical patent/EP2655616A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase

Definitions

  • the invention relates to a method for extracting nucleic acids by means of a nucleic acid extraction material comprising at least one ion exchange material and PVPP. Furthermore, the invention relates to the use of the extraction material and a kit for nucleic acid extraction.
  • PCR polymerase chain reaction
  • nucleic acids can be amplified very quickly and effectively, and then sequenced or detected.
  • An important application of PCR is clinical diagnostics.
  • the technique is used, inter alia, for the detection of pathogens such as noroviruses.
  • Another field of application is food analysis. For example, it is possible to detect contamination with Salmonella or the presence of allergens in food samples.
  • EP 0 643 140 B1 describes a method for the determination of nucleic acids by detecting the amplification product of the PCR using a dye compound.
  • the dye does not fluoresce in the free state. Only in the reaction with a double-stranded nucleic acid fluorescence can be detected. This makes it possible to determine the type and number of bacteria in a sample.
  • Pathogenic microorganisms detected by means of PCR in food are, for example, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni and Salmonella.
  • Food contaminated with pathogenic microorganisms causes diseases such as salmonellosis or listeriosis.
  • Regular checks of product batches are necessary to prevent germ-laden foods from entering the market.
  • Conventional microbial salmon // a detection in foods required more than 3 days of long enrichment times.
  • the real-time PCR as By contrast, the sensitive detection method offers the advantage that a result is already known after one day.
  • the analysis of foods such as milk, dairy products and eggs as well as egg products and meat is essential. Furthermore, it is important to detect not only bacteria but also certain viruses in food. Noroviruses are considered to cause acute gastroenteritis.
  • the noroviruses belong to the family of the Calciviridae and are single-stranded, envelope-less RNA viruses which are distributed worldwide.
  • the characteristic clinical picture of acute gastroenteritis includes severe nausea, followed by sudden vomiting and diarrhea, rarely fever. After 12 to 60 hours, the virus is eliminated from the body. Therapy is purely symptomatic and consists of adequate supply of fluid and electrolytes.
  • the noroviruses are excreted via the stool and the vomit.
  • the stool contains a particularly high virus concentration, a dose of less than 100 virus particles is sufficient for an infection.
  • the virus is highly infectious and environmentally stable.
  • the infection is fecal-oral, for example, by hand contact with contaminated surfaces or by oral uptake virus-containing droplets in severe vomiting.
  • the detection of noroviruses can be done on the one hand with an ELISA or on the detection of nucleic acids. Detection with the PCR technique requires a reverse transcriptase. The transcribed RNA is amplified and detected as cDNA (complementary deoxyribonucleic acid). The detection of noroviruses by RT-PCR is much more sensitive and specific than the detection with an ELISA.
  • the purification of nucleic acids on solid phases based on a silica matrix is a technique used in many commercial kits.
  • the principle of purification is based on the binding of the nucleic acids to the solid phase as a function of the pH and of the salt concentration of the buffer. Under chaotropic conditions, the network of hydrogen-bond relationships in the water is disturbed. This repeals the formation of a hydrate shell around the macromolecules (DNA, RNA). In the absence of the chaotropic ions, further Once a hydrate shell out, so that the interaction between silica membrane and macromolecule is repealed.
  • this type of purification was implemented on the one hand in the spin-filter method and on the other hand in the magnetic beads technology.
  • a nucleic acid extraction is disclosed.
  • the extraction takes place in four steps: cell lysis, binding of the nucleic acids to a matrix, and washing and elution of the nucleic acids.
  • the disadvantage here is that the extraction is very time consuming because z. B. numerous washing steps must be performed, in which always nucleic acid is washed out with. This significantly reduces the yield of nucleic acid.
  • this extraction method is difficult to automate.
  • nucleic acids with a silica matrix uses molecules with a large surface area that has a magnetic moment when exposed to a magnetic field.
  • colloidal magnetite Fe 3 O 4
  • colloidal magnetite uses surface-modified porous glasses.
  • These magnetic beads and a special binding buffer are added after lysis of the sample.
  • the nucleic acids bind to the silica matrix.
  • the beads collect on the edge of the vessel and the impurities can be removed in several washing steps.
  • the target molecules dissolve. If a new magnetic field is applied, the elution buffer can be separated from the beads with nucleic acids.
  • the advantage of this technique is the high degree of automation of the work processes with a low expenditure on equipment.
  • EP 1 574 584 B1 describes a method for isolating bacteria from biological samples.
  • the methods are suitable for sample preparation of biological samples for nucleic acid-based or immunodiagnostic detection of bacteria.
  • bacteria are detected and isolated by means of a specific antibody.
  • a disadvantage of the prior art is that also reduces the amount of nucleic acid to be isolated by the numerous purification steps and thus the yield is significantly reduced.
  • the numerous purification steps furthermore lead to the extraction taking a very long time.
  • the methods described in the prior art are difficult or impossible to automate. Furthermore, the extraction can not be performed on all samples.
  • the object of the invention was therefore to provide a nucleic acid extraction which does not have the disadvantages or deficiencies of the prior art.
  • nucleic acid extraction material which does not have the disadvantages of the prior art and comprises at least polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) and an ion exchange material.
  • PVPP polyvinylpolypyrrolidone
  • the extraction material according to the invention enables rapid and material-saving extraction or purification of nucleic acids.
  • the extraction material can also be used advantageously for automation processes. In addition, it is universally applicable and does not have to be adapted to individual applications.
  • the ion exchange material is preferably selected from the group comprising Sephadex, Chelex, zeolites and / or Sepharose.
  • Sephadex describes in particular a three-dimensionally crosslinked polysaccharide which is obtained by cross-linking the linear macromolecules of dextran.
  • Sephadex is indifferent to cations and anions and contains many hydroxy groups, making it highly hydrophilic and swelling in water or an electrolyte solution.
  • Sephadex may be conjugated to functional groups comprising diethylaminoethyl, diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl, carboxymethyl or sulfopropyl groups.
  • Sephadex is advantageously selected from the group comprising Sephadex G-10, Sephadex G-100, Sephadex G-15, Sephadex G-25, Sephadex G-50 and / or Sephadex G-75.
  • Chelex also refers to a polymer within the meaning of the invention, which preferably binds ions.
  • zeolites are crystalline aluminosilicates.
  • the crystal lattices of the zeolites are in particular composed of Si0 4 and Al0 4 tetrahedra, which are each linked to one another via oxygen bridges and preferably form rings or prisms.
  • SBUs secondary building units
  • zeolites a spatial arrangement of identical cavities, which are accessible via windows (pore openings) or three-dimensional duct systems.
  • Sepharose refers to a modified agarose-based polysaccharide whose polysaccharide chains are linked to form a three-dimensional network.
  • PVPP denotes in particular polyvinylpolypyrrolidones (also crospovidone, derived from cross-linked polyvinylpyrrolidone), which arises in particular when vinylpyrrolidinone is heated with alkalis or divinyl compounds.
  • PVPP is a cross-linked polymer, which is essentially insoluble in water and all solvents.
  • PVPP is advantageously a vinyl monomer copolymer. It may be preferred to use another vinyl monomer copolymer instead of PVPP or in combination with PVPP for a preferred nucleic acid extraction material.
  • a copolymer consisting of vinyl monomers preferably has the general formula on.
  • X is a heteroatom or a pe attached via a heteroatom.
  • Table shows preferred groups:
  • X alkyl (1-alkenes), aryl (for example styrene), OR (vinyl ether), O-CO-R (vinyl ester), COOR (acrylic acid and its ester), CONR 2 (acrylamide ), CN (acrylonitrile), NR 2 (vinylamines), NH-CO-R (vinylamides), S0 3 H (vinylsulfonic acid), PO (OH) 2 (vinylphosphonic acid) and others.
  • the extraction material may advantageously be present as a loose powder, tablet, pellet or chromatography column filler comprising at least one ion exchange material and one PVPP moiety. It is preferred that the loose powder, the tablet, the pellet or the chromatography column filling material contain the ion exchange material and the PVPP fraction in a particle size fraction of 5-1000 ⁇ m, preferably in a range of 50-250 ⁇ m. It was completely surprising that components of samples can be bound by means of the extraction material according to the invention, wherein the nucleic acid to be isolated does not bind.
  • the extraction material is used for sample preparation, in particular for the preparation of samples, preferably nucleic acid samples for PCR analysis.
  • a sample is preferably a culture medium, a body fluid and / or a mixture of material of plant and / or animal origin.
  • nucleic acids can also be extracted from food samples.
  • body fluids z. Stool, saliva, blood, lymph, urine, synovial fluid, digestive juices, secretions, excretions or fluid excretion or other fluids of an organism.
  • the sample may be in liquid or solid form, with a solid form within the meaning of the invention also including frozen samples or tissue or bone samples. includes samples.
  • microorganisms are preferably cultured in a culture medium, the culture medium including all nutrients relevant for microorganisms.
  • the culture medium may be in solid or liquid form and is particularly useful for the culture of microorganisms including bacteria, archaea, fungi, microalgae, protozoa and viruses.
  • RNA refers to an elongated molecule consisting of nucleotides, which has the main function in the cell of converting the genetic information stored in the deoxyribonucleic acid (DNA).
  • mRNA which, as a transcript of the genes, provides the information on protein biosynthesis (translation)
  • rRNA which is available in the form of various species (5S, 16S, 23S in bacteria and 5S, 5,8S, 18S , 28S in higher organisms) is represented in the ribosomes
  • the tRNA which mediates the incorporation of the activated amino acids into the growing protein chain on the ribosomes.
  • RNA molecules can also have enzymatic activities (ribozymes) or take over regulatory function through RNA interference (siRNA, miRNA).
  • siRNA RNA interference
  • miRNA RNA interference
  • RNA viruses the RNA itself carries genetic information. It was completely surprising that RNA comprising mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, miRNA, viral RNA or hnRNA can be extracted from a sample by means of a preferred extraction material.
  • DNA can also be isolated from a sample.
  • DNA refers in particular to long-chain polynucleotides which contain the main genetic information (the genome) of the living beings stored therein.
  • the majority of DNA is contained in eukaryotes in the nucleus, in the chromosomes or chromatin. In bacteria, it is not located in a separate cell organelle and usually consists of a single, closed-ring molecule. In addition to the genomic DNA, bacteria contain smaller, likewise ring-shaped DNA molecules, the easily transferable plasmids. It was completely surprising that DNA can be isolated simply and quickly by means of the nucleic acid extraction material. The DNA is in the Essentially not damaged and can be fed as a whole to a subsequent analysis.
  • the invention therefore also encompasses a method for purifying a nucleic acid present in a sample on an analytical or preparative scale, comprising a matrix comprising a. a synthetic or natural ion exchange material and b. a crosslinked polymer having a pyrrolidone structure wherein the sample is contacted with the matrix and, in particular, interacts with the matrix undesirable constituents of the sample comprising proteins, salts, carbohydrates, ions and / or fats.
  • the method for sample preparation for the extraction of nucleic acids from a sample comprises the following steps:
  • nucleic acids from samples, preferably body fluids, plant or animal samples and / or culture media.
  • samples preferably body fluids, plant or animal samples and / or culture media.
  • bacterial or viral nucleic acids from stool samples, nucleic acid-associated nucleic acids from plant or animal samples, and / or nucleic acid from culture media samples.
  • the method can also be carried out fully or partially automatically on a small or large scale.
  • the sample to be examined is brought into contact with a lysis buffer in a first step.
  • lysis refers in particular to the dissolution (lysis) of cells with the assistance of lytic enzymes (lysozymes) and destruction of the cell membranes (cytolysis).
  • lytic enzymes lysozymes
  • cytolysis destruction of the cell membranes
  • the sample be disrupted by mechanical methods such as sonication, French press or glass bead mill.
  • a lysis buffer is preferred since this will damage the nucleic acids less.
  • the lysis buffer in a preferred embodiment comprises a buffer which adjusts a preferred pH range.
  • the lysis buffer is Triton, preferably Triton X-15, X-35, X-45, X-100, X-102, X-104, X-114, X-165, X-305, X-405 and / or X-705.
  • Triton is a nonionic surfactant from the octylphenol ethoxylate group that denatures proteins.
  • Surfactants are amphiphilic (bifunctional) compounds having at least one hydrophobic and one hydrophilic moiety.
  • the hydrophobic radical is usually a possible linear hydrocarbon chain with preferably 8 to 22 carbon atoms.
  • the hydrophilic moiety is either a negatively or positively electrically charged (hydratable) or a neutral polar head group.
  • Surfactant betaines or amino acid surfactants carry negatively and positively charged groups in a molecule.
  • Advantageous properties of the surfactants are the oriented adsorption at interfaces and the aggregation to micelles and the formation of lyotropic phases.
  • Nonionic surfactants have an uncharged, water-solubilizing head group.
  • the buffer to which Triton was added significantly improved the nucleic acid extraction yield.
  • the purified nucleic acid has a high purity, ie it is essentially contaminated by no other ingredients.
  • the purity of the nucleic acid plays an important role in particular in further analysis methods, since numerous enzymes, such as DNA polymerase, are impaired by impurities in their function. This may lead to incorrect results. men.
  • the extraction material of the present invention can be considered as a technical advance, since the nucleic acid is not damaged during extraction and thus represents an optimal starting material for subsequent analyzes. In addition, no further precipitation reactions are necessary to remove further impurities - the extracted nucleic acid can be reused in this form.
  • the mixture of lysis buffer and sample may be preferable to heat or heat the mixture of lysis buffer and sample to ensure complete lysis of the cellular components. It has proven to be extremely advantageous to heat / heat the mixture, preferably stool to 80 ° C to 95 ° C, preferably 90 ° C for 5 minutes to 15 minutes, more preferably for 7 to 10 minutes. At the preferred temperatures, substantially complete denaturation of the proteinogenic components of the sample is achieved, with no damage to the nucleic acid.
  • the sample is preferably centrifuged to form, at room temperature, a Triton phase comprising both undissolved sample constituents and non-polar constituents.
  • an aqueous phase-a supernatant-in which the nucleic acid is present advantageously forms.
  • This supernatant can for example be applied to a centrifuge filter and centrifuged.
  • a preferred filter is, for example, a spin filter.
  • the filter comprises the nucleic acid extraction material, in particular PVPP and an ion exchange material. The nucleic acid permeates the filter and is in solution, with all inhibiting components being bound by the ion exchange material and PVPP and unable to penetrate the filter.
  • the extraction material is in the form of a tablet, pellet or chromatography column filler comprising at least one ion exchange material and one PVPP moiety. It was completely surprising that the extraction material can be carried out as a tablet. This is a easy transport and storage of the extraction material possible.
  • the contacting is carried out so that the supernatant is contacted with a tablet comprising PVPP and ion exchange material and that the mixture thus obtained is again centrifuged and the supernatant is used in particular for a PCR reaction.
  • the tablet After lysing the sample, the tablet can be added to the supernatant. As a result, a rapid extraction of the nucleic acid is possible. It may further be preferred that the lysis buffer and / or ion exchange material be present as a tablet.
  • the lysis buffer in tablet form is added to the sample, whereby the tablet dissolves and lyses the sample.
  • the ion exchange material tablet may be advantageously incorporated into the supernatant with the PVPP.
  • contacting the supernatant with the nucleic acid extraction material is such that the supernatant is applied to a chromatography column comprising the nucleic acid extraction material and that the eluate recovered from the column used in a PCR method.
  • chromatography means, in particular, the physico-chemical separation of substance mixtures on account of their different distribution between a stationary phase and a mobile phase. The individual components are delayed differently as a result of different strong interactions with the stationary phase in relation to the mobile phase; They therefore travel different distances in the same time.
  • Preferred chromatographies are z.
  • Chromatography can provide fast and efficient purification of the sample because the nucleic acid extraction material comprising ion exchange material and PVPP is present in the column as a chromatography column filler. As a result, the purity of the extracted nucleic acid after Chromatgraphie is very high. In essence, any inhibiting or interfering components from the sample can be separated from the nucleic acid by chromatography. The components are preferably retained in the column, with the nucleic acid passing through the column. If only one particular nucleic acid is to be analyzed, digestion can take place by the addition of enzymes.
  • RNA can be digested and separated by DNases.
  • RNA can be digested by RNases if only the DNA is to be analyzed.
  • the extraction material is used for sample preparation, in particular for the preparation of nucleic acid samples for PCR analysis.
  • a PCR preferably includes long-range PCR, nested PCR, inverse PCR, anchored PCR, RT-PCR and quantitative RT-PCR (also real-time PCR).
  • PCR inhibitors are generally divided into three categories: (1) inactivation of the DNA polymerase, (2) degradation of the nucleic acids and (3) the negative influence on the lysis.
  • Inhibitory substances include salts, ions (eg calcium ions), fats or proteins.
  • compounds used for sample preparation also have an inhibiting effect, such as, for example, ethanol or detergents, such as sodium dodecyl sulfate. It was completely surprising that inhibiting components can be easily and quickly separated from the nucleic acid.
  • the nucleic acid does not have to be eluted from a matrix by numerous elution steps, but the components are bound and the nucleic acid is preferably present in a solution.
  • the separation or binding of the constituents which may optionally inhibit a subsequent PCR is effected in particular by two mechanisms.
  • the first mechanism involves the binding of non-polar compounds in an aqueous phase of the sample, in particular by PVPP, which forms a nonaqueous phase under defined conditions.
  • the second mechanism inhibitors of the aqueous phase are removed by separation by molecular weight differences by means of the ion exchange material.
  • a nucleic acid extracted by means of the extraction material can also be characterized by other analysis or quantification methods become.
  • the cut nucleic acid can then be analyzed by gel electrophoresis, for example.
  • the analysis of the extracted nucleic acid by means of microarray methods or other high-throughput screening methods is also preferred.
  • the invention further relates to a nucleic acid extraction kit comprising at least one ion exchange material and PVPP.
  • a nucleic acid extraction kit comprising at least one ion exchange material and PVPP.
  • the kit may also comprise a lysis buffer, in particular in tablet form.
  • the ion exchange material may also be in tablet form.
  • the invention may also be considered as a combination invention.
  • the combination of the known elements ion exchange material and PVPP leads to surprising effects in the extraction of nucleic acids. Only the combination of these compounds leads to synergistic advantages, which bring about an efficient separation of the inhibiting components from the nucleic acids.
  • the constituents bind to the combination of ion exchange material and PVPP, whereby the nucleic acids can not interact with the ion exchange material or PVPP and thus be easily separated from the constituents.

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Nukleinsäuren-Extraktionsmaterial, welches mindestens ein Ionenaustauschmaterial und PVPP umfasst.

Description

Extraktion von Nukleinsäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels einem Nukleinsäuren-Extraktionsmaterial, welches mindestens ein lonenaustauschmaterial und PVPP umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des Extraktionsmaterials und einen Kit zur Nukleinsäuren-Extraktion.
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR Polymerase chain reaction) ist eine der wichtigsten biochemischen Methoden zur Amplifikation von Nukleinsäuren. Mit dieser Technik können Nukleinsäuren sehr schnell und effektiv amplifiziert und anschließend sequenziert oder nachgewiesen werden. Ein wichtiges Einsatzgebiet der PCR ist die klinische Diagnostik. Hier wird die Technik unter anderem für den Nachweis von Krankheitserregern wie Noroviren eingesetzt. Ein anderes Einsatzgebiet ist die Lebensmittelanalytik. So ist es zum Beispiel möglich, in Lebensmittelproben Konta- minationen mit Salmonellen oder die Anwesenheit von Allergenen nachzuweisen.
Ein weiterer Bereich der PCR ist die Analyse hinsichtlich pathogener Mikroorganismen in Lebensmitteln. So beschreibt beispielweise die EP 0 643 140 B1 ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren durch den Nachweis des Amplifikationsprodukts der PCR unter Verwendung einer Farbstoffverbindung. Der Farbstoff fluoresziert nicht im freien Zustand. Erst bei der Umsetzung mit einer doppelsträngigen Nukleinsäure kann eine Fluoreszenz festgestellt werden. Hierdurch ist es möglich, die Art und Anzahl von Bakterien in einer Probe zu bestimmen.
Pathogene Mikroorganismen, die mittels PCR-Verfahren in Lebensmitteln nachge- wiesen werden sind beispielsweise Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni und Salmonellen. Mit pathogenen Mikroorganismen kontaminierte Nahrung sorgt für Erkrankungen wie Salmonellose oder Listeriose. Regelmäßige Kontrollen der Produktchargen sind notwendig, damit keimbelastete Lebensmittel nicht in den Handel gelangen. Der konventionelle mikrobielle Sa/mone//a-Nachweis in Lebensmitteln benötigte durch lange Anreicherungszeiten mehr als 3 Tage. Die real-time PCR als sensitive Nachweismethode bietet dahingegen den Vorteil, dass ein Ergebnis schon nach einem Tag feststeht. Die Analyse von Lebensmitteln wie Milch, Milchprodukten und Eiern sowie Eierzeugnisse und Fleisch ist unerlässlich. Weiterhin ist es wichtig, neben Bakterien auch bestimmte Viren in Lebensmitteln zu detektieren. Noroviren gelten als Erreger akuter Gastroenteritiden. Die Noroviren gehören in die Familie der Calciviridae und sind einzelsträngige, hüllenlose RNA-Viren die weltweit verbreitet sind. Zu dem charakteristischen Krankheitsbild einer akuten Gastroenteritis gehört starke Übelkeit, gefolgt von plötzlichem Erbrechen und Durchfällen, selten mit Fieber. Nach 12 bis 60 Stunden ist das Virus aus dem Körper ausgeschieden. Eine Therapie erfolgt rein symptomatisch und besteht aus ausreichender Zufuhr von Flüssigkeit und Elektrolyten. Die Noroviren werden über den Stuhl und das Erbrochene ausgeschieden. Der Stuhl enthält dabei eine besonders hohe Viruskonzentration, für eine Infektion ist eine Dosis mit weniger als 100 Viruspartikeln ausreichend. Das Virus ist hochinfektiös und umweltstabil. Die Ansteckung erfolgt fäkal-oral, zum Beispiel durch Handkontakt mit kontaminierten Flächen oder durch orale Aufnahme virushaltiger Tröpfchen bei starkem Erbrechen. Der Nachweis von Noroviren kann einerseits mit einem ELISA oder über die Detektion von Nukleinsäuren erfolgen. Der Nachweis mit der PCR-Technik macht eine reverse Transkriptase notwendig. Die transkriptierte RNA wird als cDNA (complementary Desoxyribonucleic acid) verviel- fältigt und detektiert. Der Nachweis von Noroviren mittels RT-PCR ist deutlich sensitiver und spezifischer als der Nachweis mit einem ELISA.
Für die Untersuchung von Lebensmittelproben oder sonstigen Proben mit Hilfe der PCR ist eine genaue Probenvorbereitung und Nukleinsäureaufreinigung sowie Entfernung der Inhibitoren von großer Bedeutung, da inhibitorische Substanzen den Erfolg der PCR beeinträchtigen in dem sie die Amplifikation unterdrücken, die Taq- Polymerase inaktivieren oder das Messsignal unterdrücken.
Die Aufreinigung von Nukleinsäuren an festen Phasen, die auf einer Silicamatrix basieren, ist eine in vielen kommerziellen Kits angewande Technik. Das Prinzip der Reinigung beruht auf der Bindung der Nukleinsäuren an der Festphase in Abhän- gigkeit vom pH-Wert und von der Salzkonzentration des Puffers. Unter chaotropen Bedingungen wird das Netzwerk der Wasserstoff-Brücken-Beziehungen im Wasser gestört. Dadurch wird die Ausbildung einer Hydrathülle um die Makromoleküle (DNA, RNA) aufgehoben. In Abwesenheit der chaotropen Ionen bildet sich noch- mals eine Hydrathülle aus, so dass die Interaktion zwischen Silicamembran und Makromolekül aufgehoben wird. Technisch wurde diese Art der Aufreinigung einerseits in der Spin-Filter Methode und andererseits in der magnetic beads Technologie umgesetzt. In der WO 1996/09404 ist beispielsweise eine Nukleinsäure-Extraktion offenbart. Prinzipiell erfolgt die Extraktion in vier Schritten: Zelllyse, binden der Nukleinsäuren an eine Matrix, sowie waschen und eluieren der Nukleinsäuren. Nachteilig hierbei ist, dass die Extraktion sehr zeitaufwendig ist, da z. B. zahlreiche Waschschritte durchgeführt werden müssen, bei denen immer Nukleinsäure mit ausgewaschen wird. Hierdurch wird der Ertrag der Nukleinsäure erheblich reduziert. Des Weiteren ist diese Extraktionsmethode nur schwer automatisierbar.
Eine weitere Variante zur Isolierung von Nukleinsäuren mit einer Silicamatrix ist beispielsweise in der WO 1998/031840 offenbart, bei der magnetische Silicapartikel verwendet werden. Dabei werden Moleküle mit einer großen Oberfläche eingesetzt die ein magnetisches Moment besitzen, wenn sie einem Magnetfeld ausgesetzt sind. Zum Einsatz kommen unter anderem mit kolloidalem Magnetit (Fe304) oberflächenmodifizierte poröse Gläser. Diese magnetic beads und ein spezieller binding buffer werden nach der Lyse der Probe zugesetzt. Die Nukleinsäuren binden an der Silicamatrix. Durch Anlegen eines magnetischen Feldes sammeln sich die beads am Gefäßrand und die Verunreinigungen können in mehreren Waschschritten entfernt werden. Durch Entfernen des Magneten und Zugabe des elution buffer lösen sich die Zielmoleküle. Wrd ein erneutes Magnetfeld angelegt, kann der elution buffer mit Nukleinsäuren von den beads getrennt werden. Der Vorteil dieser Technik besteht in der hohen Automatisierbarkeit der Arbeitsabläufe mit einem geringen apparativen Aufwand.
Im Stand der Technik sind weiterhin Verfahren beschrieben, mit deren Hilfe Bakterien in Proben nachgewiesen werden können. So beschriebt beispielsweise die EP 1 574 584 B1 ein Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus biologischen Proben. Die Verfahren eignen sich zur Probenvorbereitung biologischer Proben für auf Nukleinsäure beruhende oder immundiagnostische Verfahren zum Nachweis von Bakterien. Hierbei werden Bakterien mittels einem spezifischen Antikörper detektiert und isoliert. Nachteilig bei dem Stand der Technik ist, dass durch die zahlreichen Aufreinigungsschritte auch die Menge der zu isolierende Nukleinsäure reduziert und somit der Ertrag erheblich verringert wird. Die zahlreichen Aufreinigungsschritte führen weiterhin dazu, dass die Extraktion sehr lange dauert. Außerdem sind die im Stand der Technik beschrieben Verfahren nicht oder nur schwer automatisierbar. Weiterhin kann die Extraktion nicht mit allen Proben durchgeführt werden. Hochkomplexe Proben, die zahlreiche Bestandteile aufweisen, wie beispielsweise Stuhlproben, sind nur schwer zu bearbeiten, da die Nukleinsäure häufig bei dem Aufreinigungsverfahren beschädigt wird. Aufgabe der Erfindung war es demgemäß, eine Nukleinsäurenextraktion bereitzustellen, die nicht die Nachteile oder Mängel des Stands der Technik aufweist.
Gelöst wird die Aufgabe durch die unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen. Es war völlig überraschend, dass ein Nukleinsäuren-Extraktionsmaterial bereitgestellt werden kann, welches nicht die Nachteile des Stands der Technik aufweist und mindestens Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) und ein lonenaustauschmaterial um- fasst. Das erfindungsgemäße Extraktionsmaterial ermöglicht eine schnelle und materialsparende Extraktion oder Aufreinigung von Nukleinsäuren. Das Extraktionsma- terial kann auch vorteilhafterweise für Automatisierungsprozesse genutzt werden. Außerdem ist es universell einsetzbar und muss nicht an individuelle Anwendungen angepasst werden.
Das lonenaustauschmaterial ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sephadex, Chelex, Zeolithe und/oder Sepharose. Sephadex beschreibt im Sinne der Erfindung insbesondere ein dreidimensional vernetztes Polysaccharid, das durch Quervernetzung der linearen Makromoleküle von Dextran erhalten wird. Sephadex ist indifferent gegenüber Kationen und Anionen und enthält viele Hydro- xy-Gruppen, wodurch es stark hydrophil ist und in Wasser oder einer Elektrolyt- Lösung aufquillt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann Sephadex mit funktio- nellen Gruppen, umfassend Diethylaminoethyl-, Diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl-, Carboxymethyl- oder Sulfopropyl-Gruppen konjugiert sein. Sephadex ist vorteilhafterweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sephadex G-10, Sephadex G-100, Sephadex G-15, Sephadex G-25, Sephadex G-50 und/oder Sephadex G-75. Chelex bezeichnet im Sinne der Erfindung ebenfalls ein Polymer, was bevorzugt Ionen bindet. Zeolithe sind im Sinne der Erfindung kristalline Alumosilicate. Die Kristallgitter der Zeolithe sind insbesondere aus Si04- und Al04-Tetraedern aufgebaut, die je- weils über Sauerstoff-Brücken miteinander verknüpft sind und bevorzugt Ringe oder Prismen bilden. Diese wiederum verbinden sich zu weiteren sekundären Baueinheiten (secondary building units, SBU), die jeweils bis zu 16 Si- oder AI-Atome enthalten können, woraus eine große Strukturvielfalt folgt. Dabei entsteht eine räumliche Anordnung gleichgebauter Hohlräume, die über Fenster (Porenöffnungen) bzw. dreidimensionale Kanalsysteme zugänglich sind. Es hat sich gezeigt, dass unterschiedliche Elemente, umfassend Ionen, Proteine, Kohlenhydrate oder Fette mit Zeolithe wechselwirken und von Nukleinsäuren trennbar sind. Es kann weiterhin vorteilhaft sein, Sepharose als lonenaustauschmaterial zu verwenden. Sepharose bezeichnet im Sinne der Erfindung ein modifiziertes Polysaccharid auf Agarose Ba- sis, deren Polysaccharid-Ketten zu einem dreidimensionalen Netzwerk verknüpft sind.
PVPP bezeichnet im Sinne der Erfindung insbesondere Polyvinylpolypyrrolidone (auch Crospovidon, abgeleitet von cross-linked Polyvinylpyrrolidon), was insbesondere beim Erhitzen von Vinylpyrrolidinon mit Alkalien oder Divinyl-Verbindungen entsteht. PVPP ist ein vernetztes Polymer, was im Wesentlichen in Wasser und allen Lösemitteln unlöslich ist. PVPP ist vorteilhafterweise ein aus Vinylmonomeren bestehendes Copolymer. Es kann bevorzugt sein, anstelle von PVPP oder in Kombination mit PVPP ein weiteres aus Vinylmonomeren bestehendes Copolymer für ein bevorzugtes Nukleinsäuren-Extraktionsmaterial zu verwenden. Ein aus Vinylmo- nomeren bestehendes Copolymer weist bevorzugt die allgemeine Formel auf. Hierbei steht X für ein Heteroatom oder eine über ein Heteroatom fixierte G pe. Im der folgenden Tabelle sind bevorzugte Gruppen dargestellt:
Tabelle 1 :
X Name
Die bevorzugten Homo- oder Copolymere umfassen insbesondere Monomere der Struktur H2C=CH-X, die aus einer polymerisierbaren Vinyl-Gruppe und einem Sub- stituenten X bestehen, der seinerseits aus nur einem einzigen Atom [z. B. F (Vinyl- fluorid), Cl (Vinylchlorid), Br (Vinylbromid)] oder einer Atomgruppe bestehen kann. Beispiele für letztere sind X = Alkyl (1-Alkene), Aryl (zum Beispiel Styrol), OR (Vi- nylether), O-CO-R (Vinylester), COOR (Acrylsäure und deren Ester), CONR2 (Acry- lamide), CN (Acrylnitril), NR2 (Vinylamine), NH-CO-R (Vinylamide), S03H (Vinylsul- fonsäure), PO(OH)2 (Vinylphosphonsäure) und andere. Auch Monomere mit der Struktureinheit C=C-C=C, also 1 ,3-Diene, sind im Wesentlichen Vinylmonomere. Sie werden aber auch als Dienmonomere bezeichnet. Darüber hinaus gehören auch Di- und Polyvinylmonomere wie z. B. das Divinylbenzol zu den Vinylmonomeren.
Im weiteren Sinne werden auch andere Monomere mit C,C-Doppelbindungen, z. B. die des Typs H2C=CR1 R2, z. B. Vinylidenchlorid (R1 = R2 = Cl), im Sinne der Erfindung zu den Vinylmonomeren gerechnet. Schließlich sind auch Verbindungen R1 R2C=CR3R4 mit nur einem oder schließlich gar keinem direkt an die ungesättigten Kohlenstoff-Atome gebundenem Wasserstoff-Atom substituierte Vinylmonomere.
Das Extraktionsmaterial kann vorteilhafterweise als loses Pulver, Tablette, Pellet oder Chromatographiesäulenfüllmaterial vorliegen, welches mindestens einen lo- nenaustauschmaterial- und einen PVPP-Anteil umfasst. Es ist bevorzugt, dass das lose Pulver, die Tablette, das Pellet oder das Chromatographiesäulenfüllmaterial den lonenaustauschmaterial- und den PVPP-Anteil in einer Korngrößenfraktion von 5-1000μηι, bevorzugt in einem Bereich von 50-250μηι, enthalten. Es war völlig überraschend, dass mittels des erfindungsgemäßen Extraktionsmaterials, Bestandteile aus Proben gebunden werden können, wobei die zu isolierende Nukleinsäure nicht bindet. Vorteilhafterweise wird das Extraktionsmaterials zur Probenaufbereitung, insbesondere zur Aufbereitung von Proben, bevorzugt Nukleinsäu- reproben zur PCR-Analyse verwendet. Eine Probe ist bevorzugt ein Kulturmedium, eine Körperflüssigkeit und/oder eine Mischung aus Material pflanzlichem und/oder tierischen Ursprungs. Überraschenderweise können auch Nukleinsäuren aus Lebensmittelproben extrahiert werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass Körperflüssigkeiten z. B. Stuhl, Speichel, Blut, Lymphe, Urin, Synovialflüssigkeit, Verdauungssäfte, Sekrete, Exkrete oder Flüssig- keitsausscheidung oder weitere Flüssigkeiten eines Organismus umfassen. Die Probe kann in flüssiger oder fester Form vorliegen, wobei eine feste Form im Sinne der Erfindung insbesondere auch gefrorene Proben oder Gewebe- oder Knochen- proben umfasst. Dem Fachmann ist bekannt, dass Mikroorganismen vorzugsweise in einem Kulturmedium kultiviert werden, wobei das Kulturmedium alle für Mikroorganismen relevanten Nährstoffe beinhaltet. Das Kulturmedium kann in fester oder flüssiger Form vorliegen und dient insbesondere der Kultur von Mikroorganismen umfassend Bakterien, Archaea, Pilze, Mikroalgen, Protozoen und Viren.
Die Nukleinsäure oder die Nukleinprobe umfasst bevorzugt RNA und/oder DNA. RNA bezeichnet ein aus Nucleotiden bestehendes langgestrecktes Molekül, das in der Zelle hauptsächlich die Funktion hat, die in der Desoxyribonucleinsäure (DNA) gespeicherte genetische Information umzusetzen. Daran sind verschiedene Formen der RNA beteiligt, die mRNA, die als Abschrift der Gene die Information zur Protein- Biosynthese (Translation) liefert, die rRNA die in Form verschiedener Spezies (5S, 16S, 23S in Bakterien und 5S, 5,8S, 18S, 28S in höheren Organismen) in den Ribo- somen vertreten ist, und die tRNA, die den Einbau der aktivierten Aminosäuren in die wachsende Protein-Kette an den Ribosomen vermittelt. Im Zellkern findet sich noch die aus Vorstufen der mRNA bestehende heterogene Kern-RNA (hnRNA von heterogeneous nuclear RNA), wie auch die beim Zusammenfügen der Exons der RNA mitwirkende kleine Kern-RNA (snRNA). RNA-Moleküle können auch enzymati- sche Aktivitäten besitzen (Ribozyme) oder regulatorische Funktion durch RNA- Interferenz (siRNA, miRNA) übernehmen. Solche RNAs faßt man häufig unter dem Begriff ncRNA zusammen. Bei RNA-Viren ist die RNA selbst Träger der genetischen Information. Es war völlig überraschend, dass mittels einem bevorzugten Extraktionsmaterial RNA umfassend mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, miRNA, Viren-RNA oder hnRNA aus einer Probe extrahiert werden kann. Vorteilhafterweise kann ebenso DNA aus einer Probe isoliert werden. DNA bezeichnet im Sinne der Erfindung insbesondere langkettige Polynucleotide, welche die hauptsächliche genetische Information (das Genom) der Lebewesen in sich gespeichert enthalten. Die Hauptmenge der DNA ist bei Eukaryonten im Zellkern enthalten, und zwar in den Chromosomen bzw. im Chromatin. Bei Bakterien befindet sie sich nicht in einer separaten Zellorganelle und besteht meist aus einem einzelnen, ringförmig geschlossenen Molekül. Bakterien enthalten neben der genomischen DNA kleinere, ebenfalls ringförmige DNA-Moleküle, die leicht übertragbaren Plasmide. Es war völlig überraschend, dass mittels des Nukleinsäuren- Extraktionsmaterials DNA einfach und schnell isoliert werden kann. Die DNA wird im Wesentlichen nicht beschädigt und kann so im Ganzen einer nachfolgenden Analyse zugeführt werden. Dies stellt einen erheblichen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik dar, da eine Beschädigung der DNA nur eine unvollständige Analyse zu- lässt. Mittels des Extraktionsmaterials sind umfangreichere Analysen durchführbar. Die Erfindung umfasst mithin auch ein Verfahren zur Aufreinigung einer in einer Probe vorliegenden Nukleinsäure in einem analytischen oder präparativen Maßstab, umfassend eine Matrix umfassend a. ein synthetisches oder natürliches lonenaustauschmaterial und b. ein vernetztes Polymer mit einer Pyrrolidonstruktur, wobei die Probe mit der Matrix in Kontakt gebracht wird und insbesondere unerwünschte Bestandteile der Probe, umfassend Proteine, Salze, Kohlenhydrate, Ionen und/oder Fette mit der Matrix wechselwirken. Hierdurch ist eine schnelle Extraktion der Nukleinsäure möglich, wobei die Trennung, Aufreinigung und/oder Detektion der Nukleinsäure bevorzugt in einem Verfahrensschritt durchgeführt wird und vorteil- hafterweise keine Wasch- und/oder Elutionsschritte notwendig sind. Das Verfahren zur Probenaufbereitung zur Extraktion von Nukleinsäuren aus einer Probe, umfasst folgende Schritte:
- in Kontakt bringen der Probe mit einem Lysepuffer,
- Erhitzen des Gemisches aus Probe und Lysepuffer, - Zentrifugieren des Gemisches,
- Aufnahme des Überstandes und
- in Kontakt bringen des Überstandes mit dem Nukleinsäure-Extraktionsmaterial.
Mittels dem Verfahren können vorteilhafterweise aus Proben, bevorzugt Körperflüssigkeiten, pflanzliche oder tierische Proben und/oder Kulturmedien Nukleinsäuren extrahiert werden. So ist es überraschenderweise mögliche, aus Stuhlproben bakterielle oder virale Nukleinsäuren, aus pflanzlichen oder tierischen Proben Allergieassoziierte Nukleinsäuren und/oder aus Kulturmedienproben Nukleinsäuren zu extrahiert. Es ist keine Bindung der Nukleinsäure an eine Membran oder sonstige Mat- rix notwendig, wodurch keine Wasch- und Elutionsschritte durchgeführt werden müssen und hierdurch der Ertrag der isolierten Nukleinsäure maßgeblich verbessert werden kann. Außerdem kann das Verfahren einfach in kleinem oder großem Maßstab auch voll- oder teilautomatisch durchgeführt werden. Die zu untersuchende Probe wird in einem ersten Schritt mit einem Lysepuffer in Kontakt gebracht. Eine Lyse bezeichnet im Sinne der Erfindung insbesondere eine Auflösung (Lysis) von Zellen unter Mitwirkung lytischer Enzyme (Lysozyme) und eine Zerstörung der Zellmembranen (Cytolyse). Es kann jedoch auch bevorzugt sein, dass die Probe mittels mechanischer Verfahren, wie Ultraschallbehandlung, French Press oder Glasperlenmühle aufgeschlossen wird. Bevorzugt ist jedoch ein Lysepuffer, da hierdurch die Nukleinsäuren weniger beschädigt werden. Der Lysepuffer um- fasst in einer bevorzugten Ausführungsform einen Puffer, der einen bevorzugten pH-Bereich einstellt.
Es ist bevorzugt, dass der Lysepuffer Triton, bevorzugt Triton X-15, X-35, X-45, X- 100, X-102, X-104, X-114, X-165, X-305, X-405 und/oder X-705, umfasst. Triton ist ein nichtionisches Tensid aus der Gruppe der Octylphenolethoxylate, welches Proteine denaturiert. Tenside sind amphiphile (bifunktionelle) Verbindungen mit mindestens einem hydrophoben und einem hydrophilen Molekülteil. Der hydrophobe Rest ist zumeist eine möglichst lineare Kohlenwasserstoff-Kette mit bevorzugt 8 bis 22 Kohlenstoff-Atomen. Der hydrophile Rest ist entweder eine negativ oder positiv elektrisch geladene (hydratisierbare) oder eine neutrale polare Kopfgruppe. Grenzflächenaktive Betaine oder Aminosäure-Tenside (amphotere oder zwitterionische Tenside) tragen negativ und positiv geladene Gruppen in einem Molekül. Vorteilhafte Eigenschaften der Tenside sind die orientierte Adsorption an Grenzflächen sowie die Aggregation zu Micellen und die Ausbildung von lyotropen Phasen. Nichtionische Tenside weisen eine ungeladene, wasserlöslich machende Kopfgruppe auf.
Es war völlig überraschend, dass durch den Puffer, dem Triton zugesetzt wurde, der Nukleinsäure-Extraktionsertrag maßgeblich verbessert wird. Außerdem weist die aufgereinigte Nukleinsäure eine hohe Reinheit auf, d. h. sie ist im Wesentlichen durch keine weiteren Bestandteile verunreinigt. Die Reinheit der Nukleinsäure spielt insbesondere bei weiteren Analyseverfahren eine wichtige Rolle, da zahlreiche Enzyme, wie beispielsweise die DNA-Polymerase, durch Verunreinigungen in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Hierdurch kann es zu falschen Ergebnissen kom- men. Der Fachmann weiß, dass die Anzahl und Verfügbarkeit von biologischen Proben häufig begrenzt sind und jede Probe mit Vorsicht zu benutzen ist. Demgemäß kann das erfindungsgemäße Extraktionsmaterial als ein technischer Fortschritt angesehen werden, da die Nukleinsäure während der Extraktion nicht beschädigt wird und somit ein optimales Ausgangsmaterial für nachfolgende Analysen darstellt. Es sind außerdem keine weiteren Fällungsreaktionen notwendig, um weitere Verunreinigungen zu entfernen - die extrahierte Nukleinsäure kann in dieser Form weiterverwendet werden.
Nach der Zugabe des Lysepuffers kann es bevorzugt sein, das Gemisch aus dem Lysepuffer und der Probe zu erwärmen oder zu erhitzen, um eine vollständige Lyse der zellulären Bestandteile sicherzustellen. Es hat sich als überaus vorteilhaft herausgestellt, das Gemisch, bevorzugt Stuhl auf 80°C bis 95°C, bevorzugt 90°C für 5 Minuten bis 15 Minuten, besonders bevorzugt für 7 bis 10 Minuten zu erwärmen/erhitzen. Bei den bevorzugten Temperaturen wird im Wesentlichen eine voll- ständige Denaturierung der proteinogenen Bestandteile der Probe erreicht, wobei die Nukleinsäure nicht beschädigt wird.
Nach dem Erhitzen wird die Probe bevorzugt zentrifugiert, wobei sich bei Raumtemperatur eine Triton-Phase bildet, die sowohl ungelöste Probenbestandteile sowie unpolare Bestandteile umfasst. Weiterhin bildet sich vorteilhafterweise eine wässri- ge Phase - ein Überstand - in der die Nukleinsäure vorliegt. Dieser Überstand kann beispielsweise auf einen Zentrifugen-Filter aufgetragen und zentrifugiert werden. Ein bevorzugter Filter ist beispielsweise ein Spin-Filter. Der Filter umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Nukleinsäure-Extraktionsmaterial, insbesondere PVPP und ein lonenaustauschmatenal. Die Nukleinsäure durchdringt den Filter und liegt in Lösung vor, wobei alle inhibierenden Bestandteile durch das lonenaustauschmatenal und PVPP gebunden werden und den Filter nicht durchdringen können. Es kann bevorzugt sein, die Nukleinsäure nach Trennung, Aufreinigung und/oder Detektion aufzukonzentrieren. Die Aufkonzentrierung kann beispielsweise mittels Vakuumverdampfung oder Fällung erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Extraktionsmaterial als Tablette, Pellet oder Chromatographiesäulenfüllmaterial vor, welches mindestens einen lonenaustauschmatenal- und einen PVPP-Anteil umfasst. Es war völlig überraschend, dass das Extraktionsmaterial als Tablette ausgeführt werden kann. Hierdurch ist ein leichter Transport und Lagerung des Extraktionsmaterials möglich. Vorteilhafterweise erfolgt das in-Kontakt-bringen so, dass der Überstand mit einer Tablette, umfassend PVPP und lonenaustauschmaterial, in Kontakt gebracht wird und dass das so gewonnene Gemisch wiederum zentrifugiert und der Überstand insbesondere für eine PCR-Reaktion verwendet wird. Nach der Lyse der Probe kann die Tablette zu dem Überstand hinzugefügt werden. Hierdurch ist eine schnelle Extraktion der Nukleinsäure möglich. Es kann weiterhin bevorzugt sein, dass der Lysepuffer und/oder lonenaustauschmaterial als Tablette vorliegen. Der Lysepuffer in Tablettenform wird der Probe zugeführt, wobei sich die Tablette auflöst und die Probe lysiert. Die lo- nenaustauschmaterial-Tablette kann vorteilhafterweise in den Überstand mit dem PVPP eingebracht werden.
Es kann jedoch auch bevorzugt sein, dass das in-Kontakt-bringen des Überstandes mit dem Nukleinsäure-Extraktionsmaterial so erfolgt, dass der Überstand auf eine Chromatographiesäule, umfassend das Nukleinsäure-Extraktionsmaterial, aufge- bracht wird, und dass das mittels der Säule gewonnene Eluat in einem PCR- Verfahren verwendet wird. Chromatographie bezeichnet im Sinne der Erfindung insbesondere die physikalisch-chemische Trennung von Substanzgemischen aufgrund ihrer unterschiedlichen Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase. Die Einzelkomponenten werden in Folge verschieden starker Wechselwir- kungen mit der stationären Phase in Bezug zur mobilen Phase unterschiedlich verzögert; sie legen somit in gleicher Zeit unterschiedliche Strecken zurück. Bevorzugt Chromatographien sind z. B.: Dünnschichtchromatographie, Gaschromatographie, Hochleistungs- oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), lonenchroma- tographie und Säulenflüssigkeitschromatographie. Durch die Chromatographie kann eine schnelle und effiziente Aufreinigung der Probe erreicht werden, da das Nukleinsäuren-Extraktionsmaterial, umfassend lonenaustauschmaterial und PVPP, in der Säule als Chromatographiesäulenfüllmaterial vorliegt. Hierdurch ist auch die Reinheit der extrahierten Nukleinsäure nach der Chromatgraphie sehr hoch. Im Wesentlichen können alle inhibierenden oder störenden Bestandteile aus der Probe durch die Chromatographie von der Nukleinsäure getrennt werden. Die Bestandteile werden bevorzugt in der Säule zurückbehalten, wobei die Nukleinsäure durch die Säule hindurchtritt. Falls lediglich eine bestimmte Nukleinsäure analysiert werden soll, kann durch die Zugabe von Enzymen ein Verdau stattfinden. Wenn nur RNA analysiert werden soll, kann die DNA durch DNasen verdaut und abgetrennt werden. Umgekehrt kann die RNA durch RNasen verdaut werden, falls nur die DNA analysiert werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Extraktionsmaterial zur Probenaufbereitung, insbesondere zur Aufbereitung von Nukleinsäureproben zur PCR- Analyse verwendet. Der Fachmann weiß, dass eine Aufbereitung von Nukleinsäureproben einer Extraktion von Nukleinsäuren aus einer Probe entspricht. Eine PCR umfasst bevorzugt long ränge PCR, nested PCR, inverse PCR, anchored PCR, RT- PCR und quantitative RT-PCR (auch real-time PCR).
Insbesondere bei der PCR-Analyse ist es wichtig, dass inhibierende Bestandteile aus den Proben entfernt werden, da die PCR ansonsten in ihrer Funktionsweise beeinträchtigt wird. PCR-Inhibitoren werden nach ihrer Wirkungsweise grundsätzlich in drei Kategorien eingeteilt: (1) Inaktivierung der DNA-Polymerase, (2) Abbau der Nukleinsäuren und (3) die negative Beeinflussung der Lyse. Inhibierend wirkende Substanzen umfassen Salze, Ionen (z. B. Calciumionen), Fette oder Proteine. Allerdings zeigen auch Verbindungen die zur der Probenvorbereitung eingesetzt werden, inhibierende Wirkung wie zum Beispiel Ethanol oder Detergenzien wie Natriumdo- decylsulfat. Es war völlig überraschend, dass inhibierende Bestandteilen einfach und schnell von der Nukleinsäure getrennt werden können. Vorteilhafterweise muss die Nukleinsäure nicht durch zahlreiche Elutionsschritte von einer Matrix eluiert werden, sondern die Bestandteile werden gebunden und die Nukleinsäure liegt bevorzugt in einer Lösung vor.
Die Abtrennung oder Bindung der Bestandteile, die ggf. eine nachfolgende PCR in- hibieren können, erfolgt insbesondere durch zwei Mechanismen. Der erste Mechanismus umfasst die Bindung von unpolaren Verbindungen in einer wässrigen Phase der Probe insbesondere durch PVPP, dass bei definierten Bedingungen eine nicht- wässrige Phase bildet. Durch den zweiten Mechanismus werden Inhibitoren aus der wässrigen Phase durch eine Abtrennung durch Molekulargewichtsunterschiede mit- tels des lonenaustauschmaterials entfernt.
Vorteilhafterweise kann eine mittels des Extraktionsmaterials extrahierte Nukleinsäure auch durch andere Analysen- oder Quantifizierungsmethoden charakterisiert werden. Es kann beispielsweise bevorzugt sein, die extrahierte Nukleinsäure einem Restriktionsverdau zu unterziehen, bei dem die Nukleinsäure an definierten Positionen von Restriktionsenzymen geschnitten wird. Die zerschnittene Nukleinsäure kann anschließend beispielsweise durch eine Gelelektrophorese analysiert werden. Auch die Analyse der extrahierten Nukleinsäure mittels Microarray-Methoden oder sonstigen High-Throughput-Screening-Verfahren ist bevorzugt.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit zur Nukleinsäuren-Extraktion, der mindestens ein lonenaustauschmaterial und PVPP umfasst. Mit dem Kit können Nukleinsäuren einfach und schnell aus einer Probe extrahiert werden. Vorteilhafterweise kann der Kit noch einen Lysepuffer insbesondere in Tablettenform umfassen. Auch das lonenaustauschmaterial kann in Tablettenform vorliegen.
Die Erfindung führt zu zahlreichen Vorteilen umfassend:
- es kann mehr Nukleinsäure extrahiert werden, da diese nicht an eine Matrix bindet und durch unvollständige Bindung Nukleinsäure verlorengeht; - keine Diskriminierung zwischen verschiedenen Bestandteilen der Probe;
- einfache und schnelle Durchführung mit reduzierte Anzahl an Arbeitsschritten;
- Automatisierung möglich;
- Geringe Kosten für das Extraktionsmaterial, da keine Wasch- oder Elutionslösun- gen benötigt werden und das - Extraktionsmaterial hat einen einfachen Aufbau - lediglich PVPP und ein lonenaustauschmaterial sind nötig.
Die Erfindung kann ebenfalls als Kombinationserfindung angesehen werden. Die Kombination von den bekannten Elementen lonenaustauschmaterial und PVPP führt zu überraschenden Effekten bei der Extraktion von Nukleinsäuren. Erst die Kombination dieser Verbindungen führt zu synergistischen Vorteilen, die eine effiziente Trennung der inhibierenden Bestandteile von den Nukleinsäuren bewirken. Die Bestandteile binden an die Kombination von lonenaustauschmaterial und PVPP, wobei die Nukleinsäuren nicht mit dem lonenaustauschmaterial oder PVPP inter- agieren und somit leicht von den Bestandteilen abgetrennt werden können.

Claims

Patentansprüche
Nukleinsäuren-Extraktionsmaterial, umfassend mindestens Polyvinylpolypyr- rolidon (PVPP) und ein lonenaustauschmaterial.
Extraktionsmaterial nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
das das lonenaustauschmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Sephadex, Chelex, Zeolithe und/oder Sepharose.
Extraktionsmaterial nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
es als loses Pulver, Tablette, Pellet oder Chromatographiesäulenfüllmaterial vorliegt, welches mindestens einen lonenaustauschmaterial- und einen PVPP-Anteil umfasst.
Extraktionsmaterial nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
das lose Pulver, die Tablette, das Pellet oder das Chromatographiesäulen- füllmaterial den lonenaustauschmaterial- und den PVPP-Anteil in einer Korngrößenfraktion von 5-1000μηι, bevorzugt in einem Bereich von 50- 250μηι, enthalten.
Verwendung des Extraktionsmaterials nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Probenaufbereitung, insbesondere zur Aufbereitung von Proben zur PCR-Analyse.
Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Probe ein Kulturmedium, eine Körperflüssigkeit und/oder eine Mischung aus Material pflanzlichem und/oder tierischen Ursprungs ist.
7. Ein Verfahren zur Aufreinigung einer in einer Probe vorliegenden Nukleinsäure in einem analytischen oder präparativen Maßstab, umfassend eine Matrix umfassend a. ein synthetisches oder natürliches lonenaustauschmaterial und b. ein vernetztes Polymer mit einer Pyrrolidonstruktur, wobei die Probe mit der Matrix in Kontakt gebracht wird und insbesondere unerwünschte Bestandteile der Probe, umfassend Proteine, Salze, Kohlenhydrate, Ionen und/oder Fette mit der Matrix wechselwirken.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Aufreinigung der Nukleinsäure in einem Verfahrensschritt durchgeführt wird.
9. Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren aus einer Probe nach einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Verfahren folgende Schritte umfasst:
in Kontakt bringen der Probe mit einem Lysepuffer,
Erhitzen des Gemisches aus Probe und Lysepuffer,
Zentrifugieren des Gemisches,
Aufnahme des Überstandes und
in Kontakt bringen des Überstandes mit dem Nukleinsäureextrakti- onsmaterial nach Anspruch 1 bis 4.
10. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch
dadurch gekennzeichnet, dass
das in Kontakt bringen des Überstandes mit dem Nukleinsäureextraktions- material so erfolgt, dass der Überstand auf eine Chromatographiesäule, umfassend das Nukleinsäureextraktionsmaterial, aufgebracht wird, und dass das mittels der Säule gewonnene Eluat in einem PCR-Verfahren verwendet wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche
dadurch gekennzeichnet, dass
das in Kontakt bringen so erfolgt, dass der Überstand mit einer Tablette, fassend PVPP und lonenaustauschmaterial, in Kontakt gebracht wird und dass das so gewonnene Gemisch wiederum zentrifugiert und der Überstand für eine PCR-Reaktion verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Lysepuffer Triton, bevorzugt Triton X-15, X-35, X-45, X-100, X-102, X- 104, X-1 14, X-165, X-305, X-405 und/oder X-705 umfasst.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Erwärmen/Erhitzen des Gemisches aus dem Lysepuffer und der Probe, bevorzugt Stuhl bei 80°C bis 95°C, bevorzugt bei 90°C für 5 Minuten bis 15 Minuten, besonders bevorzugt für 7 bis10 Minuten erfolgt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Probe Körperflüssigkeiten, pflanzliche oder tierische Proben und/oder Kulturmedien umfasst.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Nukleinsäure nach Trennung, Aufreinigung und/oder Detektion aufkonzentriert wird.
16. Kit zur Nukleinsäuren-Extraktion, umfassend mindestens ein lonenaustauschmaterial und PVPP.
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