CN1861628B - 一种分离中药蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用磁性纳米粒子分离中药蛋白质的方法，该方法包括步骤：(a)将样品与磁性纳米粒子接触，从而使得样品中蛋白质吸附于或结合于磁性纳米粒子；(b)利用磁力将磁性纳米粒子与液体样品分离开，获得吸附了或结合了蛋白质的磁性纳米粒子。本发明方法可快速有效地分离样品(尤其是中药)中的微量蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，更具体地涉及一种分离中药蛋白质的方法。
背景技术
生物样品中蛋白质的分离是一项技术性很强的工作，目前常用的方法为饱和硫酸胺沉淀法、凝胶柱层析法、蛋白质电泳等方法。在这些方法中，有些方法虽然简单，但分离的样品不纯，需要进一步处理，分离工作繁琐，且常常会导致分离样品中的蛋白质变性、降解而丧失活性。尤其从中草药分离其蛋白活性成分，更是举步维艰。
因此，本领域迫切需要开发快速有效地分离样品中微量蛋白质的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种快速有效地分离样品中微量蛋白质的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种磁性纳米粒子的用途，用于分离液体样品中蛋白质。
在另一优选例中，所述的蛋白质是可溶性蛋白质。
在另一优选例中，所述的蛋白质的来自中药的蛋白质。
在另一优选例中，所述的中药是植物中药。
在另一优选例中，所述的中药选自：人参、黄芪、灵芝、当归、生地、熟地、酸枣仁、天麻、天冬、远志、白术、白芍、葛根、天花粉，或其混合物。
在另一优选例中，所述的磁性纳米粒子是表面被氨基修饰的磁性纳米粒子。这些磁性纳米粒子的表面具有NH2。
在本发明的第二方面，提供了一种分离液体样品中蛋白质的方法，包括步骤：
(a)将样品与磁性纳米粒子接触，从而使得样品中蛋白质吸附于或结合于磁性纳米粒子；
(b)利用磁力将磁性纳米粒子与液体样品分离开，获得吸附了或结合了蛋白质的磁性纳米粒子。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(c)：对步骤(b)的吸附了或结合了蛋白质的磁性纳米粒子进行解吸，从而使得吸附的或结合的蛋白质与磁性纳米粒子解离开，从而获得分离的磁性纳米粒子和蛋白质。
在另一优选例中，所述的步骤(c)是在pH8.0±0.2的Tris溶液中放置5分钟-2小时(更佳地放置0.1-1小时)。
在另一优选例中，所述的步骤(a)是在1-20℃，pH6.5-8.0的溶液中放置5分钟-2小时(更佳地放置0.1-1小时)。
附图说明
图1显示了MNP分离BSA的量-效关系.图y轴为吸光值，x轴为不同浓度的MNP.其中系列1为吸附了BSA的MNP-NH2，系列2为未吸附BSA的MNP-NH2(对照)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现磁性纳米粒子可极其有效地分离出具有生物活性的可溶性蛋白质，从而用于可溶性蛋白质的研究或用于浓缩可溶性蛋白质。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，“磁性纳米粒子”和“MNP”可互换使用，都指直径大小为1-100nm，且具有磁性的固体颗粒。磁性纳米粒子通常为三明治结构，内核层一般为磁性纳米材料，中为包覆层，最外层则修饰与蛋白质有特异性结合作用的功能基团(如氨基)。
一种优选的磁性纳米粒子核酸含有如下的二层结构：
(1)由核壳型磁性纳米粒子构成的内核层；
(2)包覆内核层的AEAPS[N-(2-氨乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]中间层。
在另一优选例中，所述的核壳型磁性纳米粒子内核层包括内核和外壳。所述内核层的内核成分选自：铁的氧化物、镍、镍-铁合金、或其组合。较佳地，所述内核层的内核成分是铁的氧化物。所述内核层的外壳成分选自二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或其组合。较佳地，所述内核层的外壳成分是二氧化硅。
一种优选的磁性纳米粒子是中国专利申请CN03142274.8中所述的磁性纳米粒子，其中所述的磁性纳米粒子表面被氨基所修饰。
在本发明的表面连接有NH2基团的磁性纳米粒子(MNP)被简称为MNP-NH2(magnetic nanometer particle-NH2，)。这种磁性纳米粒子特别适合从生物样品中尤其是从中草药中分离蛋白质。
可用于本发明的磁性纳米粒子可用常规方法制备，例如中国专利申请CN03142274.8中所述的方法。
在一优选例中，本发明的磁性纳米粒子核酸分离器可用包括以下步骤的方法制备：
(1)在含磁性纳米粒子和内核层外壳形成剂(如正硅酸乙酯)的微乳液体系中，通过油包水型反相微乳液法，形成核壳型磁性纳米粒子，所述的核壳型磁性纳米粒子包括内核和外壳，
所述的磁性纳米粒子选自：铁的氧化物、镍、镍-铁合金、或其组合；
所述的内核层外壳形成剂形成成分选自下组的外壳：二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或其组合；
(2)使用AEAPS[N-(2-氨乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]对步骤(1)的核壳型磁性纳米粒子表面进行修饰，得到修饰了氨基的磁性纳米粒子；
本发明方法可用于分离各种含蛋白质的生物样品，尤其是从中草药中分离蛋白成分。此外，本发明方法还可用于蛋白质浓缩。
可用本发明方法分离的样品没有特别限制，可以是任何含有可溶性蛋白质的溶液。更佳地，所述的样品是含有中药蛋白或植物蛋白的溶液。代表性的中药包括(但并不限于)：人参、黄芪、灵芝、当归、生地、熟地、酸枣仁、天麻、天冬、远志、白术、白芍、葛根、天花粉，或其混合物。
本发明的主要优点在于：
(a)对蛋白质活性的影响极小，分离的蛋白质基本上保留了原有的全部活性。
(b)分离快速简便。
本发明应用磁性纳米材料分离生物样品蛋白质是一种全新的方法，该方法在制药业和科研中有广阔的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
磁性纳米粒子的制备
按照中国专利申请03142274.8中所述的方法制备磁性纳米粒子，具体方法如下：
(a)磁性纳米粒子的内核层的制备方法
采用改进的化学共沉淀制备磁性粒子的内核层，具体方法如下：用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.1～0.2mol/l，Fe3+离子的浓度为0.1～0.3mol/l，NaOH溶液的浓度为2～3mol/l。在剧烈搅拌下将体积为混合盐溶液体积一半的NaOH溶液缓慢地滴加到混合盐溶液中。将所得到的固体沉淀在40℃～60℃陈化12h，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在40℃～80℃的条件下干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即得产物。
(b)核壳型核酸磁性纳米粒子的制备方法
将TritonX-100、正己醇、环己烷按1∶2∶5的比例均匀混合，形成透明稳定的微乳液体系。将上述微乳液体系置于超声波中处理30～60分钟，再向其中加入0.5g的γ-Fe2O3，用超声波处理6分钟后取出上层液倒入三颈烧瓶中，搅拌30分钟使之均匀。取1ml一定浓度的浓氨水用2ml二次蒸馏水稀释，30分钟后将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌30分钟使氨水均匀分散在微乳液中。1小时后，向微乳液中滴加1～3ml的正硅酸乙酯，同时不断地搅拌10小时，并将体系的温度保持在15～30℃之间。向体系中加入丙酮使粒子沉淀，或者将体系静置过夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。将清洗后的粒子置于400～700℃的条件下，锻烧1～4个小时，收集粒子(即为磁性纳米粒子)。
实施例2
制备被氨基修饰的磁性纳米粒子
取15mg实施例1中制备的包被二氧化硅的磁性纳米粒子，加入到2ml毫升的甲醇和丙三醇的混合液(1∶1，v/v)中，超声处理30分钟，再取0.01g的AEAPS[N-(2-氨乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]加入混合液中，超声处理10-60分钟，使溶液混合均匀，在15-90℃的反应条件下反应2-3小时，然后取出粒子分别用甲醇和水洗涤2-3次，150℃温度下真空干燥2小时，收集粒子，即为被氨基修饰的磁性纳米粒子，简称为MNP-NH2。
用制备的氨基修饰的磁性纳米粒子，制备含20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml和80μg/ml MNP的PBS溶液。各取20微升所述溶液与200微升BSA溶液(1mg/ml)混合，然后用磁力分离，得到残液和吸附了蛋白质的磁性纳米粒子。吸附了蛋白质的磁性纳米粒子用PBS溶液洗涤3次(获得洗1、洗2、洗3溶液)。洗涤后，将吸附了蛋白质的MNP-NH2溶于200微升PBS溶液中，获得分离液，接着用常规方法测定该分离液的吸光度。
MNP-NH2对牛血清白蛋白(BSA)分离的线性关系实验的结果如图1所示。结果表明，在分离样品中，加入修饰的磁性纳米粒子的量与分离效果成正比。(注：MNP-NH2对紫外光也有一定的吸收，因此在本次实验中设置等量的MNP作为对比。)
实施例3
生物样品的处理
对于不同的生物样品采用不同的方法；
(a)从血原细胞中分离蛋白质：
采用常规的裂解法溶解细胞。裂解液中含有0.5％NP40；10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)；10mmol/L NaCl；3mmol/L MgCl2；1mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)。此裂解液适于分离血原细胞中的蛋白质和信号转导的研究。
(b)从植物药物中分离可溶性蛋白质：
按传统的民间服药方法，先以文火煎煮各种中药植物(见表1)20min，收集煎液，常温离心机3000r/min离心15min，取上清液直接用于分离蛋白质。
实施例4
蛋白质分离和测定
(a)蛋白质的分离
取上述各样品200μl加于无菌的EP管中，再加入磁性纳米粒子混合液40μL(80μg)，4℃冰箱放置15min，以使样品中蛋白质的C端与氨基结合。取出EP管，置磁性试管架上，4℃冰箱静置15min，吸附结合了蛋白质的磁性纳米粒子；用加样枪小心吸出残余液，置另一EP管中，再取PBS(磷酸缓冲液)200μL缓慢漂洗磁化管3次，分别收集漂洗液，测定各组份蛋白质含量。
(b)分离的蛋白质含量测定
取上述各组分液体100μL，加于96孔酶标板中，每组设三个平行孔，用市售的用于检测蛋白核酸的常规酶标仪(Tecan酶标仪)，测波长280nm紫外吸收值，确定分离效果。
MNP-NH2对不同种类的生物样品的分离效果如表1所示。
表1：磁性纳米粒子分离蛋白一览表
| 组分 | MNP | 原液 | 分离液 | 残液 | 洗1 | 洗2 | 洗3 | PBS |
| 巴西蘑菇P | 0.089±0.005 | 测不出 | 0.226±0.00285 | 0.5235±0.0045 | 0.1611±0.0053 | 0.1397±0.0016 | 0.1379±0.0016 | 0.0669±0.0035 |
| 黄芪P1 | 0.089±0.005 | 2.668±0.0058 | 0.1971±0.02 | 2.360±0.0075 | 0.108±0.0014 | 0.066±0.00129 | 0.0724±0.00121 | 0.0653±0.00035 |
| 组分 | MNP | 原液 | 分离液 | 残液 | 洗1 | 洗2 | 洗3 | PBS |
| 黄芪P2 | 0.088±0.003 | 0.292±0.019 | 0.167±0.01 | 0.2714±0.0035 | 0.0882±0.0051 | 0.069±0.0078 | 0.0625±0.0026 | 0.067±0.01 |
| K562细胞P | 0.088±0.003 | 0.2597±0.00064 | 0.1225±0.021 | 0.25195±0.018 | 0.1298±0.0139 | 0.074±0.0078 | 未作 | 0.0517±0.00014 |
| 硫酸胺沉淀黄芪P | 0.089±0.005 | 2.431±0.209 | 0.1683±0.0012 | 1.411±0.0484 | 0.131±0.0011 | 0.127±0.0096 | 0.0572±0.00031 | 0.0608±0.00038 |
| 人参P1 | 0.089±0.005 | 2.487±0.023 | 0.116±0.00035 | 1.521±0.0069 | 0.0977±0.0025 | 0.0738±0.0025 | 0.0677±0.00122 | 0.0595±0.00035 |
| 人参P2 | 0.089±0.005 | 0.398±0.0012 | 0.126±0.01015 | 0.342±0.0024 | 0.0781±0.01575 | 0.0706±0.00012 | 0.0583±0.00085 | 0.0714±0.00072 |
| 灵芝P1 | 0.089±0.005 | 2.974±0.0099 | 0.100±0.00018 | 2.764±0.0067 | 0.127±0.00262 | 0.0948±0.0012 | 0.0729±0.0011 | 0.0558±0.0066 |
| 灵芝P2 | 0.145±0.007 | 0.292±0.0193 | 0.1073±0.0078 | 0.1787±0.0148 | 0.0489±0.0035 | 0.041±0.0081 | 0.0371±0.0018 | 0.0369±0.0052 |
| 当归P1 | 2.891±0.0216 | 2.5153±0.244 | 0.8541±0.0184 | 0.8899±0.011 | 0.819±0.008 | 0.8268±0.008 | 0.774±0.0072 | |
| 当归P2 | 2.7748±0.096 | 2.518±0.0557 | 0.8894±0.0458 | 0.9159±0.03 | 0.847±0.031 | 0.841±0.0098 | 0.7787±0.0129 |
P＝蛋白质
表1的结果揭示，磁性纳米分离器可有效分离各种含有蛋白质的样品中的蛋白质。
实施例5
MNP-NH2-黄芪蛋白与肿瘤细胞膜黄芪蛋白受体结合的效果
中药治疗疾病的疗效无可非议，尤其在抗肿瘤和促进免疫功能等方面，显示了较强的治疗作用。为了探讨其机理，在本实施例中选择了补气中药黄芪，按传统的水煎法提取可溶蛋白，测定提取液紫外吸收值，再以MNP+NH2分离黄芪蛋白并与靶细胞(购自上海细胞所细胞库的K562细胞)一起孵育、磁化、细胞裂解液消化细胞、反复洗涤、脱磁后测定紫外吸收值。结果如表2所示。
表2：MNP-NH2对K562细胞系黄芪蛋白受体的测定
| 组别 | n | 黄芪受体(X±S) | t值 |
| MNP-NH<sub>2</sub>+黄芪P | 3 | 0.1073±0.00794 | |
| MNP-NH<sub>2</sub>+黄芪P+R | 3 | 0.3239±0.002 | 65.575∽P＜0.001 |
P＝蛋白质；R＝受体
表2的结果说明，因为“MNP-NH2+黄芪P”复合物与K562细胞上的受体(R)结合，导致紫外吸收值上升。这表明，黄芪蛋白中存在与K562细胞表面受体相结合的蛋白。
实施例6
吸附或结合的蛋白质与磁性纳米粒子的解析和分离
将实施例5中获得的MNP-NH2+黄芪蛋白复合物，置于pH8.0的Tris溶液中(室温)，放置15分钟(发生解离)。然后利用磁力去除磁性纳米粒子，得到含解离的黄芪蛋白的水溶液。测定解析前后的吸光度，结果如表3所示。
表3：解析前后样品的紫外吸收值
| 组别 | n | A值 |
| 解析前的溶液 | 3 | 0.449±0.0918 |
| 解析后的溶液 | 3 | 0.33897±0.00997 |
表3的结果说明，约75％的蛋白从磁性纳米粒子上有效地解析，并被有效地分离。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种磁性纳米粒子的用途，其特征在于，它被用于分离液体样品中的植物中药蛋白质，且所述磁性纳米粒子表面被N-(2-氨乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷修饰。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的中药选自：人参、黄芪、灵芝、当归、生地、熟地、酸枣仁、天麻、天冬、远志、白术、白芍、葛根、天花粉。
3.一种分离液体样品中植物中药蛋白质的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将样品与磁性纳米粒子接触，从而使得样品中植物中药蛋白质吸附于或结合于表面被N-(2-氨乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷修饰的磁性纳米粒子；
(b)利用磁力将磁性纳米粒子与液体样品分离开，获得吸附了或结合了植物中药蛋白质的磁性纳米粒子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤(c)：对步骤(b)的吸附了或结合了蛋白质的磁性纳米粒子进行解吸，从而使得吸附的或结合的蛋白质与磁性纳米粒子解离开，从而获得分离的磁性纳米粒子和蛋白质，其中，所述的步骤(c)是在pH8.0±0.2的Tris溶液中放置5分钟-2小时。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)是在1-20℃，pH6.5-8.0的溶液中放置5分钟-2小时。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100505 Termination date: 20130511 |