CN110724177B - 一种灵芝糖肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灵芝糖肽及其制备方法。本发明以灵芝为原料，纯水回流提取后过滤，收集滤液浓缩，加入高醇至沉淀析出，静置离心，取沉淀加入少量甲醇水混合溶剂溶解样品，离心除杂，取上清液经MCI柱层析，甲醇和水不同比例梯度洗脱，收集洗脱剂，浓缩真空干燥粉碎得到灵芝糖肽。本发明制备的灵芝多肽具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性的作用，其中多糖含量为23.52％～28.15％，蛋白质含量58.99％～62.11％。本发明工艺简单，易于操作，MCI柱层析可反复多次使用。本发明所述工艺易于工业化生产。

Description

一种灵芝糖肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种灵芝糖肽及其制备方法。
背景技术
赤芝是担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.exFr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体，具有补气安神，止咳平喘的功效，用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳气短等症。灵芝含有丰富的有效成分，其中包括多糖(肽)类，三萜类，蛋白质类，腺苷类、生物碱类及甾醇类，具有极高的药用价值。
糖肽是一种结合蛋白质的多醣体，主要成分是含有蛋白质的葡聚糖，多糖由β-(1，3)或β-(1，3)(1，6)葡聚糖组成，其具有抗肿瘤，保肝解毒和提高机体免疫力等功能。
现有的专利申请号CN106265773A的制备方法是将灵芝孢子粉采用浓醇提取、稀醇提取、乙醚脱脂，除杂脱色和树脂纯化步骤，得到灵芝孢子粉糖肽。该专利生产工艺繁琐，不易操作，用到的乙醚溶剂极易挥发，不利于大规模生产。
现有技术CN108047318A将灵芝粉碎、水浸泡提取获得灵芝水提取液，通过膜透析和Bio-GL，P-10柱色谱分离纯化获得多糖肽对照品。该专利利用液相色谱制备糖肽，不利于大规模生产。
现有技术CN1552732A通过氨水调节pH至碱性水提云芝子实体，过滤浓缩，干燥粉碎，加水溶解，通过阳离子树脂脱去重金属，得到云芝糖肽。该专利只脱除了重金属，未进行糖肽的纯化和活性测试。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种灵芝糖肽及其制备方法。本发明制备的灵芝多肽具有抑制乙酰胆碱酯酶的活性的作用，其中多糖含量为23.52％～28.15％，蛋白质含量58.99％～62.11％。本发明工艺简单，易于操作，MCI柱层析可反复多次使用。本发明所述工艺易于工业化生产。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种灵芝糖肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取浓缩：取灵芝药材粗粉，每次加入纯水的量分别是所述灵芝药材粗粉质量的8～12倍，加热回流提取的时间为1.5～2.5小时，共提取2～3次，滤布过滤，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液；
(2)醇沉：将步骤(1)所述浓缩液不断搅拌，缓慢加入95％乙醇至沉淀析出，静置，离心过滤，收集乙醇沉淀部分，上清液再次缓慢加入95％乙醇，同法操作，收集乙醇沉淀，合并两次沉淀，备用；
(3)柱层析：在步骤(2)所述两次沉淀中加入15％～30％的甲醇-水混合溶液至沉淀溶解，过滤，滤液经MCI柱层析，15％～30％甲醇-水混合溶液洗脱，50％～70％甲醇-水混合溶液解析，收集50％～70％甲醇-水解析液，减压浓缩，真空干燥粉碎即得灵芝糖肽。
优选地，所述步骤(1)中，所述灵芝为赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang。
优选地，所述步骤(1)中，所述加热回流提取的温度为150℃。
优选地，所述步骤(1)中，所述滤布的目数为200～300目。
更优选地，所述步骤(1)中，所述滤布的目数为200目。
优选地，所述步骤(1)中，所述减压浓缩时的真空度为-0.07～-0.09Mpa，温度为60～70℃。
优选地，所述步骤(1)中，所述减压浓缩至料液体积为药材质量的1/10～1/12倍(v/m)。
更优选地，所述步骤(1)中，所述减压浓缩至料液体积为药材质量的1/10倍(v/m)。
优选地，所述步骤(2)中，所述静置时的温度为4℃，时间为6～8小时。
优选地，所述步骤(2)中，所述离心时的转速为5000～10000r/min。
优选地，所述步骤(3)中，所述过滤采用滤纸进行。
优选地，所述步骤(3)中，所述MCI柱的孔径为4～300μm。
更优选地，所述步骤(3)中，所述MCI柱的孔径为75～150μm。
优选地，所述步骤(3)中，所述15％～30％甲醇-水混合溶液洗脱1～2个柱体积。
更优选地，所述步骤(3)中，所述15％～30％甲醇-水混合溶液洗脱2个柱体积。
优选地，所述步骤(3)中，所述50％～70％甲醇-水混合溶液解析3～5个柱体积。
优选地，所述步骤(3)中，所述减压浓缩时的真空度为-0.07～-0.09Mpa，温度为60～70℃。
优选地，所述步骤(3)中，所述灵芝糖肽活性检测方法包括如下步骤：采用改良的Ellman法测定灵芝糖肽抑制乙酰胆碱酯酶的活性，实验重复3次，选取96孔细胞培养板进行Ellman法反应，反应液终体系体积为200μL；反应液包含80mM pH 7.4的Na2HPO4、0.1mM iso-OMPA、0.625mM ATCh、0.5mM DTNB。
一种灵芝糖肽，采用如上所述制备方法制备得到。
本发明的基本原理：
本发明以灵芝为原料，纯水回流提取后过滤，收集滤液浓缩，加入高醇至沉淀析出，静置离心，取沉淀加入少量甲醇水混合溶剂溶解样品，离心除杂，取上清液经MCI(MCI是反相树脂，具有极好的脱色效果)柱层析，甲醇和水不同比例梯度洗脱，收集洗脱剂，浓缩真空干燥粉碎得到灵芝糖肽，得到的灵芝糖肽采用Ellman法进行抑制乙酰胆碱酯酶活性测试。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明以赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganodermasinense Zhao，Xu et Zhang为原料，经提取纯化后得到多糖含量为23.52％～28.15％，蛋白质含量58.99％～62.11％的灵芝糖肽；
(2)本发明制备的灵芝糖肽具有抑制乙酰胆碱酯酶的作用；
(3)本发明工艺简单，易于操作，易于工业化生产；
(4)本发明灵芝糖肽具有抗乙酰胆碱酯酶活性的新用途。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1～3中，得率＝样品质量/药材质量×100％。
实施例1～3中，多糖检测方法参照NY/T1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》。
实施例1～3中，蛋白质检测参照GB5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。
实施例1
取10kg赤芝粉碎成粗粉，加入纯化水回流提取两次，每次加入的纯化水的量是赤芝质量的10倍量，150℃加热回流提取，时间分别是2小时和1.5小时，200目滤布过滤，合并滤液，温度控制65℃，-0.09Mpa减压浓缩，浓缩至1L，搅拌缓慢加入3L 95％乙醇，沉淀析出，放入冰箱4℃冷藏6小时，6000r/min离心过滤，取沉淀备用，滤液中再次缓慢加入1L 95％乙醇，放入冰箱4℃冷藏8小时，同法离心取沉淀，合并沉淀后加入200ml 30％甲醇-水溶解，滤纸过滤，将滤液经柱体积为4L，孔径为75～150μm MCI GEL CHP20P反相柱层析(厂家：北京绿百草科技发展有限公司)，湿法上柱，流速3秒每滴，待滤液完全浸入柱子后，30％甲醇-水溶液洗脱2个柱体积，然后配制12L浓度为70％甲醇-水溶液解析，收集解析液，温度控制65℃，-0.09Mpa减压浓缩，真空干燥得到120.5g糖肽样品，得率1.205％，多糖含量为23.52％，蛋白质含量62.11％。
实施例2
取10kg紫芝粉碎成粗粉，加入纯化水回流提取两次，每次加入的纯化水的量分别是紫芝质量的12倍量和10倍量，150℃加热回流提取，时间分别是2小时和1.5小时，200目滤布过滤，合并滤液，温度控制66℃，-0.09Mpa减压浓缩，浓缩至1L，搅拌缓慢加入3L 95％乙醇，沉淀析出，放入冰箱4℃冷藏8小时，5000r/min离心过滤，取沉淀备用，滤液中再次缓慢加入1L 95％乙醇，放入冰箱4℃冷藏8小时，同法离心取沉淀，合并沉淀后加入200ml 25％甲醇-水溶解，滤纸过滤，将滤液经柱体积为4L，孔径为75～150μm MCI GEL CHP20P反相柱层析(厂家：北京绿百草科技发展有限公司)，湿法上柱，流速3秒每滴，待滤液完全浸入柱子后，25％甲醇-水溶液洗脱2个柱体积，然后配制18L浓度为50％甲醇-水解析液，收集解析液，温度控制65℃，-0.09Mpa减压浓缩，真空干燥得到125.3g糖肽样品，得率1.253％，多糖含量为28.15％，蛋白质含量58.99％。
实施例3
取15kg赤芝粉碎成粗粉，加入纯化水回流提取两次，每次加入的纯化水的量分别是赤芝质量的12倍量和10倍量，150℃加热回流提取，时间分别是2.5小时和2小时，200目滤布过滤，合并滤液，温度控制65℃，-0.09Mpa减压浓缩，浓缩至1.5L，搅拌缓慢加入4.5L95％乙醇，沉淀析出，放入冰箱4℃冷藏6小时，8000r/min离心过滤，取沉淀备用，滤液中再次缓慢加入1L 95％乙醇，放入冰箱4℃冷藏8小时，同法离心取沉淀，合并沉淀后加入350ml20％甲醇-水溶解，滤纸过滤，将滤液经柱体积为6L，孔径为75～150μm MCI GEL CHP20P反相柱层析(厂家：北京绿百草科技发展有限公司)，湿法上柱，流速3秒每滴，待滤液完全浸入柱子中后，20％甲醇-水溶液洗脱2个柱体积，然后配制24L浓度为65％甲醇-水解析液，收集解析液，温度控制65℃，-0.09Mpa减压浓缩，真空干燥得到178.5g糖肽样品，得率1.19％，多糖含量为27.18％，蛋白质含量60.01％。
效果实施例(灵芝糖肽的药效学实验)
阿尔兹海默病(AD)发病多见于老人，因此也称为老年痴呆症，其临床表现为认知、记忆、语言和活动能力等障碍，并伴随不同程度人格及行为等改变，是死亡率较高的神经退行性疾病，现代临床多用他克林等乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂治疗，通过抑制乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的水解，改善症状，但存在副作用大，疗效弱等缺点。本发明制备的灵芝糖肽化合物具有抑制乙酰胆碱酯酶的特点。
本实验案例用于说明灵芝糖肽抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
制备得到的3批糖肽样品用DMSO(来源：国药集团化学试剂有限公司)溶解。取110μL磷酸缓冲液(pH8.0)，10μL待测物(50μg/mL)和40μL乙酰胆碱酯酶(来源：美国Sigma-Aldrich)(0.02U/mL)于96孔板中，于30℃温育20min，再加入浓度为2.48mg/mL 20μL DTNB(来源：国药集团化学试剂有限公司)和浓度为1.81mg/mL 20μL碘化硫代乙酰胆碱(来源：美国Sigma-Aldrich)，反应体系总共200μL，30℃温育30min后，采用BioTek EPOCH2处酶标仪在405nm下检测各组样品的吸光度(扣除背景及药物本身颜色干扰)，阳性对照为他克林(来源：美国Sigma-Aldrich)，反应终浓度为0.08μg/mL，阴性对照为DMSO，终浓度为0.1％，所有样品重复3次实验。按照(E-S)/E×100％来计算化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制率(E为阴性对照平均吸光值，S为待测物的平均吸光值)。
本发明实施例1～3制得的灵芝糖肽对乙酰胆碱酯酶的抑制活性见表1。
表1实施例1～3制得的灵芝糖肽对乙酰胆碱酯酶的抑制活性
Figure BDA0002220947100000071
由表1可见，本发明制得的灵芝糖肽具有抑制乙酰胆碱酯酶的作用。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种灵芝糖肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取浓缩：取灵芝药材粗粉，每次加入纯水的量分别是所述灵芝药材粗粉质量的8～12倍加热回流提取的时间为1.5～2.5小时，共提取2～3次，滤布过滤，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液；
(2)醇沉：将步骤(1)所述浓缩液不断搅拌，缓慢加入95％乙醇至沉淀析出，静置，离心过滤，收集乙醇沉淀部分，上清液再次缓慢加入95％乙醇，同法操作，收集乙醇沉淀，合并两次沉淀，备用；
(3)柱层析：在步骤(2)所述两次沉淀中加入15％～30％的甲醇-水混合溶液至沉淀溶解，过滤，滤液经MCI柱层析，15％～30％甲醇-水混合溶液洗脱，50％～70％甲醇-水混合溶液解析，收集50％～70％甲醇-水解析液，减压浓缩，真空干燥粉碎即得灵芝糖肽；
所述步骤(1)中，所述灵芝为赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang；
所述步骤(1)中，所述加热回流提取的温度为150℃；
所述步骤(1)中，所述滤布的目数为200目；
所述步骤(1)中，所述减压浓缩时的真空度为-0.07～-0.09Mpa，温度为60～70℃；
所述步骤(1)中，所述减压浓缩至料液体积为药材质量的1/10倍；
所述步骤(2)中，所述静置时的温度为4℃，时间为6～8小时；
所述步骤(3)中，所述MCI柱的孔径为75～150μm；
所述步骤(3)中，所述15％～30％甲醇-水混合溶液洗脱1～2个柱体积；
所述步骤(3)中，所述50％～70％甲醇-水混合溶液解析3～5个柱体积；
所述步骤(3)中，所述减压浓缩时的真空度为-0.07～-0.09Mpa，温度为60～70℃。
2.一种灵芝糖肽，其特征在于，采用如权利要求1所述的一种灵芝糖肽的制备方法制备得到；所述灵芝糖肽中的多糖含量为23.52％～28.15％，蛋白质含量为58.99％～62.11％；所述灵芝糖肽对乙酰胆碱酯酶的抑制率为81.7％～84％。
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