CN114081918B - 一种乌蔹莓总黄酮的制备方法 - Google Patents

一种乌蔹莓总黄酮的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种乌蔹莓总黄酮的制备方法，涉及分离纯化技术领域，该制备方法包括以下步骤：(1)乌蔹莓药材的预处理：将乌蔹莓药材洗净、干燥，粉碎、过筛后得到乌蔹莓药材饮片，备用；(2)乌蔹莓浓缩液的制备：干燥乌蔹莓药材饮片，乙醇回流提取，减压浓缩，离心后取上清液，即得乌蔹莓浓缩液；(3)装柱、上样：将AB‑8大孔吸附树脂预处理后装柱，将乌蔹莓浓缩液调节pH后，上样，动态吸附；(4)除杂、洗脱：将吸附柱进行水洗后再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥，即得乌蔹莓总黄酮提取物。通过制备方法中各参数的优化，能够有效提高乌蔹莓黄酮的含量。

Description

一种乌蔹莓总黄酮的制备方法
技术领域
本发明涉及分离纯化技术领域，具体涉及一种乌蔹莓总黄酮的制备方法。
背景技术
乌蔹莓为葡萄科乌蔹莓属植物乌蔹莓Cayratia japonica(Thunb.)Gagnep.的全草，具有清热利湿，解毒消肿之功效，主治热毒痈肿，疔疮，丹毒，风湿痹痛，黄疸等。乌蔹莓膏是南京市中医院著名制剂，已应用于临床30余年，临床表明其对肛周脓肿、乳痈、腮腺炎、痛风性关节炎、风湿性关节炎和腰痛等症均有良好的疗效。
目前多篇文献对乌蔹莓的提取工艺展开了研究，例如，文献：赵学龙等，乌蔹莓药学与临床研究现状及分析.中医药导报，2018(02):第110-113页.通过UPLC-QTOF-MS分析乌蔹莓成分表明主要是黄酮类成分，采用UPLC法对4个主要成分(木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素)建立了含量测定方法。文献：许倩倩等，UPLC-QTOF-MS分析乌蔹莓成分及多组分定量研究.南京中医药大学学报，2020.36(04):第517-524页.目前对乌蔹莓的提取工艺有所研究。文献：许倩倩等，响应面法优化乌蔹莓的提取工艺.药学与临床研究，2019.27(04):第257-260页.以干浸膏得率和木犀草素含量作为评价指标，通过响应面法优化乌蔹莓软膏原料的最佳醇提工艺，最佳工艺修正为：加醇量12倍，提取时间2.5h，乙醇浓度70％。文献：江念等，正交试验法优化3种乌蔹莓属植物中黄酮和多糖的水提醇沉工艺.中成药，2016(10):第2281-2284页.采用正交试验法优化乌蔹莓、华中乌蔹莓和鸟足乌蔹莓中黄酮和多糖的水提醇沉工艺。但目前为止，文献多对乌蔹莓含量及提取工艺进行了研究，很少有制备乌蔹莓总黄酮提取物的方法报道，且乌蔹莓的提取或纯化工艺所得到的乌蔹莓总黄酮的纯度整体偏低。
针对乌蔹莓总黄酮提取纯化纯度低的问题，寻找一种乌蔹莓总黄酮纯度较高的制备工艺十分关键。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种乌蔹莓总黄酮的制备方法，通过各参数的优化，能够有效提高乌蔹莓黄酮的含量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种乌蔹莓总黄酮的制备方法，包括以下步骤：
(1)乌蔹莓药材的预处理：将乌蔹莓药材洗净、干燥，粉碎、过筛后得到乌蔹莓药材饮片，备用；
(2)乌蔹莓浓缩液的制备：干燥乌蔹莓药材饮片，乙醇回流提取，减压浓缩，离心后取上清液，即得乌蔹莓浓缩液；
(3)装柱、上样：将AB-8大孔吸附树脂预处理后装柱，将乌蔹莓浓缩液调节pH后，上样，动态吸附；
(4)除杂、洗脱：将吸附柱进行水洗后再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压干燥，即得乌蔹莓总黄酮提取物。
进一步地，步骤(1)中所述过筛的筛网为80-120目。
进一步地，步骤(2)中所述回流提取具体为加12倍量体积分数为70％的乙醇回流提取两次，每次2.5h，过滤并合并滤液；所述减压浓缩具体指浓缩至生药1g/mL；所述离心具体指4000r/min低速离心20min。
进一步地，步骤(3)中所述预处理具体指使用体积分数为95％的乙醇预处理24h。
进一步地，步骤(2)中所述乙醇回流提取共计2-3次，每次乙醇的重量为药材总重量的8-15倍。
进一步地，步骤(3)中所述pH为4-7。
进一步地，步骤(3)中所述乌蔹莓浓缩液的生药浓度为0.25-1g/mL。
进一步地，步骤(3)中所述上样的流速为每小时2-6柱体积。
进一步地，步骤(3)中所述AB-8大孔吸附树脂的径高比为1:5-10；优选为1:6。
进一步地，步骤(4)中所述水洗的洗脱体积为3-15倍柱体积，所述乙醇洗脱的洗脱体积为3-6柱体积。
进一步地，步骤(4)中所述乙醇洗脱中，乙醇的体积分数为30-60％。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的乌蔹莓总黄酮。
本发明所取得的技术效果是：
本发明采用UPLC法，以木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷等为检测指标，通过优化各项工艺，能够有效提高乌蔹莓黄酮的含量。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
实施例1
一种乌蔹莓总黄酮的制备方法，包括以下步骤：将乌蔹莓药材20.0kg，洗净、干燥，粉碎过100目筛备用；将药材粉末用体积分数为70％的乙醇，每次用量240L，提取2次，过滤并合并滤液，减压回收至生药浓度为1g/ml，4000r/min低速离心20min，取上清液。将上清液加入适量盐酸调pH至4.0，生药浓度为0.5g/ml，AB-8大孔树脂柱径高比为1:6，以上样体积5BV，上样流速为5BV/h，进行动态吸附后，以10BV的纯化水进行水洗，水洗流速为5BV/h，然后用体积分数为50％的乙醇3BV进行洗脱，洗脱流速为5BV/h，收集洗脱液，减压浓缩至干，得乌蔹莓总黄酮提取物。
实施例2
一种乌蔹莓总黄酮的制备方法，包括以下步骤：将乌蔹莓药材20.0kg，洗净、干燥，粉碎过100目筛备用；将药材粉末用体积分数为70％的乙醇，每次用量240L，提取2次，过滤并合并滤液，减压回收至生药浓度为1g/ml，4000r/min低速离心20min，取上清液。将上清液加入适量盐酸调pH至7.0，生药浓度为0.5g/ml，AB-8大孔树脂柱径高比为1:6，以上样体积5BV，上样流速为2BV/h，进行动态吸附后，以3BV的纯化水进行水洗，水洗流速为5BV/h，然后用体积分数为30％的乙醇3BV进行洗脱，洗脱流速为5BV/h，收集洗脱液，减压浓缩至干，得乌蔹莓总黄酮提取物。
实施例3
一种乌蔹莓总黄酮的制备方法，包括以下步骤：将乌蔹莓药材20.0kg，洗净、干燥，粉碎过100目筛备用；将药材粉末用体积分数为70％的乙醇，每次用量240L，提取2次，过滤并合并滤液，减压回收至生药浓度为1g/ml，4000r/min低速离心20min，取上清液。将上清液加入适量盐酸调pH至6.0，生药浓度为0.5g/ml，AB-8大孔树脂柱径高比为1:6，以上样体积5BV，上样流速为6BV/h，进行动态吸附后，以15BV的纯化水进行水洗，水洗流速为5BV/h，然后用体积分数为60％的乙醇6BV进行洗脱，洗脱流速为5BV/h，收集洗脱液，减压浓缩至干，得乌蔹莓总黄酮提取物。
实施例4-吸附动力学试验
称量已经预处理好的AB-8大孔树脂1.0g(湿重)，于50mL具塞锥形瓶中，以移液管加入制备的生药浓度为1g/ml的上柱液20mL，将锥形瓶置于恒温摇床中，于室温下以60r/min震荡24h，在吸附时间的第0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240min各取500ml吸附后的上柱液，经12000r/min离心10min后，以UPLC法测定各个时刻上柱液中黄酮类成分的浓度，计算其吸附能力Qt、平衡吸附能力Qe，公式分别为吸附能力Qt＝瓶中样品体积Vt*(总黄酮初始浓度C0-t时刻浓度Ct)、平衡吸附能力Qe＝瓶中样品体积Vt*(总黄酮初始浓度C0-吸附平衡时浓度Ce)。用准一、二级动力学模型描述乌蔹莓提取液中总黄酮成分的吸附过程，公式分别为ln(Qe-Qt)＝-k1t+lnQe、t/Qt＝[1/(k2*Qe 2)]+t/Qe。k1、k2分别为准一级、准二级动力学速率常数。
表1黄酮苷类动力学方程及相关参数
Figure BDA0003362438910000041
Figure BDA0003362438910000051
试验结果发现，在静态吸附前60min内，AB-8树脂对黄酮苷类成分吸附速率较快，随时间延长吸附速率慢慢下降，到150min时达到平衡。由表1中数据可知，AB-8树脂对乌蔹莓中黄酮苷类成分的静态动力学吸附更符合准二级动力学方程，其理论平衡吸附能力为Qe＝22.9358mg/g，与准一级动力学方程Qe＝17.7929mg/g相比更接近实验值20.6939mg/g。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，制备方法中，将AB-8大孔吸附树脂替换为HPD-600大孔吸附树脂。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，制备方法中，将AB-8大孔吸附树脂替换为D-101大孔吸附树脂。
对比例3
与实施例1的区别仅在于，制备方法中，将上清液加入适量盐酸调pH至8.0，上样流速为1BV/h，乙醇洗脱的体积分数为65％。
对比例4
与实施例1的区别仅在于，洗脱过程中，先用体积为5BV的水进行水洗，水洗速度为2BV/h，接着用体积为4BV浓度为30％的乙醇洗脱，醇洗速度为2BV/h，然后用体积为4BV浓度为60％的乙醇洗脱，醇洗速度为2BV/h。
本发明中方法的纯化吸附情况试验方法：采用UPLC法测定乌蔹莓总黄酮提取物的纯度，色谱柱：Waters CORTECS T3(2.1*100mm，1.6μm)；流动相为甲醇-0.2％甲酸水；梯度洗脱：0～6min，40％甲醇；6～6.5min，40％～53％甲醇；6.5～11.5min，53％甲醇；11.5～12min，53％～40％甲醇；12～15min，40％甲醇；柱温30℃；体积流量为0.2ml/min；检测波长为360nm，得到表2。
表2
Figure BDA0003362438910000061
由上表可知，本发明的技术方案能够显著提高乌蔹莓总黄酮中木樨草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木樨草以及芹菜素的质量分数，同时提高总洗脱率。本发明中乌蔹莓总黄酮的提取纯化具有特殊性，有且仅有在特定的参数的条件下，才能够具有较优的效果。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (1)

1.一种提取方法在纯化乌蔹莓提取物中木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷中的应用，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
将乌蔹莓药材20.0kg，洗净、干燥，粉碎过100目筛备用；将药材粉末用体积分数为70%的乙醇，每次用量240 L，提取2次，过滤并合并滤液，减压回收至生药浓度为1 g/ml，4000r/min低速离心20 min，取上清液；
将上清液加入适量盐酸调pH至4.0，生药浓度为0.5 g/ml，AB-8大孔树脂柱径高比为1:6，以上样体积5 BV，上样流速为5 BV/h，进行动态吸附后，以10 BV的纯化水进行水洗，水洗流速为5 BV/h，然后用体积分数为50 %的乙醇3 BV进行洗脱，洗脱流速为5 BV/h，收集洗脱液，减压浓缩至干，得乌蔹莓总黄酮提取物。
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