CN104531673A - 用于dna提取的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

公开了用于从溶液中回收生物聚合物的方法和材料。具体地，本发明提供了用于从生物材料中提取和分离核酸的方法。在洗涤剂和溶剂的存在下，可以通过形成与可溶性多糖聚合物和磁性颗粒的稳定复合物来分离核酸。当从溶液中磁性地分离出颗粒时，核酸和它们一起分离。随后可以从颗粒释放和分离核酸。该核酸制剂有用于在下游分子技术中得到有效且精确的结果，所述下游分子技术例如核酸来源的定量、鉴定以及基因分型。

Description

用于DNA提取的方法和试剂盒
本申请是申请号为200980113817.7(国际申请号为PCT/US2009/034143)、申请日为2009年2月13日、发明名称为“用于DNA提取的方法和试剂盒”的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本教导一般涉及从生物材料中分离核酸，以使所述核酸与下游应用中的使用相适应(compatible with)的方法。
发明内容
在各种实施方式中，本教导涉及多羟基聚合物和洗涤剂用于将核酸与具有亲水表面的磁性颗粒结合以及将核酸从所述磁性颗粒释放的用途。在一些实施方式中，提供了用于从生物材料中分离DNA的试剂盒。
本文所用的标题部分只是用于编排目的，不理解为以任何方式限制所描述的主题。本申请中所引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和协议，不管此类文献和类似材料的形式如何，都以全文通过引用明确并入本文，用于任何目的。
附图说明
本领域技术人员将理解下文所描述的附图只用于说明目的。附图并无意以任何方式限制本教导的范围。
图1是说明如本教导的各种实施方式中所描述的DNA的分离和纯化方法的示意图。
图2说明如实施例6中所描述的DNA分离和纯化的DNA产率，其中按照实施例4中所描述的方法，从细胞计数范围为1562-50000的培养的Raji细胞分离基因组DNA。
图3说明如实施例7中所描述的DNA分离和纯化的DNA产率，其中按照实施例4中所描述的方法，从细胞计数范围为3500-110000的培养的K562细胞分离基因组DNA。
图4说明如实施例13中所描述的从基材中分离和纯化DNA后获得的基因分型分布(genotyping profiles)，其中按照实施例11的方法从生物样品中分离基因组DNA，并使用试剂盒进行处理，用于基因分型。
具体实施方式
虽然结合各种实施方式来描述本教导，但并无意将本教导限制于此类实施方式。相反，如本领域技术人员将理解的，本教导涵盖了各种替代、修改和等同物。
本说明书中所用的绝大多数词语具有本领域技术人员所认为的那些词语的含义。本说明书中具体定义的词语具有本教导上下文中提供的整体含义和如本领域技术人员通常理解的含义。在词语或短语的本领域所理解定义与本说明书中具体教导的该词语或短语的定义相冲突的情况下，应以本说明书为准。本文所用的标题只是为了方便起见，并不理解为以任何方式进行限制。
本文所用的“DNA”指本领域所理解的各种形式的脱氧核糖核酸，例如基因组DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA和染色体DNA。“核酸”指任何形式的一种或多种核酸分子、DNA或RNA(核糖核酸)。本文所用的术语“分离的核酸分子”或“分离的核酸”指已从其天然环境中脱离(remove)的核酸分子(任何形式的DNA或RNA)。分离的核酸分子的一些实例为含于载体中的重组DNA分子；保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子；部分或基本纯化的核酸分子；获得自包含生物材料的法医样品和其它样品的核酸分子，所述生物材料例如血液、精液、唾液、皮肤组织等；以及合成的DNA分子。“分离”的核酸可以不含在取得所述核酸的有机体的基因组DNA中天然位于所述核酸侧翼的序列(即位于所述核酸5‘和3’端的序列)。此外，“分离”的核酸分子(例如cNDA分子)当通过重组技术制备时，可以基本不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，可基本不含化学前体或其它化学品。
“聚合酶链式反应”(或“PCR”)指一种技术，其中使用变性、用引物退火以及用DNA聚合酶延伸的重复循环来将靶DNA序列的拷贝数扩增大约106倍或更多。用于扩增核酸的PCR方法涵盖于美国专利Nos.4,683,195和4,683,202，通过引用将其全文并入本文，用于描述该方法。任何PCR的反应条件包括该反应的化学组分及其浓度、反应循环中使用的温度、反应的循环数目以及反应循环的阶段的持续时间。
“PCR相适应的(PCR-compatible)”指任何组合物、溶液、化合物、试剂等，其与PCT检测中的后续使用相适应，且对酶促聚合酶链式反应是相对非限制性的。如通过PCR结果与相关阳性和阴性对照的比较所证明的，PCR相适应的产品显示相对最小地抑制或者不抑制PCR扩增。PCR检测可以包括但不限于DNA基因分型系统；用于DNA定量的或绿色实时PCR检测；多重PCR检测，包括设计为对短串联重复序列进行基因分型的那些。
本文所用的“扩增”指酶促增加特定核酸序列的量的方法。该扩增并不限于但是通常由PCR来实现。
“聚合物”或“多种聚合物”指用于将核酸与具有亲水表面的磁性颗粒结合，以及将核酸从所述磁性颗粒释放的可溶性多羟基聚合物。
在本教导的一些实施方式中描述了方法，其中可以从样品中分离(separated)和/或分离(isolated)核酸分子，并且在一些实施方式中，其中从所述方法制备的产物为核酸。在一些实施方式中，本教导的方法导致形成了包含分离的核酸的产物。
在本教导的一些实施方式中，可以从含有生物材料的样品中分离和/或分离核酸分子，并且在一些实施方式中，从所述方法制备的产物为核酸。此类样品的例子包括但不限于血液和血斑(blood stain)、唾液和唾液斑、颊细胞和颊拭子、精液和精斑、烟蒂以及口香糖。
在本教导的一些实施方式中描述了方法，其中可以用包含可溶性多羟基聚合物和洗涤剂的起始溶液处理样品，并加入可磁性吸引的颗粒，以便从所述样品中回收核酸分子，并且在一些实施方式中，通过施加磁场从样品中回收核酸。在各种实施方式中，所述样品可以包括一种或多种游离核酸；细胞；生物材料，例如颊拭子、被沾染的织物等。在本教导的其它实施方式中描述了方法，其中可以从样品中分离核酸，包括以下步骤：用包含聚合物和洗涤剂的起始溶液处理样品；向处理的样品中加入悬浮的可磁性吸引的颗粒；以及通过施加磁场，分离经由聚合物附着于可磁性吸引的颗粒的核酸。此类方法可以进一步包括从可磁性吸引的颗粒释放核酸的步骤。此类方法还可以进一步包括在水溶液中洗脱核酸的步骤。
然后可将如此获得的核酸用于任何的各种下游应用中，例如定量、检测以及特定核酸的基因分型或甚至生物物种的基因分型。可以通过例如PCR扩增进行这些分析。作为一个实例，在法医DNA分析中，可以从复合生物材料中获得人的核DNA(nDNA)和/或基因组DNA，然后使用PCR进行基因分型。作为另一个实例，DNA制剂可用于使用实时PCR系统(如)对人DNA、或者更具体的男人DNA进行定量，和/或使用系统(例如试剂盒)进行常染色体或Y染色体短串联重复基因座的基因分型。基于存在于样品中的DNA的量，可以选择将产生用于特定分析所需的最佳结果的特定基因分型系统。因此，为了最好地将核酸用于下游应用中，以高产率产生产品的方法，以及相对不含下游应用(例如PCR)的抑制剂的方法均是特别合意的。
作为一个实例，在获取和处理过程中，典型的法医证据样品常常暴露于各种环境伤害中，这可导致被起抑制PCR作用的化合物污染，并且其因此对基因分型或其它分析的尝试造成干扰。在DNA分离期间以及扩增之前去除此类抑制剂是合意的。
本教导的各种实施方式涉及核酸的有效结合，例如基因组DNA按以下形式与磁性颗粒(即，可磁性吸引的颗粒或珠子)结合：然后可以在适当的水性条件下将结合的核酸释放。因此，这些教导的实施方式使核酸(例如基因组DNA)能够从各种不同类型的生物材料中有效分离。此外，可以从少量或大量的生物材料中分离核酸(例如基因组DNA)，所述材料通常在实验室中处理，例如在基因分型分析中涉及的那些材料。
这些实施方式和本教导的其它特征将从下文描述中变得更加明显。
核酸分离系统
本教导的各种实施方式涉及系统，其顺应(amenable to)组装于试剂盒中，用于在洗涤剂的存在下，将核酸(例如基因组DNA)经由可溶性多羟基聚合物与具有亲水表面的磁性颗粒结合，形成核酸-聚合物-颗粒复合物，并且产生和分离此类复合物，其中所述核酸不直接与磁性颗粒结合。复合物的形成是这样的：聚合物俘获核酸，聚合物附着于颗粒，并因此间接地将核酸与颗粒相连。各种实施方式包括裂解溶液，其引起细胞的裂解和核酸的释放，同时保护核酸免于降解并去除PCR抑制剂。在本教导的各种实施方式中，在洗涤溶液的存在下，核酸经由该复合物保持与磁性颗粒结合，该复合物在所述洗涤溶液中被洗涤以去除污染物，并使得所述核酸顺应用于例如PCR的下游应用中。用于洗涤核酸分离物的任何污染物和抑制剂的溶液为本领域技术人员所熟知，并且可包含例如洗涤剂和极性溶剂。在本教导的实施方式中，然后可以在水溶液(例如缓冲液)中释放核酸，所述水溶液也与用于例如PCR的下游应用相适应。本发明的方法中可以进行多次洗涤，分别地或者与多次向样品施加磁场一起进行所述洗涤，以回收和/或分离核酸。
标准核酸提取技术，包括细胞裂解、核酸的洗涤和洗脱是本领域所熟知的，并且除非另有说明，可以按照在例如以下文献中所描述的各种技术来进行：DNA Typing Protocols：Molecular Biology and Forensic Analysis，第1版，B.Budowle等人编，Eaton Publishing Co.(2000)；JM Butler，Forensic DNA Typing：Biology，Technology，and Genetics of STR Markers，第2版，Elsevier Academic Press(2005)；或者P.Gill，″Application of LowCopy Number DNA Profiling，″Croatian Medical Journal，第42卷，229-232页(2001)；FR Bieber等人，″Isolation of DNA from Forensic Evidence，″Current Protocols in Human Genetics，增刊26(2000)；Forensic DNAProfiling Protocols，Methods in Molecular Biology，第98卷，PJ Lincoln和J.Thomson编，Humana Press(1998)。
本教导的各种实施方式涉及核酸分离系统(例如用于基因组DNA)，其包含用于从生物样品中提取核酸的试剂和方法。这些方法的实施方式可以包括：在洗涤剂的存在下，形成核酸(如基因组DNA)与可溶性聚合物的非共价复合物，所述聚合物具有与可磁性吸引的颗粒表面相同或类似的化学结构；经由聚合物与颗粒表面之间的相互作用，将核酸-聚合物复合物与磁性颗粒结合，从而形成稳定的核酸-聚合物-颗粒复合物；从所述颗粒释放核酸，并在水溶液中洗脱核酸。
申请人已发现在适当的盐和极性溶剂的存在下，使用多羟基水溶性聚合物和洗涤剂提高了核酸(例如基因组DNA)在可磁性吸引的颗粒表面上的结合和释放效率。适当的可磁性吸引的颗粒的实例包括但不限于葡聚糖包被的磁性纳米颗粒(magnetite nanoparticles)。在本教导的一些实施方式中，将葡聚糖包被的磁性纳米颗粒以约2至约10mg/ml的范围加入到包含核酸的样品中。
所述可溶性聚合物和洗涤剂可称为结合促进剂(binding enhancer)。适当的多羟基水溶性聚合物的一些实例为但不限于长链分支的多糖，例如葡聚糖(如葡聚糖5,000,000-40,000,000)、可溶性淀粉、糊精、纤维糊精、聚乙二醇(PEG)、肝素、糖原、短链纤维素、纤维素衍生物及其组合。适当的洗涤剂的一些实例为但不限于N-月桂酰肌氨酸(NLS)；月桂酰肌氨酸钠(lauroyl sarcosinate)，也称作十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)，为衍生自肌氨酸的离子表面活性剂；十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide)或十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)(CTAB)；脱氧胆酸盐；十二烷基β-D-麦芽糖苷；壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)；十二烷基硫酸钠；聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚(商品名为X-100)；及其组合。在一些实施方式中，结合促进剂包含范围为1-5mg/ml的葡聚糖和范围为约5-约15％的十二烷基肌氨酸钠。
适当的极性溶剂的一些实例为但不限于异丙醇、乙醇、丁醇及其组合。在一些实施方式中，极性溶剂包含约80％至约100％异丙醇。
在一些实施方式中，可以将可磁性吸引的颗粒加入到包含核酸的样品(例如细胞裂解物)中，同时加入结合促进剂，形成悬浮液。之后可以将包含极性溶剂的溶液加入到该悬浮液中。或者，在本教导的一些实施方式中，可以将包含结合促进剂和极性溶剂的单一溶液加入到该悬浮液中。结合促进剂、溶剂和细胞裂解物提供独特的条件，以使核酸被俘获在与可溶性聚合物的非共价复合物中，所述可溶性聚合物具有与磁性颗粒表面相同或类似的化学结构。结果是被聚合物俘获的核酸在非共价的核酸-聚合物-颗粒复合物中有效地与磁性颗粒结合。该复合物在醇洗涤条件下是稳定的，并且以后可以在标准低盐缓冲液中容易地核酸将洗脱，所述缓冲液例如含有低浓度的二价金属离子螯合剂(例如EDTA)的Tris缓冲液。在一些实施方式中，核酸-聚合物与颗粒结合的这一阶段可以通过冷却加以辅助。
在核酸-聚合物-颗粒复合物形成中，在被聚合物俘获的核酸与磁性颗粒结合之后，可以向所述悬浮液施加磁场。该磁场可用于从悬浮液中去除核酸-聚合物-颗粒复合物，形成复合物层，例如在管的底部或一侧，并留下上清液。可以通过本领域已知的设备和方法(例如经由(Austin，TX)磁力站)将磁场施加于样品。之后可以从管中去除上清液。
然后可任选洗涤核酸-聚合物-颗粒复合物层，以去除残余的污染物和/或PCR抑制剂；然后，可以在不存在任何磁场的情况下，将核酸-聚合物-颗粒复合物重悬浮于必需体积的适当的洗脱缓冲液中。用于分离核酸的适当的洗脱缓冲液为本领域技术人员所熟知。这使得核酸从核酸-聚合物-颗粒复合物释放进入到溶液中。可以再次向管施加磁场，导致从悬浮液中去除磁性颗粒，例如到管的底部或一侧，留下现在核酸溶解于其中的上清液。现在可以通过用例如移液器收集上清液，从磁性颗粒分离再次溶解的核酸，同时所述颗粒被磁场保持于管的底部或一侧。在这些方法中不需要对样品进行离心。
在本教导的一些实施方式中，然后可以从含有生物材料的样品中分离核酸分子，并结合使用具有亲水表面的磁性颗粒(例如磁性葡聚糖颗粒)从溶液中纯化。磁性颗粒促进的核酸分离和纯化可用来极大地改善本领域技术人员熟知的基于醇的沉淀的常规分离和纯化核酸的方法。可通过这些教导修改的基于醇的分离和纯化程序的实施方式的一个实例可通过参考图1来说明。
裂解溶液
本文所述方法的实施方式可包括从存在于基材上的生物材料(例如颊拭子的棉花或沾染的织物)裂解细胞，所述基材，以产生包含核酸的裂解物；从所述裂解物中去除基材；形成核酸-聚合物-颗粒复合物，之后如上文所述，将核酸分离并洗脱。在一个实施方式中，裂解溶液可包含SDS、Tris缓冲液和NaCl，任选含有蛋白酶K；在一些实施方式中，裂解溶液可包含0.0％-1％SDS、100mM Tris缓冲液和2M NaCl。
在本教导的各种实施方式中，可将裂解溶液加入到含有生物材料的样品(并且任选地，对所述样品进行加热一段时间，例如二十分钟至两个小时)中，以便裂解细胞和将核酸释放到裂解物中。在一些实施方式中，裂解溶液可以为包含设计为有效裂解细胞(例如收集在棉拭子上的颊细胞)，同时还保护释放的核酸免于降解的化合物的组合物。在一些实施方式中，裂解溶液进一步包含确保释放的核酸与用于下游检测(例如PCR检测、尤其DNA基因分型系统)相适应的这样的化合物。
在本教导的一些实施方式中，然后在裂解程序后，可以将磁性颗粒、结合促进剂和极性溶剂加入到包含核酸的裂解物中，生成悬浮液，在该悬浮液中形成核酸-聚合物-颗粒复合物，如上文所述分离并洗脱核酸。
洗涤溶液
本教导的各种实施方式涉及核酸分离系统(例如用于基因组DNA)，其包含用于从生物样品中提取核酸的试剂和方法，并包含洗涤步骤以从所述样品中去除PCR抑制剂。在洗涤步骤中使用的洗涤溶液为例如本领域所已知的(溶液)。在一些实施方式中，所述洗涤溶液的具体组分可以为浓度为70％-90％的乙醇。这些方法的实施方式可以包括：形成核酸(如基因组DNA)与可溶性聚合物的非共价复合物，所述聚合物具有与磁性颗粒的表面相同或类似的化学结构；经由聚合物与颗粒表面之间的相互作用，将所述核酸-聚合物复合物与磁性颗粒结合，从而形成稳定的核酸-聚合物-颗粒复合物；通过包含洗涤剂和极性溶剂的洗涤溶液试剂去除未结合的材料，例如PCR抑制剂；以及在水溶液中洗脱顺应用于例如PCR的下游应用中的核酸。
使用洗涤剂和极性溶剂的洗涤溶液来洗涤核酸-聚合物-颗粒复合物帮助去除任何残留的盐、核苷酸、化学品、有机溶剂和样品中的其它污染物，并且促进去除下游应用的抑制剂，例如PCR抑制剂。在各种实施方式中，可将洗涤溶液用作核酸-聚合物-颗粒复合物的洗涤液，以去除PCR抑制剂和/或污染物。对分离和/或纯化期间洗涤核酸有用的溶液是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施方式中，将洗涤溶液加入到核酸-聚合物-颗粒复合物中以产生洗涤悬浮液。所述核酸不溶于醇，并在洗涤期间保持为与聚合物及颗粒的稳定复合物。因此，可剧烈进行(例如通过涡流混合)洗涤步骤，而没有损失核酸的风险。之后可将样品再次置于磁场前面，可从所述复合物层中去除从洗涤悬浮液中分离出来的包含污染物的所得洗涤上清液。
洗涤步骤(如果进行的话)之后，还可以按照第一次洗涤中的类似步骤进行第二次洗涤步骤。在本教导的一些实施方式中，一个或多个洗涤步骤后，如上文所述，将核酸分离并洗脱。
核酸提取和纯化
本教导的提取和纯化方法提供了用于从生物样品中获得核酸(例如基因组DNA)的有用方法，所述核酸可用于下游应用中，例如基因分型、定量和该生物材料来源的鉴定，其中利用了诸如PCR之类的分子生物学方法。本文实施例中所描述的示例性结果说明了本教导的核酸提取和纯化方法的各种优势，其包括但不限于提供核酸(例如基因组DNA)制品，其(a)可源自各种生物材料；(b)不含下游应用(例如PCR扩增)的可检测抑制剂；(c)可以为浓缩形式；以及(d)顺应用于核酸分析用的各种应用中的任何种，所述核酸分析例如基因分型、定量、生物材料来源的检测等。此外，使用标准液体处理系统的核酸的提取及纯化用程序可完全自动化。
此外，通过本教导的方法修改目前使用的标准醇沉淀程序，例如需要离心的那些程序，可以提供若干明显的益处。第一，本教导举例说明的本文方法更快速——用于从分离的核酸复合物中去除溶液的修改程序只花费约1-2分钟，相比之下，使用离心的常规方法花费约10-30分钟。第二，本文方法不依赖于离心设备，却可用简单的磁性装置来进行。第三，本文方法更易于适合自动化。例如，可以将大量的管放置在巨大的电磁体上，使用例如多通道移液器具可同时分离来自这些管中的所有核酸。第四，本教导的方法对于洗涤核酸-聚合物-磁性颗粒复合物的步骤(例如为了去除任何残留的盐、核苷酸或有机溶剂(例如酚))尤其有效，因为在本教导中，洗涤步骤不需要离心，因此可以迅速进行。此外，不存在材料损失的风险或存在最小的材料损失风险，基于离心的常规方法可发生材料损失，其中粒状沉淀(pellet)常常在此类洗涤期间从管的底部脱离。
如本领域技术人员将理解的，对本教导的各种实施方式可以进行多种变化和修改，而不背离这些教导的精神。所有此类变化有意落入这些教导的范围内。
如本文所公开和要求保护的本教导的所有组合物和方法按照本公开内容，无需过度实验，即可制备和实施。尽管已经以具体实施方式对这些教导的组合物和方法进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可对所述组合物和方法，以及在本文所述方法的步骤中或者步骤顺序中，进行改变，而不背离这些教导的概念和范围。更具体地，显而易见的是，化学及生理学上均相关的某些试剂可代替本文所述试剂，但将达到相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为在由所附权利要求所限定的本发明的范围之内。
实施例
本教导的各方面可根据以下实施例得到进一步理解，所述实施例不应理解为以任何方式限制本教导的范围。
实施例1
将人的体液样品置于2.0ml容量的聚丙烯管中。所述样品为2μl血液、10μl唾液和2μl精液。将每个样品与裂解溶液混合，以便裂解细胞。裂解溶液包含0.0％-1％SDS、100mM Tris缓冲液和2M NaCl，任选具有蛋白酶K。将该裂解混合物在约60℃至80℃范围内的温度下，在摇晃或不摇晃条件下孵育约40分钟至1小时的时段。
之后使释放自该生物材料的基因组DNA与具有葡聚糖的多羟基基团的磁性颗粒结合。每一样品的结合混合物含有：细胞裂解物；包含浓度为约5-20mg/ml的磁性颗粒的10μl至20μl悬浮液；以及约150至300μl极性化合物，例如异丙醇、乙醇和/或PEG。然后通过施加磁场，将与磁性颗粒结合的DNA从结合混合物中物理分离。
然后，用基于醇的洗涤溶液(90％乙醇)洗涤仍与复合物中的磁性颗粒结合的DNA。通过使用磁场，将DNA-磁性颗粒复合物再次从洗涤混合物中物理分离。重复洗涤步骤一至两次。在该洗涤步骤中去除俘获在DNA-磁性颗粒复合物中的PCR抑制剂和其他大分子。之后通过将DNA-颗粒复合物悬浮于10至100μl水溶液中，将DNA从磁性颗粒上释放，所述水溶液例如不含DNA的水或例如Tris-HCl的中性缓冲液，并在约50至75℃范围内的温度下孵育该DNA释放混合物。然后通过使用磁场将释放的基因组DNA与磁性颗粒物理分离。将如此获得的基因组DNA制品在4℃下短期储存，或在-20℃下长期储存。使用本领域技术人员熟知的标准方法对DNA进行定量。表1中示出了典型关于人的基因组DNA的结果。
表1：
样品 DNA产率，ng
2μl液体血液 8
2μl液体精液 250
10μl液体唾液 100
实施例2
如实施例1中所描述从生物样品中提取并分离基因组DNA，其中所述结合混合物包含：细胞裂解物；10至20μl磁性颗粒悬浮液，其中用葡聚糖的多羟基基团处理所述颗粒；10至20μl多羟基多糖，例如葡聚糖、纤维素或可溶性淀粉，其浓度为约1至10mg/ml；10至20μl阴离子洗涤剂，例如N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、X-100或十二烷基硫酸钠；以及150至300μl极性化合物，例如异丙醇、乙醇和/或PEG。表2中示出了从该方法获得的基因组DNA的产率。
表2：
样品 DNA产率，ng
2μl液体血液 140
2μl液体精液 1200
10μl液体唾液 200
实施例3
如实施例2中所描述从生物样品中提取并分离基因组DNA，其中使用两种不同的洗涤溶液去除俘获在与磁性颗粒结合的DNA中的抑制剂和其他大分子。洗涤与磁性颗粒结合的DNA的步骤包括使用第一洗涤溶液的一次洗涤(步骤)，然后使用第二洗涤溶液的一至两次洗涤步骤。
实施例4
将人的体液样品2μl血液、20μl唾液和1μl精液置于2.0ml容量的聚丙烯管中并与裂解溶液混合。将该裂解混合物在约60至80℃范围的温度下，在摇晃或不摇晃条件下孵育约40分钟至1小时的时段。
之后使释放自该生物材料的基因组DNA与包含葡聚糖的多羟基基团的磁性颗粒结合。结合混合物包含：细胞裂解物；包含浓度范围为约5-20mg/ml的磁性颗粒的10μl至20μl悬浮液；10至20μl多羟基多糖，例如葡聚糖、纤维素和/或可溶性淀粉，其浓度范围为约1至10mg/ml；约10至20μl的阴离子洗涤剂，例如N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、X-100和/或十二烷基硫酸钠；以及约150至300μl极性化合物，例如异丙醇、乙醇和/或PEG。
通过使用磁场，将与磁性颗粒结合的DNA从结合混合物中物理分离。之后用洗涤溶液洗涤与磁性颗粒结合的DNA。通过使用磁场将与磁性颗粒结合的DNA从洗涤混合物中物理分离。重复洗涤步骤一至两次。在该步骤中去除俘获入与磁性颗粒结合的DNA中的PCR抑制剂和其他大分子。
之后通过将与磁性颗粒结合的DNA悬浮于约10至100μl的水溶液中，将DNA从磁性颗粒上释放，所述水溶液例如不含DNA的水；或包含Tris-HCl和螯合剂的缓冲液。在约50至75℃范围内的温度下孵育该释放混合物。然后通过使用磁场将释放的基因组DNA与磁性颗粒物理分离。将如此获得的基因组DNA制品在4℃下短期储存，或在-20℃下长期储存。使用本领域技术人员熟知的标准方法对DNA进行定量，例如使用人DNA定量试剂盒的人DNA的定量。表3中示出了如此获得的典型关于人基因组DNA的结果。
表3：
样品 DNA产率，ng
2μl液体血液 145
1μl液体精液 650
20μl液体唾液 165
实施例5
如实施例中4所描述分离基因组DNA，其中生物液体为2μl血液、20μl唾液和1μl精液，并将所述液体沾染在织物(例如棉布、聚酯布或粗斜纹布)上。表4中示出了如此获得的沾染在棉上的液体的典型关于人基因组DNA的结果。
表4：
样品 DNA产率，ng
棉上的2μl血液 80
棉上的1μl精液 550
棉上的20μl唾液 145
实施例6
如实施例4中所描述，从细胞计数范围为1562-50000个细胞的培养的Raji细胞中分离基因组DNA。图2和表5中示出了如此获得的典型关人基因组DNA的结果。
表5：
Raji细胞，细胞计数 DNA产率，ng
50000 488
25000 266
12500 136
6250 69.7
3125 37.3
1562 21
实施例7
如实施例4中所描述，从细胞计数范围为约3500-110000个细胞的培养的K562细胞分离基因组DNA。图3和表6中示出了如此获得的典型关于人基因组DNA的结果。
表6：
K562细胞，细胞计数 DNA产率，ng
110000 1190
55000 700
27500 500
13750 217
6875 114
3438 65
实施例8
如实施例4中所描述，从生物液体和不同基材上的生物液体污斑中分离基因组DNA，所述基材例如布、FTA纸、拭子和粗斜纹布，其中通过将生物材料悬浮于裂解溶液中进行该生物材料的裂解。在50至60℃范围内的温度下孵育裂解溶液40分钟至2小时，按实施例4所概述的方法获得DNA并进行定量。
实施例9
如实施例4中所描述分离基因组DNA，其中将约2至10μl生物液体血液沾染在棉上，并用1至5μl PCR抑制剂进行富集，所述抑制剂包括至终浓度约0.1至2mM的正铁血红素，至终浓度约5mg/ml的腐殖酸，至终浓度约5至20mM的靛蓝，以及至终浓度约2至12mg/ml的城市灰尘提取物。如使用人DNA定量试剂盒测定的内部PCR对照(IPC)的Ct值所证实的，通过这些方法在提取和分离基因组DNA期间有效去除PCR抑制剂。表7中示出了如此获得的结果。
表7：
样品 IPC Ct
棉上干燥的2μl血液 27.58
在抑制剂混合物的存在下，棉上干燥的2μl血液 27.60
提取空白 27.77
实施例10
如实施例4中所描述分离基因组DNA，其中包含生物液体污斑的生物样品通过暴露于环境1至7天的时期，而经受环境伤害。按照实施例4的方法将DNA分离并定量。
实施例11
如实施例4中所描述分离基因组DNA，其中生物样品具有不同的性质，包括在棉、人造丝和尼龙材料上的颊拭子；在诸如棉布、粗斜纹布、聚酯布、FTA纸、滤纸之类的材料上的血斑、唾液斑和精斑；烟蒂，指纹拭子(swab of finger prints)；诸如上皮细胞和精液的体液混合物；不同表面上的体液拭子。
实施例12
如实施例11中所描述从生物样品中分离基因组DNA，并使用人DNA定量试剂盒进行处理，用于定量人DNA。表8中示出了人DNA的量和IPC的Ct的结果，IPC的Ct测量来自含有生物材料的一些典型基材的PCR抑制剂的存在。相对于阴性模板对照(NTC)的IPC Ct值，样品DNA制品的IPC Ct值大于1的正差异(positive difference)显示存在PCR抑制剂。
表8：
样品 DNA产率，ng IPC Ct
血液2μl 62±13 27.6
粗斜纹布上的血斑2μl 76±15 27.9
人造丝上的血斑2μl 39.5±8 27.7
尼龙上的血斑2μl 39±10 27.6
唾液5μl 158±30 27.6
棉上的唾液斑5μl 143±25 27.7
精液2μl 1250±150 27.6
棉上的精斑2μl 1340±130 27.7
烟蒂 154±40 27.8
口香糖 21±8 27.9
提取空白 0 27.6
NTC 27.6
实施例13
如实施例11中所描述从生物样品中分离基因组DNA，并使用试剂盒(例如)进行处理，用于基因分型。图4中示出了从含有生物材料的一些典型基材中如此获得的基因型分布(genotype profiles)。
实施例14
如实施例1至12中所描述从生物样品中分离基因组DNA，并使用本文所描述的试剂盒形式的试剂进行处理。

Claims (5)

1.试剂盒，其包含：
a)试剂筒，其包含裂解缓冲液，其中所述裂解缓冲液包含SDS、Tris和NaCl；
b)试剂筒，其包含葡聚糖溶液中的磁性颗粒，其中所述磁性颗粒包被于葡聚糖中；
c)试剂筒，其包含洗涤缓冲液；和
d)试剂筒，其包含洗脱缓冲液。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述裂解缓冲液包含至多1.0％SDS。
3.权利要求1的试剂盒，其中包被于葡聚糖中的磁性颗粒以2-10mg/ml的浓度存在于试剂筒中。
4.权利要求1的试剂盒，其中存在于葡聚糖溶液中的葡聚糖的分子量为50,000-40,000,000。
5.权利要求1的试剂盒，其中葡聚糖溶液中的葡聚糖以1-5mg/ml的浓度存在于试剂筒中。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8497065B2 (en) 2008-02-15 2013-07-30 Life Technologies Corporation Methods and kits for extraction of DNA
US20100029925A1 (en) * 2008-05-23 2010-02-04 Life Technologies Corporation, A Delaware Corporation Methods and kits for extraction of dna
WO2011034864A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Life Technologies Corporation Lysis buffers for extracting nucleic acids
US9777269B2 (en) * 2012-01-25 2017-10-03 Gencell Biosystems Ltd. Biomolecule isolation
WO2014159719A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Scrips Health Methods of isolating nucleic acids
US10576446B2 (en) 2013-05-04 2020-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enrichment of DNA sequencing libraries from samples containing small amounts of target DNA
US9670485B2 (en) 2014-02-15 2017-06-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Partitioning of DNA sequencing libraries into host and microbial components
CN108026570A (zh) * 2015-09-11 2018-05-11 康宁股份有限公司 从血液样品中纯化核酸的组合物和方法
EP3752833A4 (en) * 2018-02-15 2021-11-24 Yeditepe Universitesi METHOD OF EXOSOMISOLATION BY TWO-PHASE LIQUID SYSTEM
CN109709248B (zh) * 2018-12-29 2020-10-27 中国人民解放军总医院 试剂和吸附柱在制备用于检测干血片样本中的待检测物的试剂盒中的用途
WO2022190117A1 (en) * 2021-03-06 2022-09-15 Jaydeep Bhattacharya Magnetic nanoparticles based nucleic acid extraction from biological samples for molecular diagnostics

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512332A (en) * 1985-10-04 1996-04-30 Immunivest Corporation Process of making resuspendable coated magnetic particles
WO2005070471A2 (en) * 2004-01-20 2005-08-04 Alnis Biosciences, Inc. Articles comprising magnetic material and bioactive agents
WO2005089929A2 (en) * 2004-03-18 2005-09-29 Ambion , Inc. Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9003253D0 (en) 1990-02-13 1990-04-11 Amersham Int Plc Precipitating polymers
US5523231A (en) * 1990-02-13 1996-06-04 Amersham International Plc Method to isolate macromolecules using magnetically attractable beads which do not specifically bind the macromolecules
AU1153692A (en) * 1991-01-07 1992-08-17 St. George's Enterprises Limited Particulates
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
US5804684A (en) 1995-08-24 1998-09-08 The Theobald Smith Research Institute, Inc. Method for isolating nucleic acids
US6534262B1 (en) * 1998-05-14 2003-03-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
US7169618B2 (en) * 2000-06-28 2007-01-30 Skold Technology Magnetic particles and methods of producing coated magnetic particles
WO2002055727A2 (en) * 2001-01-09 2002-07-18 Whitehead Biomedical Inst Methods and reagents for the isolation of nucleic acids
US20040137449A1 (en) * 2001-10-05 2004-07-15 Nargessi R D Magnetic isolation and purification of nucleic acids
US20060078923A1 (en) * 2003-04-02 2006-04-13 Mckernan Kevin Method for isolating nucleic acids
CN1260242C (zh) 2003-04-04 2006-06-21 上海东晟纳米科技发展有限公司 用磁性纳米复合材料提取dna的方法及试剂盒
US20050042656A1 (en) * 2003-07-09 2005-02-24 Davis James C. Room temperature elution of nucleic acids
EP1758937B1 (en) * 2004-05-24 2009-09-02 Genvault Corporation Stable protein storage and stable nucleic acid storage in recoverable form
CA2575140A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-09 Agencourt Bioscience Corporation Methods of isolating nucleic acids using multifunctional group-coated solid phase carriers
US7964380B2 (en) * 2005-01-21 2011-06-21 Argylia Technologies Nanoparticles for manipulation of biopolymers and methods of thereof
EP1873241A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-02 Qiagen AS Process for isolating nucleic acids
WO2008134464A2 (en) * 2007-04-25 2008-11-06 3M Innovative Properties Company Sample-processing reagent compositions, methods, and devices
US8497065B2 (en) 2008-02-15 2013-07-30 Life Technologies Corporation Methods and kits for extraction of DNA
US20100029925A1 (en) * 2008-05-23 2010-02-04 Life Technologies Corporation, A Delaware Corporation Methods and kits for extraction of dna

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512332A (en) * 1985-10-04 1996-04-30 Immunivest Corporation Process of making resuspendable coated magnetic particles
WO2005070471A2 (en) * 2004-01-20 2005-08-04 Alnis Biosciences, Inc. Articles comprising magnetic material and bioactive agents
WO2005089929A2 (en) * 2004-03-18 2005-09-29 Ambion , Inc. Modified surfaces as solid supports for nucleic acid purification

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Publication number Publication date
CN102257158A (zh) 2011-11-23
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