CN1260242C - 用磁性纳米复合材料提取dna的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用磁性纳米复合材料提取DNA的方法及试剂盒。所述的方法包括步骤：(a)将磁性纳米复合材料与含DNA的液态样品接触，形成液态混合物，其中所述的磁性纳米复合材料具有超顺磁性内核、中间二氧化硅包覆层和外壳，其直径为50-300nm；(b)用磁场将吸附了DNA的磁性纳米复合材料与液态混合物分开，从而得到吸附有DNA的磁性纳米复合材料。本发明方法可简便有效地从各种样品中抽提出DNA。

Description

用磁性纳米复合材料提取DNA的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种用磁性纳米复合材料提取DNA的方法及试剂盒。

背景技术

DNA的抽提有广泛的应用，例如从血斑、精斑等样品中抽提DNA用于基因指纹鉴定，以及从各种组织中抽提DNA以构建文库等。DNA提取是分子生物学实验中的一项关键技术，DNA提取的质量将直接关系到以后实验的成功与否，如PCR扩增、酶学实验等，因此寻求快速、高效、简易、低成本的DNA提取方法一直是分子生物学工作者的不断追求。

目前常用的几种基因组DNA提取方法均具有明显不足。

苯酚—氯仿提取方法，虽然适用于大多数生物样本，但是实验操作时间长，容易带入污染物，DNA提取的效率和质量因人而异，采用的苯酚、氯仿等带有一定毒性，不利于大范围应用。

Chelex-100方法简单、成本低，提取的DNA可以直接用于PCR扩增。但是由于样本前处理需要多次洗涤，使得DNA提取效率明显降低，而且由于其原理基于树脂的络合作用，因此常常留有抑制剂，部分生物样本无法获得满意结果。

玻璃珠法依赖于DNA与玻璃珠表面的静电吸附，优点在于可以去除大部分杂质，对污染生物样本比较适合。但是由于玻璃珠比表面积小，提取效率较低。且实验过程需要多次离心，步骤烦琐，无法在大量生物样本的DNA提取中应用。

国外一些公司生产的试剂盒，如Promega公司、Qiagen公司、Gene公司等生产的试剂盒，价格昂贵，无法有效推广。

复合磁性粒子在生物领域中的应用前景日益受到了人们的关注。复合磁性粒子也被用作生物样品磁场分离的分离介质。用磁性粒子的分离方法操作简便、所需设备廉价，同时分离速度快，有利于保持样品的生物活性，目前应用越来越广泛。

用于生物技术中的磁性复合粒子一般要求具有如下的特性：(1)粒子具备超顺磁性，以易于吸附和洗脱。(2)粒子需具有较大的磁化强度，以保证分离效率的灵敏度。(3)粒子表面要易于进行化学修饰，以和不同的生物和药物分子进行连接。(4)用于体内时要求有较好的生物相容性。基于此目的设计的复合粒子通常为三明治结构，内核一般为超顺磁性的磁性纳米复合材料，中间为包覆层，目前已有的产品大多采用高分子材料作为包覆层。最外层则修饰与生物组织有特异性作用的功能基团，以满足生物分离的要求。

商品化的复合磁性粒子多采用乳液聚合得到的高分子微球，其中包覆了纳米尺寸的磁性颗粒。然而，高分子球的结构通常比较疏松，其中包含的磁性粒子在长时间保存过程中容易脱离微球，从而影响产品的性能。一般乳液聚合所得的高分子微球尺寸较大，多在微米范围，不能满足一些需要更小尺寸粒子的应用领域的要求。另一类通常采用的磁性粒子包覆材料是多糖类分子，如葡聚糖、壳聚糖等，但此类分子形成的包覆层更不稳定，其与磁性粒子的作用较弱，同样存在磁性粒子易脱落导致产品失效的缺点。

目前，尚没有利用磁性纳米复合材料抽提和分离DNA的技术。因此，本领域迫切需要开发新的简便有效地抽提DNA的技术。

发明内容

本发明目的就是提供一种利用磁性纳米复合材料简便有效地抽提DNA的方法。

本发明另一目的是提供一种利用磁性纳米复合材料简便有效地抽提DNA的试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种利用磁性纳米复合材料抽提DNA的方法，包括步骤：

(a)将磁性纳米复合材料与含DNA的液态样品接触，形成液态混合物，其中所述的磁性纳米复合材料具有超顺磁性内核、中间二氧化硅包覆层和外壳，其直径为50-300nm；

(b)用磁场将吸附了DNA的磁性纳米复合材料与液态混合物分开，从而得到吸附有DNA的磁性纳米复合材料。

在另一优选例中，还包括步骤(c)：从吸附有DNA的磁性纳米复合材料上回收DNA。较佳地，所述步骤(c)是加入含Tris-HCl和EDTA的溶解液，从磁性纳米复合材料上溶出DNA，从而获得DNA溶液。

在另一优选例中，所述复合材料的内核为选自下组的具有超顺磁性的磁性纳米粒子：Fe、Co、Ni、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Co₂O₃、Co₃O₄、或其混合物；其外壳为用氨基或羧基修饰的选自下组的高聚物：聚乙烯醇、多糖、硅树脂、聚苯乙烯或其混合物。

在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括步骤：用洗涤液洗涤吸附了DNA的磁性纳米复合材料。洗涤次数为1-5次，较佳地为2-3次。

在另一优选例中，所述的样品为血液、精液、血斑、精斑、烟蒂、毛发、皮肤。

在另一优选例中，所述的样品是通过以下步骤制备的：将生物样本与裂解液和DTT混合，旋涡震荡后，95±2℃温浴30±10分钟。

在本发明的第二方面，通过了一种抽提DNA试剂盒，它含有磁性纳米复合材料，所述的磁性纳米复合材料具有磁性内核、中间二氧化硅包覆层和外壳，其直径为50-300nm。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有

裂解液，其组分为1～8mol/l的胍溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，5～50mmol/l的EDTA，0.5～5％ Triton，0.2～5％表面活性剂；

洗涤液I，其组分为1～8mol/l的胍溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，5～50mmol/l的EDTA；

洗涤液II，其组分为0～2mol/l的乙酸钠，

溶解液为10±2mmol/l Tris-HCl，pH＝8.0，0.5±1mmol/l EDTA。

在另一优选例中，所述复合材料的内核为选自下组的具有超顺磁性的磁性纳米粒子：Fe、Co、Ni、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Co₂O₃、Co₃O₄、或其混合物；其外壳为用氨基或羧基修饰的选自下组的高聚物：聚乙烯醇、多糖、硅树脂、聚苯乙烯或其混合物。

在另一优选例中，在裂解液中，所述的胍溶液是盐酸胍或异硫氰酸胍溶液，且胍溶液浓度为3±1mol/l；所述的EDTA的浓度为25±5mmol/l；所述的Triton的浓度为2±0.5％；所述的表面活性剂是阴离子表面活性剂或阳离子表面活性剂(如SDS)，且表面活性剂浓度为2±1％；

在洗涤液I中，所述的胍溶液是盐酸胍或异硫氰酸胍溶液，且胍溶液的浓度为3±1mol/1；所述的EDTA浓度为20±5mmol/l；

在洗涤液II中，所述乙酸钠的浓度为1.5±0.5mol/l。

附图说明

图1为用本发明方法提取0.3μl血斑中DNA的PCR扩增结果，以及与用Chelex-100、Promega IQ^TMSystem试剂盒提取扩增结果比较。其中M为ψ_x174/HaeIII分子量标准物；1、2、3分别为Promega IQ^TMSystem试剂盒、Chelex-100和本发明试剂盒提取DNA的扩增结果。从图中可以看出三种方法均得到了满意的扩增结果，而Chelex-100和本发明试剂盒提取DNA的扩增强度略高于Promega IQ^TMSystem试剂盒。

图2显示了用本发明方法从各种样品中抽提出的DNA样品的PCR扩增结果。其中各泳道为：1为新鲜血斑；2为保存16年的陈旧血斑；3、4为保存10年的陈旧精斑；5为烟蒂；L为DNA标准物ψx174/HaeIII。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，制备了以二氧化硅为包覆层的磁性纳米复合材料，并发现这种磁性纳米复合材料与DNA分子具有高度的亲和力，可以作为分离DNA的有效介质。在此基础上开发了用磁性纳米复合材料提取DNA的方法及试剂盒。

本发明磁性纳米复合材料的制备方法包括步骤：

(1)制备Fe₃O₄溶胶

在室温利用共沉淀法制备粒径为5-8nm的Fe₃O₄磁性纳米复合材料胶体。

一种优选的方法是将水溶性三价铁盐，如氯化铁、硫酸铁、硝酸铁等与二价铁盐，如氯化亚铁、硫酸亚铁、硝酸亚铁等按照摩尔比2∶1的比例配制成总铁浓度为2～4mol/L的水溶液，在强烈搅拌下注入到浓度为5％的氨水中，搅拌10-60分钟后过滤，然后用高纯水清洗Fe₃O₄沉淀物。将沉淀物分散在23％的四甲基氢氧化铵溶液中，搅拌10-60分钟后得到分散的Fe₃O₄溶胶。

(2)包覆二氧化硅

包覆二氧化硅通常分为二个阶段。即在pH为9.5±0.5的SiO₂水溶液中进行第一次包覆，得到粒径为7-10nm的复合纳米粒子。然后转移到乙醇相，利用在碱性条件下通过正硅酸乙酯水解进行第二次包覆的，从而形成粒径为0.05-1μm的二氧化硅包覆的磁性粒子。

一种优选的方法如下：

第一次包覆：将Fe₃O₄溶胶稀释到浓度为1-2g/L，加入到含0.58％SiO₂的水溶液中，利用0.5mol/L盐酸调解溶液pH到9.5，混合溶液搅拌2-12小时后，通过磁分离柱将经第一次二氧化硅包覆处理的磁性纳米复合材料提出，重新分散于pH＝10的四甲基氢氧化铵溶液中。

第二次包覆：向含有2mol/L的氨水的浓度为0.01％的正硅酸乙酯乙醇溶液中，加入上述得到的经第一次二氧化硅包覆处理的Fe₃O₄溶胶，控制Fe₃O₄浓度为10-40mg/L，搅拌2-10小时后既得到粒径约为0.05μm的复合磁性粒子。

在一优选例中，在上述反应后，可继续补加浓度为0.01％的正硅酸乙酯，从而得到粒径为0.05-1μm的表面包覆不同厚度的二氧化硅层的Fe₃O₄磁性粒子。

(3)表面修饰

在该步骤中，用常规方法，利用不同的硅烷化试剂对二氧化硅表面进行修饰，从而得到表面带有不同的功能基团的复合磁性粒子。例如，利用带有氨基、巯基、环氧等基团的硅烷化试剂对粒子的二氧化硅表面进行修饰，从而得到表面带有氨基、巯基、环氧等基团的复合磁性粒子。

用本发明方法制备的新型的复合磁性粒子，其粒子尺寸在0.05-1μm之间可调，磁性内核被致密的二氧化硅层包覆，可以完全避免磁性粒子的脱落。同时可以减缓内核被氧化的速度，延长其使用寿命。外层包覆的二氧化硅层有良好的生物相容性。利用不同硅烷化试剂进行表面修饰后，复合磁性粒子可以与不同药物或生物分子结合，从而满足体外生物样品的分离提纯、检测、体内药物或其它生物分子的定向输运等特殊用途。

本发明磁性纳米复合材料的一种主要的应用是从各种样品中抽提出DNA样品。本发明的抽提方法通常包括以下步骤：

(a)将磁性纳米复合材料与含DNA的液态样品接触，形成液态混合物，其中所述的磁性纳米复合材料具有超顺磁性内核、中间二氧化硅包覆层和外壳，其直径为50-300nm；

(b)用磁场将吸附了DNA的磁性纳米复合材料与液态混合物分开，从而得到吸附有DNA的磁性纳米复合材料。

吸附了DNA的磁性纳米复合材料可以直接应用，例如作为模板用于PCR反应。当然，还可以将DNA从磁性纳米复合材料上解吸下来，形成DNA溶液。因此，在另一优选例中，本发明方法还包括步骤(c)：从吸附有DNA的磁性纳米复合材料上回收DNA。较佳地，所述步骤(c)是加入含Tris-HCl和EDTA的溶解液，从磁性纳米复合材料上溶出DNA，从而获得DNA溶液。

用于本发明的裂解液、洗涤液、溶解液没有特别限制，可以采用本领域采用的各种裂解液、洗涤液、溶解液。此外，试剂盒中的裂解液、洗涤液、溶解液可以是浓缩液或稀释液。

本发明主要优点在于：

1、利用具有超顺磁性的磁性纳米复合材料(以下简称NFC)，一步实现DNA的提取纯化。

2、方法简单，提取快速，通常操作可在1个小时内完成。

3、能够有效去除抑制剂和污染物，尤其适用于法医DNA实验室。

4、根据试剂盒的设计，能够估算DNA的提取数量，对以后的操作起到指示作用。

5、采用生物纳米技术进行产品研制，大幅提高DNA提取效率，总提取效率在80％以上。

6、可以与多种DNA扩增试剂盒配套使用。

7、有利于实现DNA分析的自动化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

磁性纳米复合材料的制备

取16.62克FeCl₃和9.93克FeCl₂，溶解于250ml去氧高纯水中，强烈搅拌下加入到5L5％氨水中，搅拌30分钟后过滤，用高纯水清洗沉淀，然后加入23％的四甲基氢氧化铵溶液300ml，搅拌30分钟，加入高纯水至体积为2.5L，得到Fe₃O₄浓度为1.7g/L的溶胶。取上述溶胶1.69L，与pH＝9.5的浓度为0.58％的SiO₂水溶液310ml混合，用0.5MHCl调pH＝10，搅拌3小时后，与含有168ml浓氨水(25％)、4720ml乙醇、4ml正硅酸乙酯的溶液混合均匀，搅拌30分钟，加入46.5ml浓度为1.7g/L的Fe₃O₄溶胶，搅拌6小时后得到粒径为50nm的SiO₂包覆的磁性粒子。继续加入1ml四乙氧基巯丙基硅烷，搅拌反应2小时，得到表面修饰有巯基的复合磁性粒子。

实施例2

磁性纳米复合材料的制备

按照实施例1操作得到的粒径为50nm的SiO₂包覆的磁性粒子后，继续补加4ml正硅酸乙酯，搅拌4小时后，得到粒径为100nm的SiO₂包覆的磁性粒子。然后加入1ml环氧基四乙氧基硅烷，继续搅拌2小时得到表面修饰环氧基团的复合磁性粒子。

实施例3

磁性纳米复合材料的制备

按照实施例2操作得到的粒径为100nm的SiO₂包覆的磁性粒子后，继续补加8ml正硅酸乙酯，搅拌8小时后，得到粒径为300nm的SiO₂包覆的磁性粒子。然后加入1ml胺丙基四乙氧基硅烷，继续搅拌2小时后得到表面修饰氨基的复合磁性粒子。

实施例4

制备DNA提取试剂盒

制备利用磁性纳米复合材料抽提DNA的试剂盒，其中包括：

0.50克磁性纳米复合材料(实施例1、2、或3制备的磁性纳米复合材料Fe₃O₄-SiO₂核壳复合粒子)；

100ml裂解液，其组分为3mol/l的盐酸胍溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，25mmol/l的EDTA，2％Triton，2％表面活性剂SDS；

100ml洗涤液I，其组分为3mol/l的盐酸胍溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，20mmol/l的EDTA；

100ml洗涤液II，其组分为1.5mol/l的乙酸钠，

10ml溶解液为10mmol/l Tris-HCl，pH＝8.0，0.5±1mmol/l EDTA。

实施例5

抽提固体介质上的生物样本中的DNA

对于附着在固体介质上的生物样本可采取以下步骤。

(1)取下生物样本迹放入0.5ml或1.5ml离心管中，加入适量裂解液和DTT，旋涡震荡后，95℃温浴30min；

(2)挑离或过滤去除载体(指生物样本中溶出DNA后剩下的一些固体物质)，加入磁性纳米复合材料(加入量为10ul浓度为30mg/ml的溶液，合300微克纳米复合材料)后放置；

(3)旋涡震荡后放于磁架上，吸弃液体；

(4)加入适量洗涤液I，旋涡震荡洗涤后吸弃液体；

(5)加入配好的洗涤液II，旋涡震荡洗涤后吸弃液体，重复本操作一次；

(6)室温干燥后，加入20～100μl溶解液或去离子水，65℃温浴10分钟溶出DNA，储存于一新离心管中备用。

对实施例5抽提出的DNA，按常规方法进行PCR扩增。

图1显示了用本发明方法提取0.3μl血斑中DNA的PCR扩增结果，以及与用Chelex-100、Promega IQTMSystem试剂盒提取扩增结果比较。其中M为ψX174/HaeIII分子量标准物；1、2、3分别为Promega IQTMSystem试剂盒、Chelex-100和本发明试剂盒提取DNA的扩增结果。从图中可以看出三种方法均得到了满意的扩增结果，而Chelex-100和本发明试剂盒提取DNA的扩增强度略高于Promega IQTM System试剂盒。

实施例6

抽提液体生物样本或文库的DNA样本

对于液体生物样本或文库样品采取以下步骤。

(1)取适量液体样本(如5μl血液)，加入一定量混好的裂解液和NFC，室温放置5min。

(2)其余步骤同实施例5的提取步骤(3)-(6)。

实施例7

抽提混合斑的DNA样本

对于混合斑，可采取两步消化法去除上皮细胞后，余下精子加入适量裂解液，其余步骤同实施例5的提取步骤(3)-(6)，提取精子DNA。

实施例8

抽提DNA的质量鉴定

对实施例6和7从各种样品中抽提出的DNA，按常规方法进行PCR扩增。

结果如图2所示，泳道1为新鲜血斑；2为保存16年的陈旧血斑；3、4为保存10年的陈旧精斑；5为烟蒂；L为DNA标准物ψx174/HaeIII。可以看出，除16年的陈旧血斑外，所有样本均获得了理想的扩增结果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种利用磁性纳米复合材料抽提DNA的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将磁性纳米复合材料与含DNA的液态样品接触，形成液态混合物，其中所述的磁性纳米复合材料具有超顺磁性内核、中间二氧化硅包覆层和外壳，其直径为50-300nm；

(b)用磁场将吸附了DNA的磁性纳米复合材料与液态混合物分开，从而得到吸附有DNA的磁性纳米复合材料。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(c)：从吸附有DNA的磁性纳米复合材料上回收DNA。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合材料的内核为选自下组的具有超顺磁性的磁性纳米粒子：Fe、Co、Ni、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Co₂O₃、Co₃O₄、或其混合物；其外壳为用氨基或羧基修饰的选自下组的高聚物：聚乙烯醇、多糖、硅树脂、聚苯乙烯或其混合物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，还包括步骤：用洗涤液洗涤吸附了DNA的磁性纳米复合材料。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品为血液、精液、血斑、精斑、烟蒂、毛发、皮肤。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品是通过以下步骤制备的：将生物样本与裂解液和DTT混合，旋涡震荡后，95±2℃温浴30±10分钟。

7.一种抽提DNA试剂盒，其特征在于，它含有磁性纳米复合材料，所述的磁性纳米复合材料具有磁性内核、中间二氧化硅包覆层和外壳，其直径为50-300nm。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还含有

裂解液，其组分为1～8mol/l的胍溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，5～50mmol/l的EDTA，0.5～5％Triton，0.2～5％表面活性剂；

洗涤液I，其组分为1～8mol/l的胍溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，pH＝6.7，5～50mmol/l的EDTA；

洗涤液II，其组分为0～2mol/l的乙酸钠，

溶解液为10±2mmol/l Tris-HCl，pH＝8.0，0.5±1mmol/l EDTA。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述复合材料的内核为选自下组的具有超顺磁性的磁性纳米粒子：Fe、Co、Ni、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Co₂O₃、Co₃O₄、或其混合物；其外壳为用氨基或羧基修饰的选自下组的高聚物：聚乙烯醇、多糖、硅树脂、聚苯乙烯或其混合物。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，在裂解液中，所述的胍溶液是盐酸胍或异硫氰酸胍溶液，且胍溶液浓度为3±1mol/l；所述的EDTA的浓度为25±5mmol/l；所述的Triton的浓度为2±0.5％；所述的表面活性剂是阴离子表面活性剂或阳离子表面活性剂，且表面活性剂浓度为2±1％；

在洗涤液I中，所述的胍溶液是盐酸胍或异硫氰酸胍溶液，且胍溶液的浓度为3±1mol/l；所述的EDTA浓度为20±5mmol/l；

在洗涤液II中，所述乙酸钠的浓度为1.5±0.5mol/l。

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