CN102203251A - 用于dna提取的方法和试剂盒 - Google Patents

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CN102203251A CN2009801290899A CN200980129089A CN102203251A CN 102203251 A CN102203251 A CN 102203251A CN 2009801290899 A CN2009801290899 A CN 2009801290899A CN 200980129089 A CN200980129089 A CN 200980129089A CN 102203251 A CN102203251 A CN 102203251A
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Abstract

公开了用于从溶液中回收生物聚合物的方法和材料。尤其，本发明提供了用于从生物材料中提取和分离核酸的方法。在洗涤剂和溶剂的存在下，可以通过形成与可溶性多糖聚合物和磁性颗粒的稳定复合物来分离核酸。当从溶液中磁性地分离出颗粒时，核酸和它们一起分离。随后可以从颗粒释放和分离核酸。该核酸制剂有用于在下游分子技术中得到有效且精确的结果，所述下游分子技术例如核酸来源的定量、鉴定以及基因分型。

Description

用于DNA提取的方法和试剂盒
前言
本教导提供用于获得高数量、高质量的核酸并且精确地在短时间内获得核酸的组合物、方法和试剂盒。本教导一般涉及从生物材料中分离核酸，以使所述核酸与下游应用中的使用相适应(compatible with)的方法。在各种实施方式中，本教导涉及多羟基聚合物和洗涤剂用于将核酸与具有亲水表面的磁性颗粒结合、将核酸从所述磁性颗粒释放并且通过使用数种缓冲液提取核酸的用途。在一些实施方式中，提供了用于从生物材料中分离DNA的试剂盒。
本教导的提取和纯化方法提供了用于从生物样品、食品样品、水样品、环境样品、农业样品、生物药物样品或者药物样品中获得核酸(例如基因组DNA)的有用方法，所述核酸可用于下游应用中，例如所述生物材料、食品材料、水材料、环境材料、农业材料、生物药物材料或者药物材料来源的基因分型、检测、定量和鉴定，其中采用分子生物学方法，例如PCR。所提供的缓冲液系统在提取保持DNA完整性的高数量DNA中是独特的。其提供了高效率DNA提取并去除了PCR抑制剂。此外，使用标准的液体处理系统，可使用于提取和纯化核酸的程序(procedure)完全自动化。
本文所用的标题部分只是用于编排目的，不理解为以任何方式限制所描述的主题。本申请中所引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和协议，不管此类文献和类似材料的形式如何，都以全文通过引用明确并入本文，用于任何目的。
附图
本领域技术人员将理解下文所描述的附图只用于说明目的。附图并无意以任何方式限制本教导的范围。
图1是说明如本教导的各种实施方式中所描述的DNA分离和纯化的方法的示意图。
图2说明如实施例6中所描述的DNA分离和纯化的DNA产率，其中按照实施例4中所描述的方法，从细胞计数为1562-50000的培养的Raji细胞分离基因组DNA。
图3说明如实施例7中所描述的DNA分离和纯化的DNA产率，其中按照实施例4中所描述的方法，从细胞计数为3500-110000的培养的K562细胞分离基因组DNA。
图4说明如实施例13中所描述的从基材中分离和纯化DNA后获得的基因分型分布(genotyping profiles)，其中按照实施例11的方法从生物样品中分离基因组DNA，并使用
Figure BPA00001307182400021
试剂盒进行处理，用于基因分型。
图5，在抑制剂的存在下，(加入)到洗涤溶液中的洗涤剂添加剂对从干燥于粗斜纹布(denim)上的血液中提取DNA的影响。
图6，在抑制剂的存在下，(加入)到洗涤溶液中的洗涤剂添加剂对从干燥于粗斜纹布上的血液中去除抑制剂的效率的影响。
各种实施方式的描述
虽然结合各种实施方式来描述本教导，但并无意将本教导限制于此类实施方式。相反，如本领域技术人员将理解的，本教导涵盖了各种替代、修改和等同物。
本说明书中所用的绝大多数词语具有本领域技术人员所认为的那些词语的含义。本说明书中具体定义的词语具有本教导上下文中提供的整体含义和如本领域技术人员通常理解的含义。在词语或短语的本领域所理解定义与本说明书中具体教导的该词语或短语的定义相冲突的情况下，应以本说明书为准。本文所用的标题只是为了方便起见，并不理解为以任何方式进行限制。
本文所用的“DNA”指本领域所理解的各种形式的脱氧核糖核酸，例如基因组DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA和染色体DNA。“核酸”指任何形式的一种或多种核酸分子、DNA或RNA(核糖核酸)。本文所用的术语“分离的核酸分子”或“分离的核酸”指已从其天然环境中脱离(remove)的核酸分子(任何形式的DNA或RNA)。分离的核酸分子的一些实例为含于载体中的重组DNA分子；保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子；部分或基本纯化的核酸分子；获得自法医样品和其它样品的核酸，所述其它样品包括生物材料，例如血液、精液、唾液、皮肤组织等，食品样品，包括但不限于肉、鱼、水果、蔬菜、啤酒、葡萄酒、蛋、奶等，以及植物、动物、人或环境来源的样品，水样品，环境样品，农业样品，生物药物样品，药物样品，存在于用于制备或储存食品、饮料、水、药物产品、个人护理产品或奶制品的原材料、设备、产品或工艺中的环境样品，存在于临床样本或者用于处理人或动物的设备、固定装置(fixtures)或产品中的和存在于临床样品或临床环境中的环境样品；以及合成的DNA分子。“分离”的核酸可以不含在取得所述核酸的有机体的基因组DNA中天然位于所述核酸侧翼的序列(即位于所述核酸5‘和3’端的序列)。此外，“分离”的核酸分子(例如cNDA分子)当通过重组技术制备时，可以基本不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，可基本不含化学前体或其它化学品。
“聚合酶链式反应”(或“PCR”)指一种技术，其中使用变性、用引物退火以及用DNA聚合酶延伸的重复循环来将靶DNA序列的拷贝数扩增大约106倍或更多。用于扩增核酸的PCR方法涵盖于美国专利No.4,683,195和4,683,202中，通过引用将其全文并入本文，用于描述该方法。任何PCR的反应条件包括该反应的化学组分及其浓度、反应循环中使用的温度、反应的循环数目以及反应循环的阶段的持续时间。
“PCR相适应的(PCR-compatible)”指任何组合物、溶液、化合物、试剂等，其与PCT测定中的后续使用相适应，且对酶促聚合酶链式反应是相对非限制性的。如通过PCR结果与相关阳性和阴性对照的比较所证明的，PCR相适应的产品显示相对最小地抑制或者不抑制PCR扩增。PCR测定可以包括但不限于DNA基因分型系统；用于DNA定量的
Figure BPA00001307182400031
或
Figure BPA00001307182400032
绿色实时PCR测定；多重PCR测定，包括设计为对短串联重复序列进行基因分型的那些。
本文所用的“扩增”指酶促增加特定核苷酸序列的量的方法。该扩增并不限于但是通常由PCR来实现。
“聚合物(Polymer)”或“多种聚合物(polymers)”指用于将核酸与具有亲水表面的磁性颗粒结合，以及将核酸从所述磁性颗粒释放的可溶性多羟基聚合物。
在本教导的一些实施方式中描述了方法，其中可以从样品中分离(separated)和/或分离(isolated)核酸分子，并且在一些实施方式中，其中从所述方法制备的产物为核酸。在一些实施方式中，本教导的方法导致形成了包含分离的核酸的产物。
在本教导的一些实施方式中，可以从含有生物材料的样品中分离和/或分离核酸分子，并且在一些实施方式中，从所述方法制备的产物为核酸。此类样品的例子包括但不限于血液和血斑(blood stain)、唾液和唾液斑、颊细胞和颊拭子、精液和精斑、烟蒂、口香糖、碎牛肉(ground beef)、布里干酪(brie cheese)、生鸡(raw chicken)、虾、罗马甜瓜、干燥婴儿配制食品、全壳蛋、碎(ground)黑胡椒、干燥宠物食品、花生酱、橙汁、巴氏灭菌奶、苜蓿芽、烤牛肉、烟熏鲑鱼、蛋黄酱、色拉调料、奶、冰激凌、腌培根、莴苣、香肠、甜菜(beet trim)、果汁、菠菜、切达干酪(cheddar cheese)、原奶(raw milk)、牡蛎、蛤以及贝类(mussels)。
在本教导的一些实施方式中描述了方法，其中可以用包含可溶性多羟基聚合物和洗涤剂的起始溶液处理样品，并加入可磁性吸引的颗粒，以便从所述样品中回收核酸分子，并且在一些实施方式中，通过施加磁场从样品中回收核酸。在各种实施方式中，所述样品可以包括一种或多种游离核酸；细胞；生物材料，例如颊拭子、被沾染的织物等。在本教导的另外实施方式中描述了其中可以从样品中分离核酸的方法，其包括以下步骤：用包含聚合物和洗涤剂的起始溶液处理样品；向处理的样品中加入悬浮的可磁性吸引的颗粒；以及通过施加磁场，分离经由聚合物附着于可磁性吸引的颗粒的核酸。此类方法可以进一步包括从可磁性吸引的颗粒释放核酸的步骤。此类方法还可以进一步包括在水溶液中洗脱核酸的步骤。
然后可将如此获得的核酸用于各种下游应用中的任何种，例如定量、检测以及特定核酸的基因分型或甚至生物物种的基因分型。可以通过例如PCR扩增进行这些分析。作为一个实例，在法医DNA分析中，可以从复合生物材料中获得人的核DNA(nDNA)和/或基因组DNA，然后使用PCR进行基因分型。作为另一个实例，DNA制剂可用于使用实时PCR系统(如
Figure BPA00001307182400041
)对人DNA、或者更具体的男人DNA进行定量，和/或使用系统(例如
Figure BPA00001307182400042
试剂盒)进行常染色体或Y染色体短串联重复基因座的基因分型。基于存在于样品中的DNA的量，可以选择将产生用于特定分析所需的最佳结果的特定基因分型系统。因此，为了最好地将核酸用于下游应用中，以高产率产生产品的提取和分离方法，以及相对不含下游应用(例如PCR)的抑制剂的方法均是特别合意的。
作为一个实例，在获取和处理过程中，典型的法医证据样品常常暴露于各种环境伤害中，这可导致被起抑制PCR作用的化合物污染，并且其因此对基因分型或其它分析的尝试造成干扰。在DNA分离期间以及扩增之前去除此类抑制剂是合意的。
核酸应用的另一个实例是在食品加工和生物药物制备的质量控制中检测污染性DNA。在一个实例中，分离掺入(spiked into)汉堡中的大肠杆菌(E.coli)O157：H7的DNA，然后通过实时PCR进行检测。作为另一个实例，可以分离支原体(Mycoplasma)DNA，并通过灵敏性(sensitivity)比竞争方法更高的解链曲线分析进行检测。由于要求保护的提取和分离方法产生极大的DNA回收，因此可以通过本领域技术人员已知的实时PCR方法以更高的灵敏性检测存在于样品中的DNA的量。
通常将食品或饮料的一部分与适当的液体组合，所述液体包括但不限于水、缓冲溶液或培养基(包括但不限于选择性培养基或富集培养基)。在一些实施方式中，食品是剁碎的、浸软的、液化的、切丁的(diced)或者匀质化的。在一些实施方式中，按照公开的方法，对大体积的样品(例如但不限于100mL、250mL或更大的体积)进行处理，以确定在原材料中是否存在一种或多种外源核酸。根据某些实施方式，通常将食品或饮料的一部分和适当的液体组合以形成稀释悬浮液，例如但不限于约1∶5、1∶10或1∶20(w/vol)的比率。在一些实施方式中，加入洗涤剂、乳化剂或两者，以增强高脂食品的溶解度，所述高脂食品例如但不限于黄油和某些其它的奶制品。本领域技术人员将理解，对用于悬浮食品或饮料的液体的选择将至少部分取决于原材料(即，食品或饮料)和外源核酸(包括但不限于一种或多种感兴趣的微生物)；并且食品/饮料与液体之比可以宽泛变化，条件是该悬浮液充分流动以进行处理，例如但不限于使其通过过滤介质。在某些实施方式中，将25克的固体或半固体食品与225mL合适的培养基组合。在一些实施方式中，将25mL的饮料或者液化或部分液化的食品与225mL合适的培养基组合。
本教导的各种实施方式涉及将核酸(例如基因组DNA)与磁性颗粒(即，可磁性吸引的颗粒或珠子)以然后可以在适当的水性条件下将结合的核酸释放的形式有效结合。因此，这些教导的实施方式使核酸(例如基因组DNA)能够从各种不同类型的生物材料中有效分离。此外，可以从少量或大量的生物材料中分离核酸(例如基因组DNA)，所述材料通常在实验室中处理，例如在基因分型分析中涉及的那些材料。
本文所用的洗涤缓冲液或洗涤溶液包含阴离子洗涤剂(优选为0.1％至2％)和诸如异丙醇或乙醇之类的极性溶剂(优选为50％至90％)的混合物，所述阴离子洗涤剂例如为N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)、
Figure BPA00001307182400061
X-100和/或十二烷基硫酸钠。任选地，洗涤溶液还可包含吐温20、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸钠(lauroyl sarcosinate)(也称作十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl))。图5和图6提供了洗涤缓冲液中的各种洗涤剂的比较。洗涤缓冲液在DNA结合后洗涤珠子，并且还去除DNA抑制剂。
这些实施方式和本教导的其它特征将从下文描述中变得更加明显。
核酸分离系统
本教导的各种实施方式涉及系统，其顺应(amenable to)组装于试剂盒中，用于在洗涤剂的存在下，将核酸(例如基因组DNA)经由可溶性多羟基聚合物与具有亲水表面的磁性颗粒结合，形成核酸-聚合物-颗粒复合物，并且产生和分离此类复合物，其中所述核酸不直接与磁性颗粒结合。复合物的形成是这样的：聚合物俘获核酸，聚合物附着于颗粒，并因此间接地将核酸与颗粒相连。各种实施方式包括裂解溶液，其引起细胞的裂解和核酸的释放，同时保护核酸免于降解并去除PCR抑制剂。在本教导的各种实施方式中，在洗涤溶液的存在下，核酸经由复合物保持与磁性颗粒结合，复合物在所述洗涤溶液中被洗涤以去除污染物和抑制剂，并使得所述核酸顺应用于诸如PCR之类的下游应用中。用于洗涤核酸分离物的任何污染物和抑制剂的溶液为本领域技术人员所熟知，并且可包含例如洗涤剂和极性溶剂。在本教导的实施方式中，然后可以在水溶液(例如缓冲液)中释放核酸，所述水溶液也与用于诸如PCR之类的下游应用相适应。本发明的方法中可以进行多次洗涤，分别地或者与多次向样品施加磁场一起进行所述洗涤，以回收和/或分离核酸。
标准核酸提取技术，包括细胞裂解以及核酸的洗涤和洗脱是本领域所熟知的，并且除非另有说明，可以按照在例如以下文献中所描述的各种技术来进行：DNA Typing Protocols：Molecular Biology and Forensic Analysis，第1版，B.Budowle等人编，Eaton Publishing Co.(2000)；JM Butler，Forensic DNA Typing：Biology，Technology，and Gen etics of STR Markers，第2版，Elsevier Academic Press(2005)；或者P.Gill，″Application of LowCopy Number DNA Profiling，″Croatian Medical Journal，42：229-232页(2001)；FR Bieber等人，″Isolation of DNAA from Forensic Evidence，″Current Protocols in Human Genetics，增刊26(2000)；Forensic DNAProfiling Protocols，Methods in Molecular Biology，第98卷，PJ Lincoln和J.Thomson编，Humana Press(1998)。
本教导的各种实施方式涉及核酸分离系统(例如用于基因组DNA)，其包含用于从生物样品、食品样品、水样品、环境样品、农业样品、生物药物样品或药物样品中提取核酸的试剂和方法。这些方法的实施方式可以包括：在洗涤剂的存在下，从生物材料中裂解细胞形成核酸(如基因组DNA)与可溶性聚合物的非共价复合物，所述聚合物具有与可磁性吸引的颗粒表面相同或类似的化学结构；经由聚合物与颗粒表面之间的相互作用，将核酸-聚合物复合物与磁性颗粒结合，从而形成稳定的核酸-聚合物-颗粒复合物；经由包含洗涤剂和极性溶剂的洗涤缓冲液去除未结合的材料，例如PCR抑制剂；以及从所述颗粒释放核酸，并在水溶液中洗脱核酸。
申请人已发现在适当的盐和极性溶剂的存在下，使用多羟基水溶性聚合物和洗涤剂改进了核酸(例如基因组DNA)在可磁性吸引的颗粒表面上的结合和释放效率。适当的可磁性吸引的颗粒的实例包括但不限于葡聚糖包被的
Figure BPA00001307182400071
磁性纳米颗粒(magnetite nanoparticles)。在本教导的一些实施方式中，以约2至约10mg/ml将葡聚糖包被的磁性纳米颗粒加入到包含核酸的样品中。
所述可溶性聚合物和洗涤剂可称为结合促进剂(binding enhancer)。适当的多羟基水溶性聚合物的一些实例为但不限于长链分支的多糖，例如葡聚糖(如葡聚糖5,000,000-40,000,000)、可溶性淀粉、糊精、纤维糊精、聚乙二醇(PEG)、肝素、糖原、短链纤维素、纤维素衍生物及其组合。适当的洗涤剂的一些实例为但不限于N-月桂酰肌氨酸(NLS)；月桂酰肌氨酸钠(lauroyl sarcosinate)，也称作十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)，为衍生自肌氨酸的离子表面活性剂；十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide)或十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)(CTAB)；脱氧胆酸盐；十二烷基β-D-麦芽糖苷；壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)；十二烷基硫酸钠；聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚(商品名为
Figure BPA00001307182400081
X-100)；及其组合。在一些实施方式中，结合促进剂包含1-5mg/ml范围内的葡聚糖和约5-约15％范围内的十二烷基肌氨酸钠。
适当的极性溶剂的一些实例为但不限于异丙醇、乙醇、丁醇及其组合。在一些实施方式中，极性溶剂包含约70％至约100％异丙醇。
在一些实施方式中，可以将可磁性吸引的颗粒加入到包含核酸的样品(例如细胞裂解物)中，同时加入结合促进剂，形成悬浮液。之后可以将包含极性溶剂的溶液加入到该悬浮液中。或者，在本教导的一些实施方式中，可以将包含结合促进剂和极性溶剂的单一溶液加入到该悬浮液中。结合促进剂、溶剂和细胞裂解物提供独特的条件，以使核酸被俘获在与可溶性聚合物的非共价复合物中，所述可溶性聚合物具有与磁性颗粒表面相同或类似的化学结构。结果是被聚合物俘获的核酸在非共价的核酸-聚合物-颗粒复合物中有效地与磁性颗粒结合。该复合物在醇洗涤条件下是稳定的，并且以后可以在标准低盐缓冲液(例如含有低浓度的二价金属离子螯合剂(例如EDTA)的Tris缓冲液)中容易地将核酸洗脱。在一些实施方式中，核酸-聚合物与颗粒结合的这一阶段可以通过冷却(chill)加以辅助。
此外，本教导提供了使用与极性溶剂(例如乙醇或异丙醇)混合的洗涤剂(例如但不限于N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、
Figure BPA00001307182400082
X-100和/或十二烷基硫酸钠)作为核酸-颗粒复合物的洗涤溶液，以改进下游应用的抑制剂(例如PCR抑制剂)从结合于磁性颗粒的这些核酸中的去除。
在核酸-聚合物-颗粒复合物形成中，在被聚合物俘获的核酸与磁性颗粒结合之后，可以向所述悬浮液施加磁场。该磁场可用于从悬浮液中去除核酸-聚合物-颗粒复合物，形成复合物层(例如在管的底部或一侧)，并留下上清液。可以通过本领域已知的设备和方法(例如经由
Figure BPA00001307182400083
(Austin，TX)磁力站)将磁场施加于样品。之后可以从管中去除上清液。
然后可任选洗涤核酸-聚合物-颗粒复合物层，以去除残余的污染物和/或PCR抑制剂；然后，可以在不存在任何磁场的情况下，将核酸-聚合物-颗粒复合物重悬浮于必需体积的适当洗脱缓冲液中。用于分离核酸的适当洗脱缓冲液为本领域技术人员所熟知。这使得核酸从核酸-聚合物-颗粒复合物中释放进入到溶液中。可以再次向管施加磁场，导致从悬浮液中去除磁性颗粒，例如到管(tube)的底部或一侧，留下现在核酸溶解于其中的上清液。现在可以通过用例如移液器收集上清液，从磁性颗粒分离再次溶解的核酸，同时所述颗粒被磁场保持于管的底部或一侧。在这些方法中不需要对样品进行离心。
在本教导的一些实施方式中，然后可以从含有生物材料的生物样品、食品样品、水样品、环境样品、农业样品、生物药物样品或药物样品中分离核酸分子，并结合使用具有亲水表面的磁性颗粒(例如磁性葡聚糖颗粒)从溶液中纯化。磁性颗粒促进的核酸分离和纯化可用来极大地改进本领域技术人员熟知的基于醇的沉淀的常规分离和纯化核酸的方法。可通过参考图1来说明可通过这些教导修改的基于醇的分离和纯化程序的实施方式的一个实例。
样品制备
本文所述方法的实施方式可以包括将食品或饮料的一部分与适当的液体组合，所述液体包括但不限于水、缓冲溶液或培养基(非限制性包括选择性培养基或富集培养基)。在一些实施方式中，食品是剁碎的、浸软的、液化的、切丁的或者匀质化的。在一些实施方式中，按照公开的方法，对大体积(例如但不限于100mL、250mL或更大)的样品进行处理，以确定在原材料中是否存在特定的微生物。根据某些实施方式，通常将食品或饮料的一部分和适当的液体组合以形成稀释悬浮液，例如但不限于约1∶5、1∶10或1∶20(w/vol)的比率。在一些实施方式中，加入洗涤剂、乳化剂或两者，以增强高脂食品的溶解度，所述高脂食品例如但不限于黄油和某些其它的奶制品。本领域技术人员将理解，对用于悬浮食品或饮料的液体的选择将至少部分取决于原材料(即，食品或饮料)和一种或多种感兴趣的微生物；并且食品/饮料与液体之比可以宽泛变化，条件是该悬浮液充分流动以进行处理，例如但不限于使其通过过滤介质。在某些实施方式中，将25克的固体或半固体食品与225mL合适的培养基组合。在一些实施方式中，将25mL的饮料或者液化或部分液化的食品与225mL合适的培养基组合。
裂解溶液
本文所述方法的实施方式可包括从存在于基材(例如颊拭子的棉花或沾染的织物)上的生物材料裂解细胞，以产生包含核酸的裂解物；从所述裂解物中去除基材；形成核酸-聚合物-颗粒复合物，之后如上文所述，将核酸分离并洗脱。在一个实施方式中，裂解溶液可包含SDS、Tris缓冲液和NaCl，任选含有蛋白酶K；在一些实施方式中，裂解溶液可包含0.0％-1％SDS、100mM Tris缓冲液和2M NaCl。
在本教导的一些实施方式中，裂解溶液可包含硫氰酸胍(GuSCN)或盐酸胍、Tris·HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、消泡剂A和两亲性洗涤剂(例如二甲基氨基-丙烷-1-磺酸酯(dimethylammonio-propane-1-sulfonate)(例如
Figure BPA00001307182400101
如
Figure BPA00001307182400102
3-16，具有C16链)。在本教导的一些实施方式中，裂解溶液包含3.5-6M范围内的GuSCN、10-150mM范围内的EDTA、100-500mM范围内的Tris·HCl、0.005-0.05％范围内的消泡剂A、1-5％范围内的
Figure BPA00001307182400103
pH范围为7.2-8.5。在本教导的一些实施方式中，裂解溶液可以进一步包含强还原剂，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)。因为强还原剂起到水解和断裂蛋白二硫键的作用，所以例如在生物材料为精子的情况下，这些是尤为有用的，这是因为该试剂可以起到水解蛋白的作用，所述蛋白保持精子壁完整，并且其因此使得精子细胞的裂解相对困难。
在本教导的各种实施方式中，可将裂解溶液加入到含有生物材料的样品(并且任选地，对所述样品进行加热一段时间，例如二十分钟至两个小时)中，以便裂解细胞和将核酸释放到裂解物中。在一些实施方式中，裂解溶液可以为包含设计为有效裂解细胞(例如收集在棉拭子上的颊细胞)，同时还保护释放的核酸免于降解的化合物的组合物。在一些实施方式中，裂解溶液进一步包含确保释放的核酸与用于下游测定(例如PCR测定、尤其DNA基因分型系统)相适应的这样的化合物。
在本教导的一些实施方式中，然后在裂解程序后，可以将磁性颗粒(例如葡聚糖磁性纳米颗粒)、结合促进剂和极性溶剂加入到包含核酸的裂解物中，生成其中形成核酸-聚合物-颗粒复合物的悬浮液，如上文所述分离并洗脱核酸。
结合溶液
然后可将结合促进剂加入到悬浮液中，所述结合促进剂包含离子洗涤剂(例如N-月桂酰肌氨酸(NLS)或月桂酰肌氨酸钠(也称作十二烷基肌氨酸钠，为衍生自肌氨酸的离子表面活性剂)和水可溶性长链分支的多糖(例如葡聚糖5,000,000-40,000,000)。在一些实施方式中，结合促进剂可包含洗涤剂十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide)或十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)(CTAB)、脱氧胆酸盐、十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)、十二烷基硫酸钠和聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚(商品名为
Figure BPA00001307182400111
X-100)中的一种或多种。结合促进剂还可以包含或者可选地包含其他水溶性聚合物，例如短链纤维素、纤维素衍生物、PEG、肝素、淀粉、糖原等。或者，磁性颗粒可以和结合促进剂在同一时间加入到裂解物中。在一些实施方式中，结合促进剂包含5-15％范围内的十二烷基肌氨酸钠和1-5mg/ml范围内的葡聚糖。
可将包含醇(例如乙醇、丁醇或异丙醇)的结合溶液加入到悬浮液中。在一些实施方式中，结合溶液包含30-100％异丙醇。或者，在本教导的一些实施方式中，可将包含结合促进剂和结合溶液的单一溶液加入到悬浮液中。结合促进剂、结合溶液和细胞裂解物提供了独特的条件，以使核酸被俘获在与可溶性聚合物(例如葡聚糖)的非共价复合物中，所述可溶性聚合物具有与磁性颗粒表面相同或类似的化学结构。结果是聚合物俘获的核酸在非共价的核酸-颗粒复合物中有效地与磁性颗粒结合。该复合物在醇洗涤条件(例如含乙醇的洗涤溶液)下是稳定的，并且以后可以在标准低盐缓冲液(例如含有低浓度的二价金属离子螯合剂(如EDTA)的10mM Tris缓冲液(pH8.0))中容易地洗脱核酸。在一些实施方式中，该结合阶段可以通过冷却来辅助一些类型的沉淀。
洗涤溶液
本教导的各种实施方式涉及核酸分离系统(例如用于基因组DNA)，其包含用于从生物样品、食品样品、水样品、环境样品、农业样品、生物药物样品或药物样品中提取核酸的试剂和方法，并包含洗涤步骤以从所述样品中去除PCR抑制剂。在洗涤步骤中使用的洗涤溶液为例如本领域所已知的(溶液)。在一些实施方式中，所述洗涤溶液的具体组分可以为浓度为70％-90％的乙醇。这些方法的实施方式可以包括：形成核酸(如基因组DNA)与可溶性聚合物的非共价复合物，所述聚合物具有与磁性颗粒的表面相同或类似的化学结构；经由聚合物与颗粒表面之间的相互作用，将所述核酸-聚合物复合物与磁性颗粒结合，从而形成稳定的核酸-聚合物-颗粒复合物；通过包含洗涤剂和极性溶剂的洗涤溶液试剂去除未结合的材料，例如PCR抑制剂；以及在水溶液中洗脱顺应用于诸如PCR之类的下游应用中的核酸。
在核酸-颗粒复合物的形成中，被俘获的核酸与磁性颗粒结合之后，然后可以向所述悬浮液施加磁场。该磁场可用于从悬浮液中去除核酸-颗粒复合物，在管的底部或一侧形成复合物层，并留下第一上清液。然后可从管中去除第一上清液。
使用洗涤剂和极性溶剂的洗涤溶液来洗涤去除第一上清液后留下的核酸-聚合物-颗粒复合物层，帮助去除任何残留的盐、核苷酸、化学品、有机溶剂和样品中的其它污染物，并且促进去除下游应用的抑制剂，例如PCR抑制剂。在各种实施方式中，可将洗涤溶液用作核酸-聚合物-颗粒复合物的洗涤液，以去除PCR抑制剂和/或污染物。对分离和/或纯化期间洗涤核酸有用的溶液是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施方式中，将洗涤溶液加入到核酸-聚合物-颗粒复合物中以产生洗涤悬浮液。在一些实施方式中，洗涤溶液包含十二烷基肌氨酸钠和醇(例如乙醇、异丙醇和70％(v/v)乙醇中的一种或多种)。在一些实施方式中，洗涤溶液包含洗涤剂，例如失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯(polysorbate 20)或失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯(polysorbate 80)。在一些实施方式中，洗涤溶液包含1-2M范围内的GuSCN、3-50mM范围内的EDTA、30-170mM范围内的Tris·HCl、0.001-0.02％范围内的消泡剂A、0.3-2％范围内的
Figure BPA00001307182400121
30-45％范围内的异丙醇和0.5-2％范围内的十二烷基肌氨酸钠。所述核酸不溶于醇(例如异丙醇、乙醇和70％(v/v)乙醇)，并在洗涤期间保持为与聚合物及颗粒的稳定复合物。因此，可剧烈(例如通过涡旋混合)进行洗涤步骤，而没有损失核酸的风险。之后可将样品再次置于磁场前，可从所述复合物层中去除从洗涤悬浮液中分离出来的包含污染物的所得洗涤上清液。
洗涤步骤之后，还可以按照第一次洗涤中的类似步骤进行第二次洗涤步骤。在本教导的一些实施方式中，一个或多个洗涤步骤后，如上文所述，将核酸分离并洗脱。
核酸提取和纯化
本教导的提取和纯化方法提供了用于从生物样品中获得核酸(例如基因组DNA)的有用方法，所述核酸可用于下游应用中，例如基因分型、定量和生物材料来源的鉴定，其中利用了诸如PCR之类的分子生物学方法。本文实施例中所描述的示例性结果说明了本教导的核酸提取和纯化方法的各种优势，其包括但不限于提供核酸(例如基因组DNA)制品，所述核酸制品(a)可源自各种生物材料；(b)不含下游应用(例如PCR扩增)的可检测抑制剂；(c)可以为浓缩形式；以及(d)顺应用于核酸分析(例如基因分型、定量、生物材料来源的检测等)用的各种应用中的任何种。此外，使用标准液体处理系统，可使核酸的提取及纯化用程序完全自动化。
此外，通过本教导的方法修改目前使用的标准醇沉淀程序(例如需要离心的那些程序)，可以提供数种明显的益处。第一，本教导举例说明的本文方法更快速——用于从分离的核酸复合物中去除溶液的修改程序只花费约1-2分钟，相比之下使用离心的常规方法花费约10-30分钟。第二，本文方法不依赖于离心设备，却可用简单的磁性装置来进行。第三，本文方法更易于适合自动化。例如，可将大量的管放置在大型电磁体上，使用例如多通道移液器具可同时分离来自这些管中的所有核酸。第四，本教导的方法对于洗涤核酸-聚合物-磁性颗粒复合物的步骤(例如为了去除任何残留的盐、核苷酸或有机溶剂(例如酚))尤其有效，因为在本教导中，洗涤步骤不需要离心，因此可以迅速进行。此外，不存在材料损失的风险或存在最小的材料损失风险，基于离心的常规方法可发生材料损失(其中粒状沉淀(pellet)常常在此类洗涤期间从管的底部脱离)。
如本领域技术人员将理解的，对本教导的各种实施方式可以进行多种变化和修改，而不背离这些教导的精神。所有此类变化有意落入这些教导的范围内。
如本文所公开和要求保护的本教导的所有组合物和方法按照本公开内容，无需过度实验，即可制备和实施。尽管已经以具体实施方式对这些教导的组合物和方法进行描述，但对于本领域技术人员显然的是，可对所述组合物和方法，以及在本文所述方法的步骤中或者步骤顺序中，进行改变，而不背离这些教导的概念和范围。更具体地，显然，可用化学及生理学上均相关的某些试剂代替本文所述试剂，但将达到相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为在由所附权利要求所限定的本发明的范围之内。
实施例
本教导的各方面可根据以下实施例得到进一步理解，所述实施例不应理解为以任何方式限制本教导的范围。
实施例1
将人的体液样品置于2.0ml容量的聚丙烯管中。所述样品为2μl血液、10μl唾液和2μl精液。将每个样品与裂解溶液混合，以便裂解细胞。裂解溶液包含0.0％-1％SDS、100mM Tris缓冲液和2M NaCl，任选含有蛋白酶K。将裂解混合物在约60℃至80℃范围内的温度下，在摇动或不摇动条件下孵育约40分钟至1小时的时段。
之后使释放自该生物材料的基因组DNA与具有葡聚糖的多羟基基团的磁性颗粒结合。每一样品的结合混合物含有：细胞裂解物；包含浓度为约5-20mg/ml的磁性颗粒的10μl至20μl悬浮液；以及约150至300μl极性化合物，例如异丙醇、乙醇和/或PEG。然后通过向结合混合物施加磁场，将与磁性颗粒结合的DNA从该混合物中物理分离。
然后，用基于醇的洗涤溶液(90％乙醇)洗涤仍与复合物中的磁性颗粒结合的DNA。通过使用磁场，将DNA-磁性颗粒复合物再次从洗涤混合物中物理分离。重复洗涤步骤一至两次。在该洗涤步骤中去除俘获在DNA-磁性颗粒复合物中的PCR抑制剂和其他大分子。之后通过将DNA-颗粒复合物悬浮于10至100μl水溶液(例如不含DNA的水或例如Tris-HCl的中性缓冲液)中，将DNA从磁性颗粒上释放，并在约50至75℃范围内的温度下孵育该DNA释放混合物。然后通过使用磁场将释放的基因组DNA与磁性颗粒物理分离。将如此获得的基因组DNA制品在4℃下短期储存，或在-20℃下长期储存。使用本领域技术人员熟知的标准方法对DNA进行定量。表1中示出了典型关于人的基因组DNA的结果。
表1：
  样品   DNA产率，ng
  2μl液体血液   8
  2μl液体精液   250
  10μl液体唾液   100
实施例2
如实施例1中所描述从生物样品中提取并分离基因组DNA，其中所述结合混合物包含：细胞裂解物；10至20μl磁性颗粒悬浮液，其中所述颗粒具有葡聚糖的多羟基基团；10至20μl多羟基多糖，例如葡聚糖、纤维素或可溶性淀粉，其浓度为约1至10mg/ml；10至20μl阴离子洗涤剂，例如N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、
Figure BPA00001307182400151
X-100或十二烷基硫酸钠；以及150至300μl极性化合物，例如异丙醇、乙醇和/或PEG。表2中示出了从该方法获得的基因组DNA的产率。
表2：
  样品   DNA产率，ng
  2μl液体血液   140
  2μl液体精液   1200
  10μl液体唾液   200
实施例3
如实施例2中所描述从生物样品中提取并分离基因组DNA，其中使用两种不同的洗涤溶液去除俘获在与磁性颗粒结合的DNA中的抑制剂和其他大分子。洗涤与磁性颗粒结合的DNA的步骤包括使用第一洗涤溶液的一次洗涤(步骤)，然后使用第二洗涤溶液的一至两次洗涤步骤。
第一洗涤溶液包含200至500μl的溶液，其包含下述的混合物：浓度为约1至2.5M的离液序列高的盐(例如硫氰酸胍或盐酸胍(quanidiumhydrochloride))、阴离子洗涤剂(例如N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、
Figure BPA00001307182400152
X-100和/或十二烷基硫酸钠)和极性溶剂(例如异丙醇或乙醇)。第二洗涤溶液包含浓度为约80至95％的乙醇。与磁性颗粒结合的DNA的洗涤步骤包括使用第一洗涤溶液的一次洗涤(步骤)，然后使用第二洗涤溶液的一至两次洗涤步骤。
洗涤溶液I：33mL BloodPrepTMDNA纯化溶液应用生物系统(DNAPurification Solution Applied Biosystems)(PN 4342775)+33mL异丙醇+1g十二烷基肌氨酸钠+33mL去离子水。洗涤溶液II：BloodPrepTMDNA洗涤溶液应用生物系统(DNA Wash Solution Applied Biosystems)(PN4342949)。如表3中所示，其显示该新的洗涤溶液提供了：
1.更好的DNA产率；
2.洗涤步骤期间DNA保持与磁性颗粒结合；
3.有效地去除PCR的抑制剂；以及
4.使用容易，因为只需要一种洗涤缓冲液。
表3
Figure BPA00001307182400161
实施例4
将人的体液样品2μl血液、20μl唾液和1μl精液置于2.0ml容量的聚丙烯管中并与裂解溶液混合。将该裂解混合物在约60至80℃范围的温度下，在摇动或不摇动条件下孵育约40分钟至4小时的时段。
之后使释放自该生物材料的基因组DNA与包含葡聚糖的多羟基基团的磁性颗粒结合。结合混合物包含：细胞裂解物；包含浓度为约5-20mg/ml的磁性颗粒的10μl至20μl悬浮液；10至20μl多羟基多糖，例如葡聚糖、纤维素和/或可溶性淀粉，其浓度为约1至10mg/ml；约10至20μl阴离子洗涤剂，例如N-月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠、CTAB、N-十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、X-100和/或十二烷基硫酸钠；以及约150至300μl极性化合物，例如异丙醇、乙醇和/或PEG。
通过使用磁场，将与磁性颗粒结合的DNA从结合混合物中物理分离。之后用洗涤溶液洗涤与磁性颗粒结合的DNA，该洗涤溶液包含极性溶剂中的洗涤剂，所述洗涤剂为例如脱氧胆酸钠、N-月桂酰肌氨酸、失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯(polysorbate 20)或失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯(polysorbate 80)(商品名分别为20或80)或者X-100，其浓度为约0.05％至1％，所述极性溶剂为例如乙醇或异丙醇，其浓度为约65％至80％。通过使用磁场将与磁性颗粒结合的DNA从洗涤混合物中物理分离。重复洗涤步骤一至两次。在该步骤中去除俘获入与磁性颗粒结合的DNA中的PCR抑制剂和其他大分子。
之后通过将与磁性颗粒结合的DNA悬浮于约10至100μl水溶液中，将DNA从磁性颗粒上释放，所述水溶液为例如不含DNA的水；或包含Tris-HCl(摩尔浓度范围为约10至50mM，pH范围为约7.0至8.5)和螯合剂EDTA(浓度范围为约0.1至3.0mM)的缓冲液。在约50至75℃范围内的温度下孵育该释放混合物。然后通过使用磁场将释放的基因组DNA与磁性颗粒物理分离。将如此获得的基因组DNA制品在4℃下短期储存，或在-20℃下长期储存。使用本领域技术人员熟知的标准方法对DNA进行定量，例如使用人DNA定量试剂盒的人DNA定量。表4中示出了如此获得的典型关于人基因组DNA的结果。
表4：
  样品   DNA产率，ng
  2μl液体血液   145
  1μl液体精液   650
  20μl液体唾液   165
实施例5
如实施例中4所描述分离基因组DNA，其中生物液体为2μl血液、20μl唾液和1μl精液，并将所述液体沾染在织物(例如棉布、聚酯布或粗斜纹布)上。表5中示出了如此获得的沾染在棉上的液体的典型关于人基因组DNA的结果。
表5：
  样品   DNA产率，ng
  棉上的2μl血液   80
  棉上的1μl精液   550
  棉上的20μl唾液   145
实施例6
如实施例4中所描述，从细胞计数为1562-50000个细胞的培养的Raji细胞中分离基因组DNA。图2和表6中示出了如此获得的典型关人基因组DNA的结果。
表6：
  Raji细胞，细胞计数   DNA产率，ng
  50000   488
  25000   266
  12500   136
  6250   69.7
  3125   37.3
  1562   21
实施例7
如实施例4中所描述，从细胞计数为约3500-110000个细胞的培养的K562细胞分离基因组DNA。图3和表7中示出了如此获得的典型关于人基因组DNA的结果。
表7：
  K562细胞，细胞计数   DNA产率，ng
  110000   1190
  55000   700
  27500   500
  13750   217
  6875   114
  3438   65
实施例8
如实施例4中所描述，从生物液体和不同基材上的生物液体污斑中分离基因组DNA，所述基材例如布、FTA纸、拭子和粗斜纹布，其中通过将生物材料悬浮于裂解溶液中进行该生物材料的裂解。在50至60℃范围内的温度下孵育裂解溶液40分钟至2小时，按实施例4所概述的方法获得DNA并进行定量。
实施例9
如实施例4中所描述分离基因组DNA，其中将约2至10μl生物液体血液沾染在棉上，并用1至5μl PCR抑制剂进行富集，所述抑制剂包含至终浓度约0.1至2mM的羟高铁血红素、至终浓度约5mg/ml的腐殖酸、至终浓度约5至20mM的靛蓝、以及至终浓度约2至12mg/ml的城市灰尘提取物。如使用
Figure BPA00001307182400191
人DNA定量试剂盒测定的内部PCR对照(IPC)的Ct值所证实的，通过这些方法在提取和分离基因组DNA期间有效去除PCR抑制剂。表8中示出了如此获得的结果。
表8：
  样品   IPC Ct
  棉上干燥的2μl血液   27.58
  在抑制剂混合物的存在下，棉上干燥的2μl血液   27.60
  提取空白   27.77
实施例10
如实施例4中所描述分离的基因组DNA，其中包含生物液体污斑的生物样品通过暴露于环境1至7天的时期，而经受环境伤害。按照实施例4的方法将DNA分离并定量。
实施例11
如实施例4中所描述分离的基因组DNA，其中生物样品具有不同的性质，包括在棉、人造丝和尼龙材料上的颊拭子；在诸如棉布、粗斜纹布、聚酯布、FTA纸、滤纸之类的材料上的血斑、唾液斑和精斑；烟蒂，指纹拭子(swab of finger prints)；诸如上皮细胞和精液的体液混合物；不同表面上的体液拭子。
实施例12
如实施例11中所描述从生物样品中分离基因组DNA，并使用人DNA定量试剂盒进行处理，用于定量人DNA。表8中示出了人DNA的量和IPC的Ct的结果，IPC的Ct测量来自含有生物材料的一些典型基材的PCR抑制剂的存在。相对于阴性模板对照(NTC)的IPC Ct值，样品DNA制品的IPC Ct值大于1的正差异(positive difference)显示存在PCR抑制剂。
表9：
  样品   DNA产率，ng   IPC Ct
  血液2μl   62±13   27.6
  粗斜纹布上的血斑2μl   76±15   27.9
  人造丝上的血斑2μl   39.5±8   27.7
  尼龙上的血斑2μl   39±10   27.6
  唾液5μl   158±30   27.6
  棉上的唾液斑5μl   143±25   27.7
  精液2μl   1250±150   27.6
  棉上的精斑2μl   1340±130   27.7
  烟蒂   154±40   27.8
  口香糖   21±8   27.9
  提取空白   0   27.6
  NTC   27.6
实施例13
如实施例11中所描述，从生物样品中分离基因组DNA，并使用
Figure BPA00001307182400202
试剂盒(例如
Figure BPA00001307182400203
)进行处理，用于基因分型。图4中示出了从含有生物材料的一些典型基材中如此获得的基因型分布(genotype profiles)。
实施例14
如实施例1至12中所描述，从生物样品中分离基因组DNA，并使用试剂盒形式的本文所述试剂进行处理。
实施例15
使用富集步骤增强从碎牛肉或汉堡中分离掺入的(spiked)DNA。
化学裂解规程(protocol)：
将样品置于1.5mL微型离心管中，加入300μL的裂解溶液，然后将混合物涡旋振荡(vortex)15秒直到样品完全重新悬浮，然后在70℃下孵育20分钟。接下来，将管以最大速度涡旋振荡10秒，并将磁性颗粒涡旋振荡直到它们在悬浮液中(约5分钟)。加入30μl颗粒悬浮液，低速涡旋振荡样品/颗粒混合物10秒，然后加入190μl结合溶液并涡旋振荡5秒，之后在室温下持续摇动孵育7分钟。然后低速涡旋振荡混合物10秒，将管置于磁性分离器中，在1-2分钟内发生分离。小心地移出液相并弃去，且不扰动磁性颗粒沉淀。加入300μl洗涤溶液，之后中速涡旋振荡5秒或直到沉淀重新悬浮，然后将管在磁性分离器中放置30秒，再次小心地弃去液相，且不扰动磁性颗粒沉淀。再重复该步骤2次。加入50μl洗脱缓冲液，中速涡旋振荡该管5秒，然后在70℃下孵育5分钟，之后进行第二次涡旋振荡，随后在磁性分离器中至少1分钟。将上清液转移进入一个新的管中。
蛋白酶K裂解规程(当需要处理难以溶解的、富含蛋白的组织样品、含有革兰氏+细菌的样品时推荐)：
将样品置于1.5mL微型离心管中，向该管中加入200μl PK缓冲液和10μl蛋白酶K(20mg/ml)，之后在56℃下孵育20分钟。加入400μl裂解溶液，然后中速涡旋振荡15秒，直到该样品重新悬浮，之后中速涡旋振荡10秒。如之前制备原料(stock)磁性颗粒，然后向样品中加入30μl，低速涡旋振荡10秒。加入400μl结合溶液，再次涡旋振荡5秒，之后在室温下持续摇动10分钟。然后再次低速涡旋振荡样品10秒，并在磁性分离器中放置1-2分钟，直到完全分离。如所描述进行去除和洗涤，总共进行3次洗涤。将磁性颗粒进行开盖风干5分钟。加入50μl的洗脱缓冲液，关上盖子，中速涡旋振荡5秒，然后在70℃下孵育5分钟。如必要，可将洗脱体积增加直到200μl。然后中速涡旋振荡该管2秒，并在磁性分离器中放置1分钟。DNA在洗脱流体中，并和竞争物试剂盒用于PCR反应。结果为：三个样品中的三个中，竞争物的Ct比本公开方法大几乎2Ct。因此，本公开方法比竞争物具有更高的灵敏性并导致大的DNA回收。
实施例16
通过以下方式进行支原体分离：将2至10ml的样品置于50ml管中，之后以1000×g离心5分钟。将上清液转移至50ml管中并保持在冰上。
用巴氏移液管在5ml冰冷的1X PBS中温和地重新悬浮粒状沉淀，然后以1000×g离心5分钟，小心地去除上清液并弃去。将粒状沉淀温和地重新悬浮于550μl冰冷的结合缓冲液中，注意避免细胞裂解。将悬浮液转移至2ml管中，并在冰上孵育约5分钟，之后在4℃下以1000×g离心5分钟。将400μl上清液转移至2ml管中，之后在4℃下以1000×g离心3分钟。用P200移液管尖将300μl上清液转移至2ml管中并在冰上储存。
在4℃下以16,000×g将冰上的50mil管中的上清液离心30分钟。吸出上清液并弃去，注意不扰动粒状沉淀。将细胞级分裂解物从2ml管中转移至50ml管中的粒状沉淀中，并温和地将粒状沉淀重新悬浮。将悬浮的粒状沉淀转移至2ml管中，向其中加入0.5M EDTA和18μl RNase Cocktail(PreSEQTM支原体核酸提取试剂盒，Applied Biosystems，FosterCity，CA)，短暂地涡旋振荡，然后短暂地进行微量离心(microfuged)。然后在56℃下孵育管30分钟，在孵育期间涡旋振荡2次。加入5μl蛋白酶K，之后进行短暂涡旋振荡和旋转，在56℃下另外孵育10分钟。加入700μl裂解缓冲液，之后中速涡旋振荡5秒。所得1ml裂解物用于如实施例15中所述的DNA提取。
通过PCR和解链曲线分析评价提取的支原体DNA。结果表明，洗涤溶液不显著地影响PCR或DNA的回收，并且公开的提取和分离方法产生比竞争试剂盒更好的DNA产率，具有更好的灵敏性，因为竞争试剂盒没有检测到支原体DNA，而用要求保护的发明(检测)的所有样品都检测到了支原体DNA。

Claims (27)

1.非共价复合物，其包含核酸、聚合物和可磁性吸引的颗粒，以形成核酸-聚合物-颗粒复合物。
2.制备产品的方法，其中所述产品包含核酸，所述方法包括以下步骤：
(a)用包含聚合物和洗涤剂的起始溶液处理样品；
(b)施加悬浮的可磁性吸引的颗粒；
(c)通过施加磁场回收所述核酸。
3.权利要求2所述的方法，其中所述核酸源自生物材料样品，所述样品包括血液、血斑、唾液、唾液斑、颊细胞、颊拭子、精液、精斑、烟蒂、口香糖、碎牛肉、布里干酪、生鸡、虾、罗马甜瓜、干燥婴儿配制食品、全壳蛋、碎黑胡椒、干燥宠物食品、花生酱、橙汁、巴氏灭菌奶、苜蓿芽、烤牛肉、烟熏鲑鱼、蛋黄酱、色拉调料、奶、冰激凌、腌培根、莴苣、香肠、甜菜、果汁、菠菜、切达干酪、原奶、牡蛎、蛤或贝类中的一种或多种。
4.权利要求2所述的方法，其中所述可磁性吸引的颗粒包括葡聚糖包被的磁性纳米颗粒。
5.权利要求2所述的方法，其中所述聚合物包括葡聚糖、纤维素、纤维素衍生物、可溶性淀粉、糊精、纤维糊精、聚乙二醇、肝素、糖原、及其组合中的一种或多种。
6.权利要求所述2的方法，其中所述洗涤剂包括N-月桂酰肌氨酸、十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸盐、CTAB、脱氧胆酸盐、十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚、十二烷基硫酸钠、及其组合中的一种或多种。
7.制备产品的方法，其中所述产品包含核酸，所述方法包括以下步骤：
(a)在裂解溶液中从样品中裂解细胞，从而形成包含核酸的裂解物；
(b)用包含聚合物和洗涤剂的起始溶液处理所述裂解物；
(c)施加悬浮的可磁性吸引的颗粒，以形成核酸-聚合物-颗粒复合物；
(d)用洗涤溶液洗涤所述核酸-聚合物-颗粒复合物；
(c)通过施加磁场回收所述核酸。
8.权利要求7所述的方法，其中所述可磁性吸引的颗粒包括葡聚糖包被的磁性纳米颗粒。
9.权利要求7所述的方法，其中所述聚合物包括葡聚糖、纤维素、纤维素衍生物、可溶性淀粉、糊精、纤维糊精、聚乙二醇、肝素、糖原、及其组合中的一种或多种。
10.权利要求7所述的方法，其中所述洗涤剂包括N-月桂酰肌氨酸、十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸盐、CTAB、脱氧胆酸盐、十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚、十二烷基硫酸钠、及其组合中的一种或多种。
11.用于从包含生物材料的样品中分离和纯化核酸的试剂盒，其包含含有聚合物和洗涤剂的起始溶液；以及可磁性吸引的颗粒。
12.权利要求11所述的试剂盒，其中所述聚合物包括葡聚糖、纤维素、纤维素衍生物、可溶性淀粉、糊精、纤维糊精、聚乙二醇、肝素、糖原、及其组合中的一种或多种。
13.权利要求11所述的试剂盒，其中所述洗涤剂包括N-月桂酰肌氨酸、十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸盐、CTAB、脱氧胆酸盐、十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚、十二烷基硫酸钠、及其组合中的一种或多种。
14.权利要求11所述的试剂盒，其中所述可磁性吸引的颗粒包括葡聚糖包被的磁性纳米颗粒。
15.权利要求11所述的试剂盒，其中所述试剂盒的所有内含物在一个容器内。
16.权利要求11所述的试剂盒，其进一步包含裂解溶液。
17.权利要求11所述的试剂盒，其进一步包含洗涤溶液。
18.从样品中分离核酸的方法，其包括以下步骤：
(a)用包含聚合物和洗涤剂的起始溶液处理所述样品；
(b)将悬浮的可磁性吸引的颗粒加入到经处理的样品中；以及
(c)通过施加磁场来分离经由聚合物附着于可磁性吸引的颗粒的核酸。
19.权利要求18所述的方法，其进一步包括从所述可磁性吸引的颗粒释放所述核酸的步骤。
20.权利要求19所述的方法，其进一步包括在水溶液中洗脱所述核酸的步骤。
21.权利要求18所述的方法，其中所述核酸源自生物材料样品，所述样品包括血液、血斑、唾液、唾液斑、颊细胞、颊拭子、精液、精斑、烟蒂、口香糖、碎牛肉、布里干酪、生鸡、虾、罗马甜瓜、干燥婴儿配制食品、全壳蛋、碎黑胡椒、干燥宠物食品、花生酱、橙汁、巴氏灭菌奶、苜蓿芽、烤牛肉、烟熏鲑鱼、蛋黄酱、色拉调料、奶、冰激凌、腌培根、莴苣、香肠、甜菜、果汁、菠菜、切达干酪、原奶、牡蛎、蛤或贝类中的一种或多种。
22.权利要求18所述的方法，其中所述可磁性吸引的颗粒包括葡聚糖包被的磁性纳米颗粒。
23.权利要求18所述的方法，其中所述聚合物包括葡聚糖、纤维素、纤维素衍生物、可溶性淀粉、糊精、纤维糊精、聚乙二醇、肝素、糖原、及其组合中的一种或多种。
24.权利要求18所述的方法，其中所述洗涤剂包括N-月桂酰肌氨酸、十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸盐、CTAB、脱氧胆酸盐、十二烷基β-D-麦芽糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚、十二烷基硫酸钠、及其组合中的一种或多种。
25.通过权利要求1所述方法制备的核酸产品。
26.通过权利要求7所述方法制备的核酸产品。
27.通过权利要求18所述方法分离的核酸。
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