CN103882012A - 一种快速从牛羊液态奶和奶粉等奶制品中高效提取dna的方法 - Google Patents

一种快速从牛羊液态奶和奶粉等奶制品中高效提取dna的方法 Download PDF

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张全芳
刘艳艳
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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及从牛羊奶及奶粉中提取DNA技术领域。公开了一种快速从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，首次将Chelex-100法与Glassmilk（玻璃奶）DNA纯化技术完美结合应用于牛羊液态奶及奶粉微量DNA提取上。鲜液态奶的采集量可控制在1-2ml，奶粉的量可控制在1-10mg，提取出的DNA浓度高、纯度极好，稳定不易降解。提取的DNA可以扩增500-1000bp以上的长片段基因序列，所得序列可开展后续的分子生物学分析。操作简单、用量少、耗时短，DNA纯度高，不易降解，取样方便、实用，可以避免血液和组织取样的困难问题，也不会引起动物应激反应，降低了其他取样方法为乳品企业及养殖户带来的不必要的损失。

Description

一种快速从牛羊液态奶和奶粉等奶制品中高效提取DNA的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种快速从牛羊液态奶及奶粉中高效提取DNA的方法。
背景技术
在分子生物学实验中，提取DNA是一项最基础也是最常用的技术。对于奶牛或奶山羊，目前分离DNA的材料主要包括组织和血液，组织的收集主要采用剪耳法，而血液的收集主要采用尾静脉采血。我们在生产实践中发现，这两种方式都会对实验动物产生应激，影响奶牛、奶山羊的生产水平，一方面可能造成实验结果的偏差；另一方面对实验牛场来说也是一笔不小的损失。因此，找到一种对奶牛、奶山羊产生最小应激的DNA提取方法，显得尤为重要。
奶牛乳腺细胞自身的代谢和脱落都为奶牛中提供了大量的体细胞资源：平均每毫升牛奶中的体细胞数达到30万左右，基本达到了提取DNA的细胞浓度。因此，从牛奶中分离体细胞，进而提取DNA在理论上是可行的。
传统的提取DNA的技术程序主要是SDS碱裂解，热裂解苯酚/氯仿抽提方法。但牛奶及羊奶中存在大量的蛋白，脂类物质，使用传统方法提取DNA不但步骤繁琐，耗时长，苯酚/氯仿易于挥发强致癌物质，对实验人员身体相当有害，而且提取的DNA浓度较低、蛋白比例较高，容易降解，不易长时间保存等。所以开发一种快速高效的从牛羊奶中提取DNA方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，已达到快速、经济、方便、无毒害、纯度高、不易降解的效果，适用于分子杂交，荧光定量PCR，基因测序等高级别要求的分子生物学实验。
本发明通过以下技术方案实现：
一种快速从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，其特征在于牛、羊液态奶及奶粉的基因组DNA提取方法首次采用Chelex-100加热释放DNA及玻璃奶纯化基因组DNA的办法进行提取，具体实施步骤如下：
步骤一,离心管准备：采用2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；
步骤二，白细胞收集
①取牛奶或羊奶1-2ml，或者奶粉2mg溶于2ml无菌水中，将样品于2500r/mln，4℃离心30分钟;
②用小勺刮去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLPH值7.4高压灭菌的PBS(磷酸缓冲液)，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，在3500r/min，常温(20-25℃)下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀，重复3次；
步骤三，体细胞消化：向体细胞沉淀中加入5-10%的Chelex-100悬浮液280ul及20mg/ml蛋白酶K20ul，56℃保温30min以上。
步骤四，核酸释放：高速震荡5-10s，100℃煮沸8min；高速震荡5-10s，13000r/min离心3min,将上清转移至离心柱中，10000r/min离心1min，收集液体
步骤五，核酸纯化：
1）向收集液体中加入GlassMilk5-10μL,加入900μL的gDNABindingBuffer，充分混匀，65℃水浴15min，中间要反转几次；
2）室温放置5min，中间反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底；
3）70%酒精500ul洗涤8000r/min离心1min，重复此步骤2次；
4）加入500ul无水乙醇，吹打悬浮，洗涤8000r/min离心1min，弃上清；
5）8000r/min离心30S，用10μL枪头吸走残余液体，37℃烘干箱放置5min直至完全干为止；
6）加100μLTE（pH7.0）60℃水浴5min溶解DNA，8000r/min离心5s，吸取上清转移至新的离心管中，-20度保存备用。
步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，85%以上所获得的基因组DNA浓度处于45-100ng/μL之间，纯度OD260/280值处于1.8-2.0之间；
步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计牛或羊的特异性通用引物；
步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；
步骤九，基因比对：测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，可以进行后续的分子生物学分析。
PBS(磷酸缓冲液)配制如下：
分别称取NaCL8g，KCL0.2g，Na2HPO41.44g，K2HPO40.24g，将各种物质溶解于800mL双蒸水中，调pH至7.4，加双蒸水定容体积至1L。
5-10%的Chelex-100悬浮液配制如下：
称取Chelex-1005-10g，溶于95-90ml的双蒸水中，用时要充分摇匀。
本发明突出的优点在于：首次成功的利用了Chelex-100法来提取牛奶羊奶及奶粉中的基因组DNA。Chelex-100是一种苯乙烯和苯二乙烯共聚体组成的化学离子螯合树脂，其悬液在碱性环境（pH10-11）和100℃的条件下，可导致细胞膜破裂，DNA从细胞核中释放，同时Chelex-100能结合许多可能影响下一步的非核酸物质。由于Chelex-100能有效除去非核酸有机物，并且通过结合金属离子防止DNA降解，具有经济、简便、高效等优点，目前已被广泛用于从微量血液、组织斑块、精斑和骨骼等法医物证检材，目前用于农业方面也少有报到。
本发明另一个突出的优点在于：首次应用玻璃乳快速DNA纯化试剂盒来纯化基因组DNA来替代有毒的有机物苯酚氯仿抽提方法。其优点在于：玻璃乳是一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中，核酸是不容的，可被吸附至玻璃基质上，而蛋白质在高盐溶液中是高度溶解的，脂类物质悬浮于溶液表面，从而起到纯化分离DNA的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本专利公开了一种快速从牛羊奶及奶粉中提取DNA方法，首次将Chelex-100法与Glassmilk（玻璃奶）DNA纯化技术完美结合应用于牛羊奶及奶粉微量DNA提取上。鲜奶的采集量可控制在1-2ml，奶粉的量可控制在1-10mg，提取出的DNA浓度高、纯度极好，稳定不易降解。同时提取的DNA可以扩增500-1000bp以上的长片段基因序列，所得序列可开展后续的分子生物学分析，如基因克隆，测序，荧光定量检测等。其操作简单、用量少、耗时短，DNA纯度高，不易降解，取样方便、实用，可以避免血液和组织取样的困难问题，也不会引起动物应激反应，降低了其他方法取样为乳品企业及养殖户带来的不必要的损失。所提取的DNA适用于分子杂交，荧光定量PCR，基因测序等高级别要求的分子生物学实验。
附图说明
图1：使用本发明提取的不同品牌的纯牛奶、纯羊奶、酸奶和鲜奶等液态奶，以及奶粉的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果；1,鲜羊奶2,鲜牛奶3,某品牌纯牛奶4,某品牌纯羊奶5,某品牌酸牛奶6,某品牌酸羊奶7,某品牌牛奶粉8,某品牌羊奶粉
图2：应用PCR扩增牛、羊液态奶及奶粉的线粒体16SrRNA部分基因序列的凝胶琼脂糖凝胶电泳结果；1,鲜羊奶2,鲜牛奶3,某品牌纯牛奶4,某品牌纯羊奶5,某品牌酸牛奶6,某品牌酸羊奶7,某品牌牛奶粉8,某品牌羊奶粉
图3：对牛、羊液态奶及奶粉的线粒体16SrRNA部分基因序列的PCR扩增产物测序结果及比对结果；A:牛，B:羊
图4：应用TaqMan探针技术荧光定量PCR扩增牛、羊液态奶及奶粉的线粒体16SrRNA基因结果。
具体实施方式：
实验材料
实施例1牛奶、羊奶及奶粉基因组DNA提取步骤如下：
步骤一,试剂配制及实验器材准备：
1.离心管准备采用2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；
2.PBS(磷酸缓冲液)配制如下：磷酸缓冲液(pBs):分别称取NaCL8g，KCL0.2g，Na2HPO41.44g，K2HPO40.24g，将各种物质溶解于800mL双蒸水中，调pH至7.4，加双蒸水定容体积至1L；
3.5-10%的Chelex-100悬浮液配制：称取Chelex-1005-10g，溶于95-90ml的双蒸水中，用时要充分摇匀；
4.TE缓冲液的配制：分别称取PH为8.0的1M/LTris-cl0.5M/L、EDTA-Na0.5M/LPH值调至7.0-8.0。
步骤二，白细胞收集
①取牛奶或羊奶1-2ml，或者奶粉2mg溶于2ml无菌水中，将样品于2500r/mln，4℃离心30分钟;
②用小勺刮去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLPH值7.4高压灭菌的PBS(磷酸缓冲液)，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，在3500r/min，常温(20-25℃)下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀，重复3次；
步骤三，体细胞消化：想体细胞沉淀中加入5-10%的Chelex-100悬浮液280μL及20mg/ml蛋白酶K20μL，56℃保温30min以上。
步骤四，核酸释放：高速震荡5-10s，100℃煮沸8min；高速震荡5-10s，13000r/min离心3min，将上清转移至离心柱中，10000r/min离心1min，收集液体
步骤五，核酸纯化：
1）向收集液体中加入GlassMilk5-10μL,加入900μL的gDNABindingBuffer,充分混匀，65°水浴15min，中间要反转几次；
2）室温放置5min，中间反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底；
3）70%酒精500μL洗涤8000r/min离心1min，重复此步骤2次；
4）加入500μ无水乙醇，吹打悬浮，洗涤8000r/min离心1min，弃上清；
5）8000r/min离心30S，用10μL枪头吸走残余液体，37°烘干箱放置5min直至完全干为止；
6）加100μTE（PH7.0）60℃水浴5min，8000r/min离心5s，吸取上清转移至新的离心管中，-20度保存备用。
步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度；
步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计牛或羊的特异性通用引物；
步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；
步骤九，基因比对：测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，可以进行后续的分子生物学分析。
实施例2：
本实例从山东省农科院畜牧所兴牛乳业有限公司购置新鲜液态奶：牛奶和羊奶，从济南各大商场购置不同品牌的纯牛奶、纯羊奶、酸奶等液态奶和奶粉按照本发明的方法提取奶样中的基因组DNA，使用Nanodrp（微量紫外分光光度计）对提取的基因组进行检测所得数据如表1，对其进行琼脂糖凝胶电泳见图1。
表1奶样DNA纯度及浓度测定结果
Figure BDA0000494251920000081
从表1可以看出OD260/280值在1.8-2.0范围之内，其DNA纯度符合要求，通过本发明所提取的各种类型的奶的基因组DNA的纯度及浓度都能达到要求，但浓度在不同类型奶中差异突出，原因在于鲜奶和成品奶中所含体细胞不同所致。
实施例3
普通PCR检测DNA提取的纯化效果：
本实例利用本发明对实施例2中的不同品牌的液态奶及奶粉提取的基因组DNA做模板，选择线粒体16SrRNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计牛或羊的特异性通用引物，进行PCR扩增，检测扩增效果。
1、引物序列：
正向引物：AAGACGAGAAGGGAACCCTTGGAC
反向引物：GCGCTGTTTAATCCCCATAGG
2.PCR反应
(1)以实施例2中的提取的不同品牌的液态奶及奶粉基因组DNA为模板进行PCR扩增，25μL反应体系中包括以下溶液或试剂：
Figure BDA0000494251920000091
（2）经过梯度PCR摸索实验条件，最终确定退火温度采用58℃，PCR反应条件如下：
95℃热变性3-5min一个循环；95℃30-50S,58℃30S，72℃30S共35个循环；72℃10min；16℃保存。
3.PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测；目的片段长度为230bp，结果显示液态奶和奶粉扩增效果都很好，见图2。
4.PCR产物测序
将上述8种PCR产物采用玻璃奶纯化，使用上述PCR的引物进行正反双向测序，得到的序列拼接后，与NCBI数据库Blast比对，结果与16SrRNA基因序列均一致，测序结果见图3。
实施例4
荧光定量检测DNA提取的效果
1.选用上述PCR使用的扩增牛和羊的通用引物，分别设计牛、羊的特异探针，牛特异探针5’和3’端分别用FAM，Dab修饰，羊特异探针5’和3’端分别用JOE，Dab修饰，探针序列如下：
牛(NP):5’CGAGCGAACTGGAAAGTGTGCTTGGATTCGCTCG-3’
羊(YP)：5’CGTCCACACTCTATTATTAAATAGATGGACG-3’
2.qPCR复合扩增反应体系：优先选用20μL的PCR扩增体系包括pH值为8.9，镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM，Taq酶的用量为0.2U/μL，引物探针混合物中的引物、探针的终浓度为0.4mM。
试剂名称 浓度 用量（μL）
HS-Taq 5U/μL 0.2
Premix 5X 4
PrimerMix 2μM 2
ProbeMix 2μM 2
IACDNA 1pg/μL 2
DNATemplate 20ng/μL 2
双蒸水 7.8
总体积 20
3.qPCR扩增反应在ABI7500PCR仪上进行，扩增程序：95℃1min；45个循环,95℃5s，60℃34s，在此收集荧光信号。
4.结果显示：牛和羊探针均能得到特异扩增，说明由本发明提取的各种类型的液态奶和奶粉的基因组DNA均能满足荧光定量PCR的要求，扩增曲线见图4。

Claims (3)

1.一种快速从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，首次采用Chelex-100加热释放DNA结合玻璃奶纯化办法进行基因组DNA的提取，其特征在于以下步骤：
步骤一,离心管准备：采用2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；
步骤二，白细胞收集
①取牛或羊液态奶1-2ml，或者奶粉2mg溶于2ml无菌水中，将样品于2500r/mln，4℃离心30分钟;
②用小勺刮去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLPH值7.4高压灭菌的PBS溶液，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，在3500rpm/min，常温下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀，重复3次；
步骤三，体细胞消化：向体细胞沉淀中加入5-10%的Chelex-100悬浮液280μL及20mg/ml蛋白酶K20μL，56℃保温30min以上；
步骤四，核酸释放：高速震荡5-10s，100℃煮沸8min；高速震荡5-10s，13000rpm/min离心3min，将上清转移至离心柱中，10000rpm/min离心1min，收集液体；
步骤五，核酸纯化：
1）向收集液体中加入GlassMilk5-10μL和900μL的gDNABindingBuffer，充分混匀，65°水浴15min，中间要反转几次；
2）室温放置5min，中间反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底沉淀；
3）70%酒精500ul洗涤8000rpm/min离心1min，重复此步骤2次；
4）加入500μL无水乙醇，吹打悬浮，洗涤8000rpm/min离心1min，弃上清；
5）8000rpm/min离心30S，用10μL枪头吸走残余液体，37°烘干箱放置5min直至完全干为止；
6）加100μLTE，pH7.0，60℃水浴5min溶解DNA，8000rpm/min离心5s，吸取上清转移至新的离心管中，-20℃保存备用。
步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度；
步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计牛或羊的特异性通用引物；
步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；
步骤九，基因比对：将测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，进行后续的分子生物学分析；
2.根据权利要求1所述的PBS溶液配制如下：
分别称取NaCL8g，KCL0.2g，Na2HPO41.44g，K2HPO40.24g，将各种物质溶解于800mL双蒸水中，调pH至7.4，加双蒸水定容体积至1L。
3.根据权利要求1所述5-10%的Chelex-100悬浮液配制如下：
称取Chelex-1005-10g，溶于95-90ml的双蒸水中，用时充分摇匀。
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