CN104046616B - 一种从阿胶中快速提取dna的试剂盒及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法。首次将SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法DNA提取技术与Glassmilk(玻璃奶)DNA纯化技术结合应用于阿胶DNA提取中。所需阿胶浆的用量控制在0.3-0.5ml，阿胶块可控制在0.2-0.6mg，提取出的DNA浓度高、纯度极好，稳定不易降解。提取的DNA可以扩增100-500bp的序列片段，可开展后续的基因克隆、测序等分子生物学实验。该方法操作简单、用量少、耗时短，尤其适用于深度加工而导致的核酸含量偏少和高度降解的各种类型阿胶产品DNA的提取,为利用DNA分子生物学鉴定技术实现阿胶源性鉴别提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种从阿胶中快速高效提取DNA的方法及其试剂盒。
背景技术
阿胶为马科动物驴的去毛之皮经熬制而成的胶状物，其医疗保健价值广泛，具有补血养血、美容养颜、延年益寿、强筋健骨，增强免疫力等五大功能优势，因此阿胶作为一种保健食品在市场上占有重要的位置，深受消费者的青睐。然而，随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应的紧张和原料价格上涨，不法分子为了降低成本，在制备阿胶过程中，部分或全部掺入马皮、牛皮、猪皮、骡子皮或其他动物杂皮进行熬制，通过这种方式熬制成的“假阿胶”在外观及质地上都与真正阿胶极其相似，并且价格低廉。这类伪品的存在不仅危害整个阿胶市场，而且损害了消费者的利益，甚至有些“假阿胶”还存在有毒物质，不但损害了消费者的健康，还严重破坏了我国传统中药保健品的形象，不利于我国阿胶事业的健康发展。所以我们急需建立一种高效、可靠地方法来鉴定阿胶真伪。
传统鉴别阿胶的方法主要通过观察产品外观，颜色，气味等来实现，然而跟驴皮同源性很近的骡子和马皮熬制出来的阿胶很难用传统方法来辨别真伪。近年来随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，公开号为CN1605868A的专利采用PCR-RFLP鉴定驴皮等动物皮，但该方法只适用于动物皮而不适合成品阿胶鉴定，阿胶经过高温高压长时间作用，其DNA含量很少，均已降解为小片段，很难扩增出长片段的PCR产物。公开号为CN101270357A的专利提供一种从深加工型中药或中药材中提取DNA的方法，但该方法需要用50ml离心管大量原料，费时费力，而且必须使用进口商业化试剂盒提取，实验成本高。
为了克服上述现有技术的不足，针对阿胶中蛋白含量极高，DNA含量低，且经过高温熬煮等层层加工高度降解这些特点，本发明在现有的DNA提取方法基础上，做出了有针对性的调整和改进。本发明提供了一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法。该方法简便，快捷，有效，能够从各种类型的胶类产品中提取出纯度高、产量多并且能够进行后续更高级别的分子生物学实验的微量DNA提取技术，为阿胶及其相关产品的源性鉴定奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒，包括细胞消化液(溶液A)、5％的Chelex-100(溶液B)、GlassMilk、gDNABindingBuffer(溶液C)、TE缓冲液(溶液S)、75％的酒精、及蛋白酶K。
(1)细胞消化液(溶液A)：由10mMTris-HCL，25mMEDTA，100mMNaCL，0.5％SDS构成，pH＝8.0；
(2)5％的Chelex-100(溶液B)：称取5gChelex-100，用灭菌的ddH2O定容至100ml
(3)玻璃奶GlassMilk适量
(4)溶液C：gDNABindingBuffer(6MNaI)
(5)氯仿
(6)溶液S：TE缓冲液,PH值为7.0
(7)70％酒精:35ml无水乙醇定容至50ml。
(8)20mg/ml蛋白酶K
(9)无水乙醇
(10)双蒸水
本发明还提供了从阿胶中快速提取DNA的一种方法，具体实施步骤如下：
步骤一，试剂配制及实验器材准备：消化缓冲液配制，准备2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；
步骤二，用消化液消化分解蛋白：用移液枪吸取200-300ul的阿胶液体产品(如阿胶浆)，至2ml无菌离心管中，取0.3-0.5mg食阿胶羹，液氮研磨成粉末状至2ml无菌离心管中，并向其中加入400ul细胞消化液(溶液A)，加入380ul5％的Chelex-100(溶液B)，然后置于50-60度水浴中保温，期间不时轻轻搅拌混匀，直到胶状状物全部溶解，待溶液冷却至室温后，加入20mg/ml蛋白酶K20ul，混匀，56℃放置1h，期间不时轻微摇匀。
步骤三，核酸释放：高速震荡5-10s，100℃8min；
步骤四，核酸纯化：12000rpm，离心10min，吸取上清转至新的EP管中，加入等体积氯仿(约1ml)，充分混匀，12000rpm离心10min，小心将上清转至新的EP管中；向收集液体中加入GlassMilk5ul,加600ulgDNABindingBuffer(溶液C),充分混匀，65℃水浴15min，中间要反转几次；室温放置5min，中间要反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底；70％酒精500ul洗涤8000r/min离心1min，重复此步骤2次；加入500ul无水乙醇，；吹打悬浮，洗涤8000r/min离心1min，弃上清；8000r/min离心30S，用10ul枪头吸走残余液体，室温干燥10min。
步骤五，洗脱DNA:加50ulTE缓冲液(溶液S，PH7.0)，70°5min水浴，12000rpm，离心1min，吸取上清转移至新的离心管中，-20℃保存。
步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，85％以上所获得的基因组DNA浓度值处于45-100ng/ul之间，OD260/280值处于1.8-2.0之间；
步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计驴、马的特异性通用引物；
步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；
步骤九，基因比对：测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，可以进行后续的分子生物学分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本专利公开了一种快速从阿胶中提取DNA方法，首次将Chelex-100加SDS消化液对阿胶处理消化以及将Glassmilk(玻璃奶)DNA纯化技术完美结合应用于阿胶微量DNA提取上。阿胶浆阿胶膏采集量可控制在0.3-0.5ml，阿胶块可控制在0.5-2mg，提取出的DNA浓度高、纯度极好，稳定不易降解。同时提取的DNA可以扩增100-500bp左右的短片段基因序列，所得序列可开展后续的分子生物学分析，如基因克隆，测序，荧光定量检测等。其操作简单、用量少、耗时短，DNA纯度高，不易降解，取样方便、实用，所提取的DNA适用于分子杂交，荧光定量PCR，基因测序等高级别要求的分子生物学实验，为阿胶源性检测奠定基础。
本发明的突出特征在于：利用了SDS消化液结合Chelex-100法来提取阿胶的基因组DNA，尤其符合阿胶蛋白含量高，DNA含量少且高度降解特点。其原因在于：1)SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。2)Chelex-100是一种苯乙烯和苯二乙烯共聚体组成的化学离子螯合树脂，其悬液在碱性环境(PH10-11)和100°的条件下，可导致细胞膜破裂，DNA从细胞核中释放，同时Chelex-100能结合许多可能影响下一步的非核酸物质。由于Chelex-100能有效除去非核酸有机物，并且通过结合金属离子防止DNA降解，具有经济、简便、高效等优点，目前已被广泛用于从微量血液、组织斑块、精斑和骨骼等法医物证检材，目前还没有用于阿胶DNA提取相关文献报道。
本发明的另一个突出特征在于：首次应用玻璃乳快速DNA纯化方法来替代有毒的有机物苯酚氯仿抽提方法。其优点在于：玻璃乳是一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中，核酸是不容的，可被吸附至玻璃基质上，而蛋白质在高盐溶液中是高度溶解的，脂类物质悬浮于溶液表面，从而起到纯化分离DNA的作用。
附图说明
图1为提取阿胶膏、阿胶浆、阿胶羹DNA的驴源成分的线粒体16SrRNAPCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中从左到右依次为：DNAMarker、阿胶膏、复方阿胶浆、阿胶补血口服液、阿胶羹、阴性对照、阳性对照(驴肉)、DNAMarker。
图2对阿胶中驴源成分的线粒体16SrRNA部分基因序列的PCR扩增产物测序结果及比对结果
具体实施方式
一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒，包括细胞消化液(溶液A)、5％的Chelex-100(溶液B)、GlassMilk、gDNABindingBuffer(溶液C)、TE缓冲液(溶液S)、75％的酒精、及蛋白酶K。
实施例1.以各种类型的市售阿胶，复方阿胶浆(1)、阿胶补血口服液(2)、阿胶膏(3)和即食阿胶羹(4)四种常见的阿胶产品为材料，按照以下步骤提取DNA:
步骤一，试剂配制及实验器材准备：消化缓冲液配制，准备2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；
步骤二，用消化液消化分解蛋白：取复方阿胶浆(F)、阿胶补血口服液(E)、和阿胶膏(S)和即食阿胶羹四种常见的阿胶产品，用移液枪各吸取200-300ul液体至2ml无菌离心管中，取0.3-0.5mg食阿胶羹，液氮研磨成粉末状至2ml无菌离心管中，并向其中加入400ul细胞消化液(溶液A)，加入380μl5％的Chelex-100(溶液B)，然后置于50-60度水浴中保温，期间不时轻轻搅拌混匀，直到胶状状物全部溶解，待溶液冷却至室温后，加入20mg/ml蛋白酶K20μl，混匀，56℃放置1h，期间不时轻微摇匀。
步骤三，核酸释放：高速震荡5-10s，100℃，8min；
步骤四，核酸纯化：12000rpm，离心10min，吸取上清转至新的EP管中，加入等体积氯仿(约1ml)，充分混匀，12000rpm离心10min，小心将上清转至新的EP管中；向收集液体中加入GlassMilk5μl,加600ulgDNABindingBuffer(溶液C)，充分混匀，65℃水浴15min，中间要反转几次；室温放置5min，中间要反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底；70％酒精500μl洗涤8000r/min离心1min，重复此步骤2次；加入500μl无水乙醇，；吹打悬浮，洗涤8000r/min离心1min，弃上清；8000r/min离心30S，用10μl枪头吸走残余液体，室温干燥10min。
步骤五，洗脱DNA:加50μlTE缓冲液(溶液S，PH7.0)，70℃5min水浴，12000rpm，离心1min，吸取上清转移至新的离心管中，-20℃保存。
步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，如表1所示：
| 阿胶样品 | 编码 | Sample Type | OD260/280 | 浓度(ng/μl) |
| 复方阿胶浆 | a | dsDNA | 1.897 | 50.3 |
| 阿胶补血口服液 | b | dsDNA | 1.797 | 59.5 |
| 阿胶膏 | c | dsDNA | 1.918 | 118.9 |
| 即食阿胶羹 | d | dsDNA | 1.817 | 70.6 |
所获得的基因组DNA浓度值处于45-100ng/μl之间，纯度OD260/280值处于1.8-2.0之间，通过本发明所提取的各种类型的奶的基因组DNA的纯度及浓度都能达到要求，但在不同类型产品中浓度差异明显，原因在于不同种类的阿胶所含DNA含量不同所致。
实施例2.普通PCR检测DNA提取效果
本实例利用本发明提取的复方阿胶浆(a)、阿胶补血口服液(b)、和阿胶膏(c)和即食阿胶羹(d)4种类型阿胶作为模板，选择线粒体16SrRNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计驴的特异性通用引物，进行PCR扩增，检测扩增效果。
1、引物序列：
正向引物：AAGACGAGAAGGGAACCCTTGGAC
反向引物：GCGCTGTTTAATCCCCATAGG
2.PCR反应
(1)以4种类型阿胶DNA、驴肉DNA阳性对照作为模板进行PCR扩增，25μl反应体系中包括以下溶液或试剂：
(2)经过梯度PCR摸索实验条件，最终确定退火温度采用60℃，PCR反应条件如下：
95℃热变性3-5min一个循环；95℃30-50S,60℃30S，72℃30S共35个循环；72℃10min；16℃保存。
3.共选择4种DNA样品作为扩增模板进行PCR扩增。PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。片段长度为230bp，无论是那种类型的阿胶都能很好的扩增，见图1。
4.PCR产物测序
将上述5种PCR产物经切胶纯化后，使用上述PCR的引物进行正反双向测序，得到的序列拼接后，与NCBI数据库Blast比对，结果与驴的16SrRNA基因序列均一致，说明按照本发明从阿胶中提取的DNA可以满足基因测序高纯度级别的要求，其测序比对结果见图2。
Claims (1)
1.一种快速从阿胶中提取DNA的方法，其特征在于具体实施步骤如下：
步骤一，试剂配制及实验器材准备：消化液、缓冲液配制，准备2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；
步骤二，用消化液消化分解蛋白：用移液枪吸取200-300μl的阿胶浆至2ml无菌离心管中；或称取0.3-0.5mg即食阿胶羹，液氮研磨成粉末状至2ml无菌离心管中，分别向离心管中加入400μl细胞消化液，加入380μl5%的Chelex-100，然后置于50-60℃水浴中保温，期间不时轻轻搅拌混匀，直到胶状物全部溶解；待溶液冷却至室温后，加入20μl20mg/ml蛋白酶K，混匀，56℃放置1h，期间不时轻微摇匀；
步骤三，核酸释放：高速震荡5-10s，100℃8min；
步骤四，核酸纯化：12000rpm，离心10min，吸取上清转至新的离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min，小心将上清转至新的离心管中；向收集液体中加入GlassMilk5μl，加600μlgDNABindingBuffer，充分混匀，65℃水浴15min，中间反转几次；室温放置5min，中间反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底沉淀；70%酒精500μl，洗涤，8000r/min离心1min，重复此步骤2次；加入500μl无水乙醇；吹打悬浮，洗涤，8000r/min离心1min，弃上清；8000r/min离心30s，用10μl移液器吸走残余液体，室温干燥10min；
步骤五，洗脱DNA:加50μlpH7.0的TE缓冲液，70℃水浴5min，12000rpm，离心1min，吸取上清转移至新的离心管中，-20℃保存；
步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度；
步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计驴和马的特异性通用引物；
步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；
步骤九，基因序列比对：将测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，进行后续的分子生物学分析；
其中所述细胞消化液的组成：由10mMTris-HCl，25mMEDTA，100mMNaCl，0.5%SDS构成，pH为8.0；
5%的Chelex-100的配制：称取5gChelex-100，用灭菌的ddH2O定容至100ml；
gDNABindingBuffer的组成：6MNaI。
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