CN101270357A - 一种从深度加工型中药或中药材中提取dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，包括步骤：a)用消化液对所述深度加工型中药或中药材进行预处理，利用0.5％SDS及蛋白酶K消化，使所述深度加工型中药或中药材中的大量胶原蛋白降解，少量DNA则被完全释放溶解于所述消化液中，获得预处理液；b)采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述预处理液中的DNA，该方法快速、简便、可靠、效率高，特别适合因深度加工而导致核酸含量极少、片段极短的胶类中药，获得的DNA能够用于后续常规分子生物学操作，为利用DNA生物学鉴定技术实现胶类中药的鉴别提供基础。

Description

一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法
技术领域
本发明涉及中药技术领域，更具体地，涉及中药中的DNA提取技术领域，特别是指一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，非常适合于深度加工型产品，尤其是因深度加工而导致DNA含量极少，片段极短的中草药或中草药材，更尤其是由动物皮、骨熬炼，精制而成的胶类中药或中药材。
背景技术
我国传统中药博大精深，可用作中药的物质种类繁多，其中有一类是利用动物皮、骨熬制而成的胶类中药，包括阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶等。这些胶类中药往往十分名贵，是滋阴潜阳、增强体质的上乘佳品。
阿胶作为一种传统名贵中药，有着2000多年的历史。早在东汉时期的著名医药著作《神农本草经》中就被列为“上品”，并记载“久服益气轻身”。魏晋时期的药物学集成《名医别录》中记载阿胶“出东平郡，东阿县”。南北朝梁武帝时期陶弘景在《本草经集注》中记载，“阿胶出东阿，故名阿胶”。阿胶性甘，平，其功能主要补血滋阴，润燥、止血。用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，劳嗽唠血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏，这些功能在《本草纲目》中有详细记载。据2005年版的中国药典记载，阿胶本品为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。无论是古代还是现代，阿胶都享有很高的声誉。
黄明胶又称牛皮胶，为黄牛皮熬制而成。历史上也曾经使用牛皮熬制阿胶，发展到现在，阿胶则以驴皮熬制为贵。黄明胶与阿胶一样，同样具有养血止血的功效，治疗诸血症尤有特效。
据2005年版中国药典记载，龟甲胶及鹿角胶等名贵中药分别是用龟甲及鹿角经水煎煮浓缩制成的固体胶。其中龟甲胶性咸、甘、凉，能够滋阴，养血，止血，用于阴虚潮热，骨蒸盗汗，腰膝酸软，血虚萎黄，崩漏带下；而鹿角胶性甘、咸、温，能够温补肝肾，益精养血。用于肝肾不足所致的腰膝酸冷，阳痿遗精，虚劳羸瘦，崩漏下血，便血尿血，阴疽肿痛。
由此可见，胶类中药主要用于调节身体机能，滋阴潜阳，增强体质，并且对肾虚，贫血病人具有很好的疗效。因此，该类中药在整个中药市场上占有重要的位置，深受消费者的青睐。
然而，随着胶类中药市场的不断发展，随着熬胶原料供应的紧张和原料价格的上涨，一些不法分子趁虚而入，制造假冒伪劣产品来迷惑消费者，扰乱市场的正常秩序。以阿胶为例，国家药典规定正品阿胶应该由驴皮熬制而成，然而不法分子则变相压低成本，在制备阿胶过程中，部分或全部掺入其他的动物皮，例如马皮、牛皮、猪皮或其它动物杂皮进行熬制。通过这种方式熬制而成的‘伪品阿胶’在外观及质地上都与正品阿胶极其相似，并且价格低廉，因此，这类‘伪品’对消费者而言很具有迷惑性。但是，从功用上来看，它们则没有显著的疗效，并且还很可能对人体有害。因此，这些伪品的存在对整个阿胶中药市场的危害是相当大的，不仅损害了消费者的利益，还败坏了传统中药的名声。再例如黄明胶、龟甲胶等，也存在这种类似的情况。总而言之，这些伪劣产品严重破坏了我国传统中药的形象损害了消费者的健康，不利于我国中药事业的健康发展。因此，为了保护我国的传统胶类中药以至于整个中药产业，我们急需建立一种高效、可靠的针对这种深度加工型胶类中药的鉴定方法，将市场上的假冒伪劣产品与正品进行区分。
传统的鉴别胶类物质真伪的方法主要是通过对产品的外观，颜色，气味等的考察来实现的。一方面，这些方法的应用很多都是凭经验进行判断，不仅掌握困难，误判率高，并且在判断过程中存在大量的人为主观因素；另一方面，‘伪品胶类物质’相对正品而言，只是在制作原料上存在差异，成品之间则无论是外观或是质地方面的差异都并不显著。因此，传统的鉴别胶类物质真伪的方法很难有效的打击胶类中药市场上的伪品。
然而，随着生物学技术的不断发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，包括各种分子标记的使用等，这种基于DNA的生物学鉴定方法往往准确性高，重复性好，相对于传统方法而言更具科学性，更能适应实际应用的需要。目前这一技术已经广泛的应用于司法鉴定、食品饲料检测、进出口检验等领域，已经为人们所广泛接受。与此同时，基于DNA的生物学鉴定方法也被成功应用于中药鉴定领域，例如对蛇类药材的PCR鉴定等。因此，针对传统胶类中药鉴别手段相对落后的现状，一种基于DNA的高效，便捷的生物学鉴别方法的建立将极大的促进整个胶类中药市场的防伪打假工作。
利用基于DNA的生物学鉴定技术来进行胶类中药的鉴定，所面临的最大问题在于如何从这种深度加工型中药中提取得到DNA。一方面，由于胶类中药在整个制备过程中，往往经过泡碱水、高温高压蒸煮等操作，其DNA被严重破坏，并且大量损失，因此成品中所含有的DNA含量极少，片段极短，如何富集这些仅有的少量DNA片段是提取胶类物质DNA过程中所必须面临的一个挑战；另一方面，胶类中药中最主要的成分是各种胶原蛋白等肽段，这些蛋白的存在必然对DNA提取和纯化工作造成严重的干扰，如何克服这些大量存在的蛋白质对DNA提取的影响是整个胶类物质DNA提取过程中所必须面临的另一个挑战。此外，我们提取所得到的胶类物质DNA还应该能够达到一些包括PCR在内的常规分子生物学操作的要求，以便于后续鉴定。
由于胶类物质的特殊性，它的少量的短片段DNA混杂于在大量的胶原蛋白肽段中，因此，从胶类物质中成功提取得到能进行后续分子生物学操作的DNA的难度是相当大的。事实上目前国内外还没有任何成功从胶类物质中提取出DNA的相关报道。一些常规的用于核酸提取的方法在胶类物质DNA提取过程中各自有其局限性。例如常规传统的酚/氯仿抽提方法，这种方法利用酚使得蛋白及各种肽段变性，经过萃取操作以后，蛋白聚集在水相和有机相的中间层，然后将水相取出，从而达到将核酸与蛋白分离的目的。对普通的生物制品而言，它们的蛋白含量是有限的，经过几次简单的酚抽提，人们可以方便的除去这些制品中的蛋白，因此利用这种方法，人们能够快速高效提取得到普通生物制品中的DNA。然而，胶类中药是一种深度加工的产品，其中含有大量的胶原蛋白(一般超过总重量的80％)和极少量的破坏严重的DNA，在提取DNA过程中，这种特殊生物制品仅仅依靠几次常规酚/氯仿抽提操作是无法除尽其中含有的大量蛋白的。为了除去大量蛋白，人们往往会增加酚抽提次数，然而这种简单的做法势必造成样品中DNA的大量损失，因此常规酚/氯仿抽提方法并不适用胶类物质DNA的提取。再例如碱裂解法，这种方法是利用碱性条件对蛋白的破坏作用来除去样品中的蛋白，当样品中仅仅含有少量蛋白时，这种方法是便捷、有效的，但是当样品例如胶类中药中含有大量蛋白时，利用该法就很难达到除尽蛋白的目的，所得到的DNA提取液也势必蛋白含量高，影响后续的分子生物学操作。再例如CTAB法，这种方法主要应用于植物细胞DNA的提取，因为CTAB能够与DNA形成复合物，而这种复合物在高盐浓度环境下是溶解的，转到低盐浓度环境下，这种复合物析出，通过这种转换，就能够实现样品DNA与蛋白类及多糖类物质的分离。这种方法如果用在胶类物质DNA提取上，其局限性与之前的2种方法是类似的，胶类物质所含有的大量蛋白会严重干扰CTAB与DNA复合物的形成，并且在通过离心操作分离复合物的过程也会混杂大量的蛋白，试验证明，利用这种方法我们同样很难提取出胶类中药的DNA。再例如硅材料吸附法，包括硅材料膜，硅材料树脂等，这种材料的表面电荷在高离子序溶液中会发生重组，从而能够吸附DNA分子。这种吸附作用与溶液pH密切相关，一般而言，中性偏酸性环境有利于DNA的吸附，而中性偏碱性环境则有利于DNA的解吸。目前，常用的高离子序溶液有盐酸胍、异硫氰酸胍、高氯酸钠等，在这种溶液环境下，肽段将大量变性，人们就可以通过硅材料对DNA的吸附、解吸作用来实现DNA的富集。但是同样的，胶类中药蛋白含量极高，大量的蛋白会对整个硅材料对DNA的吸附造成严重的干扰，如果在提取过程中不对胶类物质做一些预处理，首先除去部分蛋白的话，直接利用这种方法同样很难顺利提取出胶类中药的DNA。此外，利用这种方法所采用的高离子序溶液也十分关键，有研究表明，不同的溶液环境下，硅材料吸附DNA的性质是不同的，在某些溶液环境下，硅材料可能比较适合于吸附大片段核酸分子，但在另一些溶液环境中，硅材料可能就比较适合于吸附小片段的核酸分子。对于胶类中药这种深度加工的产品，其DNA含量极少，并且破坏极其严重，它所包含的显然都是一些小分子的DNA片段，因此选用一种有利于小分子DNA吸附的溶液环境是非常重要的。
可以发现，单纯使用目前存在的任何一种常用的DNA提取方法来提取胶类中药中的核酸，我们也许能够得到少量的DNA样品，但是想继续应用于后续的分子生物学检测是非常困难的，事实上，如果直接采用目前市面上的各种国内外DNA提取商业化试剂盒进行阿胶DNA提取，我们同样也很难得到能够满足后续检测要求的DNA样品。因为不可避免的，这些方法本身都没能有效的针对胶类中药中蛋白含量极高，DNA含量低，片段短的特点。因此，要建立一种能够应用于后续分子生物学操作的胶类中药DNA提取方法就必须在现有基础上，对这些常规方法包括商业化试剂盒的方法进行一些必要的，有针对性的调整和改进。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，该方法快速、简便、可靠、效率高，特别适合因深度加工而导致核酸含量极少、片段极短的胶类中药，获得的DNA能够用于后续常规分子生物学操作，为利用DNA生物学鉴定技术实现胶类中药的鉴别提供基础。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，其特点是，包括下列步骤：
a)用消化液对所述深度加工型中药或中药材进行预处理，使所述深度加工型中药或中药材中的大量胶原蛋白降解，少量DNA则被完全释放溶解于所述消化液中，获得预处理液；
b)采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述预处理液中的DNA。
所述预处理包括粉碎所述深度加工型中药或中药材成颗粒，加入所述消化液，所述消化液弱碱性且含有SDS，搅拌加热溶解所述颗粒，加入蛋白酶进行消化，所述抽提方法是硅材料吸附法。
所述消化液是Tris·EDTA溶液，pH为6～9，所述硅材料吸附法中采用了针对短片段核酸吸附的高离子型溶液。
所述消化液的pH为8.0，含有10mmol/L Tris-HCl、25mmol/L EDTA、100mmol/LNaCl和0.5％SDS，所述高离子型溶液是PN缓冲液，所述蛋白酶是蛋白酶K。
在所述步骤a)和所述步骤b)之间，还包括步骤：加入除油脂试剂进行萃取，除去所述处理液中含有的大量油脂。
所述除油脂试剂是正己烷。
上方法在提取所述深度加工型中药或中药材的DNA中的应用。
所述深度加工型中药或中药材是因深度加工而导致DNA含量极少，片段极短的中草药或中草药材。
所述深度加工型中药或中药材是由动物皮、骨熬炼、精制而成的胶类中药或中药材。
采用本发明的方法，通过预处理，在尽量不损伤DNA的前提下，使用了含有SDS的Tris·EDTA溶液溶解，并用蛋白酶消化，降解胶类中药中所存在的大量胶原蛋白，若其中含有较多油脂，可加入除油脂试剂萃取其中的大量油脂，将其中的DNA完全释放出来，然后再根据胶类中药中DNA分子在经过各种处理之后含量极少，并被大量降解成小片段的特点，以及为了减少过多提取步骤对DNA造成的损失，采用硅材料吸附法对该DNA进行富集，并且在吸附过程中采用主要针对短片段核酸吸附的高离子型溶液，在这种溶液环境下，硅材料对小分子DNA吸附效率较高。最终，通过硅材料对DNA的吸附与解吸，成功提取得到了胶类中药的DNA。所得到的DNA能够适用于一些常规的分子生物学操作包括PCR、酶切等，以便于利用DNA生物学鉴定技术来鉴定这些深度加工的胶类中药产品。该方法快速、简便、可靠、高效率地从深度加工而导致核酸含量极少、片段极短的胶类中药中提取DNA，尤其是从由各种动物皮、骨熬制而成的各种胶类中药包括阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶等中提取DNA。
附图说明
图1是采用本发明的方法从阿胶中提取的DNA的马科动物基因组特异性SINE序列ERE-1的PCR扩增结果。其中1.DNA Marker；2.驴肉基因组DNA阳性对照；3.阿胶提取DNA；4.空白对照。
图2是采用本发明的方法从黄明胶提取的DNA的反刍动物基因组特异性SINE序列Bov-A2的PCR扩增结果。其中1.DNA Marker；2.牛肉基因组DNA阳性对照；3.黄明胶提取DNA；4.空白对照。
图3是采用本发明的方法从猪皮胶提取的DNA的猪科动物基因组特异性SINE序列PRE-1的PCR扩增结果。其中1.DNA Marker；2.猪肉基因组DNA阳性对照；3.猪皮胶提取DNA；4.空白对照。
图4是采用本发明的方法从龟甲胶提取的DNA的陆龟超科基因组特异性SINE序列polIII/SINE的PCR扩增结果。其中1.DNA Marker；2.龟基因组DNA阳性对照；3.龟甲胶提取DNA；4.空白对照。
图5是采用本发明的方法从鹿角胶提取的DNA的反刍动物基因组特异性SINE序列Bov-A2的PCR扩增结果。其中1.DNA Marker；2.牛肉基因组DNA阳性对照；3.鹿角胶提取DNA；4.空白对照。
图6是用乙醇沉淀法从阿胶提取DNA的马科动物基因组特异性SINE序列ERE-1的PCR扩增结果。其中1.驴肉基因组DNA阳性对照；2.阿胶提取DNA；3.空白对照；4.DNA Marker；5.驴肉基因组DNA阳性对照；6.阿胶提取DNA；7.空白对照。
具体实施方式
本发明的方法的具体步骤如下：
1、胶类中药的预处理：将胶块锤击成颗粒状，取出若干加入一只50ml无菌离心管中，并向其中加入消化缓冲液，该缓冲液pH 8.0，由10mmol/L Tris-HCl，25mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl，0.5％SDS构成，然后将离心管置于50℃-60℃水浴中保温，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。待溶液冷却至室温后，加入蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1小时，其间不时轻微摇匀。对于含脂肪较多的样品，如猪皮胶，可在混和液上柱吸附操作之前于混和液中加入除油脂试剂进行萃取，除去样品中含有的大量油脂。
2、胶类中药DNA的提取：向上述阿胶预处理液中加入PN缓冲液，混匀，分若干次加入硅吸附柱中，离心，将溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱中加入PE缓冲液洗涤吸附柱膜，除去附着在膜上的少量蛋白及脂类物质，完毕之后用热的pH 8.0的TE缓冲液将吸附柱膜上的DNA洗脱收集下来并置于-20℃保存。提取得到的DNA可用紫外分光光度法定量，并进行后续的PCR操作。
上述提取操作过程中所用试剂、耗材皆来自商业化试剂(德国QIAGEN公司)，包括PN缓冲液(Cat.No.19071)、PE缓冲液(Cat.No.19065)、硅吸附柱(Cat.No.28304)。
本方法简便，快捷，有效，能够从各种深度加工的胶类中药中顺利提取出DNA，并且能够进行后续分子生物学常规操作，能够满足实际中药生物学鉴定的要求。
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。
下述实施例涉及到的材料和试剂、DNA提取、定量、扩增及电泳条件如下：
1.材料和试剂
材料：各种市场所售各类动物皮、骨等熬制而成的胶类中药，用作阳性对照的各种动物的基因组DNA溶液(1ng/μL)。
提取试剂：
消化缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％SDS，高压灭菌；
TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA，高压灭菌；
PN缓冲液：(产于德国QIAGEN，Cat.No.19071)；
PE缓冲液：(产于德国QIAGEN，Cat.No.19065)；
吸附柱：(产于德国QIAGEN，Cat.No.28304)；
蛋白酶K溶液：20mg/ml(产于日本TAKARA，Cat.No.D9033)；
Premix Taq
Figure A20081003444700091
(Premix Ex TaqTM Hot Start Version)：(产于日本TAKARA，Cat.No.DRR030A)；
DNA荧光染料10000×GelRedTM：DNA荧光染料(产于Biotium，Cat.No.41000)。
2.DNA提取的流程
1)将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。
2)取1g粉碎胶样，加入1ml的消化缓冲液，在60ml离心管中，封口50-60℃水浴中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。
3)待冷却至室温后加入50μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1h，其间不时轻微摇匀。
4)加入10ml PN缓冲液，混和均匀。
5)*取混和液700μl至吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
6)重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)
7)加入500μl PE缓冲液于吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
8)重复7操作2次。
9)将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。
10)将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5min干燥。
11)加入100μl预热(70℃)TE缓冲液(pH 8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置5min。
12)13000g常温离心1min，取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置1min。
13)13000g常温离心2min，取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20℃保存备用。
*对于含脂肪较多的样品，如猪皮胶，可在混和液上柱吸附操作之前于混和液中加入除油脂试剂进行萃取，除去样品中含有的大量油脂。
3.制备DNA的核酸定量
将所提取胶类中药DNA进行核酸定量，利用紫外分光光度法检测其OD260确定浓度，并且根据OD260/OD280值来考察所提取DNA样品纯度。将所提取的胶类中药DNA稀释至10ng/μl备用。
4.制备DNA的PCR检测，确定其来源并且考察其是否可用于PCR反应，下面的试验方法以阿胶、黄明胶、猪皮胶以及龟甲胶为例，试验方法和条件具体如下：
A)引物设计
根据马科动物(Equidae)SINE序列ERE-1设计，理论目标条带大小81bp，用于检测阿胶中DNA。其序列如下：
上游引物Ass up：5’-CGGACATGGCACTGCTCAT-3’
下游引物Ass down：5’-TATATTCTTCGTTGTGGGTCCTTCT-3’
根据反刍亚目动物(Ruminantia)SINE序列Bov-A2设计引物，理论目标条带大小70bp，用于检测黄明胶中DNA。其序列如下：
上游引物Rum up：5’-AGAAGGCAATGGCAACCCAC-3’
下游引物Rum down：5’-AACCCACCAGGCTCCTCTGT-3’
根据猪科动物(Suidae)SINE序列PRE-1设计引物，理论目标条带大小88bp，用于检测猪皮胶中DNA。其序列如下：
上游引物Pig up：5’-CGAATCCGACTAGGAACCA-3’
下游引物Pig down：5’-ACCACATCTCACGGCTACG-3’
根据陆龟超科动物(Testudinoidea)SINE序列polIII/SINE设计引物，理论目标条带大小72bp，用于检测龟甲胶中DNA。其序列如下：
上游引物Turtle up：5’-GAGCATTGGCCTGCTAAACC-3’
下游引物Turtle down：5’-TTTTGCCCCAGATCCCTAAA-3’
B)PCR反应体系
反应体系中各试剂用量根据反应体系的总体积进行适当调整。以检测阿胶、黄明胶、猪皮胶以及龟甲胶中DNA为例，PCR检测参考反应体系如下：
检测阿胶提取DNA：
25μl PCR反应体系：Premix Taq
Figure A20081003444700111
12.5μl、Ass up(10μmol/l)0.5μl，Ass down(10μmol/l)0.5μl，*模板DNA(10ng/μL)5-10μl、无菌超纯水补足反应体系，使总体积为25μl。
*：阳性对照样品中的DNA模板(1ng/μL)用量0.5-1μl。
检测黄明胶提取DNA：
25μl PCR反应体系：Premix Taq12.5μl、Rum up(10μmol/l)0.5μl，Rum down(10μmol/l)0.5μl，*模板DNA 5-10μl、无菌超纯水补足反应体系，使总体积为25μl。
*：阳性对照样品中的DNA模板量(1ng/μL)用0.5-1μl。
检测猪皮胶提取DNA：
25μl PCR反应体系：Premix Taq
Figure A20081003444700113
12.5μl、Pig up(10μmol/l)0.5μl，Pig down(10μmol/l)0.5μl，*模板DNA 5-10μl、无菌超纯水补足反应体系，使总体积为25μl。
*：阳性对照样品中的DNA模板量(1ng/μL)用0.5-1μl。
检测龟甲胶提取DNA：
25μl PCR反应体系：Premix Taq12.5μl、Turtle up(10μmol/l)0.5μl，Turtle down(10μmol/l)0.5μl，*模板DNA(10ng/μl)5-10μl、无菌超纯水补足反应体系，使总体积为25μl。
*：阳性对照样品中的DNA模板量(1ng/μL)用0.5-1μl。
C.PCR反应条件
以分别检测阿胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶DNA的PCR反应为例，它们的反应条件是类似的：
阿胶DNA检测：变性：94℃6min；扩增：94℃30s，60℃30s，72℃30s(40循环)；最后延伸：72℃7min
黄明胶DNA检测：变性：94℃6min；扩增：94℃30s，50℃30s，72℃30s(40-50循环)；最后延伸：72℃7min
猪皮胶DNA检测：变性：94℃6min；扩增：94℃30s，50℃30s，72℃30s(30循环)；最后延伸：72℃7min
龟甲胶DNA检测：变性：94℃6min；扩增：94℃30s，50℃30s，72℃30s(40-50循环)；最后延伸：72℃7min
D.电泳条件
用1×TAE电泳缓冲液制备2.5％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料GelRedTM。按照比例将10μl的PCR产物与上样缓冲液均匀混合，加入凝胶孔中，所用的DNA marker为20bp DNA Ladder Marker(日本TAKARA，Cat.No.D521A)，点样5μl于凝胶孔中电泳。选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照。
实施例1提取阿胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测
以市售阿胶(山东东阿阿胶股份有限公司)为材料，采用下述方法提取其中的DNA。
1)将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。
2)取1g粉碎胶样，加入1ml的消化缓冲液，在60ml离心管中，封口50-60℃水浴中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。
3)待冷却至室温后加入50μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1h，其间不时轻微摇匀。
4)加入10ml PN缓冲液，混和均匀。
5)取混和液700μl至吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
6)重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)
7)加入500μl PE缓冲液于吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
8)重复7操作2次。
9)将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。
10)将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5min干燥。
11)加入100μl预热(70℃)TE缓冲液(pH 8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置5min。
12)13000g常温离心1min，取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置1min。
13)13000g常温离心2min，取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20℃保存备用。
利用核酸定量仪对所提取的阿胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及纯度。浓度为21.0ng/μl，OD260/OD280为1.26。由此可见，从1g阿胶样品中成功提取得到DNA。
用传统方法提取的驴肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增马科动物特异性SINE序列ERE-1的引物，以本方法提取的阿胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图1。
由图1，从阿胶中提取的DNA，利用扩增马科动物特异性DNA序列ERE-1的引物进行PCR扩增，所得扩增片段与对照驴肉基因组的扩增片段大小完全一致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到阿胶中的DNA，包括其中因深度加工而含量极少、片段极短的驴源性成分DNA，并且能完全满足后续PCR检测的要求。
实施例2提取黄明胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测
以市售黄明胶(山东东阿阿胶股份有限公司)为原料采用下述方法提取其中的DNA。
1)将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。
2)取1g粉碎胶样，加入1ml的消化缓冲液，在60ml离心管中，封口50-60℃水浴中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。
3)待冷却至室温后加入50μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1h，其间不时轻微摇匀。
4)加入10ml PN缓冲液，混和均匀。
5)取混和液700μl至吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
6)重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)
7)加入500μl PE缓冲液于吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
8)重复7操作2次。
9)将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。
10)将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5min干燥。
11)加入100μl预热(70℃)TE缓冲液(pH 8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置5min。
12)13000g常温离心1min，取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置1min。
13)13000g常温离心2min，取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20℃保存备用。
利用核酸定量仪对所提取的黄明胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及纯度。浓度为26.6ng/μl，OD260/OD280为1.35。由此可见，从1g黄明胶样品中成功提取得到DNA。
用传统方法提取的牛肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增反刍亚目动物特异性SINE序列Bov-A2的引物，以本方法提取的黄明胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图2。
由图2，从黄明胶中提取的DNA，在利用扩增反刍亚目动物特异性SINE序列Bov-A2的引物进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照牛肉基因组的扩增片段大小完全一致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到黄明胶中的DNA，包括其中因深度加工而含量极少、片段极短的牛源性成分DNA并且能完全满足后续PCR检测的要求。
实施例3提取猪皮胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测
以山东东阿阿胶股份有限公司研究所利用猪皮熬制的猪皮胶为原料采用下述方法提取其中的DNA。
1)将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。
2)取1g粉碎胶样，加入1ml的消化缓冲液，在60ml离心管中，封口50-60℃水浴中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。
3)待冷却至室温后加入50μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1h，其间不时轻微摇匀。
4)加入10ml PN缓冲液，混和均匀，加入2ml正己烷，轻微颠倒混匀，3000g，4℃离心5min，弃上清，将下层溶液转移到干净的50ml离心管中。
5)取混和液700μl至吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
6)重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。
7)加入500μl PE缓冲液于吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
8)重复7操作2次。
9)将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。
10)将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5min干燥。
11)加入100μl预热(70℃)TE缓冲液(pH 8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置5min。
12)13000g常温离心1min，取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置1min。
13)13000g常温离心2min，取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20℃保存备用。
利用核酸定量仪对所提取的猪皮胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及纯度。浓度为177.6ng/μl，OD260/OD280为1.8。由此可见，从1g猪皮胶样品中成功提取得到DNA。
用传统方法提取的猪肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增猪科动物特异性SINE序列PRE-1的引物，以本方法提取的猪皮胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图3。
由图3，从猪皮胶中提取的DNA，在利用扩增猪科动物特异性SINE序列PRE-1的引物进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照猪肉基因组的扩增片段大小完全一致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到猪皮胶中的DNA，包括其中因深度加工而含量极少、片段极短的猪源性成分DNA，并且能完全满足后续PCR检测的要求。
实施例4提取龟甲胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测
以市售龟甲胶(山东东阿阿胶股份有限公司生产)为原料，采用下述方法提取其中的DNA。
1)将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。
2)取1g粉碎胶样，加入1ml的消化缓冲液，在60ml离心管中，封口50-60℃水浴中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。
3)待冷却至室温后加入50μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1h，其间不时轻微摇匀。
4)加入10ml PN缓冲液，混和均匀。
5)取混和液700μl至吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
6)重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)
7)加入500μl PE缓冲液于吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
8)重复7操作2次。
9)将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。
10)将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5min干燥。
11)加入100μl预热(70℃)TE缓冲液(pH 8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置5min。
12)13000g常温离心1min，取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置1min。
13)13000g常温离心2min，取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20℃保存备用。
利用核酸定量仪对所提取的龟甲胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及纯度。浓度为20.8ng/μl，OD260/OD280为1.45。由此可见，从1g龟甲胶样品中成功提取得到DNA。
用传统方法提取的龟肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增陆龟超科动物特异性SINE序列polIII/SINE的引物，以本方法提取的龟甲胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图4。
由图4，从龟甲胶中提取的DNA，利用扩增陆龟超科动物特异性DNA序列pol III/SINE的引物进行PCR扩增，所得扩增片段与对照龟肉基因组的扩增片段大小完全一致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到龟甲胶中的DNA，包括其中因深度加工而含量极少、片段极短的龟源性成分DNA，并且能完全满足后续PCR检测的要求。实施例5提取鹿角胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测
以市售鹿角胶(山东东阿阿胶股份有限公司生产)为原料，采用下述方法提取其中的DNA。
1)将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。
2)取1g粉碎胶样，加入1ml的消化缓冲液，在60ml离心管中，封口50-60℃水浴中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。
3)待冷却至室温后加入50μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1h，其间不时轻微摇匀。
4)加入10ml PN缓冲液，混和均匀。
5)取混和液700μl至吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
6)重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)
7)加入500μl PE缓冲液于吸附柱中，13000g常温离心1min，弃收集液。
8)重复7操作2次。
9)将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。
10)将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5min干燥。
11)加入100μl预热(70℃)TE缓冲液(pH 8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置5min。
12)13000g常温离心1min，取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置1min。
13)13000g常温离心2min，取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20℃保存备用。
利用核酸定量仪对所提取的鹿角胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及纯度。浓度为16.2ng/μl，OD260/OD280为1.28。由此可见，从1g鹿角胶样品中成功提取得到DNA。
方法以及试剂和实施例2中检测黄明胶时所用条件都是一致的，因为鹿也是属于反刍动物亚目的，因此也可以利用该反刍亚目SINE序列来检测其中的鹿源性成分。即，用传统方法提取的牛肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增反刍亚目动物特异性SINE序列Bov-A2的引物，以本方法提取的鹿角胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图5。
由图5，从鹿角胶中提取的DNA，在利用扩增反刍亚目动物特异性SINE序列Bov-A2的引物进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照牛肉基因组的扩增片段大小完全一致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到鹿角胶中的DNA，包括其中因深度加工而含量极少、片段极短的鹿源性成分DNA并且能完全满足后续PCR检测的要求。
对比实施例：利用酚/氯仿、乙醇沉淀法提取阿胶DNA及PCR检测此方法所用试剂：
乙酸钠溶液：3M PH 5.2
消化缓冲液：50mM Tris-HCl，50mM EDTA，0.5％SDS，PH 8.0
1.将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。
2.取1g粉碎胶样，加入20-25ml的消化缓冲液，在60ml离心管中，封口50-60℃水浴中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。
3.待冷却至室温后加入100-150μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1h，其间不时轻微摇匀。
4.于离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/1体积比)PH 8.0抽提液，漩涡振荡器上强烈振荡10s，使2相充分混合形成乳浊液。室温下5000g离心10-15min。静置分层，收集水相于另一60ml离心管中。
5.重复4操作2次。
6.加入0.1倍体积的乙酸钠溶液以及2倍体积的冰冷乙醇，充分混匀，于-20℃冰箱中放置过夜。
7.取出离心管，于0℃，10000rpm离心30min，用移液管小心吸出上清液
8.加入1ml的70％冰乙醇，轻轻旋转离心管，洗涤沉淀，4℃下10000rpm离心10min，用移液管小心吸出上清液。
9.重复8操作。
10.将离心管于室温下敞口放置在试验台上，直至残留的液体挥发干。
11.将沉淀下来的DNA充分溶解于100μl的TE缓冲液中-20℃保存备用。
利用核酸定量仪对利用常规酚/氯仿，乙醇沉淀法提取的阿胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及纯度。浓度为18.6ng/μl，OD260/OD280为2。由此可见，从1g阿胶样品中我们也能够成功提取得到DNA。
用传统方法提取的驴肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增马科动物特异性SINE序列ERE-1的引物，以本方法提取的阿胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图6，其中，1～3为30个循环的结果，5～7为40个循环的结果。
由图6，利用传统方法从阿胶中提取的DNA，在利用扩增马科动物特异性SINE序列ERE-1的引物进行PCR扩增以后，无法得到任何扩增条带。可见我们利用常规方法得到的DNA中并不包含驴源性成分，所得到的DNA很可能来自阿胶制备后期所添加的辅料包括黄酒、豆油等，而极少量的破坏严重的驴源性DNA利用这种常规方法是无法得到富集的。可见，利用本方法并没能富集得到阿胶中含量极少、片段极短的驴源性成分DNA，并不能够满足后续PCR检测的要求。
上述试验结果表明，本发明的DNA提取方法可以有效提取胶类中药中含量极少的DNA分子，获得的DNA完全能够满足后续的分子生物学检测的需要。
在本发明中，为了防止胶类物质中本来就含量极少的DNA分子在提取过程中再次损失，我们尽量减少萃取操作步骤，并且选择了硅材料吸附法进行DNA的富集。同样的，为了能够顺利富集胶类物质中存在的短片段DNA分子，我们所用的高离子型吸附缓冲液也是精心选择的。又例如，在提取过程初始阶段，我们增加了蛋白酶消化的预处理步骤，使得样品通过预处理之后，一方面DNA分子能够完全释放到缓冲液中，另一方面，样品中包含的大量蛋白也能够被初步消化分解。再例如，为了排除动物胶类物质中可能存在的大量脂质对整个DNA提取过程的干扰，我们在提取过程中还添加除油脂试剂，通过萃取以消除这些物质的影响。
综上所述，为了克服了胶类物质中蛋白含量极高，DNA含量极少，片段极短的困难，顺利制备得到胶类物质中的DNA，建立了一种在现有的各种DNA提取方法基础上进行改进的、新的适合于深度加工的胶类物质DNA提取的技术，并且所提取得到的DNA能够满足后续的分子生物学检测的需要。
因此，本发明的从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法快速、简便、可靠、效率高，特别适合因深度加工而导致核酸含量极少、片段极短的胶类中药，获得的DNA能够用于后续常规分子生物学操作，为利用DNA生物学鉴定技术实现胶类中药的鉴别提供基础。
需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，其特征在于，包括下列步骤：
a)用消化液对所述深度加工型中药或中药材进行预处理，使所述深度加工型中药或中药材中的大量胶原蛋白降解，少量DNA则被完全释放溶解于所述消化液中，获得预处理液；
b)采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述预处理液中的DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括粉碎所述深度加工型中药或中药材成颗粒，加入所述消化液，所述消化液弱碱性且含有SDS，搅拌加热溶解所述颗粒，加入蛋白酶进行消化，所述抽提方法是硅材料吸附法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消化液是Tris·EDTA溶液，pH为6～9，所述硅材料吸附法中采用了针对短片段核酸吸附的高离子型溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消化液的pH为8.0，含有10mmol/LTris-HCl、25mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl和0.5％SDS，所述高离子型溶液是PN缓冲液，所述蛋白酶是蛋白酶K。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤a)和所述步骤b)之间，还包括步骤：加入除油脂试剂进行萃取，除去所述处理液中含有的大量油脂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述除油脂试剂是正己烷。
7.根据权利要求1所述的方法在提取所述深度加工型中药或中药材的DNA中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述深度加工型中药或中药材是因深度加工而导致DNA含量极少，片段极短的中草药或中草药材。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述深度加工型中药或中药材是由动物皮、骨熬炼、精制而成的胶类中药或中药材。
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