CN105132576A - 用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列及对应检测方法 - Google Patents

用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列及对应检测方法 Download PDF

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Abstract

一种用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列，包括tetO-F、tetO-R和tetO-F-GC；以及一种采用如上引物序列进行水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分类检测方法，通过所提供引物序列进行PCR扩增及变性梯度凝胶电泳技术，来达到分类检测tetO序列的目的。本发明通过设计引物，将PCR-DGGE技术应用于tetO序列的分类鉴定，较传统方法省去了DNA的分离纯化、载体连接及转化、阳性克隆的筛选、序列大量测序等耗工耗时耗费高的步骤，同时能得到样本中较全面的tetO序列信息，使整个操作变得简单、快速、节省成本。

Description

用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列及对应检测方法
技术领域
本发明涉及水体及沉积物中DNA提取技术、PCR扩增技术、变性梯度凝胶电泳技术及传统测序技术领域，更具体地涉及一种用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列及对应检测方法，以最终达到分离鉴定不同tetO序列的目的。
背景技术
抗生素是在低浓度下，能选择性地抑制或杀伤它种微生物或肿瘤细胞的微生物次级代谢产物和采用化学或生物学等方法制得的同类化合物与结构修饰物。抗生素广泛应用于医药业和畜禽养殖业。近年来，抗生素的家庭性及医源性使用量大幅增加。由于机体服用的抗生素仅有约25％左右被机体吸收消化，大部分以原化学态随排泄物排出，使大量未及消化的抗生素随污水直接排放到环境中。在环境中残留的抗生素除了具有直接的生物毒性外，更可以促进抗药细菌在环境中的累积及抗药基因的传播，使携带有抗生素抗性基因的细菌最终进入食物链进入人体内，就会引发无法治愈的细菌性疾病，给人类的健康带来严重的威胁。抗生素在环境中的各种传播途径中，以水体传播途径的距离长、范围广，给周围环境带来的危害大，因此，对水体及沉积物中进行抗性的检测和定量及风险评估，具有十分重要的意义。
四环素类抗生素是最早开发的广谱抗生素，已有半个多世纪的应用历史。近年来其向环境水体中的排放量日益升高，在养殖场废水中的最高浓度可达90μg/L，同时由于其不断排放所造成的环境选择压力，使环境水体中的四环素类抗性基因污染日益严重。核糖体保护机制、外排泵机制和酶学修饰机制是微生物抵抗四环素类抗生素侵扰的三种主要途径，而有相关报道指出，核糖体保护机制相关的四环素类抗性基因在水体中占有优势，其中tetO丰度较高。
据现有的研究结果显示，tetO基因存在一定的多样性，不同种菌所含的tetO序列存在一定差异。然而目前对于tetO基因的检测技术，有常规的PCR定性方法，也有基于荧光染料的定量PCR方法，但当在样本中混杂有多种tetO基因时，上述方法均不能有效地对多种tetO基因进行有效地分类鉴定。传统的通过连接转化来扩增基因至载体细菌中，再通过蓝白斑筛选、挑取大量阳性克隆并测序的方法虽然能够达到全面分析样本中不同基因的目的，但操作费时费力、后期分析费用较高，因此并不常用。
变性梯度凝胶电泳技术(denaturedgradientgelelectrophoresis，以下简称DGGE)是一种基于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的DNA分离技术，在含有浓度线形递增的变性剂(尿素和甲酰胺的混合物)的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，可将长度相同但碱基排列不同的双链DNA分离开来。DGGE技术由于其重复和操作简单等特点，已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。因此，采用DGGE技术对环境样本中的tetO基因进行分类鉴定，不仅能够得到样本中完整的tetO序列信息，而且能够根据所获信息分析其来源，对于研究tetO基因在环境中的传播及溯源、并进一步控制其传播具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列，再一目的在于提供一种水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分类检测方法，达到对于样本中不同tetO基因分离鉴定的目的。
为了实现上述目的，本发明研制了扩增不同tetO基因的通用引物，引物名称分别为tetO-F、tetO-R和tetO-F-GC，使用tetO-F和tetO-R可扩增tetO基因可变区的基因片段，使用tetO-F-GC和tetO-R可扩增带有GC夹子的tetO基因可变区基因片段。序列如下：
tetO-F：5’-3’CGTTATTTCCCGTTTATC；
tetO-R：5’-3’ATCGTTGTTTGGAGCATA；或者
tetO-F-GC：5’-3’CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG-GGCACGGGGGGCGTTATTTCCCGTTTATC。
本发明研制了一种扩增并分离鉴定水体及沉积物样本中不同tetO基因的方法，其具体方案如下：
1.提取水体及沉积物总DNA；
2.以tetO-F-GC和tetO-R为引物，使用PCR方法扩增带有GC夹子的tetO基因可变区基因片段；
3.将所得到的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳；
4.对电泳后的凝胶进行染色、切下含有分离tetO基因片段的凝胶，浸提其中的DNA分子；
5.以浸提液为模板，以tetO-F-和tetO-R为引物，重新扩增其中的序列，以DNA测序仪进行测序，再通过序列比对分析以检测其种类。
本发明通过设计引物，将PCR-DGGE技术应用于水体及沉积物样本中tetO序列的分类鉴定中，较传统方法省去了DNA的分离纯化、载体连接及转化、阳性克隆的筛选、序列大量测序等耗工、耗时、耗费较高的步骤，同时能够得到样本中较为全面的tetO序列信息，使整个操作过程变得简单、快速、节省成本，也为开发其他相关抗生素抗性基因的分类分析提供借鉴。
附图说明
图1是本发明的分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的方法的操作流程图；
图2是通过本发明设计的引物应用于实际样本中的扩增结果DGGE电泳图谱；
图3是对应于图2中所得四环素抗性基因tetO序列通过测序并BLAST比对后建立的Neighbour-Joining系统发育树。
具体实施方案
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明公开了几种扩增不同tetO基因的通用引物，包括正向引物(tetO-F-GC和tetO-F)和反向引物(tetO-R)，使用tetO-F和tetO-R可扩增tetO基因可变区的基因片段，使用tetO-F-GC和tetO-R可扩增带有GC夹子的tetO基因可变区基因片段。序列如下：
tetO-F：5’-3’CGTTATTTCCCGTTTATC；
tetO-R：5’-3’ATCGTTGTTTGGAGCATA；以及
tetO-F-GC：5’-3’CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG-GGCACGGGGGGCGTTATTTCCCGTTTATC。
此外，本发明还公开了一种扩增并分离鉴定水体及沉积物样本中不同tetO基因的方法，包括以下步骤：
1.提取水体及沉积物的总DNA；
2.以tetO-F-GC和tetO-R为引物，使用PCR方法扩增带有GC夹子的tetO基因可变区基因片段；
3.将所得到的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳；
4.对电泳后的凝胶进行染色、在300nm紫外灯下切下含有分离tetO基因片段的凝胶，浸提其中的DNA分子；其中切下的凝胶为分散条带，随后将其置于双蒸水中浸泡，4℃下存放过夜以实现浸提操作；
5.以浸提液为模板，以tetO-F和tetO-R为引物，重新扩增其中的序列；
6.将得到的PCR产物以DNA测序仪进行测序，再通过序列比对分析以检测其种类。
作为优选，进行变性梯度凝胶电泳时使用的变性剂为聚丙烯酰胺溶液，其中聚丙烯酰胺浓度为8％(聚丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝37.5∶1摩尔比)，变性剂的梯度范围为30～60％(7M尿素及40％去离子甲酰胺为100％变性剂浓度)。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的阐述说明。
一、使用FastDNASPINKitforSoil提取水体及沉积物总DNA
1.对于沉积物样本，添加0.2～0.4g该样本至LysingMatrixETube；对于水体样本，取适量体积(河流、湖泊等悬浮物质较少的水体样本取100mL，污水、废水等悬浮物质较多的水体样本取10～30mL)，首先将其通过0.22μm滤膜，再用灭菌剪刀将带有滤渣的滤膜尽量剪碎并转移至LysingMatrixETube。
2.在LysingMatrixETube中加入978μL的SodiumPhosphateBuffer和122μL的MTBuffer，注意尽量留下约0.25cm3的空气空间。将LysingMatrixETube安置于FastPrep-24(MPBio)上，设定速度6.0，震荡破碎40秒。
3.将LysingMatrixETubes置于高速离心机中14000×g离心15min。
4.将上清液转移到干净的2mL离心管中，加入250μL的PPS试剂，上下颠倒离心管10次以混匀。
5.14000×g离心15min，将上清液转移到干净的15mL离心管中，并加入1mLBindingMatrixSuspension(BindingMatrix需在用前重悬均匀)。
6.使用涡旋震荡器或手工反转离心管2min，以使DNA结合于BindingMatrix基质中。将管放架上静置3min，让基质沉淀。
7.使用移液器缓慢吸除700μL上清液，期间避免碰到沉淀。用剩余的液体中重悬基质，取700μL的悬浊液转移到SPINFilter中，14000×g离心1min，倒掉CatchTube中收集的废液，把SPINFilter重新放回CatchTube中。再次取剩余的悬浊液加到SPINFilter中，重复上述操作。
8.将SPINFilter转移到新的CatchTube中，添加500μL的SEWS-M并用枪头重悬其中沉淀，14000×g离心1min。倒掉CatchTube中收集的废液，把SPINFilter重新放回CatchTube中，14000×g离心2min，以尽量去除SPINFilter中残余的SEWS-M。
9.移动SPINFilter到新的1.5ml离心管中，室温下风干5min。
10.加入100μL55℃预热的DES，轻轻的重悬沉淀并静置1min，14000×g离心1min，下层离心管中的液体即为水体及沉积物总DNA提取液。
二、引物设计
通过NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上查阅tetO序列(JQ613156.1、AY485123.1、M18896.2、AY987963.1、JQ280445.2、GQ331104.1、GQ331105.1、M20925.1、Y07780.1、M18896.2)，使用clustalx1.83比对，找到tetO序列的可变区和保守区，使用Primer5.0设计针对可变区的引物，得到以下正、反向引物：
tetO-F：5’-3’CGTTATTTCCCGTTTATC
tetO-R：5’-3’ATCGTTGTTTGGAGCATA
使用此引物对可以扩增tetO序列中的一段长度为421bp的片段，并通过NCBI网站上的引物特异性检验工具Primer-Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)测试特异性良好。同时，为了扩增带有GC夹子的PCR产物，在引物tetO-F前端加入一段富含GC的核酸序列，得到如下正向引物：
tetO-F-GC：5’-3’CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-CGTTATTTCCCGTTTATC。
三、水体及沉积物中tetO序列的PCR扩增(带有GC夹子)
1.取1μL所提取的DNA加入到终体积50μL的PCR反应体系中，其中包括ddH2O32μL，20mg/mLBSA2.5μL，10×PCRBuffer5μL，2.0mMMgCl24μL，2mMdNTPs3μL，10mM正反向引物(tetO-F-GC和tetO-R)各1μL，TaqDNApolymerase0.5μL(2.5U)。
2.PCR反应条件如下：94℃5min；94℃1min，48℃1min，72℃2min，循环30次；72℃6min，4℃保存。
3.制备含有1×GelRed(Unique)的琼脂糖凝胶，取所得到的PCR扩增产物3～5μL，与6×loadingbuffer按照5∶1的比例混合后上样电泳，电泳使用固定电压100V，时间35min。
4.电泳结束后，将琼脂糖凝胶块置于波长为300nm的紫外灯下观察是否在约400bp的位置有扩增条带。如有条带，则继续下一步操作。
四、tetO序列的分离和鉴定
1.配制浓度梯度变化范围为8％，变性浓度范围为30～60％的聚丙烯酰胺变性胶(7M尿素及40％去离子甲酰胺为100％变性剂浓度)。
2.取12μL步骤三中所得的含有tetO序列的PCR产物溶液，与3μL6×loadingbuffer混合进行电泳，电泳使用固定电压200V，时间5h。
3.使用3×GelRed染色液染色45min，在紫外灯下观察条带并拍摄照片(如图2所示)，用灭菌刀片切取不同条带后，置于100μL无菌水中过夜浸泡。如图2所示，其中W代表废水样本，S代表沉积物样本，O1、O2、O3、O4为聚丙烯酰胺凝胶中含有不同四环素抗性基因tetO序列的条带。
4.取1μL浸提液作为模板，按照步骤三中所述的PCR体系(引物改用tetO-F-GC和tetO-R)和反应条件重新扩增片段，所扩增片段可委托测序公司进行序列分析。
5.将测序所得到的各tetO序列使用NCBI网站上的nucleotideblast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)进行比对，在比对结果中下载与所比对序列最接近的tetO序列并建立系统发育树，如图3所示，图3是对应于图2中所得四环素抗性基因tetO序列通过测序并BLAST比对后建立的Neighbour-Joining系统发育树，从图中可以清楚地看出，不同tetO序列与来源于不细菌中的已知tetO序列聚类到一起，从而可以达到分析样本中tetO来源的目的。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列，其特征在于，所述引物序列如下所示：
tetO-F：5’-3’CGTTATTTCCCGTTTATC；
tetO-R：5’-3’ATCGTTGTTTGGAGCATA；或者
tetO-F-GC：5’-3’CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGC-ACGGGGGGCGTTATTTCCCGTTTATC。
2.一种水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分类检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，提取所述水体及沉积物中的总DNA；
步骤2，以权利要求1中所述tetO-F-GC和tetO-R为引物，对步骤1所得到的总DNA进行PCR扩增；
步骤3，将得到的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳；
步骤4，对电泳后的凝胶进行染色，切取含有分离tetO基因片段的凝胶，浸提其中的DNA分子；
步骤5，以浸提液为模板，以权利要求1中所述tetO-F和tetO-R为引物，重新扩增其中的序列，并对扩增后得到的产物采用DNA测序仪进行测序，再通过序列比对分析以检测所得到的四环素抗性基因tetO的种类。
3.如权利要求2所述的水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分类检测方法，其中步骤2中所述对总DNA进行PCR扩增的步骤包括：使用PCR方法扩增带有GC夹子的tetO基因可变区基因片段，具体扩增条件为：94℃5min；94℃1min，48℃1min，72℃2min，循环30次；72℃6min，4℃保存。
4.如权利要求2所述的水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分类检测方法，其中步骤3中所述的变性梯度凝胶电泳，其中使用聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶中所含聚丙烯酰胺浓度为8％，聚丙烯酰胺∶双丙烯酰胺的摩尔比为37.5∶1。
5.如权利要求2所述的水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分类检测方法，其中步骤3中所述的变性梯度凝胶电泳，其中使用聚丙烯酰胺凝胶，所述聚丙烯酰胺凝胶中所含的变性剂为尿素和甲酰胺，变性剂的梯度范围为30～60％，以7M尿素及40％去离子甲酰胺为100％变性剂浓度。
6.如权利要求2所述的水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分类检测方法，其中步骤5中所述对浸提液进行PCR重新扩增的步骤包括：使用PCR方法扩增四环素抗性基因tetO基因可变区基因片段，具体扩增条件为：94℃5min；94℃1min，48℃1min，72℃2min，循环30次；72℃6min，4℃保存。
7.一种如权利要求1所述的引物序列在分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO中的用途。
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