CN109652512A - 太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，包括水体和沉积物样本采集、样本总基因组DNA提取、目标DNA标准品制备及荧光定量PCR检测，其中，所述耐药基因为磺胺类耐药菌中抗性基因sul2和四环素类耐药菌中抗性基因tetO。本发明通过荧光定量PCR技术对太湖水体和沉积物中磺胺类和四环素类抗生素的耐药基因进行了绝对定量检测，可辅助了解湖泊等自然水体和沉积物中四环素类和磺胺类耐药基因的含量水平和时空分布特征。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法。
背景技术
抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能够干扰或抑制病原体的生长和存活。常见的抗生素分为四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类、氯霉素类和多肽类。抗生素作为预防和治疗细菌感染的药物不但广泛应用于临床医疗事业，同时作为饲料添加剂和生长促进剂在水产和畜牧养殖方面也大量使用。
大量研究表明，用于医疗事业和畜牧养殖业的抗生素被使用后，仍有高达75％的抗生素未被利用或以活性代谢物的形态被排除生物体外,通过各种途径进入环境,继而所产生的抗生素选择压力，驱动了细菌的变异和水平基因转移，导致了抗生素耐药性的产生和发展。同时，在畜牧养殖业中以低剂量的抗生素来促进禽畜快速生长的养殖方式同时也促进了耐药病菌的生长。作为新兴环境污染物，耐药基因因其分布广、高含量以及潜在的多耐药基因重组特性，受到广泛关注。
目前抗性基因在污水处理厂、水产养殖环境、畜牧养殖环境等抗生素含量高的地区都有大量的研究，但是对于自然水体和沉积物中抗性基因的研究甚少。太湖是苏州、无锡等几大城市重要的生活污水受纳水体，其面临的抗生素污染压力将越来越大。此外，太湖中抗生素含量相对于我国其他湖泊中抗生素含量较低，其抗性基因的检测难度也高于其他湖泊水体或沉积物。
发明内容
本发明的目的在于提供太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，尤其是磺胺类和四环素类抗生素的耐药基因的定量检测方法。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种太湖自然水体与沉积物中细菌耐药基因的定量检测方法，包括采集水体和沉积物样本、样本总DNA提取、目标DNA标准品制备及荧光定量PCR检测，所述耐药基因为磺胺类耐药菌中抗性基因sul2和四环素类耐药菌中抗性基因tetO；所述荧光定量PCR反应体系为：
Premix ExTaq Ⅱ 10μL；
浓度为10μM的上游引物0.3μL；
浓度为10μM的下游引物0.3μL；
ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μL；
ddH2O 7μL；
反应程序为：预变性：95℃30s；变性：95℃30s，退火：62℃(sul2)/55℃(tetO)30s，延伸：72℃，30s，40个循环。
进一步的，所述水体和沉积物样本采集方法为：水样采用高压灭菌的聚乙烯瓶采集；沉积物和污泥采用高压灭菌的采样器采集。其中，水样取水面以下10cm处水样。
进一步的，水体和沉积物样本采集后，水样先过5μm滤膜，再过0.22μm滤膜，在4-10℃暗冷条件下保存，固体样本在-20℃以下保存。
进一步的，采集的水体样本过膜后，用高压灭菌的剪刀将滤膜剪碎，采用DNA提取试剂盒提取和纯化样本总DNA；固体样本冷冻干燥并研磨后采用试剂盒提取和纯化样本总DNA。
进一步的，所述目标DNA标准品制备过程包括：
(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段；
(2)切胶回收耐药基因的PCR产物；
(3)将回收的PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化至感受态细菌进行克隆；
(4)通过蓝白实验筛选阳性克隆子，分离纯化后提取质粒；
(5)梯度稀释标准质粒制备荧光定量PCR标准曲线。
其中，所述步骤(1)中，以耐药基因阳性菌株所提取的基因组DNA为模板扩增出200bp以下的DNA片段。
PCR反应体系共25μL，包括：
模板DNA 2μL；
10×PCRbuffer 2.5μL；
浓度各为2.5mM的dNTPs3μL；
浓度为25mM的MgCl24μL；
浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL；
浓度为10μM的上游引物0.125μL；
浓度为10μM的下游引物0.125μL；
ddH2O13μL；
反应程序为：预变性：94℃5min；变性：94℃30s，退火：55℃30s，延伸：72℃30s，30个循环；72℃10min。
其中，所述上游引物和下游引物和荧光定量PCR采用相同引物序列，为：
sul2：
上游引物：TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG；
下游引物：CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG；
tetO：
上游引物：ACGGARAGTTTATTGTATACC；
下游引物：TGGCGTATCTATAATGTTGAC。
所述步骤(5)中，用Tris EDTA缓冲液将所提质粒稀释为梯度浓度的标准DNA溶液，以建立实时荧光定量PCR的标准曲线。
本发明通过荧光定量PCR技术对太湖水体和沉积物中细菌对磺胺类和四环素类抗生素的耐药基因进行了定量检测，可辅助了解太湖生态系统中自然水体和沉积物中四环素类和磺胺类耐药基因的含量水平和分布特征。采用本发明的方法进行抗性基因Sul2和TetO的检测，PCR扩增效率高，测量准确度高。
附图说明
图1是Sul2荧光定量PCR的标准曲线；
图2是TetO荧光定量PCR的标准曲线；
图3是各水体样本中Sul2含量；
图4是各沉积物样本中Sul2含量；
图5是各水体样本中TetO含量；
图6是各沉积物样本中TetO含量。
具体实施方式
本实施例具体说明太湖水体与沉积物中抗性基因sul2和tetO定量检测的方法。
步骤一：自然水体水样和沉积物的采集方法
水样：用高压灭菌的聚乙烯瓶子采集水样。采集时取水面以下10cm为宜，每个采样点采集3瓶为3个样品平行，标上编号、采集地点、采集时间。采集后马上将水样放入盛有冰块的保温箱中，及时带回实验室处理。
沉积物：沉积物和污泥用高压灭菌的采样器采集，放入灭菌的50mL离心管中。采集后马上将样品放入盛有冰块的保温箱中，及时带回实验室处理。
步骤二：样品运输与保存
样品采集后应马上放入4-10℃的冰盒中保存，2h内运回实验室48h内进行分析测定。如不能立即开展分析测定工作，应把水样保存在4-10℃暗冷处，并尽快进行分析测定，考虑太湖蓝藻较多，水样先过5μm滤膜，再过0.22μm滤膜。滤膜在-20℃保存。固体样品应在-20℃以下存放，以防DNA降解。
步骤三：样品总DNA提取
水样过膜后，用高压灭菌的剪刀把滤膜剪碎，并用DNA提取试剂盒(SpinKitforsoil)，按照试剂盒说明书操作步骤进行提取和纯化样品总DNA；根据固体样品类型，称取0.5g冷冻干燥并研磨后的样品，按照试剂盒( SpinKitforsoil)说明书操作步骤进行提取和纯化样品总DNA。
步骤四：耐药基因标准质粒的TA克隆构建和标准曲线的制备
利用PCR技术扩增耐药基因的DNA片段，克隆该DNA片段到宿主细胞构建标准质粒，制备荧光定量PCR的标准曲线。
具体实验步骤为：
1.通过普通PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段。
2.切胶回收耐药基因的PCR产物。
3.回收后的PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化进感受态细菌进行克隆。
4.通过蓝白实验筛选阳性克隆子，分离纯化后提取质粒。
5.梯度稀释标准质粒制备荧光定量PCR标准曲线。
①目标DNA片段的获得
利用PCR技术，以耐药基因阳性菌株所提基因组DNA为模板扩增出200bp以下的DNA片段。PCR反应体系包括：2μL模板DNA,2.5μL 10×PCRbuffer,3μLdNTPs(2.5mMeach),4μLMgCl2(25mM),0.25μLTaqDNA聚合酶(5U/μL),上、下游引物(10μMeach)各0.125μL,13μLddH2O,共25μL。反应程序为：94℃预变性5min。94℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸30s；30个循环。72℃10min。
②目标基因标准质粒的TA克隆构建
将目标基因的PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收，具体操作参照试剂盒说明书。将纯化后的目标基因的PCR产物连接到19-T载体上，具体操作参照19-T载体试剂盒(TaKaRa，日本)说明书。将连接了耐药基因DNA片段的载体转化进入DH5α感受态细胞，通过蓝白实验筛选出阳性克隆子，用目标基因的引物和19-T载体的引物分别进行PCR反应对克隆子进行进一步确认。具体实验操作见19-T克隆连接试剂盒说明书。
③目标基因标准质粒的提取和拷贝数计算
经确认后的阳性克隆子在LB培养基中37℃下过夜培养，用质粒小提试剂盒提取阳性克隆子中已连接耐药基因的载体质粒。具体实验操作见质粒小提试剂盒说明书。
测定所提载体质粒的核酸浓度，根据质粒大小(19-T载体与耐药基因PCR产物碱基对之和)计算出目标耐药基因的拷贝数(copies/μLDNA)，计算公式为：
C为所提质粒的浓度，L为所提质粒碱基对的数目(19-T载体碱基对数2682bp加上目标耐药基因PCR产物的碱基对数)。
④已知浓度质粒的稀释
根据计算结果，用Tris EDTA缓冲液把所提质粒稀释成108、107、106、105、104、103copies/μL的标准DNA溶液，以此建立实时荧光定量PCR的标准曲线。
⑤标准曲线的绘制：用目标基因标准质粒的梯度溶液为DNA模板，对其进行荧光定量PCR扩增，得到各个浓度的CT值，并确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线。以copies/mL(g)为纵坐标，CT值为横坐标，得到标准曲线和一元线性方程。
本实施例中Sul2标准曲线R2＝0.998，PCR扩增效率(AmplificationEfficiency)为104.578％；TetO标准曲线R2＝0.999，PCR扩增效率(AmplificationEfficiency)为98.019％；Sul2和TetO的荧光定量PCR标准曲线分别如图1、图2所示。
步骤五：耐药基因荧光PCR检测方法
反应体系：采用SYBRGreen染料法，实时荧光定量PCR反应体系为PremixExTaqⅡ10μL，PCR上游引物(10μM)0.3μL，PCR下游引物(10μM)0.3μL，ROXReferenceDyeⅡ0.4μL，ddH2O 7μL(引物参照上表)。根据样品数量配置反应溶液体系,混合均匀后分装18μL溶液到每管中，然后分别加入提取的样品微生物总DNA溶液2μL做模板。每个样品设置2个样品平行，每个样品平行设3个仪器平行。
反应程序为：预变性：95℃30s；PCR扩增：95℃变性30s，62℃(sul2)/55℃(tetO)退火30s，72℃延伸30s，40个循环；融解曲线检测。按照ABI 7500荧光定量PCR仪默认融解曲线程序进行。
样品检测：对纯化后的样品微生物基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，并确认其扩增曲线和融解曲线。根据标准曲线和样品的CT值得到自然水体中耐药基因的含量(copies/mLDNA)，通过数学计算出沉积物样品中耐药基因的含量(copies/gdrysample)。各水体、沉积物样本中Sul2含量分别如图3、图4所示；各水体、沉积物样本中TetO含量分别如图5、图6所示。
Claims (10)
1.一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，包括采集水体和沉积物样本、样本总DNA提取、目标DNA标准品制备及荧光定量PCR检测，其特征在于，所述耐药基因为磺胺类耐药菌中抗性基因sul2和四环素类耐药菌中抗性基因tetO；所述荧光定量PCR反应体系为：
Premix ExTaq Ⅱ 10μL；
浓度为10μM的上游引物0.3μL；
浓度为10μM的下游引物0.3μL；
ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μL；
ddH2O 7μL；
反应程序为：预变性：95℃30s；变性：95℃30s，退火：62℃(sul2)/55℃(tetO)30s，延伸：72℃，30s，40个循环。
2.根据权利要求1所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，所述水体和沉积物样本采集方法为：
水样采用高压灭菌的聚乙烯瓶采集；沉积物和污泥采用高压灭菌的采样器采集。
3.根据权利要求2所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，所述水样取水面以下10cm处水样。
4.根据权利要求1所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，水体和沉积物样本采集后，水样先过5μm滤膜，再过0.22μm滤膜，在4-10℃暗冷处保存；固体样本在-20℃以下保存。
5.根据权利要求1所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，采集的水体样本过膜后，用高压灭菌的剪刀将滤膜剪碎，采用DNA提取试剂盒提取和纯化样本总DNA；固体样本冷冻干燥并研磨后采用试剂盒提取和纯化样本总DNA。
6.根据权利要求1所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，目标DNA标准品制备过程包括：
(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段；
(2)切胶回收耐药基因的PCR产物；
(3)将回收的PCR产物与克隆载体连接成环状质粒，转化至感受态细菌进行克隆；
(4)通过蓝白实验筛选阳性克隆子，分离纯化后提取质粒；
(5)梯度稀释标准质粒制备荧光定量PCR标准曲线。
7.根据权利要求6所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，以耐药基因阳性菌株所提取的基因组DNA为模板扩增出200bp以下的DNA片段。
8.根据权利要求6所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR反应体系共25μL，包括：
模板DNA 2μL；
10×PCRbuffer 2.5μL；
浓度各为2.5mM的dNTPs3μL；
浓度为25mM的MgCl24μL；
浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL；
浓度为10μM的上游引物0.125μL；
浓度为10μM的下游引物0.125μL；
ddH2O13μL；
反应程序为：预变性：94℃5min；变性：94℃30s，退火：55℃30s，延伸：72℃30s，30个循环；72℃10min。
9.根据权利要求1或8所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物序列为：
sul2：
上游引物：TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG；
下游引物：CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG；
tetO：
上游引物：ACGGARAGTTTATTGTATACC；
下游引物：TGGCGTATCTATAATGTTGAC。
10.根据权利要求6所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中用Tris EDTA缓冲液将所提质粒稀释为梯度浓度的标准DNA溶液，以建立实时荧光定量PCR的标准曲线。
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