CN102534002A - 一种水产养殖生物和养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法 - Google Patents

一种水产养殖生物和养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法 Download PDF

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CN102534002A CN2012100045427A CN201210004542A CN102534002A CN 102534002 A CN102534002 A CN 102534002A CN 2012100045427 A CN2012100045427 A CN 2012100045427A CN 201210004542 A CN201210004542 A CN 201210004542A CN 102534002 A CN102534002 A CN 102534002A
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culture environment
gene
strains
dna
aquatic products
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CN2012100045427A
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黄志坚
陈旭凌
何建国
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Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
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Abstract

本发明公开了一种水产养殖生物和养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，该方法是提取细菌的总DNA作为模板，SEQIDNO:1~2所示序列为引物，PCR扩增和16SrDNA序列分析鉴定菌株，同时以SEQIDNO:3~8所示序列为引物，进行测序鉴定，检测带有抗性基因的抗性菌株。本发明的方法针对水产养殖生物和养殖环境中的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有效，DNA提取无需使用特殊试剂，也无需用酚和氯仿等有毒试剂，安全环保，价格低廉，步骤简单，耗时短，结果稳定可靠，PCR产物的扩增阳性率高。运用16SrDNA鉴定菌种和检测抗性基因，DNA图谱信息度高、实用性强、简便快速，结果准确、稳定、重复性好、灵敏度高，具有十分广阔的应用前景、有很高的理论研究意义和实用价值。

Description

一种水产养殖生物和养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种水产养殖生物和养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法。
背景技术
近年来由于抗生素在养殖业和畜牧业中的大量使用，导致其对环境污染的问题日趋严重，已成为当前国际上的研究热点之一。我国是世界第一水产养殖大国，但近年来由于水产养殖污染加剧，造成养殖环境质量不断恶化，病原生物种类增多和传播速度加快，养殖病害日趋严重，水产养殖中的病害问题特别是细菌性病害在密集型养殖系统中发生频繁且影响严重，这极大地限制了我国水产养殖业的发展。目前病害防治的主要方法是使用抗生素类药物，抗生素作为饲料添加剂在动物养殖业中使用非常普遍。抗生素的长期滥用很可能会诱导动物体内产生抗生素抗性基因（Antibiotics resistance genes, ARGs），ARGs经排泄后将对养殖区域及其周边环境造成潜在基因污染。随着抗生素类药物不断的大量使用，许多细菌都有了耐药性，且情况日益严重，抗生素抗性基因已经成为一种新型的环境污染物。目前在不同的环境介质如水体沉积物水生生物和细菌体内等均已检出 ARGs的存在，并且有研究还发现ARGs能够通过可移动的遗传元件（Genetic mobile elements）在细菌之间传播，进而在环境中扩散，这将会对公共健康和食品安全构成严重的威胁。针对水产养殖业大量使用抗生素这一现状，开展渔业环境抗生素抗性基因污染的研究，建立水产养殖生物和养殖环境抗生素抗性菌株筛选和鉴定方法，揭示抗生素抗性基因在渔业环境中的扩散和传播规律，对于评价抗生素抗性基因的生态风险十分必要。不仅能确保我国水产养殖业的健康可持续发展，而且对于我国的生态安全和经济发展具有重要的现实意义。
目前，人们普遍认为抗生素对环境微生物的耐药性的选择和诱导可能是其环境效应最重要的部分。抗生素对耐药菌株抗性基因ARGs的诱导具专一性，因此可以认为抗生素本身在环境中的迁移、转化及归趋等环境行为与其所诱导的抗生素抗性基因在环境中的广泛传播在理论上应该具有很大的相似性和一致性。己有一些研究证实了抗性基因的存在与抗生素的使用之间存在很好的相关性。研究表明，携带ARGS的微生物菌株死亡后，携带ARGS的DNA可释放到环境中并持久存在，原因是在脱氧核糖核酸酶的保护下，防止其被降解，裸露的DNA分子最终又可以转入到其他细胞内。抗生素抗性基因的分子检出可以确定无疑地证明细菌的耐药性，阐释细菌耐药机理，更可以检查耐药因子的起源及传播扩散途径和动态，为耐药细菌，尤其是耐药病原菌的追踪监测提供了其它方法无法取代的最佳手段。利用现代分子生物学技术测定耐药基因的核酸序列还可用来检测耐药基因的变异，用来追踪某一耐药基因的系统发生和进化演化，并通过计算机分子结构建模而预测该耐药基因表达产物耐药谱的演化。目前的抗性基因检测方法主要有两种，传统的方法是利用抗性平板法筛选出抗性细菌，对其进行总量的测定，并鉴定出抗性细菌的种属，然后从菌体中提取 DNA，再利用聚合酶链式反应（PCR）检测环境中的抗性基因。由于环境中许多微生物难以平板培养，主要是因为对其最适生长温度、pH、氧、营养成分等不十分清楚。因此，以传统微生物培养的方法评价抗性难免低估了微生物的种类。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种直接在水产养殖生物或环境样品中提取总DNA，再利用 PCR方法分析抗性菌株的方法，即一种水产养殖生物或水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种水产养殖生物或水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，步骤如下：
（1） 细菌总DNA的提取：提取水产养殖生物或水产养殖环境样品里细菌总DNA；
（2） 以步骤（1）所得总DNA为模板，SEQ ID NO:1~2所示序列为引物， PCR扩增和分析16S rDNA序列，进行测序，鉴定菌株的种属名称；
（3）经过种属鉴定的菌株进一步测序鉴定，检测带有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因为耐氯霉素基因floR、耐磺胺类基因sul1，和/或耐磺胺类基因sul2（三种耐药基因均为北京六合华大基因科技股份有限公司深圳分公司产品）。
上游引物27f有19个碱基：AGA GTT GAT CCT GGC TCA G（SEQ ID NO:1），下游引物1492r有19个碱基：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T（SEQ ID NO:2）。
上述鉴定方法的步骤（2）中所述16S rDNA序列为SEQ ID NO:9~11所示任意一条序列；步骤（3）所述耐氯霉素基因floR序列如SEQ ID NO:12所示，耐磺胺类基因sul1序列如SEQ ID NO:13所示。
上述方法除用于鉴定外，也可以用于筛选水产养殖生物或水产养殖环境中的抗生素抗性菌株。
其中，步骤（1）细菌总DNA的提取优选如下操作方法：
（1）将分离纯化的细菌接种于2216E液体培养基或LB液体培养基中，隔夜摇床培养；其中分离纯化优选平板划线法，2216E液体培养基（可从青岛海博生物技术有限公司购买）主要适用于海水环境，LB液体培养基主要适用于淡水环境，LB配方包括胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；
（2）吸取经过培养的菌液，7500rpm离心5min，弃上清液；
（3）沉淀加入无菌水，振荡摇匀后，沸水煮10min；
（4）12000rpm离心10min，上清液即可作为DNA模板。
步骤（2）鉴定细菌的PCR反应体系为50μL，内含2×PCR Reaction Mix 25μL、10μM的引物27f和引物1492r各2μL、2.5U的Taq酶0.5μL、含50～150ng的DNA模板溶液2μL、ddH2O 18.5μL。
步骤（2）鉴定细菌的PCR扩增条件为：94 ℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，最后在72℃充分延伸10min。
步骤（2）鉴定细菌的PCR扩增16S rDNA产物大小为1.5Kbp。
步骤（3）中检测抗生素抗性基因的PCR反应体系为20μL，其中2×PCR Reaction Mix 10μL、2.5U 的Taq酶0.2μL、10μM的上下游引物各0.8μL、含50～150ng的DNA模板溶液1μL，ddH2O7.2μL。
扩增耐氯霉素基因floR使用的引物序列：上游引物floR-FW有18个碱基：TGG CTC CTT TCG ACA TCC（SEQ ID NO:3），下游引物floR-RV有19个碱基：ATC CAC ATC GGT AGG ATG A（SEQ ID NO:4）。
扩增耐氯霉素基因floR的条件为：94 ℃预变性5min，然后94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后在72℃充分延伸5min。
扩增耐磺胺类基因sul1使用的引物序列为：上游引物sul1-FW有22个碱基：CGC ACC GGA AAC ATC GCT GCA C（SEQ ID NO:5），下游引物sul1-RV有22个碱基：TGA AGT TCC GCC GCA AGG CTC G（SEQ ID NO:6）。
扩增耐磺胺类基因sul2使用的引物序列：上游引物sul2-FW有22个碱基：TCC GGT GGA GGC CGG TAT CTG G （SEQ ID NO:7），下游引物sul2-RV有22个碱基：CGG GAA TGC CAT CTG CCT TGA G （SEQ ID NO:8）。
扩增耐磺胺类基因sul1或sul2的条件最佳为：95 ℃预变性5min，然后95 ℃变性15s，63.7℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后在72℃充分延伸7min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
    本发明的方法针对水产养殖生物和养殖环境中的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有效，DNA提取无需使用特殊试剂，也无需用酚和氯仿等有毒试剂，安全环保，价格低廉，步骤简单，耗时短，结果稳定可靠，PCR产物的扩增阳性率高。以耐氯霉素基因(floR)、耐磺胺类基因(sul1、sul2)设计引物，进行PCR扩增，具有与目的条带吻合的菌株即为携带抗性基因的抗性菌株。运用16S rDNA鉴定菌种和检测抗性基因，DNA图谱信息度高、实用性强、简便快速，结果准确、稳定、重复性好、灵敏度高，具有十分广阔的应用前景，可运用于水产养殖生物和养殖环境抗生素抗性菌株筛选和鉴定及相关分析，具有很高的理论研究意义和实用价值。
附图说明
图1.细菌菌株16S rDNA鉴定结果，其中1为阴性对照，2-10为鉴定菌种，M为DNA分子量标准DL-2000。
图2.抗性基因检测结果，其中1，2为floR基因检测，3为sul2基因检测，4为sul1基因检测，5为阴性对照，M为DNA分子量标准DL-2000。
具体实施方式
实施例1 抗生素抗性菌株筛选和鉴定
取养殖池塘的水样，加1ml吐温溶液，用灭菌的海水将水样10-1、10-2倍比稀释，用移液枪吸取0.1mL的水样涂布2216E液体培养基（海水）或LB液体培养基（淡水）平板，28℃隔夜摇床培养。用吸管吸取1mL的细菌培养液，7500rpm离心5min，弃掉上清，加入0.4mL的无菌水，振荡摇匀后，沸水浴煮10min，然后再12000rpm离心10min，上清液即可作为DNA模板，-20℃保存。
取制备的环境样品DNA模板液，选取上游引物27f：AGA GTT GAT CCT GGC TCA G（SEQ ID NO:1），下游引物1492r：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T（SEQ ID NO:2），进行16S rDNA的PCR扩增（引物由华大基因合成）。PCR反应体系为50μL，内含2×PCR Reaction Mix、10μM的引物27f和引物1492r、Taq酶、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH2O。具体成分见表1（其中2×PCR Reaction Mix、2.5U的Taq酶来源于北京东胜创新生物科技有限公司的PCR Kit）：
表1 16S rDNA的PCR反应体系
DNA模板 2μL
27f 2μL
1492r 2μL
2×PCR Reaction Mix 25μL
Taq酶（2.5U） 0.5μL
ddH2O 18.5μL
扩增条件为：94 ℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，最后在72℃充分延伸10min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度，目的条带约为1.5Kb，见图1。
切胶回收PCR扩增产物，直接测序，或采用Omega公司的E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit进行割胶纯化后测序，或用Takara公司的pMD19-T vector载体进行克隆测序。委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物27f/1492r，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。经测序鉴定，其16S rDNA的DNA序列与SEQ ID NO:9相一致。
实施例2 筛选和检测抗生素抗性基因
按实施例1方法提取DNA，作为模板，然后进行如下步骤：
（1）引物选择：选取耐氯霉素基因(floR)、耐磺胺类基因(sul1、sul2)设计引物
耐氯霉素基因(floR)上游引物floR-FW有18个碱基：TGG CTC CTT TCG ACA TCC（SEQ ID NO:3），下游引物floR-RV有19个碱基：ATC CAC ATC GGT AGG ATG A（SEQ ID NO:4）；
耐磺胺类基因(sul1)上游引物sul1-FW有22个碱基：CGC ACC GGA AAC ATC GCT GCA C（SEQ ID NO:5），下游引物sul1-RV有22个碱基：TGA AGT TCC GCC GCA AGG CTC G（SEQ ID NO:6）；
耐磺胺类基因(sul2)上游引物sul2-FW有22个碱基：TCC GGT GGA GGC CGG TAT CTG G（SEQ ID NO:7），下游引物sul2-RV有22个碱基：CGG GAA TGC CAT CTG CCT TGA G（SEQ ID NO:8）。
（2）PCR反应体系
反应体系为20μL，内含2×PCR Reaction Mix、10μM的引物27f和引物1492r、Taq酶、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH2O，具体成分见表2：
表2
DNA模板 1μL
floR-FW/sul1-FW/sul2-FW 0.8μL
floR-RV/sul1-RV/sul2-RV 0.8μL
2×PCR Reaction Mix 10μL
Taq酶（2.5U） 0.2μL
ddH2O 7.2μL
（3）PCR扩增
floR抗性基因检测的扩增条件为：94 ℃预变性5min，然后94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后在72℃充分延伸5min。
sul1、sul2抗性基因检测的扩增条件为：95 ℃预变性5min，然后95 ℃变性15s，63.7℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后在72℃充分延伸7min。
扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度，floR基因扩增目的条带约为841bp，sul1基因扩增目的条带约为120bp，sul2基因扩增目的条带约为150bp，见图2。
（4）PCR扩增产物进行直接测序，或采用Omega公司的E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit进行割胶纯化后测序，或用Takara公司的pMD19-T vector载体进行克隆测序。委托公司进行双向直接测序，测序引物分别为扩增引物floR-FW/floR-RV、sul1-FW/sul1-RV、sul2-FW/sul2-RV，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。经测序鉴定，扩增产物各目的条带序列分别与floR抗性基因、sul1、sul2抗性基因相吻合，表明三种基因都存在于样品菌株中。
综上，通过细菌菌株16S rDNA鉴定和抗性基因检测即可筛选和鉴定出水产养殖生物或养殖环境中的抗生素抗性菌株，简便快速，实用性强。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  中山大学
 
<120>  一种水产养殖生物和养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法
 
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<211>  1456
<212>  DNA
<213>  Vibrio parahaemolyticus
 
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ccaccttgcc gcagtctaac catgcaagtc gagcggaacg agttatctga accttcgggg     60
 
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ggggataacc attggaaacg atggctaata ccgcatgatg cctacgggcc aaagaggggg    180
 
accttcgggc ctctcgcgtc aggatatgcc taggtgggat tagctagttg gtgaggtaag    240
 
ggctcaccaa ggcgacgatc cctagctggt ctgagaggat gatcagccac actggaactg    300
 
agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag    360
 
cctgatgcag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc actttcagtc    420
 
gtgaggaagg tggtgtagtt aatagctgca ttatttgacg ttagcgacag aagaagcacc    480
 
ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg cgagcgttaa tcggaattac    540
 
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tcggaattgc atttgaaact ggcagactag agtactgtag aggggggtag aattcaggtg    660
 
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gatactgaca ctcagatgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc    780
 
cacgccgtaa acgatgtcta cttggaggtt gtggccttga gccgtggctt tcggagctaa    840
 
cgcgttaagt agaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa tgaattgacg    900
 
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc    960
 
tactcttgac atccagagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga actctgagac   1020
 
aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga   1080
 
gcgcaaccct tatccttgtt tgccagcgag taatgtcggg aactccaggg agactgccgg   1140
 
tgataaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct   1200
 
acacacgtgc tacaatggcg catacagagg gcagccaact tgcgaaagtg agcgaatccc   1260
 
aaaaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc   1320
 
tagtaatcgt ggatcagaat gccacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc   1380
 
gtcacaccat gggagtgggc tgcaaaagaa gtaggtagtt taaccttcgg ggggacgctt   1440
 
accacttcgt catgcg                                                   1456
 
 
<210>  12
<211>  841
<212>  DNA
<213>  Hafnia alvei蜂房哈夫尼菌 floR
 
<400>  12
gggatcggaa agtggccgat ccccaacagg atcgcgccgg aacgagcaac gccatcccgc     60
 
gcgctacgca tcccgcgata ccccatttgg caacgaagga ctttgcgaag cgggttgtcg    120
 
tgaccatgac cagcgcgaca gtcgcgaagg ccaagctaaa tccgatctcg gaatagccgg    180
 
cttggcctat gagaacacgg ggggctgtcg agaagaaaac gaagaatgtg cccatgccgg    240
 
cactaaatcc gaccgtgtaa acccaaaagg ccggactcgc gaagatcggc aaaacagatc    300
 
gttgcgttct ggcctgatcc aacggtcggg tttcatgcca cctgaaactg gcgtttaaga    360
 
gtgcgagcga agccagtgca gccagtgtga tgaagatcgc ctgccatccc caaaactcgc    420
 
cgatcagcgc accggctata gggccgagcg caggcacgaa cgccagcatc gaactgaaaa    480
 
ggccgtagat gacggcacct tcgggacgat tggcatatac gtcgcgcacg gtcgcgaagg    540
 
tggccaccag catggccgat gctccaacag cctgaaccag acgaaacgca acaaaggcta    600
 
atgcagttga agaacaagcc gctcccagag acgcagcaac gaaagccgtt gcgcctacaa    660
 
gcaggatcgg ccgtcgcccg acgcgatcgg agagtggccc aaagatcact tggcccacac    720
 
cgagcatcac catgtagagg ctcaacgtga gttggattat ggatggagtc gtgttcagga    780
 
cgcccggcat cgccggaacg actggaagat aaatatccat cgccagcgag gcgaggatgc    840
 
c                                                                    841
 
 
<210>  13
<211>  126
<212>  DNA
<213>  Citrobacter freundii弗氏柠檬酸杆菌  sul1基因
 
<400>  13
ataaagctga gtcggcgttg gggcttccgc tattggtctc ggtgtcgcgg aaatccttct     60
 
tgggcgccac cgttggcctt cctgtaaagg atctgggtcc agcgagcctt gcggcggaac    120
 
ttcaaa                                                               126

Claims (10)

1.一种水产养殖生物或水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤如下：
（1） 细菌总DNA的提取：提取水产养殖生物或水产养殖环境样品里细菌总DNA；
（2） 以步骤（1）所得总DNA为模板，SEQ ID NO:1~2所示序列为引物， PCR扩增和分析16S rDNA序列，进行测序，鉴定菌株的种属名称；
（3）经过种属鉴定的菌株进一步测序鉴定，检测带有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因为耐氯霉素基因floR、耐磺胺类基因sul1，和/或耐磺胺类基因sul2。
2.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（1）细菌总DNA的提取具体操作如下：
（1）将分离纯化的细菌接种于2216E液体培养基或LB液体培养基中，28℃隔夜摇床培养；
（2）吸取经过培养的菌液，7500rpm离心5min，弃上清液；
（3）沉淀加入无菌水，振荡摇匀后，沸水煮10min；
（4）12000rpm离心10min，上清液即可作为DNA模板。
3.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（2）鉴定细菌的PCR反应体系为50μL，内含2×PCR Reaction Mix 25μL、2.5U的Taq酶0.5μL、10μM的引物SEQ ID NO:1和引物 SEQ ID NO:2各2μL、含50～150ng的DNA模板溶液2μL、ddH2O 18.5μL。
4.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（2）鉴定细菌的PCR扩增条件为：94 ℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，最后在72℃充分延伸10min。
5.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（2）鉴定细菌的PCR扩增16S rDNA产物大小为1.5Kbp。
6.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于步骤（3）中检测抗生素抗性基因的PCR反应体系为20μL，其中2×PCR Reaction Mix 10μL、2.5U 的Taq酶0.2μL、10μM的上下游引物各0.8μL、含50～150ng的DNA模板溶液1μL，ddH2O7.2μL。
7.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于扩增耐氯霉素基因floR使用的引物序列为SEQ ID NO:3~4。
8.根据权利要求7所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于扩增耐氯霉素基因floR的条件为：95 ℃预变性5min，然后98℃变性15s，52℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后在72℃充分延伸5min。
9.根据权利要求1所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于扩增耐磺胺类基因sul1使用的引物序列为SEQ ID NO:5~6；
扩增耐磺胺类基因sul2使用的引物序列为SEQ ID NO:7~8。
10.根据权利要求9所述水产养殖环境中抗生素抗性菌株的鉴定方法，其特征在于扩增耐磺胺类基因sul1或sul2的条件为：95 ℃预变性5min，然后98 ℃变性15s，63.7℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后在72℃充分延伸7min。
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