CN102321618A - 一种用于从生物材料中直接扩增dna片段的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于从生物材料中直接扩增DNA片段的方法及试剂盒。本发明的试剂盒包括：裂解液a：50-70v％PEG200、20-40mM KOH，pH13.2-13.8；裂解液b：5wt％-10wt％ chelex-100；裂解液c：5wt％-10wt％ chelex-100，1wt％-2wt％ TritonX-100；中和液：pH6.8-7.5的190-210mmol/L Tris-HCl缓冲液，还可进一步包含2×Taq PCR混合液。本发明的试剂盒及方法适用于细菌、动物组织、植物组织、真菌、血液、唾液和毛发等多种样品。

Description

一种用于从生物材料中直接扩增DNA片段的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程领域。具体地，本发明涉及一种从微量生物样品中扩增目标基因组DNA片段的方法。进一步，本发明涉及基于本方法的试剂盒及其试剂组成和操作方法。

背景技术

DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子。随着分子生物技术的发展，基因组DNA抽提技术和PCR扩增技术已经成为分子生物学研究的基础，也是基因组DNA及其相关研究中最重要的一个环节。

DNA存在于各种生物的细胞核、线粒体、叶绿体中，也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。DNA作为重要的遗传物质基础具有三个重要特性：(1)同一个体的一致性，也就是说同一生物体的各个部分体细胞的DNA组成是相似的。根据DNA这个特性，可对物种进行鉴定，如DNA条码技术。DNA条码是一段能够高效鉴定物种的DNA标准区域，通过此项新技术可以准确快速的鉴定新物种。(2)不同个体之间高度的特异性，每个个体的DNA都不会完全相同；根据这一特性可以进行法医个体识别，如DNA指纹识别。DNA指纹是指个体间特异的DNA多态性，其个体识别能力类似于手指指纹识别，每个个体之间都是高度特异的。可用来进行个人识别鉴定。(3)DNA的恒定性，DNA作为一种稳定的遗传物质，在生物体中具有稳定性，不受年龄和营养条件等因素的影响。虽然DNA十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种隐定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，从而会产生一种新的性状，也可能引起某种病变。根据这一特性可以通过检测DNA来预测或诊断疾病。

以上所述DNA应用通常都涉及以下几步：第一，样品采集；第二，设计合成相应的引物；第三，PCR扩增；第四，筛选和比对。其中就应用到了基因组DNA抽提和目的片段PCR扩增这两项最基本也是最重要的分子生物学实验技术。常规的DNA抽提方法通常包含三个步骤，第一步是样品裂解，通过一些离液剂(异硫氰酸胍、盐酸胍)或是离子去污剂(SDS、CTAB)将细胞裂解，使DNA游离出来，分布在混合液中。第二步是DNA纯化，借助有机溶剂或是吸附柱将蛋白、酚类物质和糖类物质等杂质与基因组DNA分离。第三步为DNA的沉淀富集，通过乙醇或异丙醇使DNA聚集，再过水或是TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)进行溶解或洗脱。由于各种分子生物研究的方式和目的不同，所以对基因组的质量要求也不同。对于一些微量样品，尤其是一些比较珍贵的样品，如果用常规方法进行DNA抽提，少量的DNA会在一步一步的操作过程中损失，最后就很难得到用于下一步实验的DNA。所以针对不同的研究要求，选择最合适的实验方法可使研究工作者在最短的时间内获得最真实最理想的结果。

目前国内外市场上开发出了多种商品化的DNA抽提纯化试剂盒。根据纯化方法可以分为以下几种：(1)有机溶剂纯化方法，这是最经典的一种核酸抽提纯化的技术；(2)盐析纯化法，是一种经济且毒性较小的种核酸抽提纯化方法。(3)玻璃珠纯化法，是早期核酸抽提试剂盒中常用的一种方法，不过由于存在玻璃珠残留等问题，已经逐渐被其他方法所取代。(4)吸附柱纯化法，是利用一种特殊的玻璃纤维膜对核酸进行吸附的方法，操作简单适合高通量核酸抽提。(5)磁珠纯化法，是利用纳米级磁性微粒与核酸发生吸附反应，磁珠可在磁场的作用下发生聚集和分散，使核酸的分离纯化实现自动化的一种方法。(6)离子交换介质纯化方法，采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下，使DNA能在离心过柱的瞬间结合到DNA纯化柱上，获得的核酸纯度较高。

以上几种商品化的DNA抽提纯化试剂盒都有各自的优势，不过，获得质量较高的基因组DNA的前提是需要一定起始量的样品。如果样品量非常少，如小米粒大小的动物组织，就不适合选用以上的抽提方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种快速而简便的方法及试剂盒，从来源不同的微量样品中快速提取基因组DNA，用于PCR扩增或以PCR扩增为基础的相关检测。

本发明首先提供了一种生物样本DNA抽提用试剂盒，包括：

1.裂解液a：

裂解液a为含有下列溶质的水溶液：50-70％PEG200(v/v)、20-40mM KOH，

裂解液酸碱度为pH13.2-13.8，优选pH 13.5-13.8。

优选的，裂解液a含60％PEG200、20mM KOH，pH13.5。

2.裂解液b：

裂解液b为含有下列溶质的水溶液：5％-10％ chelex-100(wt％)。

优选的，裂解液b含10％ chelex-100。

3.裂解液c：

裂解液c为含有下列溶质的水溶液：5％-10％ chelex-100，1-2％

TritonX-100(wt％)。

优选的，裂解液c含10％ chelex-100，1wt％-2wt％ TritonX-100。

4.中和液：为pH6.8-7.5的190-210mmol/L Tris-HCl缓冲液。较佳的，为pH6.8-7.5的200mmol/L Tris-HCl缓冲液。

进一步的，chelex-100购自Bio-Rad公司。

进一步的，所述试剂盒中还包括2×Taq PCR混合液。

所述2×Taq PCR混合液的配方为：2×PCR Buffer；3-5mM MgSO₄；0.1-0.2mM dNTP；0.1-0.25U/μL Taq DNA polymerase；2×Loading Buffer。

其中，PCR Buffer、Loading Buffer均为常规。

本发明的试剂盒可用于从样品中提取DNA或用于扩增样本DNA片段。

本发明进一步提供了一种利用前述试剂盒从生物样品中提取DNA的方法，包括下列步骤：

1.选择前述试剂盒中合适的裂解液与样本混合裂解样本；

2.将步骤1获得的混合液直接去除细胞碎片获得样本DNA。

进一步的，步骤1中：

当所述生物样本选自：动物组织、植物组织、细菌和酵母时，选用裂解液a。该裂解液的裂解条件为：将样本与裂解液混合均匀后，在65℃下，裂解5-20分钟。

当所述生物样本选自：抗凝血液、血斑、凝固血块、细胞和口腔拭子时，选用裂解液b。该裂解液的裂解条件为：将样本与裂解液混合均匀后，在56℃下，裂解30分钟，100℃煮沸8分钟。

当所述生物样本选自：带毛囊的发根时，选用裂解液c和蛋白酶K(ProteinaseK)。该裂解液的裂解条件为：将样本与裂解液和蛋白酶K混合均匀后，在56℃下，裂解30分钟，100℃煮沸8分钟，裂解液和Proteinase K的混合体积比一般为8-12∶1。

步骤1中，样本与裂解液的混合比例为：样本体积∶裂解液体积＝0.05-0.1∶1。

当步骤1选用裂解液a时，在步骤1将样本裂解后步骤2去除细胞碎片前还包括将样本裂解后的混合液直接采用所述试剂盒中的中和液中和。

进一步的，样本裂解后的混合液与中和液的混合比例为：样本裂解后的混合液体积∶中和液体积＝1∶1。

中和条件可为：将样本裂解后的混合液与中和液混合均匀后，在室温下，中和1-2分钟。

步骤2中，去除细胞碎片可采用常规方法如离心等方法去除。

采用本发明试剂盒所获得的样本DNA可直接用于PCR扩增。

对与含有2×Taq PCR混合液的试剂盒，在采用前述方法获得样本DNA后，将获得的样本DNA与所述2×Taq PCR混合液以1-2∶5的体积比混合。所得的混合液只需再加入适量引物和水即可进行PCR扩增。

本发明还公开了一种利用本发明的试剂盒从生物材料中直接扩增DNA片段的方法，为先采用前述从样品中提取DNA的方法获得样本DNA，而后将所获得的样本DNA与2×Taq PCR混合液、适量引物和水混合后进行PCR扩增。这种用于从生物材料中直接扩增DNA片段的方法操作过程简单，仅仅分为裂解、稀释/中和和扩增三步反应。

本发明的发明要点之一在于提供了三种裂解液，对不同的生物样品提供了三种裂解方法。一是，通过裂解液a中强碱作用使微量样品快速裂解。再经过简单的中和、离心等过程从微量的生物样品中获得可以直接用于PCR扩增的DNA。二是通过裂解液b中的chelex-100树脂催化DNA释放，去除有螯合作用的多价金属离子。三是裂解液b中的chelex-100树脂在蛋白酶K的辅助下裂解样品，再通过简单的离心过程去使chelex-100沉降在离心管底部。

作为进一步的改进，本发明还使用了2×Taq PCR混合液。经过优化的2×TaqPCR混合液使PCR扩增更稳定，大大节省了研究工作者的宝贵时间，同时也减少了PCR扩增过程中的假阳性及假阴性等现象。使用2×Taq PCR混合液，无需自己配制PCR反应体系，大大缩短了操作时间，也最大限度降低样品间的污染。

本发明的优点：

本发明的试剂盒稳定性好，整个操作过程中不需要使用酚、氯仿等有毒的有机溶剂，使用安全。操作非常方便，把复杂的基因组DNA抽提和PCR扩增变得简单化，仅仅分为裂解、稀释/中和和扩增三步反应，全过程可在20分钟之内完成。非常适合多个微量样品的同时提取。

本发明的几种裂解液供实验者选择，针对不同的微量样品可以选择合适的裂解液。这使得本发明的试剂盒适用范围非常广，可用于动物、植物、微生物以及临床样品DNA的快速PCR扩增，可从细菌、动物组织、植物组织、真菌、血液、唾液和毛发等多种样品中分离DNA。获得的上清液可直接用于PCR扩增。

本发明提供2×Taq PCR混合液，包括2×Taq DNA Polymerase，2×PCRBuffer，2×dNTP，2×Mg²⁺，只需加入适量引物、模板和水即可进行PCR扩增。大大简化了PCR操作，使操作更加快捷，也减少了PCR操作过程中可能导致的污染，使PCR的重复性更好。

本发明的样本基因组DNA的抽提全过程将常规的三步抽提合并为一步，并且不涉及样品的转移，仅在一个离心管内完成，避免微量样品的损失。此外，操作多个样品DNA抽提时，常会因为移液器的重复使用或是气溶胶等原因造成样品间交叉污染，干扰后续的实验，而采用本发明不仅不涉及到上清的转移，还避免了操作多个样品时管与管之间的交叉污染问题，获得的DNA可以作为PCR扩增的模板。

附图说明

图1为实施例1中以不同裂解液获得的DNA为模板PCR扩增结果

M为DL2000 DNA Marker

1-2：裂解液a-1

3-4：裂解液a-2

5-6：裂解液a-3

7-8：裂解液a-4

图2为实施例1中以不同方法获得DNA为模板的PCR扩增结果

1-3为使用本发明裂解液a-2获得的DNA为模板

4-6为使用常规植物基因组DNA抽提试剂盒获得的DNA为模板

图3为实施例2中以不同裂解液获得的DNA为模板PCR扩增结果

M为DL2000 DNA Marker

1-3：裂解液b-1

4-6：裂解液b-2

图4为实施例2中以不同方法获得DNA为模板的PCR扩增结果

1-2为使用本发明获得的DNA为模板

3-4为使用常规血液基因组DNA抽提试剂盒获得的DNA为模板

图5为实施例3中以不同裂解液获得的DNA为模板PCR扩增结果

M为DL2000 DNA Marker

1-2：裂解液c-1

3-4：裂解液c-2

图6为实施例4 PCR扩增的结果(植物)

M为DL2000 DNA Marker

1-5为使用本发明获得的DNA为模板

-为阴性对照

图7为实施例4 PCR扩增的结果(抗凝血液)

M为DL2000 DNA Marker

1-5为使用本发明获得的DNA为模板

-为阴性对照

图8为实施例4 PCR扩增的结果(毛发)

M为DL2000 DNA Marker

1-4为使用本发明获得的DNA为模板

-为阴性对照

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

(1)实施例1中采用的溶液

A.样品裂解液a，所述样品裂解液配方为

裂解液a-1：70％PEG200；20mM KOH，pH 13.5；

裂解液a-2：60％PEG200；20mM KOH，pH 13.5；

裂解液a-3：60％PEG200；40mM KOH，pH 13.8；

裂解液a-4：50％PEG200；20mM KOH，pH 13.5.

B.中和液，配方如下

200mM Tris-HCl(pH值6.8-7.5).

C.2×Taq PCR混合液，所述配方如下

2×PCR Buffer；

3mM MgSO₄；

0.2mM dNTP；

0.1U/μL Taq DNA polymerase；

2×Loading Buffer.

D.2×PCR Buffer，所述配方如下：

40mM Tris-HCl，pH＝8.825℃；

20mM(NH4)₂SO₄；

20mM KCl；

0.2％Trtion X-100；

0.2mg/mL BSA.

E.2×Loading Buffer，所述配方如下：

8％ Glycerol；

0.05％ Bromophenol Blue.

(2)提取烟草的基因组DNA。

1.取直径为0.5-0.7cm大小的植物叶片，加入1.5ml离心管中用研磨棒充分研磨，用研磨棒进行研磨。加入100μL裂解液1，震荡混匀，85℃水浴20min。

2.水浴后向离心管中加入100μL中和液，震荡混匀。

3.离心：12,000rpm室温离心5min去除不溶的组织碎片。

4.取上清液作为模板直接用于PCR检测。

(3)PCR反应

将上述获取的模板进行PCR扩增，上下游引物按烟草质体全基因设计，上游引物为5’-TGTCACTCAACGACGGAACCT-3’，下游引物为5’-TTGGCATTGGAAGCACATCAC-3’。所扩增的目的片段大小为667bp。

PCR反应体系为2×Taq PCR混合液10μL，上下游引物各1μL，模板DNA2μL，无菌水6μL。PCR扩增条件为95℃预变性5分钟，94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒，进行35个循环。72℃最终延伸10分钟。

PCR扩增结束后，通过1％琼脂糖电泳对PCR扩增结果进行检测，结果如图所示。

(4)常规基因组DNA抽提与PCR扩增

使用常规的植物DNA抽提试剂盒从相同的样品中抽提基因组，并在相同的条件下进行PCR扩增。

PCR扩增结束后，通过1％琼脂糖电泳对PCR扩增结果进行检测，结果如图所示。

实施例2

(1)实施例2中采用的溶液

A.样品裂解液b，所述样品裂解液配方为

裂解液b-1：5％ chelex-100(chelex-100购自sigma公司)

裂解液b-2：10％ chelex-100(chelex-100购自sigma公司)

B.2×Taq PCR混合液，配方如下

2×PCR Buffer；

3mM MgSO₄；

0.2mM dNTP；

0.1U/μL Taq DNA polymerase；

2×Loading Buffer.

其中所使用的2×PCR Buffer和6×Loading Buffer与实施例1中完全相同。

(2)提取微量血液的基因组DNA。

1.取5-10μL抗凝全血加到1.5ml离心管中，加入500μl无菌水，剧烈振荡。

12,000rpm离心2min，弃上清，收集沉淀。

2.沉淀中加入100μL裂解液2，56℃水浴30min，100℃煮沸8min。

3.12,000rpm离心3min，上清液用于PCR反应。

(3)PCR反应

将上述获取的模板进行PCR扩增，上下游引物按人类8号染色体基因设计，上游引物为5’-CCATCTCCCATCAGGCAGTATCC-3’，下游引物为5’-CTTCCAGAAACTTCCACCCAGCA-3’。所扩增的目的片段大小为678bp。

PCR反应体系为2×Taq PCR混合液10μL，上下游引物各1μL，模板DNA 4μL，无菌水4μL。PCR扩增条件为95℃预变性5分钟，94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒，进行35个循环。72℃最终延伸10分钟。

PCR扩增结束后，通过1％琼脂糖电泳对PCR扩增结果进行检测，结果如图所示。

(4)常规基因组DNA抽提与PCR扩增

使用常规的血液基因组DNA抽提试剂盒从相同的样品中抽提基因组，并在相同的条件下进行PCR扩增。

PCR扩增结束后，通过1％琼脂糖电泳对PCR扩增结果进行检测，结果如图所示。

实施例3

(1)实施例3中采用的溶液

A.样品裂解液c，所述样品裂解液配方为

裂解液c-1：10％ chelex-100，1％ TritonX-100；

裂解液c-2：10％ chelex-100，2％ TritonX-100.

B.2×Taq PCR混合液，配方如下

2×PCR Buffer；

3mM MgSO₄；

0.2mM dNTP；

0.1U/μL Taq DNA polymerase；

2×Loading Buffer.

其中所使用的2×PCR Buffer和6×Loading Buffer与实施例1中完全相同。

(2)提取毛发的基因组DNA。

1.取3-4根带毛囊的毛发，取其根部，放入1.5ml离心管中，加入30μl裂解液c和1μL Proteinase K，震荡，56℃水浴30min，100℃水浴8min。

2.12,000rpm离心3min，取上清液用于PCR反应。

(3)PCR反应

将上述获取的模板进行PCR扩增，上下游引物按大鼠的Actin基因设计，上游引物为5’-GGACTTCAGGGGGAATCACTAT-3’，下游引物为5’-TCTTTAGGTGTTTCTCAGCCATT-3’。所扩增的目的片段大小为284bp。

PCR反应体系为2×Taq PCR混合液10μL，上下游引物各1μL，模板DNA4μL，无菌水4μL。PCR扩增条件为95℃预变性5分钟，94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，进行35个循环。72℃最终延伸10分钟。

PCR扩增结束后，通过1.7％琼脂糖电泳对PCR扩增结果进行检测，结果如图所示。

实施例4

试剂盒的组装：分别将实施例1-3配置的裂解液a-2、b-2、c-1、中和液和2×Taq PCR混合液密封包装，置入盒中组装成试剂盒。分别对组装好的试剂盒按照相应的操作步骤进行检测，测试结果如图所示。

Claims (16)

1.一种生物样本DNA抽提用试剂盒，包括：

1)裂解液a：

裂解液a为含有下列溶质的水溶液：50-70v％PEG200、20-40mM KOH，裂解液酸碱度为pH13.2-13.8；

2)裂解液b：

裂解液b为含有下列溶质的水溶液：5wt％-10wt％ chelex-100；

3)裂解液c：

裂解液c为含有下列溶质的水溶液：5wt％-10wt％ chelex-100，1wt％-2wt％TritonX-100；

4)中和液：为pH6.8-7.5的190-210mmol/L Tris-HCl缓冲液。

2.如权利要求1所述生物样本DNA抽提用试剂盒，其特征在于，所述裂解液a酸碱度为pH 13.5-13.8。

3.如权利要求1所述生物样本DNA抽提用试剂盒，其特征在于，所述裂解液a含60％PEG200和20mM KOH，酸碱度为pH13.5。

4.如权利要求1所述生物样本DNA抽提用试剂盒，其特征在于，所述裂解液b含10％ chelex-100。

5.如权利要求1所述生物样本DNA抽提用试剂盒，其特征在于，所述中和液为pH6.8-7.5的200mmol/L Tris-HCl缓冲液。

6.如权利要求1-5任一权利要求所述生物样本DNA抽提用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括2×Taq PCR混合液。

7.如权利要求6所述生物样本DNA抽提用试剂盒，其特征在于，所述2×TaqPCR混合液的配方为：2×PCR Buffer；3-5mM MgSO₄；0.1-0.2mM dNTP；0.1-0.25U/μL Taq DNA polymerase；2×Loading Buffer。

8.如权利要求1-7任一权利要求所述试剂盒用于从样品中提取DNA或用于扩增样本DNA片段的用途。

9.一种从生物样品中提取DNA的方法，包括下列步骤：

1)选择权利要求1-7任一权利要求所述试剂盒中合适的裂解液与样本混合裂解样本；

2)将步骤1获得的混合液直接去除细胞碎片获得样本DNA。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤1中：

当所述生物样本选自：动物组织、植物组织、细菌和酵母时，选用裂解液a；

当所述生物样本选自：抗凝血液、血斑、凝固血块、细胞和口腔拭子时，选用裂解液b；

当所述生物样本选自：带毛囊的发根时，选用裂解液c和蛋白酶K裂解样本。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，选用裂解液a时，裂解液的裂解条件为：将样本与裂解液混合均匀后，在65℃下，裂解5-20分钟；选用裂解液b时，裂解液的裂解条件为：将样本与裂解液混合均匀后，在56℃下，裂解30分钟，100℃煮沸8分钟；选用裂解液c时，裂解液的裂解条件为：将样本与裂解液和蛋白酶K混合均匀后，在56℃下，裂解30分钟，100℃煮沸8分钟。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤1中，样本与裂解液的混合比例为：样本体积∶裂解液体积为0.05-0.1∶1。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，当步骤1选用裂解液a时，在步骤1将样本裂解后步骤2去除细胞碎片前还包括将样本裂解后的混合液直接采用所述试剂盒中的中和液中和。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，中和条件为：将样本裂解后的混合液与中和液混合均匀后，在室温下，中和1-2分钟。

15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤2获得样本DNA后，将获得的样本DNA与所述2×Taq PCR混合液以1-2∶5的体积比混合。

16.一种从生物材料中直接扩增DNA片段的方法，为先采用权利要求9-14任一权利要求所述方法获得样本DNA，而后将所获得的样本DNA与2×Taq PCR混合液、适量引物和水混合后进行PCR扩增。

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