CN105255861A - 直接提取牛奶中3种致病菌dna的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，主要包括溶液A，溶液A含有EDTA-2Na、NaOH、SDS、NaCl。该试剂盒试剂成分简单，无需用到溶菌酶、蛋白酶K，也没有用到毒性较大的苯酚、氯仿、乙醇等有机溶剂，成本低廉、操作简便。基于精心设计的提取液并结合微波法，发明人还建立了一种直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。该法改善了裂解细胞效果，同时简化了常规提取步骤，牛奶处理过程仅需在1个EP管中进行，整个提取过程缩短至30min内，所得模板可直接用于PCR反应，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，即可完成在短时间内对样品的检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学中DNA提取技术领域，尤其涉及一种直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法及试剂盒。
背景技术
乳房炎是奶牛场中最普遍也是造成经济损失最严重的疾病之一，该病引起牛奶产量和品质降低，治疗成本大大提高，奶牛过早淘汰，制约奶牛养殖业、乳品加工业的健康发展，危害公共卫生安全及人类健康，如何有效预防和控制该病已成为国内外关注的焦点。
病原细菌感染是引起该病的最主要原因，其中以大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、无乳链球菌(S.agalactiae)这三种病原菌为主要致病菌。致病菌的检测是乳房炎防控的前提条件，目前诊断奶牛乳房炎致病菌的方法基于牛奶中的微生物的培养和细菌生化试验，一方面工作量大，另外一方面耗时长。由于细菌培养方法的局限性，PCR方法已经得到了较为广泛的研究与应用，它大大提高了诊断奶牛乳房炎致病菌的效率，而DNA模板的制备直接影响到了PCR方法检测的速度与敏感性，通常直接从牛奶中分离纯度较高的目标致病菌的DNA是很难的，一般需要通过选择性增菌培养过程，这虽然提高了检测的敏感性，却大大降低了检测的速度。
近年来报道的直接提取牛奶中细菌DNA的方法，存在步骤繁杂、费时，需要昂贵的试剂及毒性等不足，限制了这些方法的推广与应用。因此，迫切需要建立一种便捷的从牛奶中提取乳房炎致病菌DNA的新方法，以便于配合早期诊断，为乳房炎诊断争取宝贵的时间，避免因诊断耗时而造成的进一步经济损失。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、方便、稳定、经济、无污染的直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法及试剂盒，适用于受奶牛乳房炎病原细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌污染的牛奶样品的DNA提取。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，主要包括溶液A，溶液A的组成为62.5-375mMEDTA-2Na、82.43-494.58mMNaOH(片状)、0.083-0.5％SDS、233mMNaCl。
溶液A的组成为323mMEDTA-2Na、426mMNaOH、0.1834％SDS、233mMNaCl。
上述直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒还包括溶液B，溶液B的组成为NaCl8g/L、KCl0.2g/L、KH2PO40.24g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L，用浓盐酸调pH至7.4。
上述直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，还包括溶液C、EP管(1.5mL)和灭菌棉签，溶液C为灭菌双蒸水。
使用上述试剂盒直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，3种致病菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌。
上述直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，包括以下步骤：
(1)取400μL牛奶和600μL溶液A，于1.5mLEP管中，充分混合；65℃温浴0-15min，充分混匀；微波功率700W，开盖微波3min，充分混匀；
(2)在12000r/min、4℃条件下，离心8min，弃上层，并用溶液B浸润灭菌棉签后，小心擦拭附着在管壁上的乳脂；
(3)加0.25-1.5mL溶液B，充分混匀，在10000r/min、4℃条件下，离心10min，弃上清。
步骤(1)中温浴时间为6min，步骤(3)中溶液B为1mL。
上述的直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，还包括以下步骤：
(4)加35μL溶液C，充分混匀，直接用于PCR或者-20℃保存。
针对现有牛奶中致病菌DNA提取方法存在的不足，发明人研发了一种直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，主要包括溶液A，溶液A的组成为62.5-375mMEDTA-2Na、82.43-494.58mMNaOH、0.083-0.5％SDS、233mMNaCl。该试剂盒试剂成分简单，无需用到溶菌酶、蛋白酶K，也没有用到毒性较大的苯酚、氯仿、乙醇等有机溶剂，成本低廉、操作简便。基于精心设计的提取液并结合微波法，发明人还建立了一种直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。该法改善了裂解细胞效果，同时简化了常规提取步骤，牛奶处理过程仅需在1个EP管中进行，整个提取过程缩短至30min内，所得模板可直接用于PCR反应，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，即可完成在短时间内对样品的检测。
本发明的主要原理是：溶液A中含有EDTA、NaOH、SDS和NaCl，首先将牛奶和温浴过的溶液A充分混合后，经较高温度(65℃)温浴一段时间后，有利于SDS裂解细胞，释放细胞核酸，同时使蛋白变性；NaOH使溶液A处于碱性环境利于EDTA溶解和细胞膜的变性。接着，在微波条件下，原本难裂解的革兰氏阳性菌细胞壁被裂解而释放核酸。NaCl溶液的终浓度为0.14M时DNA的溶解度最小。EDTA是二价金属离子的螯合剂，可结合钙离子和镁离子，能抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解，且EDTA可降低细胞膜的稳定性，与SDS协作下，更有利于DNA的提取。在低温高速离心条件将DNA沉淀，并将蛋白质，油脂，金属离子等分离。溶液B为洗涤液即PBS缓冲液，可洗涤上一步残留的油脂和溶液A，最后用灭菌双蒸水将DNA溶解。
本发明为配合快速PCR检测乳房炎病原菌提供了有效的手段。应用其进行牛奶致病菌DNA提取，具有比常规提取方法更便捷、经济的特点，适合实际操作，具有显著的经济与社会效益。
附图说明
图1是3种方案直接提取牛奶中3种致病菌DNA的PCR电泳图，图中：M是Marker；1-3为方案一，4-6为方案二，7-9为方案三，其中1、4、7泳道为大肠杆菌；2、5、8泳道为金黄色葡萄球菌；3、6、9泳道为无乳链球菌；10为阴性对照。
图2是应用本发明提取大肠杆菌的敏感性PCR电泳图，图中：M是Marker；1-8分别对应不同浓度的大肠杆菌，依次为4×107、4×106、4×105、4×104、4×103、4×102、4×101、4×100CFU/mL；9阳性对照模板DNA；10无细菌乳样阴性对照。
图3是应用本发明提取金黄色葡萄球菌的敏感性PCR电泳图，图中：M是Marker；1-8分别对应不同浓度的金黄色葡萄球菌，依次为2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104、2.5×103、2.5×102、2.5×101CFU/mL；9阳性对照模板DNA；10无细菌乳样阴性对照。
图4是应用本发明提取无乳链球菌的敏感性PCR电泳图，图中：M是Marker；1-8分别对应不同浓度的无乳链球菌，依次为7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、7×100CFU/mL；9阳性对照模板DNA；10无细菌乳样阴性对照。
图5是本发明提取方法的稳定性PCR电泳图，图中：M是Marker；1-7为大肠杆菌；8-14为金黄色葡萄球菌；15-21为无乳链球菌；22为阴性对照。
图6是应用本发明提取方法添加不同体积溶液A时，提取含等量金黄色葡萄球菌的奶样和肉汤的PCR电泳图，图中：M是Marker；1-8为含金黄色葡萄球菌奶样，分别对应不同体积溶液A，依次为0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mL；9-16为含金黄色葡萄球菌肉汤，分别对应不同体积溶液A，依次为0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mL；17为阴性对照。
图7是应用本发明提取多种微生物DNA的PCR电泳图，图中：M是Marker；1-8分别为蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、白色念珠菌；9为阴性对照。
具体实施方式
以下各例中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、蜡样芽孢杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、白色念珠菌由广西大学动物科学技术学院临床兽医学实验室提供；超高温灭菌(UHT)乳购买于超市。
实施例1试剂盒的制备
直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，主要包括溶液A、溶液B、溶液C、EP管(1.5mL)和灭菌棉签。其中，
溶液A的组成为323mMEDTA-2Na、426mMNaOH(片状)、0.1834％SDS、233mMNaCl；配制溶液A时，先将混合物充分混匀，然后置于-20℃5min，再置于65℃温浴，期间可颠倒混匀数次，至完全溶解。同样，使用溶液A前应先置于65℃温浴，数分钟至完全溶解。
溶液B的组成为NaCl8g/L、KCl0.2g/L、KH2PO40.24g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L，用浓盐酸调pH至7.4。
溶液C为灭菌双蒸水。
实施例23种方案直接提取牛奶中3种致病菌DNA的比较
方案一：试剂盒制备基本参照实施例1，其中，当溶液A的组成为312.5mMEDTA-2Na、412.3mMNaOH(片状)、0.167％SDS、233mMNaCl时；具体提取方法参照下述实施例3中的步骤。
方案二：试剂盒制备基本参照实施例1，其中，当溶液A的组成为375mMEDTA-2Na、494.6mMNaOH(片状)、0.167％SDS、233mMNaCl时；具体提取方法基本参照下述实施例3中的步骤，区别在于温浴时间为3min。
方案三：试剂盒制备参照实施例1，具体提取方法参照下述实施例3中的步骤。
结果：方案三，3种菌的条带均最亮。由图1可知，方案三，实施效果最好。
实施例3使用试剂盒直接提取牛奶中大肠杆菌DNA
(1)取400μL人工模拟奶样(仅含大肠杆菌)和600μL溶液A，于1.5mLEP管中，充分混合；65℃温浴6min，充分混匀；微波功率700W，开盖微波3min，充分混匀；
(2)在12000r/min、4℃条件下，离心8min，弃上层，并用溶液B浸润灭菌棉签后，小心擦拭附着在管壁上的乳脂；
(3)加1mL溶液B，充分混匀，在10000r/min、4℃条件下，离心10min，弃上清。
(4)加35μL溶液C，充分混匀，直接用于PCR或者-20℃保存。
结果：使用本发明提取牛奶中大肠杆菌的PCR检测敏感性为4×101CFU/mL，提取牛奶中不同浓度大肠杆菌的DNA，其PCR电泳结果如图2所示。其意义在于只要奶样中大肠杆菌浓度达到4×101CFU/mL时，即可提取到DNA并检出。
实施例4使用试剂盒直接提取牛奶中金黄色葡萄球菌DNA
DNA提取方法参照实施例3中的步骤。
结果：使用该方法提取牛奶中金黄色葡萄球菌的PCR检测敏感性为2.5×104CFU/mL，提取牛奶中不同浓度金黄色葡萄球菌的DNA，其PCR电泳结果如图3所示。其意义在于只要奶样中金黄色葡萄菌浓度达到2.5×104CFU/mL时，即可提取到DNA并检出。
实施例5使用试剂盒直接提取牛奶中无乳链球菌DNA
DNA提取方法参照实施例3中的步骤。
结果：使用该方法提取牛奶中无乳链球菌的PCR检测敏感性为7×103CFU/mL，提取牛奶中不同浓度无乳链球菌的DNA，其PCR电泳结果如图4所示。其意义在于只要奶样中无乳链球菌浓度达到为7×103CFU/mL时，即可提取到DNA检出。
实施例6使用试剂盒直接提取牛奶中3种致病菌DNA
DNA提取方法参照实施例3中的步骤。
结果：使用该方法提取牛奶中3种菌的DNA，结果稳定性一致，所提取的3种菌的DNAPCR电泳结果如图5所示。
实施例7使用试剂盒，添加不同体积溶液A，直接提取牛奶和菌液肉汤中金黄色葡萄球菌DNA
DNA提取方法参照实施例3中的步骤。
结果：使用该方法提取牛奶和菌液肉汤中的金黄色葡萄球菌DNA其PCR电泳结果如图6所示。由图可知，当溶液A体积较大时会降低检测效率，因此以菌液肉汤为参考，针对状态较差的奶样建议溶液A的添加范围为：0.1-0.4mL。
实施例8使用试剂盒直接提取牛奶中多种致病菌DNA
DNA提取方法参照实施例3中的步骤。
结果：使用该方法提取牛奶中8种菌(蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、白色念珠菌)的DNA，单重PCR电泳结果如图7所示。其意义在于该方法能够提取出被污染奶样中具有代表性的革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌DNA。
Claims (8)
1.一种直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，其特征在于主要包括溶液A，溶液A的组成为62.5-375mMEDTA-2Na、82.43-494.58mMNaOH、0.083-0.5％SDS、233mMNaCl。
2.根据权利要求1所述的直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，其特征在于所述溶液A的组成为323mMEDTA-2Na、426mMNaOH、0.1834％SDS、233mMNaCl。
3.根据权利要求2所述的直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，其特征在于还包括溶液B，溶液B的组成为NaCl8g/L、KCl0.2g/L、KH2PO40.24g/L、Na2HPO4·12H2O3.63g/L，用浓盐酸调pH至7.4。
4.根据权利要求3所述的直接提取牛奶中3种致病菌DNA的试剂盒，其特征在于还包括溶液C、EP管和灭菌棉签，溶液C为灭菌双蒸水。
5.使用权利要求4所述试剂盒直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，其特征在于：所述3种致病菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌。
6.根据权利要求5所述的直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取400μL牛奶和600μL溶液A，于1.5mLEP管中，充分混合；65℃温浴0-15min，充分混匀；微波功率700W，开盖微波3min，充分混匀；
(2)在12000r/min、4℃条件下，离心8min，弃上层，并用溶液B浸润灭菌棉签后，小心擦拭附着在管壁上的乳脂；
(3)加0.25-1.5mL溶液B，充分混匀，在10000r/min、4℃条件下，离心10min，弃上清。
7.根据权利要求6所述的直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，其特征在于步骤(1)中温浴时间为6min，步骤(3)中溶液B为1mL。
8.根据权利要求7所述的直接提取牛奶中3种致病菌DNA的方法，其特征在于还包括以下步骤：
(4)加35μL溶液C，充分混匀，直接用于PCR或者-20℃保存。
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