CN105087814A - 一种检测羊四种病原菌的多重pcr检测用引物及检测方法 - Google Patents

一种检测羊四种病原菌的多重pcr检测用引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法，所述引物分别为：肺炎克雷伯氏菌上下游引物、奇异变形杆菌上下游引物、大肠杆菌上下游引物和沙门氏菌上下游引物；所述检测方法采用引物，分别以肺炎克雷伯氏菌DNA、奇异变形杆菌DNA、大肠杆菌DNA、沙门氏菌DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将PCR？扩增反应产物加入上样缓冲液后，置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，验证引物的特异性。本发明的有益效果是：只需要常规仪器就可以具有高敏感性的分子检测方法，这种方法的检测敏感性高，同时不需要复杂的操作系统，可以在普通实验室条件下实施检测，并具有操作简单、敏感性高、快速等特点。

Description

一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法
技术领域
本发明涉及一种病原体检测技术，特别是用于检测羊体内肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的多重PCR检测用引物及多重PCR检测方法。
背景技术
近年来，随着我国养羊业向规模化、集约化方向发展以及各类畜禽疫病发病种类的不断增多，羊群疾病发生的种类在不断增加，而且发病率显著上升，肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、布氏杆菌和葡萄球菌等是导致羊群发病的主要细菌性病原菌（贾俊元，2009），而且细菌多重感染发生日益频繁、越来越普遍，给规模化养羊场造成巨大的经济损失，严重地威胁到羊养殖业的持续发展。牛钟相等(1996)报道了山羊“猝死症”是由肺炎克雷伯氏菌与凝结芽孢杆菌的混合感染导致，房海等在2005年报道了一起肺炎克雷伯氏菌导致小尾寒羊死亡。沙门氏菌和大肠杆菌都是目前世界公认的重要致病菌，包玉花等在2003年研究发现，羊大肠杆菌病一年四季均可发生，但多发于冬春舍饲时期，发病急、死亡快，可引起严重的腹泻和败血症，是危害我国养羊业的重要传染病之一；而薛俊龙2011年报道，羊大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种急性细菌性传染病，各种年龄的羊都易感，临床上以严谊腹泻和败血症为特征，在我国内蒙，青海，宁夏，云南，山西，山东等地，该病均有发生，加之从业人员技术水平却相对滞后，使得羊大肠杆菌病成为规模化养殖场的常见病和多发病，严重影响着养羊业的发展。
当前检测致病细菌方法还是以传统的细菌分离培养鉴定为主，然后进一步用免疫学方法进行血清分型及生化鉴定。传统细菌学检测方法每次仅能鉴定一种病原菌，检测周期长、灵敏度低，操作繁琐，因此，临床上迫切需要一种能够快速同时鉴定多种病原菌混合感染的检测方法。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种DNA扩增技术，一次可以检测多个基因，实现了对多种病原菌的同步检测。有研究以Salmonella的invA、ompC、IpaB和hilA基因，E.coli的HlyA、rfbE和phoA基因，K.pneumoniae的mrkA、mrkD基因为靶基因，建立单一或双重PCR方法检测不同的病原菌，对于肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌4种导致毛皮死亡病原菌的四重PCR检测方法国内外均未见有关报道。本发明建立一种能够同时检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌的四重PCR检测方法，为快速检测导致羊发病的致病菌，及时采取有效的防制措施提供依据。
随着分子生物学的发展，PCR已成为细菌检测的重要方法之一。多重PCR由Chamberian等于1988年提出以来，与常规PCR相比，多重PCR简化了检测程序，更为快捷和经济，在细菌混合感染检测上具有较大优势。应用PCR方法检测病原菌的关键是选择特异的保守基因作为靶基因，设计合适的引物，经综合分析，本研究选取肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因(mrkA)、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)、大肠杆菌碱性磷酸酶基因(PhoA)基因作为检测的靶基因。K.pneumoniaemrkA基因是其特有的编码Ⅲ型菌毛的基因；SalmonellainvA基因是编码侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门氏菌属特有的；E.coliphoA基因是其持家基因，存在于所有E.coli中；而P.aeruginosatoxR基因是其特有的毒素基因。因此，选取以上基因作为检测靶基因能够保证检测的准确性和特异性。多重PCR影响因素较多而且复杂，本研究选取对扩增效率影响较大的退火温度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶浓度和引物浓度5个参数进行优化，获得较好的敏感性结果，可同时扩增4条目的片段，最低检出限可达104cfu/mL。该方法临床验证结果与常规检测结果一致，具有较好的实际应用价值，对快速检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌具有重要价值，对预防由这4种病原菌引起的羊发病具有重要意义。
发明内容
针对现有技术检测羊细菌病多重感染时，检测周期长和敏感性低的缺点，本发明提供了一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法。可以同时检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，主要通过研究上述四种病原菌的特性，分别设计4对特异性引物进行多重PCR反应，扩增产物加入上样缓冲液后，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，通过检测结果即可判定上述四种病原菌是否存在，整个检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物，所述引物为：
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:2所示，
奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:3所示，
奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:4所示，
大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:5所示，
大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:6所示，
沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:7所示，
沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:8所示。
为了更好的实现发明目的，本发明还提供一种多重PCR检测方法，所述检测方法是用于非诊疗目的，包括采用如下引物：
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:2所示，
奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:3所示，
奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:4所示，
大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:5所示，
大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:6所示，
沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:7所示，
沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:8所示；
分别以肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的全基因组DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将获得的PCR扩增反应产物加入上样缓冲液后，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，验证引物的特异性。
所述引物为利用以肺炎克雷伯氏菌Ⅲ型菌毛结构基因、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因、大肠杆菌碱性磷酸酶基因设计的4对特异性引物。
所述多重PCR扩增反应的反应体系为每50μL反应体系中：5.0μL含Mg2+的10×PCRbuffer[750mmol/LTris-HCl(pH8.8)，200mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Tween20，25mmol/LMgCl2]、2.5mmol/L的dNTP5.0μL、5U/μL的Taq聚合酶0.5μL、肺炎克雷伯氏菌的DNA模板1μL、奇异变形杆菌的DNA模板1μL、大肠杆菌的DNA模板1μL、沙门氏菌的DNA模板1μL、引物分别为浓度均为25pmol/μL的肺炎克雷伯氏菌上游引物和肺炎克雷伯氏菌下游引物各1.2μL、浓度均为25pmol/μL的沙门氏菌上游引物和沙门氏菌下游引物各0.9μL、浓度均为25pmol/μL的大肠杆菌上游引物和大肠杆菌下游引物各0.8μL、浓度均为25pmol/μL的奇异变形杆菌上游引物和奇异变形杆菌下游引物各1.1μL。
所述肺炎克雷伯氏菌为肺炎克雷伯菌ATCC700603，沙门氏菌为ATCC14028伤寒沙门氏菌，大肠杆菌为ATCC8739大肠埃希氏菌，奇异变形杆菌为ATCC12453奇异变形杆菌。
所述多重PCR扩增反应的条件为：上样缓冲液浓度为1×，dNTPs浓度为0.25mmol/L，Mg2+浓度为2.5mmol/L，退火温度55℃，延伸时间45s，循环次数30次。
所述上样缓冲液为：含0.25wt％的溴酚蓝，0.25wt％的二甲苯青、40wt％的蔗糖，余量为水。
所述上样缓冲液与PCR扩增反应产物体积比为1:5。
所述含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中含0.5ug/mL的溴化乙锭、1.5wt％的琼脂糖和2vt%的TAE。
所采用的上样缓冲液与DNA结合后可以平衡掉DNA中原有电荷，使结合物带上相同的负电荷，从而可以使DNA在电场中移动速度只取决于DNA分子大小；同时上样缓冲液以溴酚蓝为指示剂，稀释后比重仍然较大，加样后易下沉，便于加样，且颜色清晰可见，起到电泳指示的作用，上述缓冲液与对应的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶可以使电泳的结果更好的反应出来。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明选择肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因、大肠杆菌碱性磷酸酶基因基因作为检测的靶基因，是由于肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因是其特有的编码Ⅲ型菌毛的基因；沙门氏菌侵袭性抗原保守基因是编码侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门氏菌属特有的；大肠杆菌碱性磷酸酶基因基因是其持家基因，存在于所有大肠杆菌中；而奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因是其特有的毒素基因。因此，选取以上基因作为检测靶基因能够保证检测的准确性和特异性。只需要常规仪器就可以具有高敏感性的分子检测方法，这种方法的检测敏感性高，同时不需要复杂的操作系统，可以在普通实验室条件下实施检测，并具有操作简单、敏感性高、快速等特点。可同时扩增4条目的片段，最低检出限可达104cfu/mL。可以同时检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌。
附图说明
图1为引物特异性检测结果显示图，
图中M为DL2000Marker，1-4为大肠杆菌，5-9为肺炎克雷伯氏菌，9-12为奇异变形杆菌，13-16为沙门氏菌，17-20为葡萄球菌，21-24为多杀性巴氏杆菌，25为Negativecontrol；
图2为以不同稀释度的大肠杆菌DNA为模板利用特异性引物进行PCR反应的结果显示图，
图中M为DL2000Marker，1-9分别为稀释浓度为108-100cfu/mL的大肠杆菌DNA，通过结果可知大肠杆菌的最低检出率均为102cfu/mL；
图3为以不同稀释度的肺炎克雷伯氏菌DNA为模板利用特异性引物进行PCR反应的结果显示图，
图中M为DL2000Marker，1-9分别为稀释浓度为108-100cfu/mL的肺炎克雷伯氏菌DNA，通过结果可知肺炎克雷伯氏菌的最低检出率均为103cfu/mL；
图4为以不同稀释度的奇异变形杆菌DNA为模板利用特异性引物进行PCR反应的结果显示图，
图中M为DL2000Marker，1-9分别为稀释浓度为108-100cfu/mL的奇异变形杆菌DNA，通过结果可知奇异变形杆菌的最低检出率均为102cfu/mL；
图5为以不同稀释度的沙门氏菌DNA为模板利用特异性引物进行PCR反应的结果显示图，
图中M为DL2000Marker，1-9分别为稀释浓度为108-100cfu/mL的沙门氏菌DNA，通过结果可知沙门氏菌的最低检出率均为102cfu/mL；
图6为以多种细菌DNA为模板，采用本发明所述多重PCR反应体系进行扩增结果显示图；
图中M为DL2000Marker，A为大肠杆菌，B为肺炎克雷伯氏菌，C为奇异变形杆菌，D为沙门氏菌，E为变形杆菌，F为葡萄球菌，G为副禽嗜血杆菌，H为禽多杀性巴氏杆菌，5为ABCD菌混合物（每种菌DNA各1μL），6为BEFGH菌混合物（每种菌DNA各1μL），7为CEFGH菌混合物（每种菌DNA各1μL），8为AEFGH菌混合物（每种菌DNA各1μL），9为DEFGH菌混合物（每种菌DNA各1μL），10为ABCDEFGH菌混合物（每种菌DNA各1μL），15为EFGH菌混合物（每种菌DNA各1μL），16为空白阴性对照；
图7为对相同稀释度的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和沙门氏菌基因组DNA混合物进行的多重PCR反应扩增的结果显示图；
图中M为DL2000Marker，1-9分别为108-100cfu/mL稀释浓度的四种菌基因组DNA混合物。
具体实施方式
针对现有技术检测羊细菌病多重感染时，检测周期长和敏感性低的问题，本发明提供一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法。
以下提供本发明的具体实施方式，本发明的检测方法在200μL的离心管中进行，所使用的引物及试剂如下：
1）本发明所用的引物为：
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:2所示，
奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:3所示，
奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:4所示，
大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:5所示，
大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:6所示，
沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:7所示，
沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:8所示。
2）所用的上样缓冲液为：含0.25wt％的溴酚蓝，0.25wt％的二甲苯青、40wt％的蔗糖、余量为水。
其具体的操作方法如下：
各种试剂均采购自宝生物公司。
实施例1单重PCR反应
将过夜培养的肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)抽提细菌的基因组DNA，用来进行PCR扩增。其中所述的肺炎克雷伯氏菌选自肺炎克雷伯菌ATCC700603，沙门氏菌选自ATCC14028伤寒沙门氏菌，大肠杆菌选自ATCC8739大肠埃希氏菌，奇异变形杆菌选自ATCC12453奇异变形杆菌。
单重PCR扩增反应体系(50μL)为：5.0μL含Mg2+的10×PCRbuffer[750mmol/LTris-HCl(pH8.8)，200mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Tween20，25mmol/LMgCl2]、2.5mmol/L的dNTP5.0μL、5U/μL的Taq聚合酶0.5μL、上下游引物各1μL(每种引物浓度为25pmol/μL)，用水补齐至50μL。
反应条件为：预变性94℃7min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；产物末端72℃延伸10min。PCR产物加入上样缓冲液后，再置于含0.5ug/mL溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中，进行电泳检测。
通过本发明设计的4对引物对待测物进行单一PCR扩增，电泳图结果如图1所示，本发明设计的4对引物仅对其对应的目的菌的基因组发生特异性反应，在相应位置出现特异性条带。
4种病原菌敏感性的检测均采用本发明中与之对应的特异性引物，采用上述相同的单重PCR扩增反应体系和条件进行扩增；同时将过夜培养的4种病原菌分别计数，以生理盐水将其浓度分别调整为108cfu/mL，并进行10倍梯度稀释，利用上述的PCR扩增检测其灵敏度。反应结果如图2—图5所示，奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌的最低检出率均为102cfu/mL，肺炎克雷伯氏菌最低检出率为103cfu/mL。
实施例2多重PCR反应
过夜培养各参试菌，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)抽提细菌的基因组DNA，并用于PCR扩增。所采用的各参试菌中，其中所述的肺炎克雷伯氏菌选自肺炎克雷伯菌ATCC700603，沙门氏菌选自ATCC14028伤寒沙门氏菌，大肠杆菌选自ATCC8739大肠埃希氏菌，奇异变形杆菌选自ATCC12453奇异变形杆菌。其他菌E为普通变形杆菌ATCC49132，F为葡萄球菌ATCC6538金黄色葡萄球菌，G为单增李斯特氏菌ATCC19114单增李斯特氏菌，H为绿脓杆菌ATCC9027绿脓杆菌。
引物为利用以肺炎克雷伯氏菌Ⅲ型菌毛结构基因、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因、大肠杆菌碱性磷酸酶基因设计的4对特异性引物；
其中引物序列为：
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:2所示，
奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:3所示，
奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:4所示，
大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:5所示，
大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:6所示，
沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:7所示，
沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:8所示；
采用上述4对引物，分别以肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的全基因组DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将获得的PCR扩增反应产物加入上样缓冲液后（上样缓冲液与PCR扩增反应产物体积比为1:5），再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，验证引物的特异性。
上样缓冲液为：含0.25wt％的溴酚蓝，0.25wt％的二甲苯青、40wt％的蔗糖、余量为水。
多重PCR反应条件为：预变性94℃7min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；产物末端72℃延伸10min。
多重PCR扩增反应体系，每50μL为：5.0μL含Mg2+的10×PCRbuffer[750mmol/LTris-HCl(pH8.8)，200mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Tween20，25mmol/LMgCl2]、2.5mmol/L的dNTP5.0μL、5U/μL的Taq聚合酶0.5μL、模板为参试菌的DNA各1μL、引物分别为肺炎克雷伯氏菌上下游引物各1.2μL、沙门氏菌上下游引物各0.9μL、大肠杆菌上下游引物各0.8μL、奇异变形杆菌上下游引物各1.1μL；每种引物浓度均为25pmol/μL；
含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中含0.5ug/mL的溴化乙锭、1.5wt％的琼脂糖和2vt%的TAE。
从检测结果可知：大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和沙门氏菌均出现目的条带，而其他非目的菌均未扩增出任何片段（如图6所示），表明该方法具有良好的特异性；
对于该多重PCR的敏感性检测，利用相同稀释度的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和沙门氏菌基因组DNA混合物进行多重多重PCR反应体系进行扩增以测定多重PCR检测时各菌的最低检出限，结果如图7所示：
最终结果可知对于本发明给出的多重PCR检测方法，肺炎克雷伯氏菌的最低检出限为5.00×104cfu/mL，沙门氏菌为3.40×103cfu/mL，大肠杆菌为2.00×104cfu/mL，奇异变形杆菌为1.80×104cfu/mL。
实施例3临床检测
随机选取保存的羊病料20份，分别将组织液在肉汤培养基中进行增菌培养，经增菌培养，分离的各病原菌含量均在106cfu/mL以上。提取细菌基因组DNA，利用实施例2中的方法进行多重PCR扩增。同时进行常规细菌分离鉴定作为对照。
多重PCR扩增结果显示，13个样品扩增出约600bp条带可见其含有肺炎克雷伯氏菌，10个样品扩增出约380bp条带，可见其含有奇异变形杆菌；8个样品扩增出约974bp条带，可见其含有大肠杆菌；8个样品扩增出约280bp条带，可见其含有沙门氏菌。从结果分析可知，有的样本存在不同病原菌混合感染的情况，并且该结果与常规细菌分离鉴定确诊的病原菌种类一致，可见本发明提供的多重PCR检测方法具有敏感性高、特异性好、操作简便、迅速的特点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>山东农业大学
<120>一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法
<160>8
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
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<213>人工序列
<400>2
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<211>21
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<213>人工序列
<400>3
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<400>4
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<400>5
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<400>7
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<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
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Claims (9)

1.一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物，其特征在于，所述引物为：
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:2所示，
奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:3所示，
奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:4所示，
大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:5所示，
大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:6所示，
沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:7所示，
沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SEDIDNO:8所示。
2.一种利用权力要求1所述的检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物的多重PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌上游引物、肺炎克雷伯氏菌下游引物、奇异变形杆菌上游引物、奇异变形杆菌下游引物、大肠杆菌上游引物、大肠杆菌下游引物、沙门氏菌上游引物和沙门氏菌下游引物，分别以肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的全基因组DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将获得的PCR扩增反应产物加入上样缓冲液后，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，验证引物的特异性。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述引物为分别利用肺炎克雷伯氏菌Ⅲ型菌毛结构基因、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因或大肠杆菌碱性磷酸酶基因设计的4对特异性引物。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的反应体系为每50μL反应体系中：含Mg2+的10×PCRbuffer5.0μL、2.5mmol/L的dNTP5.0μL、5U/μL的Taq聚合酶0.5μL、肺炎克雷伯氏菌的DNA模板1μL、奇异变形杆菌的DNA模板1μL、大肠杆菌的DNA模板1μL、沙门氏菌的DNA模板1μL、引物分别为浓度均为25pmol/μL的肺炎克雷伯氏菌上游引物和肺炎克雷伯氏菌下游引物各1.2μL、浓度均为25pmol/μL的沙门氏菌上游引物和沙门氏菌下游引物各0.9μL、浓度均为25pmol/μL的大肠杆菌上游引物和大肠杆菌下游引物各0.8μL、浓度均为25pmol/μL的奇异变形杆菌上游引物和奇异变形杆菌下游引物各1.1μL。
5.根据权利要求2-4任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述肺炎克雷伯氏菌为肺炎克雷伯菌ATCC700603，沙门氏菌为ATCC14028伤寒沙门氏菌，大肠杆菌为ATCC8739大肠埃希氏菌，奇异变形杆菌为ATCC12453奇异变形杆菌。
6.根据权利要求2-5任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的条件为：上样缓冲液浓度为1×，dNTPs浓度为0.25mmol/L，Mg2+浓度为2.5mmol/L，退火温度55℃，延伸时间45s，循环次数30次。
7.根据权利要求2-6任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述上样缓冲液为：含0.25wt％的溴酚蓝，0.25wt％的二甲苯青、40wt％的蔗糖、余量为水。
8.根据权利要求2-7任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述上样缓冲液与PCR扩增反应产物体积比为1:5。
9.根据权利要求2-8任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中含0.5ug/mL的溴化乙锭、1.5wt％的琼脂糖和2vt%的TAE。
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