CN103146827A - 用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华菌的多重pcr引物及其设计方法 - Google Patents
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Abstract
用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华菌的多重PCR引物及其设计方法，涉及沙门氏菌等的检测。沙门氏菌引物对应的PCR扩增片段为526bp，弗氏枸橼酸杆菌引物对应的PCR扩增片段为161bp，奇异变形杆菌引物对应的PCR扩增片段为396bp，迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段为330bp。1设计多重PCR引物组合；2对引物组合中的引物进行筛选，保留不能合成引物二聚体的引物；3判断所保留引物的竞争优劣状态，将步骤2保留不能合成引物二聚体的引物的GC%和碱基数进行比较，选取GC含量高的判断为竞争状态优势引物，转步骤5；否则转步骤4；4再次筛选竞争状态劣的引物；5对竞争状态优引物扩增。
Description
技术领域
本发明涉及沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的检测，尤其是涉及一种用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物及其设计方法。
背景技术
沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、迟缓爱德华菌均属于肠杆菌科，可通过食物、伤口传播。除了引起食物中毒还能引起人和动物机体的多系统感染。
沙门氏菌为肠杆菌科细菌较早的成员，具有呼吸和发酵两种代谢类型，存在于温血及冷血动物体内、食物和环境中，是一种常见的病原菌，可以引起伤寒、肠伤寒、胃肠炎和败血症等相关疾病。沙门菌的血清型很多，给鉴定带来很大困难。沙门菌在自然界分布比较广泛，在外界环境中能生存较久，在水和土壤中能生存数周到数月，在冰库中甚至能存活半年以上。近年来，由于抗生素的滥用，该菌对氯霉素的耐药菌株明显增多，有的菌株对庆大霉素、卡那霉素、氨苄青霉素等也耐药，这使得食品安全中对该菌的检测投入了大量的人力物力。
弗氏枸橼酸杆菌，也被称为弗氏柠檬酸杆菌。曾被归于埃希菌属。柠檬酸杆菌属的细菌，具有如肠杆菌科的菌体、表面和鞭毛的相应抗原，有研究表明，柠檬酸杆菌中许多血清型的抗原与沙门菌属和埃希菌属的抗原有关，这个也给常规鉴定带来了一定困难。弗氏枸橼酸杆菌在自然界广泛分布，是人和多种动物包括哺乳类、鸟类、爬行类和两栖类的肠道常在菌，常见于粪便和被粪便污染的地方，也常见于土壤、水体和食物中，所以该菌也列在了大肠菌群。作为环境和食品等的粪源污染的卫生细菌学指标。该属的细菌作为人的条件致病菌，看在社区或者医院内发生感染，大多数感染部位是尿路和呼吸道，还可引起败血症、脑膜炎、骨髓炎、中耳炎及心内膜炎，在一定的数量下，还能引起食物中毒。对动物的致病性有明确记述的主要是鱼类，最近也有甲壳类和爬行类感染的报道，死亡率较高，对水产养殖影响不小，当前分子生物学鉴定还局限于对该菌的16SrRNA基因序列测定与系统发育学分析，时间周期太长，无法应用于日常监测和检测。
奇异变形杆菌亦被称作奇异杆菌，是变形杆菌属中较早的成员，对人类可引起原发性或继发性感染，也可以导致人类食物中毒，对动物也有致病作用。该属的细菌广泛存在于自然界中，尤其以奇异变形杆菌更为常见，它是一种已被确定的病原菌，或是单独或是与其他病原菌混合感染引起人的不同类型感染症，也是人尿路感染的一种主要病原，有的菌株还引起食物中毒，在呼吸道、消化道以及烧伤创面感染中的检出率也不断增加，是一种常见的医院感染菌。最重要的是，奇异变形杆菌能产生耐热肠毒素，引起相应的胃肠炎性食物中毒。
迟缓爱德华菌在试爱德华均属细菌中最早的成员，该菌能在特定条件下引起人的多种类型感染，也是鱼类常见的病原细菌，广泛存在于自然界中，此菌多从腹泻病人的粪便中分离到，而在健康人群的粪便中是极少分离到的。迟缓爱德华菌还能引起人的脑膜炎、腹膜炎、菌血症、败血症、皮肤软组织感染，发生肠道感染的临床表现类似沙门氏菌，虽然该菌被认定为人、鱼共染病原菌，但是主要发生在鱼类，甲壳类也是常见宿主，对养殖产业造成巨大影响。
目前，国内对沙门菌的检测已经有了相应的国家标准，分为以下几个过程:(1)前增菌；(2)选择性增菌；(3)选择性培养；(4)生化鉴定；(5)血清学实验。但国标方法步骤繁琐，费时费力，重复性不好，且弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的检测还没有建立相应的标准。因此，建立简便、快速、准确、可靠、的检测方法同时适用于这四种的检测，弥补目前检测方法的不足尤为重要。
多重PCR技术的应用，可大大减少检测成本，可大大减少工作量，适应于口岸快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR势在必行。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。一个反应常有25～35个循环，一个循环包含3个步骤，首先使模板DNA双链在94～95℃变性为单链，然后在较低温度下，使引物与模板结合，接着在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA互补链。可看作生物体外的特殊DNA复制。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段。多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂盒操作过程与一般PCR相同。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改造，于一个PCR反应体系中加多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR在一次反应中就能同时扩增一个基因的多个靶序列。多重PCR最先是在1988年就被Chamberlain（Chamberlain JS.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophylocus via multiplex DNA amplification[J].Nucleic Acids Research，1988，16：11141-11156）所提出，在这短短22个年头之内，它已经在DNA检测的多个领域得到成功的应用。具体包括检测基因突变、缺失等多态，定量PCR，反转录PCR。Henegariu在1997年设计出了多重PCR步步优化协议，指导怎样多重PCR的反应体系。但是多重PCR最大的问题还是存在于引物的设计上。和一般PCR相比较，多重PCR在同一PCR反应管内同时扩增出多个病原的基因片段，一次完成多个模板的扩增。多重PCR的系统性主要体现在它能够根据需求一次性扩增出所有的相关基因，将大大节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
多重PCR检测技术在一次反应中就能同时扩增一个模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。以其快速、高效，特异性好、灵敏度高的特点，在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用；但多重PCR在提高食品微生物检测灵敏度、去除食品抑制因子的干扰，提高卫生标准及加强技术人员水平上仍有许多问题需要解决。多重PCR改进技术简化了食品微生物检测过程、缩短检测时间、降低检测成本同时提高了食品微生物检测的灵敏度；但是多重PCR的改进技术也存在一定问题。未来的研究主要集中在改进样品前处理技术、去除食品抑制因子干扰，其次是多重PCR与其它技术的整合应用，如多重PCR与变性梯度凝胶电泳、基因芯片、荧光探针定量技术、免疫磁珠吸附等技术结合应用，进一步提高食品微生物检测的灵敏度、可重复性，实现大批量食品检测、复杂样品基质中的多种微生物的有效检测、食品微生物检测的标准化，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
PCR是一种模拟体内DNA复制过程的技术，由于具有快速、特异和敏感等特点，近年来在猪病诊断上得到广泛应用。多重PCR是一种特殊PCR形式，比单一PCR反应更快捷、更节约，其最突出的特点，即一次PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的使用价值。
多重PCR技术的应用，可大大减少检测成本，可大大减少工作量，适应于口岸快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR势在必行。这对于加强进出口水产品中弧菌的快速检验检疫、水产养殖病害的调查和防治、无公害水产品检测和生产以及水产品卫生质量监督检验等方面都具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决快速检测进出口水生动物及其产品中的沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌，提供一种用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物及其设计方法，所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物在同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的应用中具有简单、灵敏、快速、特异的优点。
所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物为：
S.spp.F1：5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’；
S.spp.R1：5’-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3’；
C.freu.F1：5’-AACATAGCGATGGACAACTGA-3’；
C.freu.R1：5’-TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3’；
P.mira.F1：5’-TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3’；
P.mira.R1：5’-TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3’；
E.tarda.F1：5’-CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3’；
E.tarda.R1：5’-GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3’。
其中，S．spp.为沙门氏菌的英文缩写，C．freu.为弗氏枸橼酸杆菌的英文缩写,P．mira.为奇异变形杆菌的英文缩写，E．tarda.为迟缓爱德华菌的英文缩写；
S.spp.F1和S.spp.R1为根据沙门氏菌FimA基因设计的上游引物F1和下游引物R1；C.freu.F1和C.freu.R1为根据弗氏枸橼酸杆菌Idh基因设计的上游引物F1和下游引物R1;P.mira.F1和P.mira.R1为根据奇异变形杆菌IdsC基因设计的上游引物F1和下游引物R1；E.tarda.F1和E.tarda.R1为根据迟缓爱德华菌FimA基因设计的上游引物F1和下游引物R1；
所述沙门氏菌引物对应的PCR扩增片段大小为526bp，弗氏枸橼酸杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为161bp，奇异变形杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为396bp，迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为330bp。
所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，包括以下步骤：
步骤1，利用引物设计软件设计同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20～24个，引物组合的熔解温度Tm值为52～62℃，引物组合的GC%为40%～60%；
步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不能合成引物二聚体的引物；
步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将步骤2所述保留不能合成引物二聚体的引物的GC%和碱基数进行比较，选取GC含量高的判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；否则判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4；
步骤4，再次筛选竞争状态劣的引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；
步骤5，利用PCR方法对竞争状态优引物进行扩增。
在步骤1中，所述所用的引物设计软件为Primer Premier5.0，所述多重PCR引物组合的熔解温度Tm值为60℃。
在步骤2中，所述对引物组合中的引物进行筛选的具体步骤可为：对所用的引物进行PCR扩增，筛选扩增效果最好的引物组合；所述不能形成引物二聚体的引物的碱基数目为20～24。
在步骤5中，所述PCR方法的变性温度可94℃，退火温度可为60℃，延伸温度可72℃。
本发明的有益效果如下：
采用本发明建立的多重PCR技术同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的方法，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点,只需一个PCR反应就可同时检测出沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌，通过应用该方法对肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品等50份样品的检测，同时与常规方法检测进行比较。多重PCR方法检测出1份沙门氏菌阳性，与常规细菌分离鉴定结果完全吻合。本发明可大大加快沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的检测。
采用本发明多重PCR技术同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的方法，具有简单、灵敏、快速、特异等优点，在食品卫生安全、公共卫生安全及口岸卫生检疫中都有重要意义。可应用于日常食品中四种细菌的快速检测，同时应用于口岸部门进出口食品中四种细菌的快速验放以及突发食物中毒事件的应急反应。目前未见国内外利用该技术检测食品中沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的报道。该技术可用于食品中这4种细菌的污染情况调查，可有效预防和控制相关食源性疾病的发生，有助于建设食品安全检测与食品安全监管，打造食品“放心工程”，有利于快速查找食品安全中毒事件的原因，符合科技发展规划倡导的食品质量与安全控制精神，让人们吃上健康食物，建设和谐社会。
附图说明
图1为多重PCR反应退火温度优化。在图1中，M，DL1500；1，58℃；2，59℃；3，60℃；4，61℃；5，62℃；6，63℃；7，64℃；8，65℃。
图2为多重PCR引物体积优化。在图2中，M，DL1500；1，0.8μL；2，1.0μL；3，1.2μL；4，1.4μL；5，1.6μL；6，1.8μL；7，2.0μL；8，2.2μL。
图3为多重PCR反应镁离子优化。在图3中，M，DL1500；1，1.25μL；2，1.5μL；3，1.75μL；4，2.0μL；5，2.5μL。
图4为多重PCR体系dNTP优化。在图4中，M，DL1500；1，1.0μL；2，1.5μL；3，2.0μL；4，2.5μL；5，3.0μL；6，3.5μL。
图5为多重PCR体系灵敏度试验。在图5中，M，DL1500；1:阴性对照；2～6:模板核酸101～106倍稀释。
图6为多重PCR引物特异性试验。在图6中，M，DL1500；1，沙门氏菌；2，弗氏枸橼酸杆菌；3，奇异变形杆菌；4，迟缓爱德华菌；5，绿脓杆菌；6:大肠杆菌；7，溶藻弧菌；8，副溶血弧菌；9，阴沟肠杆菌。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但附图和具体实施例不应理解为是对本发明进行的限定。
所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，包括以下步骤：
a）利用Primer Premier5.0引物设计软件设计同时扩增沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重引物组合；
b）筛选多重引物组合中PCR检测沙门氏菌的引物；
c）筛选多重引物组合中PCR检测弗氏枸橼酸杆菌的引物；
d）筛选多重引物组合中PCR检测奇异变形杆菌的引物；
e）筛选多重引物组合中PCR检测迟缓爱德华菌的引物
f）筛选多重PCR技术同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的引物组合。
在步骤a）中，所涉及的引物为参照GenBank上发表（S.spp.FimA为GenBank M18283，C.freu.Idh为GenBank DQ991236.1，P.mira.IdsC为GenBank EU635876，E.tarda.FimA为GenBank AF491964）的沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的基因序列，应用Primer Premier5.0设计的同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的特异性引物组合。
在步骤b）、c）、d）和e)中，经过筛选，得出沙门氏菌引物对应的PCR扩增片段大小为526bp，弗氏枸橼酸杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为161bp，奇异变形杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为396bp，迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为330bp；具体引物序列如下：
S.spp.F1：5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’；
S.spp.R1：5’-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3’；
C.freu.F1：5’-AACATAGCGATGGACAACTGA-3’；
C.freu.R1：5’-TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3’；
P.mira.F1：5’-TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3’；
P.mira.R1：5’-TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3’；
E.tarda.F1：5’-CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3’；
E.tarda.R1：5’-GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3’。
在步骤f）中，多重PCR技术同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌方法最佳反应条件的测定，分别利用4对引物进行4种细菌多重PCR方法最佳退火温度、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、模板浓度等的测定，然后根据实验结果进行多重PCR方法最佳循环次数的测定；多重PCR技术同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌方法的反应体系为12.5μL，具体如下：10×PCR Buffer1.25μL，25mmol/L MgCl22μL，10mmol/L dNTP2.5μL，20μmol/L的四种细菌的上下游引物混合物添加量依次为沙门氏菌0.72μL，弗氏枸橼酸杆菌0.21μL，奇异变形杆菌0.21μL，迟缓爱德华菌0.54μL，5u/μL Taq酶0.075μL，ddH2O0.995μL，4种细菌的DNA模板各1μL。扩增条件为94℃4min；94℃35s，60℃40s，72℃40s35循环；72℃7min。
1、摸索细菌模板提取方法
参照《精编分子生物学实验指南》采用传统方法（酚-氯仿提取法）、直接菌体加入法、反复冻融法、热裂解法和试剂盒提取法5种方法分别对细菌DNA进行提取，并将提取的DNA模板进行PCR扩增，对结果进行对照，选出最佳提取方法。其中试剂盒提取法、热裂解法和传统提取法提取效果相同，并且在这5种提取方法中，这3种提取方法效果较好。但是传统方法操作较为烦琐，热裂解法提取的DNA纯度太低，因此最终选择试剂盒提取法为最佳提取方法。
2、多重PCR一步法技术同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌方法的建立
将沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌菌株分别接种到营养肉汤培养基中，过夜培养后，按商业化试剂盒提取法制备菌体DNA模板溶液，进行PCR扩增。反应体系为12.5μL，具体如下：10×PCR Buffer1.25μL，25mmol/L MgCl22μL，10mmol/LdNTP2.5μL，20μmol/L的四种细菌的上下游引物混合物添加量依次为沙门氏菌0.72μL，弗氏枸橼酸杆菌0.21μL，奇异变形杆菌0.21μL，迟缓爱德华菌0.54μL，5u/μL Taq酶0.075μL，ddH2O0.995μL，4种细菌的DNA模板各1μL。扩增条件为94℃4min；94℃35s，60℃40s，72℃40s35循环；72℃7min。取PCR扩增产物5μL进行琼脂糖（3%）电泳检测扩增结果。
3、多重PCR一步法最佳反应条件的摸索
分别利用4对引物进行4种细菌多重PCR方法最佳退火温度、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度的测定，然后根据实验结果进行多重PCR方法最佳循环次数的测定。
结果测得多重PCR一步法，退火温度以60℃最佳，见图1；
引物加入梯度为0.8μL、1.0μL、1.2μL、1.4μL、1.6μL、1.8μL、2.0μL、2.2μL，最终确定各引物组分浓度如下：沙门氏菌上下游引物添加量为0.72μL；弗氏枸橼酸杆菌上下游引物添加量为0.21μL；奇异变形杆菌上下游引物添加量为0.21μL；迟缓爱德华菌上下游引物添加量为0.54μL，见图2；
多重PCR一步法镁离子浓度为在12.5μL的反应体系中，设计25mM Mg2+梯度为1.25、1.5、1.75、2.0、2.25μL通过比较，最终选择2.0μL为最佳添加量，见图3；
2.5mmol/L dNTP的剂量25mM Mg2+梯度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL，最终选择2.5μL作为最佳添加量，见图4。
4、多重PCR一步法灵敏度检测
取37℃培养18h的沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌菌液做10倍梯度稀释，稀释至10-7，各稀释度菌液平板计数参照国标法（GB/T4789.2-2003)进行细菌计数，四种目的菌的个数为沙门氏菌：8.9×108cfu/ml,弗氏枸橼酸杆菌：7.2×108cfu/ml,奇异变形杆菌：5.7×108cfu/ml,迟缓爱德华菌：6.4×108cfu/ml。选择提取效果较好的方法提取各个不同稀释度的菌体DNA模板，然后用优化好的PCR体系进行灵敏度的检测。从结果中可知,体系的检测灵敏度为：沙门氏菌89cfu,弗氏枸橼酸杆菌7cfu,奇异变形杆菌57cfu，迟缓爱德华菌6cfu。见图5。
5、多重PCR一步法特异性测定
分别对沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、迟缓爱德华菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、阴沟肠杆菌进行DNA提取，利用所选择的最佳条件分别进行多重PCR扩增，以检测其特异性。结果9个菌株中只有沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌能扩增出相应的片段，分别在161bp、330bp、396bp、526bp有4条扩增带，说明本研究建立的方法特异性好。见图6。
6、多重PCR一步法稳定性测定
按照以上摸索的最优条件将除模板以外的PCR反应体系混合后分装，放-20℃中冻存，按照最佳反应条件定期取出检测。检测期间将预先混合好的PCR混合物放置-20℃条件下保存1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月仍能扩增出和现配的PCR混合物一样清晰的条带，通过一年的检测可以看出该试剂的稳定性较好，至少能保持一年以上。
7、多重PCR一步法临床检测
肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品等50份样品，用多重PCR技术检测，同时与常规方法检测进行比较。PCR检测出1份样品为沙门氏菌阳性，与常规细菌分离鉴定结果完全吻合。
可以理解，很多细节的变化是可能的，但这并不因此违背本发明的范围和精神，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化，皆应视为不脱离本发明专利的范畴。
Claims (7)
1.用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物，其特征在于为：
S.spp.F1：5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’；
S.spp.R1：5’-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3’；
C.freu.F1：5’-AACATAGCGATGGACAACTGA-3’；
C.freu.R1：5’-TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3’；
P.mira.F1：5’-TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3’；
P.mira.R1：5’-TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3’；
E.tarda.F1：5’-CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3’；
E.tarda.R1：5’-GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3’；
其中，S．spp.为沙门氏菌的英文缩写，C．freu.为弗氏枸橼酸杆菌的英文缩写,P．mira.为奇异变形杆菌的英文缩写，E．tarda.为迟缓爱德华菌的英文缩写；
S.spp.F1和S.spp.R1为根据沙门氏菌FimA基因设计的上游引物F1和下游引物R1；C.freu.F1和C.freu.R1为根据弗氏枸橼酸杆菌Idh基因设计的上游引物F1和下游引物R1;P.mira.F1和P.mira.R1为根据奇异变形杆菌IdsC基因设计的上游引物F1和下游引物R1；E.tarda.F1和E.tarda.R1为根据迟缓爱德华菌FimA基因设计的上游引物F1和下游引物R1；
所述沙门氏菌引物对应的PCR扩增片段大小为526bp，弗氏枸橼酸杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为161bp，奇异变形杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为396bp，迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为330bp。
2.如权利要求1所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1，利用引物设计软件设计同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20～24个，引物组合的熔解温度Tm值为52～62℃，引物组合的GC%为40%～60%；
步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不能合成引物二聚体的引物；
步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将步骤2所述保留不能合成引物二聚体的引物的GC%和碱基数进行比较，选取GC含量高的判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；否则判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4；
步骤4，再次筛选竞争状态劣的引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；
步骤5，利用PCR方法对竞争状态优引物进行扩增。
3.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤1中，所述所用的引物设计软件为Primer Premier5.0。
4.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤1中，所述多重PCR引物组合的熔解温度Tm值为60℃。
5.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤2中，所述对引物组合中的引物进行筛选的具体步骤为：对所用的引物进行PCR扩增，筛选扩增效果最好的引物组合。
6.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤2中，所述不能形成引物二聚体的引物的碱基数目为20～24。
7.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤5中，所述PCR方法的变性温度94℃，退火温度为60℃，延伸温度72℃。
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