CN111154751A - 一种高效的提取毛干中dna的方法 - Google Patents

一种高效的提取毛干中dna的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111154751A
CN111154751A CN202010044705.9A CN202010044705A CN111154751A CN 111154751 A CN111154751 A CN 111154751A CN 202010044705 A CN202010044705 A CN 202010044705A CN 111154751 A CN111154751 A CN 111154751A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hair
solution
dna
hair shaft
magnetic beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010044705.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111154751B (zh
Inventor
徐艳春
周永恒
杨淑慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Forestry University
Original Assignee
Northeast Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Forestry University filed Critical Northeast Forestry University
Priority to CN202010044705.9A priority Critical patent/CN111154751B/zh
Publication of CN111154751A publication Critical patent/CN111154751A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111154751B publication Critical patent/CN111154751B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种高效的提取毛干中DNA的方法,属于分子生物学技术领域。为了提高毛干DNA回收效率，减少色素等污染物对下游实验的干扰，扩大毛干适用范围，本发明用1％SDS和4M NaOH溶液处理样本，然后按一定比例加入SDS、DTT、PK和Ca2+进行消化，随后用EDTA溶液螯合掉Ca2+和其他离子，提高毛发消化效率，最后利用磁珠对DNA的强吸附能力吸附DNA，再使用漂洗液A处理不同类型的发干，最终获得毛干中DNA。本发明方法获得的DNA经过一轮PCR，就可以检测到核基因组的目的片段,SNP和STR分型的成功率和正确率均较高。本发明适用于动物生态、法医鉴定等各种条件下人类和动物毛干DNA的提取。

Description

一种高效的提取毛干中DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种高效的提取毛干中DNA的方法。
背景技术
通常，毛发样品分为具有毛囊的毛根和不具有毛囊的毛轴(或称毛干)两种，头发代谢活性强的区域称为毛根，毛根会附带很多毛囊的残留物，而毛轴属于高度角化的部分，所以具有毛囊的毛根可以从中提出高质量的mtDNA(线粒体DNA)和nuDNA(核DNA)，而不具有毛囊的毛轴通常仅能够提出少量的mtDNA。曾有人研究毛发超纤维结构图谱，发现毛轴中能清晰看到线粒体，而无法看到完整的细胞核，线粒体可以为mtDNA提供保护，而失去细胞核的nuDNA会暴露在各种内切酶的环境中，发生不同程度的降解，普遍认为可提取的DNA长度不超过180bp，所以nuDNA的质量要比mtDNA的质量差很多，这就是为什么我们能很容易从毛轴中提出mtDNA而很难提出nuDNA。此外，使用DNA的原位标记技术，将nuDNA与DNA的特异性染料Hoechst 33258结合，通过荧光显微镜观察到nuDNA的存在。虽然毛轴中的DNA数量很少而且质量也比较差，但毛轴具有稳定的化学结构。其表面的硬角质层，较强的二硫键结构以及抑制微生物降解的蛋白质结构，使头发在室温不溶于水，稀酸、碱溶液以及有机溶剂，保存更长时间。在过去的20多年中，研究表明，毛发中的DNA的确可以存活更久，人们从数百年甚至上千年的古老的考古样本的毛发中提出并证明了mtDNA的存在。
目前常见的毛发的提取方法有经典有机溶剂萃取法，Chelex 110处理法，QiagenPromega等试剂盒处理法及PCR缓冲液加蛋白酶K快速提取法等方法，PCR扩增结果表明PCR缓冲液快速提取法成功率最高，为85％，其次是Chelex方法成功率为70％，而经典有机溶剂提取法和Qiagen tissue kit试剂盒法的成功率仅仅是48％和42％，其中Chelex 110处理法和试剂盒法扩增效率一般且成本过高，而经典有机溶剂萃取法需要大量的样本，且操作复杂，效率低下，此外，上述技术中存在如下问题：
(1)提取的nuDNA片段短。
之前人们检测到的nuDNA片段不会超过200bp，多数人都会选择150以下bp长度的nuDNA片段作为目的片段。
(2)PCR扩增nuDNA片段效率低。
目前所有的DNA提取方法中，即使能从毛干中提取出nuDNA，但由于提取的nuDNA的量很少或者色素等物质的干扰，使其很难直接进行下游实验，通常采用两轮PCR才可以勉强检测到目的片段。
(3)回收效率低或者色素干扰。
目前提取DNA常用DNA纯化柱进行回收，但不适合毛干中nuDNA这种短小片段的回收，在漂洗的过程中，多数片段都被洗掉；磁珠跟纯化柱相比对DNA具有更强的吸附能力，但由于磁珠的纯化能力较差，提取后的DNA原液容易有色素残留，严重影响后序实验。还有一些选择试剂盒法更加昂贵，但提取效率并没有明显的提升。
(4)目前从毛干中提取的DNA无法系统的应用到微卫星(又称STR)分型和SNP分型等核基因的分析实验中。
发明内容
为了提高DNA回收效率、扩大扩增片段范围、同时减少色素等污染物对下游实验的干扰，本发明分别从提取的前处理、消化体系和纯化回收方法进行了改进，技术方案如下：
一种高效的提取毛干中DNA的方法，步骤如下：
一、毛干的前处理：
将毛干置于酒精中浸泡5min～10min后蒸干，然后与质量分数1％-2％的SDS溶液混合，60℃～65℃条件下加热30min～40min；取出毛干清洗后，再将毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃～70℃浸泡15s～35s，取出清洗后，用酒精浸泡5min～10min；
二、毛干的消化：
将经过前处理后的毛干置于处理液中，56℃消化3h～4h，然后再加入PK溶液消化1h，再加入EDTA溶液56℃温育30min～40min，得到毛干消化液；所述处理液由消化液A、PK溶液、SDS溶液和DTT溶液配制而成，所述消化液A为含有50mmol/LTris-HCl、10mmol/L Ca2+和100mmol/LNaCl的水溶液；
三、消化液提纯：
1)将步骤二得到的毛干消化液与氯仿溶液按照1:1的体积比混合后静置3min～4min，然后离心，取上清；
2)向上清液中加入等体积异丙醇，混匀后加入磁珠，静置3min～4min，然后进行磁分离，弃废液；
3)然后，利用漂洗液A对磁珠进行漂洗，弃废液；所述漂洗液A为异丙醇和TE的混合液，pH＝8；如步骤2)中上清液无色，则不需要步骤3)；
4)然后，利用体积分数为70％～75％乙醇对磁珠进行漂洗，弃废液；
5)然后，将磁珠离心后进行磁分离，弃废液，晾干磁珠，去除乙醇；
6)再将磁珠与洗脱液混合，56℃加热10min～15min，离心后进行磁分离，得到的上清液即为毛干DNA。
进一步地限定，步骤一中所述酒精体积浓度为95％。
进一步地限定，步骤一中所述毛干与SDS溶液的用量比为：(1-10)mg:750μL。
进一步地限定，步骤一中将毛干与质量分数1％的SDS溶液混合，温度为65℃条件下加热30min；取出毛干清洗后，再将毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃浸泡20s。
进一步地限定，步骤二中所述毛干的消化，具体为：每1mg～10mg毛干中加入消化液A335μL，10mg/ml的PK溶液50μL，质量分数为15％的SDS溶液40μL，体积分数为15.4％的DTT溶液50μL，56℃消化3h后，再加入30μL 10mg/ml的PK溶液，继续消化1h，再加入0.5mol/L的EDTA溶液25μL，56℃消化30min。
进一步地限定，步骤三所述消化液提纯中，步骤1)中所述离心为12000rpm离心5min～10min。
进一步地限定，步骤三中所述漂洗液A中异丙醇的体积分数为30％～35％。
进一步地限定，步骤三中所述晾干为室温晾干5min～10min。
进一步地限定，步骤三所述磁珠与洗脱液混合后，56℃加热15min。
有益效果
本发明的技术创新性主要体现在：
(1)用1％～2％SDS和4mol/LNaOH溶液处理的样本，可以去掉大量细菌DNA和外源DNA的污染，但对核DNA的影响很小，极大的减小了大量的细菌DNA对后续分子实验的干扰。
(2)在消化体系中，按一定比例加入SDS、DTT、PK(蛋白酶K)和Ca2+可以极大的提高消化效率，随后用EDTA溶液螯合掉Ca2+和其他离子，避免对后续实验的干扰。消化4h～6h即可进行后续实验，缩短了以往提取毛发的消化时间。
(3)选择磁珠纯化消化液并用漂洗液A进行漂洗，即保证了磁珠对DNA极强的吸附能力，又避免了色素的干扰。
本发明所得的有益效果如下：
(1)本方法提取后的DNA可扩增的nuDNA片段可以达到250bp左右，个别个体扩增片段达到330bp左右，且成功率较高，而以往人们所能扩出来的nuDNA片段不超过200bp，成功率很低；mtDNA片段的扩增长度可达到1400bp，如有需要完全支持更长的mtDNA片段的扩增。
(2)本方法可以极大的提高PCR扩增nuDNA的效果，以前的提取方法提出来的DNA大多需要进行两轮扩增，才能检测到nuDNA的目的片段，而通过本方法提出来的DNA只需一轮PCR，就可以检测到核基因的目的片段。
(3)本方法适合各种动物的不同类型的毛发。以前的提取方法仅见于蓝狐等动物的毛发，而对于大多数动物的毛发，则很难提取出满足后续实验要求的DNA。
(4)本方法提取的DNA可以供SNP分型和STR分型。在已经做过的实验中，SNP分型的成功率和正确率(一次实验检测结果，与肌肉DNA分型对比)分别达到94％和94.7％,之前还没有人可以将毛干中的DNA应用到核DNA的SNP分型中；STR分型成功率为95％，分型正确率81％(一次实验检测结果，与肌肉DNA分型结果对比)，以前STR成功分型的报道极为鲜见。
(5)本方法成本低廉。使用本方法每样本的提取成本在9元以下，经过组装试剂盒等措施，在保证提取效果的同时，成本还可以进一步降低。
附图说明
图1核基因片段(142bp，250bp)和线粒体DNA片段(1450bp左右)电泳图，(A)为线粒体DNA片段(CYTB，1430bp左右)，(B)为核DNA片段(GAPDH，250bp)，(C)为核DNA片段(GAPDH，142bp)，(D)为核DNA片段(GAPDH，329bp)，数字为样品编号；1为实施例1梅花鹿DNA样本，2、3为实施例2梅花鹿DNA样本，4、5为实施例3华南虎DNA样本，6、7为实施例4蓝狐绒毛样本，8、9为实施例5蓝狐针毛DNA样本c:阴性对照；M：Marker，条带大小从上到下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图2微卫星分型比较，(右)华南虎肌肉DNA进行微卫星分型的结果(对照组),(左)华南虎毛干DNA分型微卫星分型的结果，其中横坐标数值为片段长度(bp)，纵坐标为对应片段的信号峰强度；
图3从毛干中提取的DNA片段分布图，T3是虎针毛毛干DNA，Ar4是蓝狐绒毛毛干DNA，横坐标为片段大小(bp)，纵坐标为浓度(pg/μL)；
图4部分SNP分型数据的比较，W1-W6为狼肌肉DNA的SNP分型结果，WH1-WH6个体毛干DNA的SNP分型结果。
具体实施方式
实施例1.以梅花鹿为例描述毛干中DNA的提取。
一、毛干的前处理：
取待提取毛发适量(根据自己提取的量而定)，放入含有雕牌洗衣粉的水溶液中清洗，随后用去离子水清洗两遍，最后将毛发放入医用酒精(体积分数95％)中浸泡10min，蒸干备用。称量1mg毛发，置于1.5mlEP管中，加入750μLSDS溶液(质量分数1％)，放置在65℃水浴锅水浴30min，取出清洗两遍，放入新的EP管中，随后用65℃的NaOH溶液(4mol/L)浸泡20s，取出，无菌的双蒸水清洗两遍，用体积分数95％医用酒精浸泡5min，蒸干备用。
注：用NaOH溶液浸泡毛发时要严格控制时间，否则毛发受损严重会影响后续实验，不同类型的毛也可根据实际情况适当增加或减少浸泡时间。此步骤在去除细菌DNA的同时也会降低mtDNA的量，因此在一般实验中(如PCR扩增、STR或SNP分型)如果没有必要去除细菌DNA，可以省去此步骤。
二、毛干的消化：
向经过前处理后的毛干中加入处理液：消化液A 335μL(50mmol/LTris-HCl、10mMCa2+、100mmol/LNaCl)、PK溶液(10mg/ml)50μL、SDS(质量分数15％)溶液40μL和DTT(体积分数15.4％)溶液50μL；震荡，56℃水浴消化3h后，在加入30μLPK溶液(10mg/ml)，震荡，继续消化1h，加入EDTA(0.5mol/L)溶液25μL，震荡，56°水浴30min，得到毛干消化液，取出备用。
三、消化液提纯
1.向步骤二得到的毛干消化液中加入500μl氯仿(实验要在通风橱或生物安全柜中操作，注意防护)，轻柔混匀15s，静置3min，12000rpm离心10min。
2.取出离心管，小心吸取上清溶液(尽量吸净上清溶液，但不要吸取中间层)于新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10sec，再向离心管中加入30μL磁珠(使用前将磁珠震荡混合均匀)，振荡混匀1min，室温静置3min，期间颠倒混匀2次，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液。
3.取下离心管，向离心管中加入700μL的漂洗液A(异丙醇和TE 3:7体积比混合得到的混合液，pH＝8)轻柔混匀10s(如果磁珠凝结成小块可适当增加震荡力度使磁珠尽量的分散开)，将离心管置于磁力加上进行磁分离，吸取废液，如步骤2的上清液(DNA混合液)无色，则不需要此步骤，此步骤主要处理色素的干扰。
4.从磁力架上取下离心管,向离心管中加入650μL漂洗液B(70％乙醇)，轻柔混匀1min～2min，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液,重复步骤4一次。
5.将离心管10000rpm离心1min，再置于磁力架上进行磁分离，再次吸弃废液，室温开盖晾干5-10min，至乙醇完全挥发。
6.从磁力架上取下离心管，加入100μL洗脱液，振荡混匀，56℃水浴15min，每隔2min-3min轻摇离心管混匀5次-7次。将离心管从水浴锅中取出，10000rpm离心1min，置于磁力架或磁铁上进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，所得上清即为目的DNA，可直接进行下游实验或于适当条件保存。
实施例2.与实施例1的不同在于，本实施例中所述的梅花鹿的毛发用量为5mg。
具体方法如下：
一、毛干的前处理：
取待提取毛发适量(根据自己提取的量而定)，放入含有雕牌洗衣粉的水溶液中清洗，随后用去离子水清洗两遍，最后将毛发放入医用酒精(体积分数95％)中浸泡10min，蒸干备用。
称量两份5mg的鹿毛，置于1.5mlEP管中，其中一份加入750μL SDS溶液(质量分数1％)，放置在60℃水浴锅水浴40min，取出清洗两遍，放入新的EP管中，随后用68℃的NaOH溶液(4mol/L)浸泡15s，取出，无菌的双蒸水清洗两遍，用医用酒精浸泡10min，蒸干备用。注：用NaOH溶液浸泡毛发时要严格控制时间，否则毛发受损严重会影响后续实验，不同类型的毛也可根据实际情况适当增加或减少浸泡时间。此步骤在去除细菌DNA的同时也会降低mtDNA的量，本实施例中另外一份鹿毛DNA不经NaOH处理，用于PCR扩增、STR或SNP分型。
二、毛干的消化：
向经过前处理后的毛干中加入处理液：消化液A 335μL(50mM Tris-HCl，10mM Ca2 +，100mM NaCl)，PK溶液(10mg/ml)50μL，SDS(质量分数15％)溶液40μL和DTT(体积分数15.4％)溶液50μL；震荡，56℃水浴消化3h后，在加入30μLPK溶液(10mg/ml)，震荡，继续消化1h，加入EDTA(0.5M)溶液25μL，震荡，56℃水浴40min，得到毛干消化液，取出备用。
三、消化液提纯
1.向毛干消化液中加入500μL氯仿(实验要在通风橱或生物安全柜中操作，注意防护)，轻柔混匀15s，静置4min，12000rpm离心10min。
2.取出离心管，小心吸取上清溶液(尽量吸净上清溶液，但不要吸取中间层)于新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10sec，再向离心管中加入30μL磁珠(使用前将磁珠震荡混合均匀)，振荡混匀1min，室温静置4min，期间颠倒混匀2次，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液。
3.取下离心管，向离心管中加入700μL的漂洗液A(异丙醇和TE 3:7体积比混合得到的混合液，pH＝8)轻柔混匀10s(如果磁珠凝结成小块可适当增加震荡力度使磁珠尽量的分散开)，将离心管置于磁力加上进行磁分离，吸取废液，如步骤2的上清溶液无色，则不需要此步骤，此步骤主要处理色素的干扰。
4.从磁力架上取下离心管,向离心管中加入650μL漂洗液B(75％乙醇)，轻柔混匀1min～2min，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液,重复步骤4一次。
5.将离心管10000rpm离心1min，再置于磁力架上进行磁分离，再次吸弃废液，室温开盖晾干5-10min，至乙醇完全挥发。
6.从磁力架上取下离心管，加入100μL洗脱液，振荡混匀，56℃水浴10min，每隔2min～3min轻摇离心管混匀5～7次。将离心管从水浴锅中取出，10000rpm离心1min，置于磁力架或磁铁上进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，所得上清即为目的DNA，可直接进行下游实验或于适当条件保存。
实施例3.与实施例1的不同在于，本实施例中步骤1)中所用的毛干为华南虎毛干。
具体方法如下：
一、毛干的前处理：
取待提取毛发适量(根据自己提取的量而定)，放入含有雕牌洗衣粉的水溶液中清洗，随后用去离子水清洗两遍，最后将毛发放入医用酒精(体积分数95％)中浸泡10min，蒸干备用。
称量两份5mg的毛发，置于1.5mlEP管中，其中一份加入750μL SDS溶液(质量分数1％)，放置在65℃水浴锅水浴30min，取出清洗两遍，放入新的EP管中，随后用65℃的NaOH溶液(4mol/L)浸泡35s，取出，无菌的双蒸水清洗两遍，用医用酒精浸泡5min，蒸干备用。
注：用NaOH溶液浸泡毛发时要严格控制时间，否则毛发受损严重会影响后续实验，不同类型的毛也可根据实际情况适当增加或减少浸泡时间。此步骤在去除细菌DNA的同时也会降低mtDNA的量，本实施例中另外一份鹿毛DNA不经NaOH处理，用于PCR扩增、STR或SNP分型。
二、毛干的消化：
向经过前处理后的毛干中加入处理液：消化液A 335μL(50Mm Tris-HCl、10mmol/LCa2+，100mmol/LNaCl)，PK溶液(10mg/ml)50μL，SDS(质量分数15％)溶液40μL和DTT(体积分数15.4％)溶液50μL；震荡，56℃水浴消化4h后，在加入30μLPK溶液(10mg/ml)，震荡，继续消化1h，加入EDTA(0.5M)溶液25μL，震荡，56℃水浴30min，得到毛干消化液，取出备用。
三、消化液提纯
1.向毛干消化液中加入500μl氯仿(实验要在通风橱或生物安全柜中操作，注意防护)，轻柔混匀15s，静置3min，12000rpm离心10min。
2.取出离心管，小心吸取上清溶液(尽量吸净上清溶液，但不要吸取中间层)于新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混10s，再向离心管中加入30μL磁珠(使用前将磁珠震荡混合均匀)，振荡混匀1min，室温静置3min，期间颠倒混匀2次，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液。
3.取下离心管，向离心管中加入700μL的漂洗液A(异丙醇和TE 3:7体积比混合得到的混合液，pH＝8)轻柔混匀10s(如果磁珠凝结成小块可适当增加震荡力度使磁珠尽量的分散开)，将离心管置于磁力加上进行磁分离，吸取废液，如步骤2的上清液(即废液)无色，则不需要此步骤，此步骤主要处理色素的干扰。
4.从磁力架上取下离心管,向离心管中加入650μL漂洗液B(70％乙醇)，轻柔混匀1-2min，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液,重复步骤4一次。
5.将离心管10000rpm离心1min，再置于磁力架上进行磁分离，再次吸弃废液，室温开盖晾干5min～10min，至乙醇完全挥发。
6.从磁力架上取下离心管，加入100μL洗脱液，振荡混匀，56℃水浴15min，每隔2min～3min轻摇离心管混匀5～7次。将离心管从水浴锅中取出，10000rpm离心1min，置于磁力架或磁铁上进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，所得上清即为目的DNA，可直接进行下游实验或于适当条件保存。
实施例4.重复实施例2，与实施例2的不同在于，本实施例中所述的毛干为蓝狐绒毛毛干。
实施例5.重复实施例2，与实施例2的不同在于，本实施例中所述的毛干为蓝狐针毛毛干。
参照上述DNA提取方法，本发明还分别提取了狼、狗等动物的毛干DNA。
考察本发明所述的提取DNA的方法的实验效果。
以GAPDH基因为例，通用引物Primer1，扩增产物长为142bp，序列如下：
F:GGTCAGACAACATTTGCCACA/R:ACAGCAGGTTTGTACTTTTTAGGTG。
华南虎DNA扩增引物Primer2，扩增产物长为250bp，序列如下：
F:CTGGTATGCTGCTGGGGTG/R:TGTGTTGGGTGATGAACGGG。
以本发明方法提取的毛干DNA为模板，经一轮PCR扩增即可得到目的片段，nuDNA片段可以达到250bp左右，个别个体扩增片段达到330bp左右，如引物A329(F:GAAACCGCAAAATTGGAC\R:GATCAAGAATTTAAAGCCCAT，用于蓝狐样本扩增)。
以CYTB基因为例，引物Primer3F:CCHCCATAAATAGGNGAAGG/R:WAGAAYTTCAGCTTTGGG，扩增毛干中线粒体DNA，以本发明方法提取的毛干DNA为模板，经一轮PCR扩增即可得到目的片段，mtDNA片段可以达到1430bp，如图1所示。
以梅花鹿和老虎的肌肉组织提取的DNA微卫星分型为对照，STR分型成功率为95％，分型正确率81％。如图2所示。以蓝狐的毛发作为研究对象，对所有样本进行荧光定量PCR，均得出有效的数值，如表1所示。
表1部分样本荧光定量实验结果，Sample1-5是蓝狐针毛，6-10是蓝狐绒毛。
Figure BDA0002366416630000091
使用2100expert-High Sensitivity DNAAssay试剂盒和Agilent 2100对所有样本进行分析，结果表明，毛干中的DNA片段主要在200bp以下和10kbp左右(此试剂盒检测的范围在10k以下)，片段在10kbp左右的DNA大片段多数是细菌DNA，也有可能含有少量的线粒体，如图3所示，其中T3为老虎毛干DNA片段分布，Ar4为蓝狐绒毛的DNA片段分布。
在SNP分型实验中得到的灰狼、宠物狗和梅花鹿样本的SNP位点基因分型结果，结果表明，在灰狼和宠物狗的SNP位点的平均分型成功率为96.25％(90％～100％)，匹配成功率(与肌肉组织DNA分型结果对比)为98.7％(90％～100％)。肉牛的SNP位点的平均分型成功率为85.42％(66.67％～100％)，匹配成功率为87.80％(66.67％～100％)，如图4所示为狼SNP结果。

Claims (9)

1.一种高效的提取毛干中DNA的方法，其特征在于，步骤如下：
一、毛干的前处理：
将毛干置于酒精中浸泡5min～10min后蒸干，然后与质量分数1％-2％的SDS溶液混合，60℃～65℃条件下加热30min～40min；取出毛干清洗后，再将毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃～70℃浸泡15s～35s，取出清洗后，用酒精浸泡5min～10min；
二、毛干的消化：
将经过前处理后的毛干置于处理液中，56℃消化3h～4h，然后再加入PK溶液消化1h，再加入EDTA溶液56℃温育30min～40min，得到毛干消化液；所述处理液由消化液A、PK溶液、SDS溶液和DTT溶液配制而成，所述消化液A为含有50mmol/LTris-HCl、10mmol/L Ca2+和100mmol/LNaCl的水溶液；
三、消化液提纯：
1)将步骤二得到的毛干消化液与氯仿溶液按照1:1的体积比混合后静置3min～4min，然后离心，取上清；
2)向上清液中加入等体积异丙醇，混匀后加入磁珠，静置3min～4min，然后进行磁分离，弃废液；
3)然后，利用漂洗液A对磁珠进行漂洗，弃废液；所述漂洗液A为异丙醇和TE的混合液，pH＝8；如步骤2)中上清液无色，则不需要步骤3)；
4)然后，利用体积分数为70％～75％乙醇对磁珠进行漂洗，弃废液；
5)然后，将磁珠离心后进行磁分离，弃废液，晾干磁珠，去除乙醇；
6)再将磁珠与洗脱液混合，56℃加热10min～15min，离心后进行磁分离，得到的上清液即为毛干DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述酒精体积浓度为95％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述毛干与SDS溶液的用量比为：(1-10)mg:750μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中将毛干与质量分数1％的SDS溶液混合，温度为65℃条件下加热30min；取出毛干清洗后，再将毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃浸泡20s。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述毛干的消化，具体为：每1mg～10mg毛干中加入消化液A 335μL，10mg/ml的PK溶液50μL，质量分数为15％的SDS溶液40μL，体积分数为15.4％的DTT溶液50μL，56℃消化3h后，再加入30μL 10mg/ml的PK溶液，继续消化1h，再加入0.5mol/L的EDTA溶液25μL，56℃消化30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述消化液提纯中，步骤1)中所述离心为12000rpm离心5min～10min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述漂洗液A中异丙醇的体积分数为30％～35％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述晾干为室温晾干5min～10min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述磁珠与洗脱液混合后，56℃加热15min。
CN202010044705.9A 2020-01-14 2020-01-14 一种高效的提取毛干中dna的方法 Active CN111154751B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010044705.9A CN111154751B (zh) 2020-01-14 2020-01-14 一种高效的提取毛干中dna的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010044705.9A CN111154751B (zh) 2020-01-14 2020-01-14 一种高效的提取毛干中dna的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111154751A true CN111154751A (zh) 2020-05-15
CN111154751B CN111154751B (zh) 2023-02-17

Family

ID=70563294

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010044705.9A Active CN111154751B (zh) 2020-01-14 2020-01-14 一种高效的提取毛干中dna的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111154751B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846308A (zh) * 2019-11-27 2020-02-28 深圳市卫生健康发展研究中心 从毛发中提取dna的方法
CN112649610A (zh) * 2020-12-09 2021-04-13 厦门海洋职业技术学院 一种毛发中甲基苯丙胺类毒品的检测试剂盒及检测方法
CN113151254A (zh) * 2021-05-13 2021-07-23 浙江大学 一种从绵羊毛干中提取线粒体dna的方法
CN113186185A (zh) * 2020-01-14 2021-07-30 东北林业大学 一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主dna的方法
CN114736898A (zh) * 2022-05-17 2022-07-12 广州金域司法鉴定技术有限公司 提取指甲游离缘核dna的方法及应用
CN115961054A (zh) * 2022-11-18 2023-04-14 广州动物园 用于华南虎个体识别和/或亲子鉴定的遗传标记及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6316248B1 (en) * 2000-10-25 2001-11-13 Royal Canadian Mounted Police Rapid extraction of hair root DNA
CN101492486A (zh) * 2009-03-13 2009-07-29 中南大学 从福尔马林固定的毛发干内抽提dna的方法
CN101508716A (zh) * 2009-03-24 2009-08-19 中南大学 一种毛发干裂解液

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6316248B1 (en) * 2000-10-25 2001-11-13 Royal Canadian Mounted Police Rapid extraction of hair root DNA
CN101492486A (zh) * 2009-03-13 2009-07-29 中南大学 从福尔马林固定的毛发干内抽提dna的方法
CN101508716A (zh) * 2009-03-24 2009-08-19 中南大学 一种毛发干裂解液

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. ALMEIDA 等: "Efficient DNA extraction from hair shafts", 《FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL: GENETICS SUPPLEMENT SERIES》 *
周永恒 等: "毛干DNA提取中四种细菌清除方法的比较研究", 《野生动物学报》 *
周永恒: "毛干DNA高效提取技术的研发及其效果评价", 《万方》 *
管政 等: "毛干DNA提取方法概述", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846308A (zh) * 2019-11-27 2020-02-28 深圳市卫生健康发展研究中心 从毛发中提取dna的方法
CN113186185A (zh) * 2020-01-14 2021-07-30 东北林业大学 一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主dna的方法
CN112649610A (zh) * 2020-12-09 2021-04-13 厦门海洋职业技术学院 一种毛发中甲基苯丙胺类毒品的检测试剂盒及检测方法
CN113151254A (zh) * 2021-05-13 2021-07-23 浙江大学 一种从绵羊毛干中提取线粒体dna的方法
CN114736898A (zh) * 2022-05-17 2022-07-12 广州金域司法鉴定技术有限公司 提取指甲游离缘核dna的方法及应用
CN114736898B (zh) * 2022-05-17 2024-03-22 广州金域司法鉴定技术有限公司 提取指甲游离缘核dna的方法及应用
CN115961054A (zh) * 2022-11-18 2023-04-14 广州动物园 用于华南虎个体识别和/或亲子鉴定的遗传标记及应用
CN115961054B (zh) * 2022-11-18 2023-08-25 广州动物园 用于华南虎个体识别和/或亲子鉴定的遗传标记及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111154751B (zh) 2023-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111154751B (zh) 一种高效的提取毛干中dna的方法
JP2004500892A (ja) シトシン−メチル化の検出方法
CN111269963B (zh) 一步法核酸提取转化试剂盒及其使用方法
CN108642048B (zh) 一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒及提取方法
KR20070042912A (ko) 정제된 ｒｎａ를 분리하기 위한 시약 및 방법
CN106636072B (zh) 一种用于动物类中药分子鉴定的通用dna提取方法及试剂盒
CN108048449B (zh) 一种提取基因组dna的试剂盒
CN107475248A (zh) 一种植物基因组dna快速提取方法
CN108410861B (zh) 一种皮张中古dna的提取方法及试剂盒
CN111763721A (zh) 一种适用于植物的ATAC-seq方法
CN113088516A (zh) 用于粪便微生物基因组的dna提取试剂盒及提取方法
CN101712953A (zh) 用于评价动物肠道微生物群落多样性的dna提取方法
CN116024203A (zh) 一种水凝胶固定化复合生物酶的制备方法及其产品和应用
JP4665124B2 (ja) 環境サンプルからのｄｎａの回収方法
CN106148326A (zh) 宏基因组dna的提取方法
CN111575277B (zh) 一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮dna的方法
RU2637360C1 (ru) Способ выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом
CN112646806A (zh) 一种土壤dna快速提取方法及试剂盒
CN113528507A (zh) 一种高通量快速磁珠法提取鸡血基因组dna的试剂盒及提取法
CN113186250B (zh) 一种用于粪便微生物基因组dna提取的除杂试剂
JP2009521946A (ja) シトシンメチル化の検出方法
CN114231526B (zh) 一种高丰度粪便微生物基因组dna提取的方法
CN114958831A (zh) 一种难裂解细菌基因组dna提取方法
CN112251431A (zh) 一种快速提取生物dna的样品处理方法、提取试剂盒及提取装置
CN113249433B (zh) 基因长期保存方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant