CN111154751A - 一种高效的提取毛干中dna的方法 - Google Patents

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Abstract

一种高效的提取毛干中DNA的方法,属于分子生物学技术领域。为了提高毛干DNA回收效率，减少色素等污染物对下游实验的干扰，扩大毛干适用范围，本发明用1％SDS和4M NaOH溶液处理样本，然后按一定比例加入SDS、DTT、PK和Ca2+进行消化，随后用EDTA溶液螯合掉Ca2+和其他离子，提高毛发消化效率，最后利用磁珠对DNA的强吸附能力吸附DNA，再使用漂洗液A处理不同类型的发干，最终获得毛干中DNA。本发明方法获得的DNA经过一轮PCR，就可以检测到核基因组的目的片段,SNP和STR分型的成功率和正确率均较高。本发明适用于动物生态、法医鉴定等各种条件下人类和动物毛干DNA的提取。

Description

一种高效的提取毛干中DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种高效的提取毛干中DNA的方法。
背景技术
通常，毛发样品分为具有毛囊的毛根和不具有毛囊的毛轴(或称毛干)两种，头发代谢活性强的区域称为毛根，毛根会附带很多毛囊的残留物，而毛轴属于高度角化的部分，所以具有毛囊的毛根可以从中提出高质量的mtDNA(线粒体DNA)和nuDNA(核DNA)，而不具有毛囊的毛轴通常仅能够提出少量的mtDNA。曾有人研究毛发超纤维结构图谱，发现毛轴中能清晰看到线粒体，而无法看到完整的细胞核，线粒体可以为mtDNA提供保护，而失去细胞核的nuDNA会暴露在各种内切酶的环境中，发生不同程度的降解，普遍认为可提取的DNA长度不超过180bp，所以nuDNA的质量要比mtDNA的质量差很多，这就是为什么我们能很容易从毛轴中提出mtDNA而很难提出nuDNA。此外，使用DNA的原位标记技术，将nuDNA与DNA的特异性染料Hoechst 33258结合，通过荧光显微镜观察到nuDNA的存在。虽然毛轴中的DNA数量很少而且质量也比较差，但毛轴具有稳定的化学结构。其表面的硬角质层，较强的二硫键结构以及抑制微生物降解的蛋白质结构，使头发在室温不溶于水，稀酸、碱溶液以及有机溶剂，保存更长时间。在过去的20多年中，研究表明，毛发中的DNA的确可以存活更久，人们从数百年甚至上千年的古老的考古样本的毛发中提出并证明了mtDNA的存在。
目前常见的毛发的提取方法有经典有机溶剂萃取法，Chelex 110处理法，QiagenPromega等试剂盒处理法及PCR缓冲液加蛋白酶K快速提取法等方法，PCR扩增结果表明PCR缓冲液快速提取法成功率最高，为85％，其次是Chelex方法成功率为70％，而经典有机溶剂提取法和Qiagen tissue kit试剂盒法的成功率仅仅是48％和42％，其中Chelex 110处理法和试剂盒法扩增效率一般且成本过高，而经典有机溶剂萃取法需要大量的样本，且操作复杂，效率低下，此外，上述技术中存在如下问题：
(1)提取的nuDNA片段短。
之前人们检测到的nuDNA片段不会超过200bp，多数人都会选择150以下bp长度的nuDNA片段作为目的片段。
(2)PCR扩增nuDNA片段效率低。
目前所有的DNA提取方法中，即使能从毛干中提取出nuDNA，但由于提取的nuDNA的量很少或者色素等物质的干扰，使其很难直接进行下游实验，通常采用两轮PCR才可以勉强检测到目的片段。
(3)回收效率低或者色素干扰。
目前提取DNA常用DNA纯化柱进行回收，但不适合毛干中nuDNA这种短小片段的回收，在漂洗的过程中，多数片段都被洗掉；磁珠跟纯化柱相比对DNA具有更强的吸附能力，但由于磁珠的纯化能力较差，提取后的DNA原液容易有色素残留，严重影响后序实验。还有一些选择试剂盒法更加昂贵，但提取效率并没有明显的提升。
(4)目前从毛干中提取的DNA无法系统的应用到微卫星(又称STR)分型和SNP分型等核基因的分析实验中。
发明内容
为了提高DNA回收效率、扩大扩增片段范围、同时减少色素等污染物对下游实验的干扰，本发明分别从提取的前处理、消化体系和纯化回收方法进行了改进，技术方案如下：
一种高效的提取毛干中DNA的方法，步骤如下：
一、毛干的前处理：
将毛干置于酒精中浸泡5min～10min后蒸干，然后与质量分数1％-2％的SDS溶液混合，60℃～65℃条件下加热30min～40min；取出毛干清洗后，再将毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃～70℃浸泡15s～35s，取出清洗后，用酒精浸泡5min～10min；
二、毛干的消化：
将经过前处理后的毛干置于处理液中，56℃消化3h～4h，然后再加入PK溶液消化1h，再加入EDTA溶液56℃温育30min～40min，得到毛干消化液；所述处理液由消化液A、PK溶液、SDS溶液和DTT溶液配制而成，所述消化液A为含有50mmol/LTris-HCl、10mmol/L Ca2+和100mmol/LNaCl的水溶液；
三、消化液提纯：
1)将步骤二得到的毛干消化液与氯仿溶液按照1:1的体积比混合后静置3min～4min，然后离心，取上清；
2)向上清液中加入等体积异丙醇，混匀后加入磁珠，静置3min～4min，然后进行磁分离，弃废液；
3)然后，利用漂洗液A对磁珠进行漂洗，弃废液；所述漂洗液A为异丙醇和TE的混合液，pH＝8；如步骤2)中上清液无色，则不需要步骤3)；
4)然后，利用体积分数为70％～75％乙醇对磁珠进行漂洗，弃废液；
5)然后，将磁珠离心后进行磁分离，弃废液，晾干磁珠，去除乙醇；
6)再将磁珠与洗脱液混合，56℃加热10min～15min，离心后进行磁分离，得到的上清液即为毛干DNA。
进一步地限定，步骤一中所述酒精体积浓度为95％。
进一步地限定，步骤一中所述毛干与SDS溶液的用量比为：(1-10)mg:750μL。
进一步地限定，步骤一中将毛干与质量分数1％的SDS溶液混合，温度为65℃条件下加热30min；取出毛干清洗后，再将毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃浸泡20s。
进一步地限定，步骤二中所述毛干的消化，具体为：每1mg～10mg毛干中加入消化液A335μL，10mg/ml的PK溶液50μL，质量分数为15％的SDS溶液40μL，体积分数为15.4％的DTT溶液50μL，56℃消化3h后，再加入30μL 10mg/ml的PK溶液，继续消化1h，再加入0.5mol/L的EDTA溶液25μL，56℃消化30min。
进一步地限定，步骤三所述消化液提纯中，步骤1)中所述离心为12000rpm离心5min～10min。
进一步地限定，步骤三中所述漂洗液A中异丙醇的体积分数为30％～35％。
进一步地限定，步骤三中所述晾干为室温晾干5min～10min。
进一步地限定，步骤三所述磁珠与洗脱液混合后，56℃加热15min。
有益效果
本发明的技术创新性主要体现在：
(1)用1％～2％SDS和4mol/LNaOH溶液处理的样本，可以去掉大量细菌DNA和外源DNA的污染，但对核DNA的影响很小，极大的减小了大量的细菌DNA对后续分子实验的干扰。
(2)在消化体系中，按一定比例加入SDS、DTT、PK(蛋白酶K)和Ca2+可以极大的提高消化效率，随后用EDTA溶液螯合掉Ca2+和其他离子，避免对后续实验的干扰。消化4h～6h即可进行后续实验，缩短了以往提取毛发的消化时间。
(3)选择磁珠纯化消化液并用漂洗液A进行漂洗，即保证了磁珠对DNA极强的吸附能力，又避免了色素的干扰。
本发明所得的有益效果如下：
(1)本方法提取后的DNA可扩增的nuDNA片段可以达到250bp左右，个别个体扩增片段达到330bp左右，且成功率较高，而以往人们所能扩出来的nuDNA片段不超过200bp，成功率很低；mtDNA片段的扩增长度可达到1400bp，如有需要完全支持更长的mtDNA片段的扩增。
(2)本方法可以极大的提高PCR扩增nuDNA的效果，以前的提取方法提出来的DNA大多需要进行两轮扩增，才能检测到nuDNA的目的片段，而通过本方法提出来的DNA只需一轮PCR，就可以检测到核基因的目的片段。
(3)本方法适合各种动物的不同类型的毛发。以前的提取方法仅见于蓝狐等动物的毛发，而对于大多数动物的毛发，则很难提取出满足后续实验要求的DNA。
(4)本方法提取的DNA可以供SNP分型和STR分型。在已经做过的实验中，SNP分型的成功率和正确率(一次实验检测结果，与肌肉DNA分型对比)分别达到94％和94.7％,之前还没有人可以将毛干中的DNA应用到核DNA的SNP分型中；STR分型成功率为95％，分型正确率81％(一次实验检测结果，与肌肉DNA分型结果对比)，以前STR成功分型的报道极为鲜见。
(5)本方法成本低廉。使用本方法每样本的提取成本在9元以下，经过组装试剂盒等措施，在保证提取效果的同时，成本还可以进一步降低。
附图说明
图1核基因片段(142bp，250bp)和线粒体DNA片段(1450bp左右)电泳图，(A)为线粒体DNA片段(CYTB，1430bp左右)，(B)为核DNA片段(GAPDH，250bp)，(C)为核DNA片段(GAPDH，142bp)，(D)为核DNA片段(GAPDH，329bp)，数字为样品编号；1为实施例1梅花鹿DNA样本，2、3为实施例2梅花鹿DNA样本，4、5为实施例3华南虎DNA样本，6、7为实施例4蓝狐绒毛样本，8、9为实施例5蓝狐针毛DNA样本c:阴性对照；M：Marker，条带大小从上到下为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；
图2微卫星分型比较，(右)华南虎肌肉DNA进行微卫星分型的结果(对照组),(左)华南虎毛干DNA分型微卫星分型的结果，其中横坐标数值为片段长度(bp)，纵坐标为对应片段的信号峰强度；
图3从毛干中提取的DNA片段分布图，T3是虎针毛毛干DNA，Ar4是蓝狐绒毛毛干DNA，横坐标为片段大小(bp)，纵坐标为浓度(pg/μL)；
图4部分SNP分型数据的比较，W1-W6为狼肌肉DNA的SNP分型结果，WH1-WH6个体毛干DNA的SNP分型结果。
具体实施方式
实施例1.以梅花鹿为例描述毛干中DNA的提取。
一、毛干的前处理：
取待提取毛发适量(根据自己提取的量而定)，放入含有雕牌洗衣粉的水溶液中清洗，随后用去离子水清洗两遍，最后将毛发放入医用酒精(体积分数95％)中浸泡10min，蒸干备用。称量1mg毛发，置于1.5mlEP管中，加入750μLSDS溶液(质量分数1％)，放置在65℃水浴锅水浴30min，取出清洗两遍，放入新的EP管中，随后用65℃的NaOH溶液(4mol/L)浸泡20s，取出，无菌的双蒸水清洗两遍，用体积分数95％医用酒精浸泡5min，蒸干备用。
注：用NaOH溶液浸泡毛发时要严格控制时间，否则毛发受损严重会影响后续实验，不同类型的毛也可根据实际情况适当增加或减少浸泡时间。此步骤在去除细菌DNA的同时也会降低mtDNA的量，因此在一般实验中(如PCR扩增、STR或SNP分型)如果没有必要去除细菌DNA，可以省去此步骤。
二、毛干的消化：
向经过前处理后的毛干中加入处理液：消化液A 335μL(50mmol/LTris-HCl、10mMCa2+、100mmol/LNaCl)、PK溶液(10mg/ml)50μL、SDS(质量分数15％)溶液40μL和DTT(体积分数15.4％)溶液50μL；震荡，56℃水浴消化3h后，在加入30μLPK溶液(10mg/ml)，震荡，继续消化1h，加入EDTA(0.5mol/L)溶液25μL，震荡，56°水浴30min，得到毛干消化液，取出备用。
三、消化液提纯
1.向步骤二得到的毛干消化液中加入500μl氯仿(实验要在通风橱或生物安全柜中操作，注意防护)，轻柔混匀15s，静置3min，12000rpm离心10min。
2.取出离心管，小心吸取上清溶液(尽量吸净上清溶液，但不要吸取中间层)于新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10sec，再向离心管中加入30μL磁珠(使用前将磁珠震荡混合均匀)，振荡混匀1min，室温静置3min，期间颠倒混匀2次，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液。
3.取下离心管，向离心管中加入700μL的漂洗液A(异丙醇和TE 3:7体积比混合得到的混合液，pH＝8)轻柔混匀10s(如果磁珠凝结成小块可适当增加震荡力度使磁珠尽量的分散开)，将离心管置于磁力加上进行磁分离，吸取废液，如步骤2的上清液(DNA混合液)无色，则不需要此步骤，此步骤主要处理色素的干扰。
4.从磁力架上取下离心管,向离心管中加入650μL漂洗液B(70％乙醇)，轻柔混匀1min～2min，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液,重复步骤4一次。
5.将离心管10000rpm离心1min，再置于磁力架上进行磁分离，再次吸弃废液，室温开盖晾干5-10min，至乙醇完全挥发。
6.从磁力架上取下离心管，加入100μL洗脱液，振荡混匀，56℃水浴15min，每隔2min-3min轻摇离心管混匀5次-7次。将离心管从水浴锅中取出，10000rpm离心1min，置于磁力架或磁铁上进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，所得上清即为目的DNA，可直接进行下游实验或于适当条件保存。
实施例2.与实施例1的不同在于，本实施例中所述的梅花鹿的毛发用量为5mg。
具体方法如下：
一、毛干的前处理：
取待提取毛发适量(根据自己提取的量而定)，放入含有雕牌洗衣粉的水溶液中清洗，随后用去离子水清洗两遍，最后将毛发放入医用酒精(体积分数95％)中浸泡10min，蒸干备用。
称量两份5mg的鹿毛，置于1.5mlEP管中，其中一份加入750μL SDS溶液(质量分数1％)，放置在60℃水浴锅水浴40min，取出清洗两遍，放入新的EP管中，随后用68℃的NaOH溶液(4mol/L)浸泡15s，取出，无菌的双蒸水清洗两遍，用医用酒精浸泡10min，蒸干备用。注：用NaOH溶液浸泡毛发时要严格控制时间，否则毛发受损严重会影响后续实验，不同类型的毛也可根据实际情况适当增加或减少浸泡时间。此步骤在去除细菌DNA的同时也会降低mtDNA的量，本实施例中另外一份鹿毛DNA不经NaOH处理，用于PCR扩增、STR或SNP分型。
二、毛干的消化：
向经过前处理后的毛干中加入处理液：消化液A 335μL(50mM Tris-HCl，10mM Ca2 +，100mM NaCl)，PK溶液(10mg/ml)50μL，SDS(质量分数15％)溶液40μL和DTT(体积分数15.4％)溶液50μL；震荡，56℃水浴消化3h后，在加入30μLPK溶液(10mg/ml)，震荡，继续消化1h，加入EDTA(0.5M)溶液25μL，震荡，56℃水浴40min，得到毛干消化液，取出备用。
三、消化液提纯
1.向毛干消化液中加入500μL氯仿(实验要在通风橱或生物安全柜中操作，注意防护)，轻柔混匀15s，静置4min，12000rpm离心10min。
2.取出离心管，小心吸取上清溶液(尽量吸净上清溶液，但不要吸取中间层)于新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10sec，再向离心管中加入30μL磁珠(使用前将磁珠震荡混合均匀)，振荡混匀1min，室温静置4min，期间颠倒混匀2次，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液。
3.取下离心管，向离心管中加入700μL的漂洗液A(异丙醇和TE 3:7体积比混合得到的混合液，pH＝8)轻柔混匀10s(如果磁珠凝结成小块可适当增加震荡力度使磁珠尽量的分散开)，将离心管置于磁力加上进行磁分离，吸取废液，如步骤2的上清溶液无色，则不需要此步骤，此步骤主要处理色素的干扰。
4.从磁力架上取下离心管,向离心管中加入650μL漂洗液B(75％乙醇)，轻柔混匀1min～2min，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液,重复步骤4一次。
5.将离心管10000rpm离心1min，再置于磁力架上进行磁分离，再次吸弃废液，室温开盖晾干5-10min，至乙醇完全挥发。
6.从磁力架上取下离心管，加入100μL洗脱液，振荡混匀，56℃水浴10min，每隔2min～3min轻摇离心管混匀5～7次。将离心管从水浴锅中取出，10000rpm离心1min，置于磁力架或磁铁上进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，所得上清即为目的DNA，可直接进行下游实验或于适当条件保存。
实施例3.与实施例1的不同在于，本实施例中步骤1)中所用的毛干为华南虎毛干。
具体方法如下：
一、毛干的前处理：
取待提取毛发适量(根据自己提取的量而定)，放入含有雕牌洗衣粉的水溶液中清洗，随后用去离子水清洗两遍，最后将毛发放入医用酒精(体积分数95％)中浸泡10min，蒸干备用。
称量两份5mg的毛发，置于1.5mlEP管中，其中一份加入750μL SDS溶液(质量分数1％)，放置在65℃水浴锅水浴30min，取出清洗两遍，放入新的EP管中，随后用65℃的NaOH溶液(4mol/L)浸泡35s，取出，无菌的双蒸水清洗两遍，用医用酒精浸泡5min，蒸干备用。
注：用NaOH溶液浸泡毛发时要严格控制时间，否则毛发受损严重会影响后续实验，不同类型的毛也可根据实际情况适当增加或减少浸泡时间。此步骤在去除细菌DNA的同时也会降低mtDNA的量，本实施例中另外一份鹿毛DNA不经NaOH处理，用于PCR扩增、STR或SNP分型。
二、毛干的消化：
向经过前处理后的毛干中加入处理液：消化液A 335μL(50Mm Tris-HCl、10mmol/LCa2+，100mmol/LNaCl)，PK溶液(10mg/ml)50μL，SDS(质量分数15％)溶液40μL和DTT(体积分数15.4％)溶液50μL；震荡，56℃水浴消化4h后，在加入30μLPK溶液(10mg/ml)，震荡，继续消化1h，加入EDTA(0.5M)溶液25μL，震荡，56℃水浴30min，得到毛干消化液，取出备用。
三、消化液提纯
1.向毛干消化液中加入500μl氯仿(实验要在通风橱或生物安全柜中操作，注意防护)，轻柔混匀15s，静置3min，12000rpm离心10min。
2.取出离心管，小心吸取上清溶液(尽量吸净上清溶液，但不要吸取中间层)于新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混10s，再向离心管中加入30μL磁珠(使用前将磁珠震荡混合均匀)，振荡混匀1min，室温静置3min，期间颠倒混匀2次，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液。
3.取下离心管，向离心管中加入700μL的漂洗液A(异丙醇和TE 3:7体积比混合得到的混合液，pH＝8)轻柔混匀10s(如果磁珠凝结成小块可适当增加震荡力度使磁珠尽量的分散开)，将离心管置于磁力加上进行磁分离，吸取废液，如步骤2的上清液(即废液)无色，则不需要此步骤，此步骤主要处理色素的干扰。
4.从磁力架上取下离心管,向离心管中加入650μL漂洗液B(70％乙醇)，轻柔混匀1-2min，将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液,重复步骤4一次。
5.将离心管10000rpm离心1min，再置于磁力架上进行磁分离，再次吸弃废液，室温开盖晾干5min～10min，至乙醇完全挥发。
6.从磁力架上取下离心管，加入100μL洗脱液，振荡混匀，56℃水浴15min，每隔2min～3min轻摇离心管混匀5～7次。将离心管从水浴锅中取出，10000rpm离心1min，置于磁力架或磁铁上进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，所得上清即为目的DNA，可直接进行下游实验或于适当条件保存。
实施例4.重复实施例2，与实施例2的不同在于，本实施例中所述的毛干为蓝狐绒毛毛干。
实施例5.重复实施例2，与实施例2的不同在于，本实施例中所述的毛干为蓝狐针毛毛干。
参照上述DNA提取方法，本发明还分别提取了狼、狗等动物的毛干DNA。
考察本发明所述的提取DNA的方法的实验效果。
以GAPDH基因为例，通用引物Primer1，扩增产物长为142bp，序列如下：
F:GGTCAGACAACATTTGCCACA/R:ACAGCAGGTTTGTACTTTTTAGGTG。
华南虎DNA扩增引物Primer2，扩增产物长为250bp，序列如下：
F:CTGGTATGCTGCTGGGGTG/R:TGTGTTGGGTGATGAACGGG。
以本发明方法提取的毛干DNA为模板，经一轮PCR扩增即可得到目的片段，nuDNA片段可以达到250bp左右，个别个体扩增片段达到330bp左右，如引物A329(F:GAAACCGCAAAATTGGAC\R:GATCAAGAATTTAAAGCCCAT，用于蓝狐样本扩增)。
以CYTB基因为例，引物Primer3F:CCHCCATAAATAGGNGAAGG/R:WAGAAYTTCAGCTTTGGG，扩增毛干中线粒体DNA，以本发明方法提取的毛干DNA为模板，经一轮PCR扩增即可得到目的片段，mtDNA片段可以达到1430bp，如图1所示。
以梅花鹿和老虎的肌肉组织提取的DNA微卫星分型为对照，STR分型成功率为95％，分型正确率81％。如图2所示。以蓝狐的毛发作为研究对象，对所有样本进行荧光定量PCR，均得出有效的数值，如表1所示。
表1部分样本荧光定量实验结果，Sample1-5是蓝狐针毛，6-10是蓝狐绒毛。
Figure BDA0002366416630000091
使用2100expert-High Sensitivity DNAAssay试剂盒和Agilent 2100对所有样本进行分析，结果表明，毛干中的DNA片段主要在200bp以下和10kbp左右(此试剂盒检测的范围在10k以下)，片段在10kbp左右的DNA大片段多数是细菌DNA，也有可能含有少量的线粒体，如图3所示，其中T3为老虎毛干DNA片段分布，Ar4为蓝狐绒毛的DNA片段分布。
在SNP分型实验中得到的灰狼、宠物狗和梅花鹿样本的SNP位点基因分型结果，结果表明，在灰狼和宠物狗的SNP位点的平均分型成功率为96.25％(90％～100％)，匹配成功率(与肌肉组织DNA分型结果对比)为98.7％(90％～100％)。肉牛的SNP位点的平均分型成功率为85.42％(66.67％～100％)，匹配成功率为87.80％(66.67％～100％)，如图4所示为狼SNP结果。

Claims (9)

1.一种高效的提取毛干中DNA的方法，其特征在于，步骤如下：
一、毛干的前处理：
将毛干置于酒精中浸泡5min～10min后蒸干，然后与质量分数1％-2％的SDS溶液混合，60℃～65℃条件下加热30min～40min；取出毛干清洗后，再将毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃～70℃浸泡15s～35s，取出清洗后，用酒精浸泡5min～10min；
二、毛干的消化：
将经过前处理后的毛干置于处理液中，56℃消化3h～4h，然后再加入PK溶液消化1h，再加入EDTA溶液56℃温育30min～40min，得到毛干消化液；所述处理液由消化液A、PK溶液、SDS溶液和DTT溶液配制而成，所述消化液A为含有50mmol/LTris-HCl、10mmol/L Ca2+和100mmol/LNaCl的水溶液；
三、消化液提纯：
1)将步骤二得到的毛干消化液与氯仿溶液按照1:1的体积比混合后静置3min～4min，然后离心，取上清；
2)向上清液中加入等体积异丙醇，混匀后加入磁珠，静置3min～4min，然后进行磁分离，弃废液；
3)然后，利用漂洗液A对磁珠进行漂洗，弃废液；所述漂洗液A为异丙醇和TE的混合液，pH＝8；如步骤2)中上清液无色，则不需要步骤3)；
4)然后，利用体积分数为70％～75％乙醇对磁珠进行漂洗，弃废液；
5)然后，将磁珠离心后进行磁分离，弃废液，晾干磁珠，去除乙醇；
6)再将磁珠与洗脱液混合，56℃加热10min～15min，离心后进行磁分离，得到的上清液即为毛干DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述酒精体积浓度为95％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述毛干与SDS溶液的用量比为：(1-10)mg:750μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中将毛干与质量分数1％的SDS溶液混合，温度为65℃条件下加热30min；取出毛干清洗后，再将毛干置于4mol/L的NaOH溶液中，65℃浸泡20s。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述毛干的消化，具体为：每1mg～10mg毛干中加入消化液A 335μL，10mg/ml的PK溶液50μL，质量分数为15％的SDS溶液40μL，体积分数为15.4％的DTT溶液50μL，56℃消化3h后，再加入30μL 10mg/ml的PK溶液，继续消化1h，再加入0.5mol/L的EDTA溶液25μL，56℃消化30min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述消化液提纯中，步骤1)中所述离心为12000rpm离心5min～10min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述漂洗液A中异丙醇的体积分数为30％～35％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中所述晾干为室温晾干5min～10min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述磁珠与洗脱液混合后，56℃加热15min。
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