KR20070042912A - 정제된 ｒｎａ를 분리하기 위한 시약 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA를 실질적으로 함유하지 않는, 정제된 RNA로 명명되는 완전한 RNA를 분리하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 어떠한 공급원(예: 사람, 기타 동물, 식물, 바이러스 등)으로부터의 RNA도 분리할 수 있다. 하나의 양태에서, 시료는 pH 4.0 미만의 페놀로 처리하며 정제된 RNA는 수성 상으로부터 회수한다. 다른 양태에서, RNA는 저 용적의 유기 용매를 함유하는 산성화된 시료로부터 침전시킨다. 기타 양태도 기술되어 있다. 동일한 본 발명의 조성물이 pH 조절을 이용하는 일부 양태를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 정제된 RNA는 DNA 오염물이 바람직하지 않는 검정, 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응에서 사용할 수 있다.
정제된 RNA의 분리 방법, 폴리머라제 연쇄 반응

Description

정제된 ＲＮＡ를 분리하기 위한 시약 및 방법{Reagents and methods for isolation of purified RNA}
본 발명은 생물학적 시료로부터 정제된 RNA의 분리를 증진시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
순수하고, 완전한 RNA의 분리는 분자 생물학, 임상 및 바이오기술 적용에 있어 유전자 발현의 분석을 위한 주요 단계이다. RNA 분리 방법은 이러한 목표를 달성하기 위한 시도로 개발되어 왔다. 대부분 흔히 사용되는 RNA 분리 방법은 본 출원인의 미국 특허 제4,843,155호; 제5,346,994호; 및 제5,945,515호에서 고찰되는 바와 같이, 페놀 추출, 카오트로프 염 용액(chaotropic salt solution) 및 실리카상의 흡착(참조: Ausubel et al, 1002)을 기초로 한다. '155 특허에 기술된 방법은 흔히 단일-단계 방법으로 언급되며 pH 4에서 페놀-구아니딘 용액을 사용하여 RNA를 추출한다. 이의 효능 및 단순성은, 단일-단계 방법이 RNA를 분리하기위해 가장 흔히 사용된 방법이 되도록 한다.
본 출원인의 '994 특허에 기술된 단일-단계 방법의 개선은 pH 4 내지 6에서 페놀-구아니딘 추출에 의해 동일한 시료로부터 RNA, DNA 및 단백질이 동시 분리되 도록 한다. 생물학적 시료는 균질화시켜 균질물을 클로로포름 또는 브로모클로로프로판과 같은 소수성 유기 용매를 사용한 상 분리에 적용시킨다. 원심분리에 이어, 혼합물을 RNA를 함유하는 상부 수성 상과, DNA 및 단백질을 함유하는 중간 상 및 유기 상으로 분리한다. 수성 상은 수집하여 RNA를 침전시키고 알코올로 세척한다.
'155 및 '994 특허에 기술된 단일-단계 방법에서, 분리된 수성 상의 조심스런 수집은 분리된 RNA의 품질을 위해 중요하다. 소량의 중간 상 및 유기 상은 수성 상과 함께 용이하게 제거될 수 있으며, 이는 분리된 RNA의 DNA 및 단백질에 의한 오염을 초래한다. 또한, 수성 상의 수집은 수작업 시도를 필요로하며, 이는 단일-단계 방법을 자동화하는데 장애가 된다.
'155 및 '994 특허에 기술된 시약 및 방법은 실질적으로 순수하고, 분해되지 않은 RNA를 제공한다. 그러나, '155 및 '994 특허에 따라 분리된 RNA는 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 검정(RT-PCR)에 의해 검출할 수 있는 잔류량의 게놈 DNA를 함유한다. 따라서, '155 및 '994 특허에 따라 분리된 RNA는, 이것이 DNA를 함유하지 않도록 추가로 정제하여야만 한다(참조: Guan at al, 2003; Girotti and Zingg, 2003). 오염시키는 게놈 DNA는 DNA 폴리머라제에 대한 매트릭스로서 제공되어 추가의 증폭 산물을 생성하고 RNA-의존성 RT-PCR을 파괴한다. 인트론을 함유하지 않는 유사유전자(pseudogene)의 존재는 이러한 시도를 신뢰할 수 없도록 하므로(참조: Mutimer 1998), RT-PCR에서 DNA 오염은 게놈 DNA에서 엑손-인트론 서열을 포함하는 프라이머 세트를 사용함에 의해서만 부분적으로 완화시킬 수 있다.
단일-단계 방법에 대한 변형은 분리된 RNA의 품질을 증진시킨다. 하나의 변형으로, RT-PCR 억제제는 염화리튬 침전 단계를 추가함에 의해 제거하였다(참조: Puissant, 1990; Mathy, 1996). 다른 변형에서, 염의 존재하에 RNA의 알코올 침전은 분리된 RNA의 순도를 증가시켰다(참조: Chomczynski, 1995). 그러나, 이러한 변형은 DNA 오염물을 제거하는데 있어 효과적이지 않다.
오염시키는 DNA를 제거하기 위한 일반적인 실행은 RNA-함유 시료를 데옥시리보뉴클레아제(DNase)로 처리하는 것이다. DNase 처리에 이어서, RNA-함유 시료를 페놀 및 클로로포름을 사용하여 후속적으로 추출한다. DNA 오염을 제한시키기 위한 노력에서, 추가의 DNA 침전 단계를 단일-단계 방법에 포함시켰다. 오염시키는 DNA는 1/3 용적의 95%w/w 에탄올을 첨가함으로써 수성 상으로부터 침전시켰다(참조: Siebert, 1993). 에탄올의 최종 농도는 약 24%w/w이었다. 시버트(Siebert)는, 이러한 낮은 에탄올 농도에서, DNA가 침전되는 반면 RNA는 용액속에 잔류함을 제시하였다. RNA는 추가의 알코올을 첨가함으로써 용액으로부터 침전시켰다. 그러나, 당해 프로토콜은 에티디움 브로마이드로 염색한 아가로즈 겔 상에서 및 RT-PCR에 의해 분리된 RNA를 분석하는 경우 가시적인 밴드로서 입증되는 바와 같이, 여전히 DNA로 오염된 RNA를 생성하였다.
단일-단계 방법에서 DNA 오염을 축소시키고 RNA의 품질을 개선시키기 위한 다른 노력에서, 몬스타인(Monstein, 1995)은 실험실 과정에서 페놀 추출의 pH를 pH 4.1 내지 4.7로 증가시키고 시료를 프로테이나제 K로 처리한 후, 다른 횟수의 페놀 추출, 침전 및 에탄올 세척을 수행하였다. 이러한 연장된 과정에도 불구하고, DNase 처리가 RT-PCR에서 사용하기 위해 준비된 DNA를 함유하지 않는(DAA-free) RNA를 수득하는데 있어 여전히 필수적이다.
DNA로부터 RNA를 분리하는 것은 또한 구아니딘 염을 첨가하지 않고 pH 4에서 페놀 추출함으로써 달성되었다(참조: Kedzierski, 1991). 그러나, 당해 과정 동안 구아니딘 염의 부재는, RNA가 리보뉴클레아제(RNase)에 민감하도록 함으로써 RNA를 분해시켰다. 당해 프로토콜의 추후 개선 방법은 나트륨 도데실 설페이트의 존재하에 pH 4.2에서 페놀 추출 완충액을 사용하였다(참조: Chattopadhyay et al., 1993). DNase 처리는 또한 단일-단계 방법에 이은 실리카 컬럼 과정의 조합을 사용하는 RNA 분리 방법에서 또한 필요로 한다(참조: Bonham, 1996). 이러한 이중 정제 프로토콜의 사용은 DNA 오염을 감소시키지만, 분리된 RNA는 RT-PCR에 의해 검출된 게놈 DNA를 여전히 함유하였다. RNA를 분리하는 다른 방법은 10%w/w 내지 60%w/w의 페놀을 함유하는 단일상 수용액을 사용하였다(참조: 미국 특허원 제20030204077호). 카오트로프의 부재하에서, 15%w/w 내지 55%w/w의 모노알코올, 디올 또는 폴리올을 사용하여 수용액중 페놀을 유지하였다.
따라서, '155 및 '994 특허에서 기술된 방법에 의해 분리된 RNA에 존재하는 잔류량의 DNA는 DNase 처리를 포함시킴에 의해 과정을 연장하키는 것이 필수적이도록 하였다. 이는 과정을 연장시키고 RNA를 DNase 처리 및 추가의 정제 단계 동안 분해 가능성에 불필요하게 노출되도록 함으로써 당해 방법의 유용성을 축소시켰다. 그러나, RNA 침전물로부터 잔류 DNA를 제거하는 것은 RT-PCR을 기초로 하는 유전자 발현의 미세배열 결정(microarray determination)에 요구된다.
'155 및 '994 특허에 기술된 바와 같은, RNA를 분리하는 선행의 방법은 pH 4 또는 그 이상에서 수행한 페놀 추출을 기초로 하였다. 단일-단계 방법의 선행의 변형 중 어느 것도 pH 4 이하에서 페놀 추출을 수행함으로써 RNA의 품질을 개선시키는 것을 시도하지 않았다. 반대로, 처음 '155 특허에서 사용된 pH 4는, 다음 '994 특허에서 pH가 4 내지 6의 범위로 증가되었다. 유사하게 몬스타인(참조: Monstein, 1995)에 의해 기술된 프로토콜은 페놀 추출의 pH를 4.7로 증가시켰다. 단일-단계 방법을 개선시키기 위한 다른 공들인 시도는 구아니딘-페놀 추출의 pH를 pH 5.2로 증가시켰다(참조:Suzuki, 2003).
RNA 분리의 단일-단계 방법에 대한 변형법은 비-카오트로프 산성 염을 사용하는 미국 특허 제5,973,137호에 기술되었다. 그러나, 단일-단계 페놀 추출 방법은 RNA 분리를 위해 여전히 가장 흔하게 사용된 방법이다. 단일-단계 방법을 기술하는 공보(참조: Chomczynski 1987)는 미국 화학회 및 과학 정보 협회의 데이타베이스에서 4번째로 흔하게 인용되는 논문이며, 가장 많이 인용된 논문은 최근 20년 이내에 발표되었다(참조: CAS 2003, American Chemical Society).
따라서, 분리된 RNA의 순도를 증진시키는 신규 방법이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 DNA를 실질적으로 함유하지 않음으로써 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 위해 준비된 RNA를 생물학적 시료로부터 분리할 수 있는 시약 및 방법을 기술한다. 이러한 RNA는 실질적으로 순수한 RNA로 명명되며, 임상, 연구 및 기타 적용에서 유전자 발현의 적절한 진단에 요구된다.
하나의 양태는 산성 페놀을 사용하는 상 분리 방법이며, 이는 RNA를 수성 상에서 분리한다. 이는, 실질적으로 순수한 RNA가 pH 4 미만에서 수행된 페놀 추출에 의해 분리될 수 있다는 예측하지 못한 발견을 기초로 한다.
다른 양태는 DNA 및 단백질의 산성 페놀 침전이며, 이는 RNA가 가용성 분획으로 잔류한다. 이는, 특정 농도의 산성 페놀이 DNA, 단백질 및 기타 세포 성분을 선택적으로 침전시켜, RNA를 가용성 형태로 잔류시키도록 하는 예측하지 못한 발견을 기초로 한다. DNA 및 단백질을 선택적으로 침전시키기 위한 산성 페놀의 사용은 상 침전에 대한 필요성을 제거하고 또한 독성 상-분리 용매의 사용을 제거한다. 이러한 시도는 RNA 분리 방법을 현저히 단순화시킨다.
다른 양태는 페놀, 카오트로프 및 저 용적의 유기 용매를 함유하는 용액으로부터 선택적인 RNA 침전이다. 당해 양태는 RNA 분자를 약 200개 뉴클레오타이드까지 선택적으로 침전시키는데 사용할 수 있다. 보다 짧은 RNA 분자(저 분자량 RNA) 및/또는 DNA를 또한 회수할 수 있다. DNA는 또한 유기 용매의 농도를 약 50%w/w 이상으로 증가시킴에 의해 시료로부터 회수할 수 있다.
다른 양태는 용액의 pH를 최대 pH 3.3으로 조절함으로써 하나 이상의 염을 함유하는 용액으로부터 RNA를 침전시키는 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 의해 분리된 RNA는 높은 순도를 지니므로, 즉, 각각 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 미국 특허 제4,843,155호; 제5,346,994호; 및 제5,945,515호에 기술된 방법과 같은 RNA 분리를 위한 선행 방법과 비교하여, RNA가 DNA 및/또는 단백질로 거의 오염되지 않으므로, RT-PCR에 직접 사용될 수 있 다. 분리된 RNA는 일본쇄(ssRNA) 또는 이본쇄(dsRNA)일 수 있으며, 동물, 식물, 효모, 세균 및 바이러스를 포함하는 각종의 생물학적 공급원으로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 방법 및 본 발명의 조성물로 분리된 RNA는 분자 생물학, 바이오기술, 및 임상 과학에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 시약은 단독으로, 또는 실질적으로 순수한 DNA(RNA 및 단백질을 실질적으로 함유하지 않는 DNA), 및 실질적으로 순수한 단백질(RNA 및 DNA를 실질적으로 함유하지 않는 단백질)을 분리하기 위한 다른 방법과 함께 사용할 수 있다.
이러한 및 다른 장점들은 다음의 상세한 설명 및 실시예의 측면에서 명백해질 것이다.
생물학적 시료로부터 정제된 RNA를 제조하기 위한 방법 및 조성물이 기술되어 있다. 생물학적 시료는 생체내, 시험관내, 또는 생체외와 상관없이, 생물학적 공급원으로부터의 어떠한 시료이다. 시료는 사람, 동물, 식물, 세균, 바이러스, 진균, 기생충, 마이코플라즈마 등으로부터 기원할 수 있다. 정제된 RNA는 역전사효소 폴리머라제 연연쇄 반응(RT-PCR)으로 검정하는 경우 DNA를 함유하지 않고 실질적으로 분해되지 않는 RNA이다.
상 분리
본 발명의 하나의 양태는 pH 4.0 미만에서 RNA-함유 시료의 페놀 추출을 수행함으로써 분리된 RNA의 순도를 증진시키는 방법 및 시약을 제공한다. 하나의 양태에서, pH는 약 pH 3.9 내지 약 pH 3.6의 범위이다. pH 4.0 미만에서 페놀 추출은 pH 4.0 이상에서의 페놀 추출보다 DNA로부터 RNA를 더욱 효율적으로 분리한다.
본 발명의 상 분리 방법에 사용된 RNA 분리 시약은 페놀 수용액, 및 pH를 약 3.6 내지 pH 4.0 미만의 범위내로 유지시키기 위한 완충액을 포함한다. 하나의 양태에서, pH는 pH 3.7 내지 pH 3.9의 범위이다. RNA 분리 시약에서 페놀의 유효 농도는 약 10%w/w 내지 약 60%w/w의 범위이다. 하나의 양태에서, 페놀의 농도는 약 25%w/w 내지 약 45%w/w의 범위이다.
조성물은 또한 리보뉴클레아제(RNase) 억제제, 염, 킬레이트제(chelating agent), 가용화제, 세제, 카오트로프제 및 페놀 유도체와 같은 다른 성분들을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 배양된 세포와 같이 RNase 활성이 낮은 시료중 RNA는 약 3.6 내지 pH 4.0 미만의 pH에서 산성 페놀로 추출할 수 있으며, 이는 RNA 분해에 대해 효과적으로 보호할 수 있다. 그러나, 페놀은 시료로부터 또는 오염된 실험실 기기로부터 기원한 세포 RNase에 의한 RNA의 분해를 적절하게 방지할 수 없다. 즉, 하나 이상의 RNase 억제제의 유효량이 조성물에 포함될 수 있다. RNase 억제제는 시료 균질화 동안 및/또는 산 페놀 추출 동안 존재할 수 있다. RNase 억제제는 프로테이나제 K, 사람 태반으로부터의 리보뉴클레아제 억제제, 바나딜 리보뉴클레오사이드 복합체 및 카오트로프 염을 포함한다. 카오트로프 염은 구아니딘 티오시아네이트, 구아니딘 하이드로클로라이드 및 이들의 혼합물을 포함한다. 하나의 양태에서, 카오트로프 염의 유효 농도는 약 0.5M 내지 약 6M의 범위이다. 다른 양태에서, 카오트로프 염의 유효 농도는 약 2M 내지 약 4M의 범위이다.
완충액은 하나 이상의 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트, 프탈레이트, 타르트레이트 또는 락테이트의 염일 수 있다. 완충액의 농도는 pH 약 3.6 내지 4.0 미만에서 조성물을 유지시키기에 충분할 수 있다. 하나의 양태에서, pH는 약 3.75 내지 약 3.85의 범위이다. 완충액은 시료 균질화 전 또는 후에, 별도로 또는 상 분리 시약과 함께 가해질 수 있다. 혈액 및 식물 조직과 같은 고 완충 능력을 지닌 일부 시료가 pH를 바람직한 범위내로 조절하기 위해 추가량의 산을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 나트륨, 칼륨, 리튬 및 암모늄의 클로라이드, 포스페이트, 아세테이트 및 티오시아네이트와 같은 유기 및 무기 염을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 시트레이트 및 에틸렌디아민 테트라아세테이트 염과 같은 킬레이트제를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 폴리옥시에틸렌소르비탄, 나트륨 도데실설페이트 및 사르코신과 같은 세제를 함유할 수 있다. 염, 킬레이트제 및 세제는 실질적으로 순수한 RNA의 침전 및 조직 가용화를 촉진한다. 페놀을 가용화시키는 것을 보조하기 위해, 수성 조성물은 가용화제 또는 가용화제들의 혼합물을 함유할 수 있다. 가용화제는 약 1%w/w 내지 약 10%w/w 농도의 글리세롤과 같은 폴리알코올을 포함하며, 상한치는 분리된 RNA의 DNA 오염을 증가시키지 않도록 선택된다. 가용화제는 또한 구아니딘 염을 포함한다.
본 발명의 조성물은 약 60%w/w의 페놀, 및 페놀 자체보다 독성이 거의 없는 약 5%w/w 이하의 페놀 유도체를 함유할 수 있다. 이러한 유도체들은 페닐에탄올, 프로필렌 페녹시톨, 티몰 또는 부틸페놀을 포함한다. 하나의 양태에서, 이들 유도체는 약 1%w/w 내지 약 5%w/w의 범위의 양으로 존재한다. 조성물은 또한 불용성 또는 부분 수용성 유기 화합물, 예를 들면, 사이클로헥산올, 사이클로헥실 브로마이드, 및 디클로로벤조산을 함유할 수 있다. 이들 화합물은 조성물의 밀도를 증가시켜 페놀을 대체함으로써 조성물의 독성을 최소화시킨다.
상 분리 방법의 하나의 양태에서, 시료는 통상적으로 본 발명의 조성물속에서 균질화하거나 분해하여 제조한다. 다량의 DNA 및 미립자 물질은 균질물 또는 분해물로부터 침강시키거나 여과시켜 제거할 수 있다. 균질물 또는 분해물은 소수성 유기 용매, 또는 클로로포름, 삼염화탄소, 브로모나프탈렌, 브로모아니솔 또는 브로모클로로프로판과 같은 용매의 혼합물과 혼합시킴으로써 수성 및 유기 상으로 분리한다. 당해 혼합물은 원심분리, 예를 들면 약 4℃ 내지 약 10℃ 사이의 범위에서의 온도로 원심분리하여 침강시킬 수 있다. 상부 수성 상은 RNA를 함유하며, 중간 상 및 유기 상은 DNA 및 단백질을 함유한다.
RNA는 수성 상으로부터 저급 알코올과 같은 수용성 유기 용매를 사용하여 침전시킨다. 침전된 RNA는 침강 또는 여과에 의해 세척하고, 및 물, 포름아미드 또는 완충액 속에서 가용화시킨다. 최종 RNA 제제는 실질적으로 순수한데, 즉, 이는 분해되지 않고 RT-PCR로 시험시 DNA로 실질적으로 오염되지 않는다.
또한, 본 발명의 상 분리 방법은 RNA, DNA 및 단백질의 동시 분리를 위한 방법과 혼용된다. DNA 및 단백질은 중간 상으로 격리되고 유기 상은 문헌(참조: Chomczynski, 1993; TRI Reagent brochure, 2003)에 기술되어 있는 바와 같이, 회수할 수 있다. 달리는, DNA를 유기 상 및 중간 상으로부터 0.3 용적의 에탄올을 가한 후, 단백질을 보다 많은 양의 에탄올로 침전시켜 침전시킨다. 예를 들어, DNA는 중간 상 및 유기 상으로부터 pH 7.0 이상의 수용액을 사용하여 재-추출할 수 있다. 재-추출된 DNA는 수용액으로부터 에탄올로 침전시킨다. 인지되는 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 동일한 시료로부터 실질적으로 순수한 RNA, 실질적으로 순수한 DNA(즉, DNA는 필수적으로 RNA를 함유하지 않는다), 및 단백질을 분리할 수 있다. 모든 3개 성분들의 분리는, 유전자 발현 패턴이 생물학적 시료에서 DNA 서열 및 단백질 함량에 있어서의 변화와 연관되도록 하고, 다수의 다른 적용을 지니도록 한다.
하나의 양태에서, 시료를 균질화하거나 분해시키는데 사용된 조성물은 이후에 단독으로, 또는 상 분리 용매(예를 들면, 클로로포름)와 함께 균질물 또는 분해물에 가해질 하나 이상의 성분들을 결여할 수 있다. 다른 양태에서, 시료 균질화 또는 분해는 pH 4.0 이상에서 수행할 수 있으며, 이 경우, 산 및 완충액이 이후에 균질화된 또는 분해된 시료에 균질물 또는 분해물의 pH가 약 3.6 내지 pH 4.0 미만의 범위내가 되도록 하기에 충분한 양으로 가해진다. 당해 양의 산 또는 완충액은 균질물 또는 분해물에 직접 가해질 수 있거나, 또는 상 분리 용매속에 용해될 수 있다. 상 분리 용매와 함께 가해지는 경우, 산은 포름산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 아미노카프로산, 락트산 또는 클로로페닐아세트산일 수 있다. 산 용해도를 증진시키기 위하여, 상 분리 용매는 글리콜과 같은 가용화제를 함유할 수 있다.
하나의 양태에서, 시료 균질화 또는 분해는 RNase 억제제를 함유하는 페놀을 함유하지 않는 용액속에서 수행된다. 균질화 또는 분해 후, 페놀을 가하여 약 10%w/w 내지 약 60%w/w 범위의 최종 농도를 달성하고 추출을 pH 약 3.6 내지 4.0 미만에서 수행한다. 추출 동안 당해 pH 범위는 수용액의 일부이거나, 페놀에 가해지거나, 또는 별도로 가해질 수 있는 완충액에 의해 유지된다. 원심분리에 의한 상 분리 후, RNA는 수성 상으로부터 알코올로 침전시킨다. 침전된 RNA를 세척하여 물, 완충액 또는 포름아미드와 같은 용매 속에 용해시킬 수 있다.
상층액 속에 RNA를 남기는 DNA의 산성 페놀 침전
본 발명의 하나의 양태는 상 분리를 수행하지 않고 산성 페놀 용액을 사용하여 실질적으로 순수한 RNA를 분리한다. 특정 농도의 산성 페놀은 DNA[일본쇄 DNA(ssDNA) 및 이본쇄 DNA(dsDNA) 둘 다], 단백질, 및 기타 세포 성분을 선택적으로 침전시키나, RNA는 가용성 형태로 남는다. 이러한 예측하지 못한 현상을 이용하여 수성 및 유기 상과 중간 상을 분리하지 않고 RNA를 분리하기 위한 시약 및 방법을 고안하였다.
산성 페놀 침전 방법은 RNA 분리 방법을 단순화시킨다. 이는 또한 상 분리 방법에 사용될 수 있는 독성 유기 용매를 제거한다. 조성물은 DNA 및 단백질을 몰아내어 튜브의 하부에 단단한 펠릿(pellet)을 형성시키며, 이는 DNA 및 단백질 분자의 RNA를 함유하는 상층액 분획으로의 우연한 이동 위험성을 완화시킨다. 상층액은 피펫팅, 흡수(siphoning), 경사분리 또는 여과에 의해 안전하게 수집할 수 있으며, 이들 각각은 RNA 분리를 위한 자동화된 과정에서 사용하기 위해 자동화할 수 있다. 또한, 전체 산성 페놀 침전 방법은 실온에서 일어날 수 있으며, 이는 상 분리 방법에서 사용할 수 있는 냉장 원심분리에 대한 요구를 제거한다.
산성 페놀 침전에 사용된 조성물은 페놀의 수용액을 약 3%w/w 내지 30%w/w 미만 범위의 농도로 포함한다. 하나의 양태에서, 페놀 농도는 3%w/w 내지 약 25%w/w의 범위이다. 다른 양태에서, 페놀 농도는 약 8%w/w 내지 약 20%w/w 범위이다. 산 침전 양태에서 페놀 농도는 '155 및 '994 특허에 기술된 30%w/w 페놀 내지 60%w/w 페놀 농도보다 더욱 낮다.
본 발명의 조성물은 약 3.6 내지 약 5.5 범위내의 pH를 유지시키기에 충분한 양의 완충액 또는 산으로 산성화시킨다. 하나의 양태에서, pH는 약 3.9 내지 약 4.5의 범위이다. 완충액은 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트, 프탈레이트, 타르트레이트 및/또는 락테이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 유기 또는 무기 완충액으로부터 선택할 수 있다.
RNA 분리 효율을 증진시키기 위하여, 산성 페놀을 RNase 억제제, 염, 킬레이트제, 페놀 가용화제 및/또는 세제로 보충시킬 수 있다. RNase 억제제는 바나딜 리보뉴클레오사이드 착물 및 프로티나제 K 또는 이들 억제제의 배합물을 포함한다. RNase 억제제는 또한 카오트로프제 또는 구아니딘 염과 같은 카오트로프를 약 0.5M 내지 약 6M 범위의 농도에서 포함한다. 하나의 양태에서, 카오트로프의 농도는 약 1.5M 내지 약 2.5M이다. 카오트로프 염은 수용액속에서 페놀을 유지시킴에 의해 페놀 가용화제로서 제공될 수 있다. 산성 페놀 조성물은 또한 나트륨, 칼륨, 리튬 및 암모늄의 클로라이드, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트 및 티오시아네이트 염과 같은 유기 및/또는 무기 염을 함유할 수 있다. 조성물은 또한 시트레이트 및 에틸렌디아민 테트라아세테이트 염과 같은 킬레이트제를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 폴리옥시에틸렌소르비탄, 나트륨 도데실설페이트 및 사르코신을 포함하는 세제를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 티몰, 페닐에탄올, 사이클로헥산올, 사이클로헥실 브로마이드 및 디클로로벤조산과 같은, 페놀보다 독성이 거의 없는 시약 및 용매 5%w/w 이하를 함유할 수 있다. 이러한 추가의 성분들은 순수한 RNA의 침전 및 조직 가용화를 증진시킨다.
산성 페놀 침전 시약은 수용액 속에서 페놀을 유지하는데 도움을 주는 추가의 가용화제 또는 가용화제의 혼합물을 함유할 수 있다. 페놀 가용화제는 글리콜, 폴리알코올 및 저급 알코올을 포함한다. 이들은 산성 페놀 침전 시약에 약 1%w/w 내지 약 10%w/w의 양으로 가해질 수 있으며, 상한치는 분리된 RNA의 DNA 오염을 증가시키지 않도록 선택된다.
산성 페놀 침전 방법의 하나의 양태에서, 생물학적 시료는 균질화되거나 침전 시약속에서 분해된다. 수득되는 균질화물 또는 분해물은 원심분리하거나 여과하여 침전된 DNA, 단백질 및 기타 세포 성분들을 제거한다. RNA는 가용성 형태로 잔존하며 실질적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올을 포함하는 저급 알코올과 같은 수용성 유기 용매화 함께 상층액으로부터 후속적으로 침전된다. 이후에, RNA 펠릿을 세척하여 물, 완충액 또는 포름아미드속에 용해할 수 있다.
산성 페놀 침전 방법의 다른 양태에서, 생물학적 시료는 약 3배(3X) 내지 약 1.5배(1.5X) 농축된 산성 페놀 침전 시약속에서 균질화한다. 농축된 시약의 사용은 고체 조직 및 하나의 시약을 사용한 고 용량 액체 시료의 가공을 허용한다. 고 용량의 액체 시료는 농축된 시약에 소량의 물을 가함으로써 상쇄시킬 수 있다. 농축된 시약은 생물학적 시료중 대부분의 성분들을 용해시키며 세포 구조물로부터 RNA를 효과적으로 방출한다. 예를 들어, 시료는 2배(2X) 농축된 시약 속에서 균질화시킬 수 있다. 균질화에 이어서, 동일한 용량의 물을 균질화물과 혼합한다. 물을 첨가하여 페놀, 구아니딘 및 기타 성분들을 목적한 농도내로 한다. 이는 RNA를 함유하는 시료로부터 DNA 및 단백질을 효과적으로 침전시키고 제거하기 위한 조건을 생성한다.
균질화물 또는 분해물의 원심분리 또는 여과 후, RNA는 상층액 또는 여액속에 잔류하는 반면, DNA, 단백질 및 기타 세포 성분들은 튜브 바닥에 단단한 펠릿을 형성한다. RNA는 상층액 또는 여액으로부터 앞서 기술한 바와 같은 수-용성 유기 용매로 침전시킨다. RNA 침전물은 세척하여 물, 완충액 또는 포름아미드 속에 용해시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 단일 시약을 상 분리 방법 또는 산성 페놀 침전 방법에 사용할 수 있다. 이러한 이중 사용 시약은 상 분리 방법에 사용된 시약의 성분들 및 산성 페놀 침전 방법에 사용된 2X 농도의 시약을 포함한다. 앞서 기술한 바와 같이, 상 분리 방법을 위한 pH는 약 pH 3.6 내지 약 pH 4.0 미만일 수 있으며, 산성 페놀 침전 방법을 위한 pH는 약 pH 3.6 내지 약 pH 5.5일 수 있다. 따라서, 이중 사용 양태에서, 시약의 pH 조절은 하나의 방법으로부터 다른 방법으로 스위칭(switching)하기 전에 필수적이다. 예를 들어, pH 4.2에서 산성 페놀 침전 방법을 위한 2X 시약은 또한 상 분리 방법에서 사용하기 전에 pH 4.0 미만으로 산성화시켜야 한다.
본 발명의 상 분리 방법은 지방 조직 및 특정의 종양 또는 신생물 조적과 같은 다량의 지방을 함유하는 표본에 대해 사용할 수 있다. 식물 및 지방-함유 조직과 같은 높은 수준의 오염물을 지닌 시료는 산성 페놀 침전 방법 및 상 분리 방법을 결합한 이중 사용 과정으로 가공할 수 있다. 하나의 양태에서, 생물학적 시료는 2X 산성 페놀 침전 시약속에서 균질화시킨다. 이후에, 균질물을 물로 희석하여 산성 페놀 침전 시약의 농도 범위(즉, 약 3%w/w의 페놀 내지 30%w/w 미만의 페놀)에 근접하도록 한다. 희석 후, 침전된 DNA, 단백질 및 기타 세포 성분들을 침강 또는 여과로 제거한다. 수득되는 상층액 또는 여액을 수집하여 상 분리 용매와 혼합한다. 하나의 양태에서, 0.05 용적 내지 0.01 용적의 상 분리 용매를 상층액 1 용적당 가한다. 상 분리 용매 또는 용매의 혼합물은 카프로락톤, 에틸렌 글리콜 디아세테이트, 폴리에틸렌 글리콜 디벤조에이트를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 소수성 용매, 및 상 분리 방법에 사용된 용매이다. 혼합물을 원심분리하여 상부 수성 상, 중간 상 및 유기 상을 수득한다. RNA를 함유하는 수성 상을 수집하고 RNA를 침전시키기 위한 저급 알코올 1 용적과 혼합한다. 침전된 RNA를 세척하고 물, 완충액 또는 포름아미드 속에 용해시킨다.
본 발명의 산성 페놀 용액을 기초로 정제된 RNA를 제공하는 방법은 바이오 기술, 분자생물학 및 임상 적용에서 사용된 RT-PCR을 기초로 하는 미세배열을 사용하는 유전자 발현 프로파일링(profiling)에 유용하다. 이는 암 세포 및 기타 유형의 병리학적 표본에서 특정 유전자 발현 패턴의 검출에 의해 예시될 수 있다.
저 용적 유기 용매를 사용한 선택적인 RNA 침전
앞서 기술한 바와 같이, RNA는 본 발명의 상 분리 방법에서 수성 상으로부터, 및 본 발명의 산성 페놀 조성물로부터 침전시킬 수 있다. 각각의 경우에, RNA는 약 1 용적의 유기 용매를 약 50%w/w의 최종 유기 용매 농도에 근접하도록 가함으로써 침전시킨다. 그러나, 일부 시료 제제에서, 1 용적의 유기 용매는 RNA와 함께 프로테오글리칸과 같은 단백질 및 다당류를 공-침전시킨다. 앞서, 오염물의 공-침전을 방지하기 위하여, 하나의 방법은 0.9M 나트륨 이온의 존재하에 25%w/w 알코올을 사용함으로써 단일-단계 RNA 정제 방법을 변형시켜 RNA를 침전시켰다(참조: Chomczynski, 1995). 다른 방법은 페놀을 함유하지 않는 카오트로프 용액과 13%w/w 내지 23%w/w의 유기 용매로 처리하였으며, 용액의 pH는 RNA를 침전시키기 위해 pH 6 내지 pH 7.5의 범위내에서 유지하였다.
본 발명의 방법에서, 실질적으로 순수한 RNA는 유기 용매 또는 용매의 혼합물을 가하여 약 10%w/w 내지 약 40%w/w의 유기 용매의 농도를 달성함으로써 페놀-카오트로프 용액으로부터 침전시킨다. 유기 용매는 아세톤, 테트라메틸렌 설폰, 저급 알코올, 글리콜, 폴리알코올, 아세톤, 에틸렌글리콜 디아세테이트 및/또는 메틸 설폭사이드일 수 있다. 당해 방법은 상 분리 방법에서 수성 상으로부터, 또는 산성 페놀 침전 방법에서 DNA- 및 단백질을 함유하지 않는 상층액으로부터 RNA를 침전시키는 경우 실질적으로 순수한 RNA를 제공한다. 당해 방법은 염을 페놀-카오트로프 용액에 가하는 것을 필요로 하지 않는다.
실질적으로 순수한 RNA가 앞서 제안된 바와 같이(참조: Chomczynski 1995), 용액을 염으로 보충하지 않고 약 10%w/w 내지 약 40%w/w 농도의 유기 용매에서 페놀-카오트로프 용액으로부터 침전된다는 것은 예측되지 않았던 것이다. 실제로, 염을 알코올과 함께 가하는 것은 분리된 RNA의 순소를 감소시켰다. 10%w/w 내지 40%w/w 알코올 단독이 페놀-카오트로프 용액으로부터 RNA를 침전시켰다는 발견은, 0.3 용적의 알코올(24%w/w의 최종 농도)을 페놀-카오트로프 용액에 가함으로써 DNA가 침전되고 RNA가 가용성 형태로 잔류한다는 보고(참조: Siebert, 1993)와 대치되는 것이었다.
하나의 양태에서, 조성물 중 유기 용매(들)의 최종 농도는 약 20%w/w 내지 약 25%w/w이다. 다른 양태에서, 조성물중 유기 용매(들)의 최종 농도는 약 10% 내지 약 40%이다. 페놀-카오트로프 용액의 pH는 약 pH 2.0 내지 약 pH 9.0의 범위일 수 있다. 하나의 양태에서, 페놀-카오트로프 용액의 pH는 약 pH 3.5 내지 약 pH 5.0의 범위이다.
약 10%w/w 내지 약 40%w/w의 농도에서 유기 용매는 보다 많은 분자량 RNA로서 고려되는, 약 200개 염기 보다 큰 RNA 분자를 침전시킨다. 약 200개 염기 미만의 RNA 단편과 함께, 다당류 및 프로테오글리칸은 용액속에 잔류한다. 보다 많은 분자량의 RNA의 침전에 이어서, 보다 적은 분자량의 RNA를 용액으로부터 약 50%w/w 이상, 예를 들면, 약 90%w/w의 최종 농도에 근접하기 위한 추가량의 유기 용매를 사용하여 침전시킴으로써 회수할 수 있다.
RNA를 약 10%w/w 내지 약 40%w/w의 유기 용매를 사용하여 침전시키는 본 발명의 방법을 또한 사용하여 RNA 침전물중 오염시키는 DNA의 양을 감소시킬 수 있다. RNA의 선택적인 침전은, 소량의 오염시키는 DNA가 용액 속에, 예를 들면 1㎍의 RNA당 10ng 미만의 DNA로 존재하는 경우에 효과적이다. 약 10%w/w 내지 약 40%w/w의 유기 용매를 사용하여 RNA를 침전시키는 것은 또한 분리된 RNA의 품질을 개선시킴으로써, 실질적으로 순수하고 분해되지 않은 RNA의 높은 수율이 본 출원인의 선행 '155 및 '994 특허에 기술된 방법에 따라 수득되도록 한다.
염-함유 용액으로부터 산성 RNA 침전
DNA와 함께, 실질적으로 순수한 RNA는 약 3.3 미만의 pH에서 RNA의 pH-의존적 침전에 의해 염을 함유하는 수용액으로부터 수득할 수 있다. 산성 pH에서 염 용액으로부터 RNA를 침전시키는 것은 미국 특허 제5,973,137호에 보고된 것과 대치된다. '137 특허는, 6 미만의 pH에서의 용액 중, 비-카오트로프 염이 DNA를 침전시키는 반면, RNA는 가용성 형태로 존재함을 기술한다.
본 발명의 방법에서, 완충액 산은 pH 3.3 이하를 생성하기에 충분한 양으로 RNA 용액에 가해진다. 하나의 양태에서, 수득되는 pH는 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.7의 범위이다. 산은 유기 산 또는 무기 산일 수 있다. 산은 염산, 인산, 아세트산 및/또는 락트산일 수 있다. 하나의 양태에서, 조성물 중 염은 구아니딘 염일 수 있다.
당해 양태는 본 발명의 상 분리 방법 및/또는 본 발명의 산성 페놀 침전 방법으로 혼입될 수 있다. 산성 페놀 침전 방법에서 사용하기 위해, 산 또는 완충액을 물 또는 유기 용매속에 용해시킬 수 있다. 산은 RNA를 선택적으로 침전시켜 다당류 및 단백질을 가용성 형태로 남긴다. RNA를 침전시키는데 사용된 산의 용적은 작으며 RNA 분리동안 적은 시료 용적을 허용한다. 하나의 양태에서, 산의 용적은 RNA 용액의 용적의 약 0.1%w/w 내지 약 25%w/w의 범위이다.
본 발명에 기술된, 소량의 유기 용매와 산성 pH를 사용한 RNA의 침전을 또한 사용함으로써 본 출원인의 '155 및 '994 특허에 기술된 방법을 사용한 RNA의 품질을 개선시킬 수 있다.
RNA의 침전에 의해 수득된 RNA-함유 시료의 염-함유 용액으로부터 RNA의 산성 침전 또는 적은 용적의 유기 용매를 사용한 처리는 보다 많은 분자량의 RNA를 침전시킨다. 보다 많은 분자량의 RNA는 리보소옴 RNA(rRNA, 예를 들면, 18S 및 28S RNA) 및 전령 RNA(mRNA)를 포함한다. 나머지 보다 적은 분자량의 RNA는 약 200개 미만의 뉴클레오타이드이고, 전달 RNA(tRNA), 5S RNA, 및 유전자 발현을 조절하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. 보다 적은 분자량의 RNA는 상술한 용액으로부터 추가 용적의 유기 용매로 처리함으로써 회수한다. 하나의 양태에서, 시료는 1 용적의 저급 알코올, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 등으로 처리하여 저 분자량 RNA를 침전시킨다.
본 발명의 예시적인 용액 및 방법은 다음 작업 실시예에서 기술된다
실시예 1
랫트 간(rat liver)으로부터 RNA의 상 분리적 분리
하나의 양태에서, 다음 조성물을 RNA의 상 분리에 사용하였다: 4M 구아니딘 티오시아네이트, 0.2M 암모늄 티오시아네이트, 5%w/w 글리세롤, 40%w/w 페놀, 0.1%w/w 사르코신, 10mM 나트륨 시트레이트, 및 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액, pH 3.8.
랫트 간(38mg)을 1.5ml의 상기 조성물속에서 균질화시켰다. 이후에, 0.15ml의 브로모클로로프로판을 균질화물에 가하였다. 수득되는 혼합물을 진탕시키고 15분 동안 4℃에서 12,000xg로 침강시켰다. 침강시킨 후, 수성 상, 중간 상 및 하부 유기 상이 형성되었다. RNA는 수성 상내로 격리되는 반면, DNA 및 단백질은 중간 상 및 유기 상내로 격리되었다.
RNA는 수성 상으로부터 0.75ml의 이소프로판올을 가함으로써 침전시켰다. RNA 침전물을 10,000xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 수득되는 펠릿을 0.75ml의 75%w/w 에탄올로 세척하고 10,000xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 최종 RNA 펠릿을 물속에 용해시키고 RNA 농도를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 A260/280에서 분광광도계적으로 측정하였다.
RNA의 수율은 0.22mg이었다. A260/280 비는 1.76이며, 이는 단백질 오염의 결여를 나타내었다. 분리된 RNA를 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 액틴 및 c-fos 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 대해 성공적으로 이용하였다. 역 전사를 인비트로겐(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재)으로부터 슈퍼스크립트 전사효소(SuperScript transcriptase)를 사용하여 수행하고 PCR을 시그마(Sigma, 미쥬리주 세인트 루이스 소재)로부터의 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 수행하였다. RT-PCR 생성물을 1% 아가로즈-에티디움 브로마이드 겔상에서 분석하였다. 어떠한 DNA도 역 전사의 부재하에서 분리된 RNA에서 검출되지 않았다. 분리된 RNA의 노던 블롯 분석을 1%-포름알데하이드-아가로즈 겔을 사용하여 수행하고 나일론 막에 이전시켰다. 에티디움 브로마이드 및 메틸렌 블루 염색은, 분해되지 않는 리보소옴 밴드를 나타내었다. 바이오틴-표지된 프로브를 사용한 하이브리드화는 GAPDH, 액틴 및 c-fos에 대한 mRNA의 분해되지 않는 밴드를 나타내었다.
실시예 2
사람 혈액으로부터 RNA의 상 분리적 분리
사람 혈액(0.5ml)을 75㎕의 빙초산 및 5ml의 실시예 1에서 기술한 조성물과 혼합하였다. 이후에, 0.5ml의 브로모클로로프로판을 혼합물에 가하였다. 당해 혼합물을 진탕시키고 15분 동안 4℃에서 12,000xg로 침강시켰다. 침강 후, 혼합물은 수성 상, 중간 상 및 하부 유기 상을 형성하였다. RNA는 수성 상에 격리된 반면, DNA 및 단백질은 중간 상 및 유기 상내에 격리되었다.
RNA를 수성 상으로부터 1.25ml의 이소프로판올을 가하여 침전시켰다. RNA 침전물을 5분 동안 12,000xg에서 원심분리하였다. 수득되는 펠릿을 5ml의 75% 에탄올로 세척하고 5분 동안 10,000xg에서 원심분리하였다. 최종 RNA 펠릿을 물속에 용해하고 RNA 농도를 당해 분야의 숙련가에 공지된 방법에 의해 A260/280에서 분광광도계적으로 측정하였다.
RNA의 수율은 18.9㎍이었다. A260/ 280비는 1.70이며, 이는 단백질 오염물의 결여를 나타내었다. 분리된 RNA를 GAPDH 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 성공적으로 이용하였다. 어떠한 DNA 오염도 역전사없이 분리된 RNA의 PCR에 의해 검출되지 않았다. 분리된 RNA의 노던 블롯 분석은 리보소옴 RNA의 분해되지 않은 밴드 및 GAPDH mRNA의 분해되지 않은 밴드를 나타내었다.
실시예 3
상 분리 및 산성화된 브로모클로로프로판에 의한 RNA의 분리
랫트 비장(21mg)을 3.5M 구아니딘 티오시아네이트, 50mM 나트륨 아세테이트, 43%w/w 페놀, 0.1% 트리톤 X-100, pH 4.1을 함유하는 1ml의 수용액 속에서 균질화시켰다. 균질물을 12,000xg에서 10분 동안 원심분리하여 다량의 DNA 및 미립자를 제거하였다. 선명한 균질물을 14%w/w 아세트산을 함유하는 0.1ml의 브로모클로로프로판과 혼합하였다. 혼합물의 수득되는 pH는 3.7이었다. 당해 혼합물을 진탕시키고 10분 동안 4℃에서 12,000xg로 침강시켰다. 침강 후, 혼합물은 수성 상, 중간 상 및 하부 유기 상을 형성하였다. RNA는 수성 상내로 격리되는 반면, DNA 및 단백질은 중간 상 및 유기 상내로 격리되었다.
RNA를 수성 상으로부터 0.5ml의 에탄올을 가하여 선택적으로 침전시켰다. 침전된 RNA를 5분 동안 10,000xg에서 침강시킨 후, 75%w/w 에탄올로 세척하고 5분 동안 10,000xg에서 침강시켰다. 최종 RNA 펠릿을 물속에 용해시키고 RNA 농도를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 A260/280에서 분광광도계적으로 측정하였다.
RNA의 수율은 77㎕이었다. A260/280비는 1.74이며, 이는 단백질 오염이 없음 을 나타내었다. 분리된 RNA는 GAPDH 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 성공적으로 이용되었으며 어떠한 DNA 오염도 검출되지 않았다. 분리된 RNA의 노던 블롯 분석은 리보소옴 RNA의 분해되지 않은 밴드 및 GAPDH mRNA의 분해되지 않은 밴드를 나타내었다.
실시예 4
페놀을 함유하지 않는 카오트로프 용액속에서 상 분리 및 균질화에 의한 RNA의 분리
랫트 골격근(29mg)을 3M 구아니딘 티오시아네이트 및 5mM 나트륨 아세테이트의 수용액 0.5ml 속에서 균질화하였다. 균질화물을 0.5ml의 페놀 및 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액, pH 3.7과 혼합하였다. 수득되는 혼합물을 0.1ml의 브로모클로로프로판과 함께 진탕하고 15분 동안 4℃에서 12,000xg로 침강시켰다. 침강 후, 혼합물은 수성 상, 중간 상 및 하부 유기 상을 형성하였다. RNA는 수성 상내로 격리된 반면, DNA 및 단백질은 중간 상 및 유기 상내로 격리되었다.
RNA는 50%w/w 에탄올을 함유하는 0.5ml의 수용액을 가함으로써 수성 상으로부터 침전시켰다. RNA 침전물을 실시예 1에 기술된 바와 같이, 세척하고, 처리하고 분석하였다.
RNA의 수율은 16㎕이었다. A260/ 280비는 1.70이며, 이는, 단백질 오염이 없음을 나타내었다. 분리된 RNA는 GAPDH 프라이머를 사용한 RT-PCR에 성공적으로 이용되었으며 어떠한 DNA 오염도 검출되지 않았다. 분리된 RNA의 노던 블롯 분석은 리 보소옴 RNA의 분해되지 않은 밴드 및 GAPDH mRNA의 분해되지 않은 밴드를 나타내었다.
실시예 5
1%w/w 나트륨 도데실 설페이트 속에서 균질화를 사용한 상 분리에 의한 RNA의 분리
25cm2의 플라스틱 병에서 성장시킨 사람 섬유아세포의 1차 배양물[클로네틱스(Clonetics) 제조원, 캘리포니아주 샌디에고 소재]를 1%w/w 나트륨 도데실 설페이트 및 10mM 나트륨 시트레이트, pH 7.0을 함유하고, 55㎍/ml의 프로테이나제 K로 보충된 1.5ml의 용액으로 덮었다. 수득되는 세포 용액을 실온(약 20℃)에서 1시간 동안 항온처리하고, 원심분리 튜브로 옮기고, 12%w/w 물 및 10mM 나트륨 아세테이트, pH 3.7를 함유하는 1.5ml의 산성 페놀과 혼합하였다. 15분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 혼합물은 수성 상, 중간 상 및 유기 상을 형성하였다. 상 분리 후, RNA는 수성 상내로 격리된 반면, DNA 및 단백질은 중간 상 및 유기 상내로 각각 격리되었다.
RNA를 수성 상으로부터 0.75ml의 에탄올을 가하고 5분 동안 10,000xg에서 침강시켜 침전시켰다. RNA 펠릿을 75% 에탄올로 세척하고, 5분 동안 10,000xg에서 원심분리하고, 수중에 용해하였다.
RNA의 수율은 18㎍이었다. A260/280 비는 1.71이며, 이는, 단백질 오염이 없음을 나타내었다. 분리된 RNA는 GAPDH 프라이머를 사용한 RT-PCR에 성공적으로 이 용되었으며 어떠한 DNA 오염도 검출되지 않았다. 분리된 RNA의 노던 블롯 분석은 리보소옴 RNA의 분해되지 않은 밴드 및 GAPDH mRNA의 분해되지 않은 밴드를 나타내었다.
실시예 6
산성 페놀 침전에 의한 RNA의 분리
하나의 양태에서, 다음 조성물을 RNA의 산성 페놀 침전에 사용하였다: 20%w/w 페놀, 2M 구아니딘 티오시아네이트, 15mM 나트륨 시트레이트, 0.1M 염화리튬, 0.05%w/w 사르코신, 1.5%w/w 글리세롤 및 나트륨 아세테이트 완충액, pH 4.2. 랫트 간(52mg)을 1ml의 당해 조성물 속에서 균질화시켰다. 균질화물을 10,000xg에서 5분 동안 실온(약 20℃)으로 원심분리하여 침전된 DNA, 단백질 및 세포 성분들을 제거하였다.
수득되는 상층액을 투명한 튜브로 이전시키고 1ml의 에탄올과 혼합하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA를 10,000xg에서 5분 동안 침강시키고, 75%w/w 에탄올로 세척하고, 수중에 용해하였다.
RNA의 수율은 187㎍이었다. A260/280 비는 1.74이며, 이는, 단백질 오염이 없음을 나타내었다. 분리된 RNA는 GAPDH 프라이머를 사용한 RT-PCR에 성공적으로 이용되었으며 어떠한 DNA 오염도 검출되지 않았다. 분리된 RNA의 노던 블롯 분석은 리보소옴 RNA의 분해되지 않은 밴드 및 GAPDH mRNA의 분해되지 않은 밴드를 나타내었다.
실시예 7
2회 농축시킨 시약을 사용한 산성 페놀 침전에 의한 RNA의 분리
랫트 간(47mg)을 실시예 6에서 기술한 1ml의 시약속에 실시예 6에서 나타낸 농도의 2배로 균질화하였다. 농축된 시약은 추가로 1%w/w의 페닐에탄올을 함유하였다. 균질물을 1ml의 물과 혼합하여 침전하는 시약을 형성시켰다.
침전된 DNA, 단백질 및 기타 세포 성분들을 10,000xg에서 5분 동안 실온(약 20℃)에서 원심분리시켜 침강시켰다. 수득되는 상층액을 투명한 튜브로 이전시키고 1ml의 에탄올과 혼합하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA를 10,000xg에서 5분 동안 침강시키고, 75%w/w 에탄올로 세척하고, 수중에 용해하였다.
RNA의 수율은 178㎍이었다. A260/280 비는 1.77이며, 이는 단백질 오염이 없음을 나타내었다. 분리된 RNA는 GAPDH 프라이머를 사용한 RT-PCR에 성공적으로 이용되었으며 어떠한 DNA 오염도 검출되지 않았다. 분리된 RNA의 노던 블롯 분석은 리보소옴 RNA의 분해되지 않은 밴드 및 GAPDH mRNA의 분해되지 않은 밴드를 나타내었다.
실시예 8
본 발명의 2-단계 과정에 의한 RNA의 분리
랫트 뇌(61mg)를 실시예 7에 기술된 2배 농축된 시약 1ml 속에서 균질화하였다. 균질화물을 1ml의 물과 혼합하고 수득되는 혼합물을 10,000xg에서 5분 동안 실온(약 20℃)으로 원심분리하여 침전된 DNA, 단백질 및 세포 성분들을 제거하였 다. 상층액을 투명한 튜브로 이전시키고 0.05ml의 브로모클로로프로판과 혼합하였다. 혼합물을 원심분리하고 상부 수성 상, 중간 상 및 유기 상으로 분리하였다.
RNA를 함유하는 수성 상을 새로운 튜브에 이동시키고 이소프로판올 중 5M 락트산을 사용하여 pH 2.9로 산성화하였다. RNA 침전물을 10,000xg에서 5분 동안 침강시키고, 75%w/w 에탄올로 세척하고, 물에 용해하였다.
RNA의 수율은 33㎍이었다. A260/280 비는 1.77이며, 이는 단백질 오염이 없음을 나타내었다. 분리된 RNA는 GAPDH 프라이머를 사용한 RT-PCR에 성공적으로 이용되었으며 어떠한 DNA 오염도 검출되지 않았다. 분리된 RNA의 노던 블롯 분석은 리보소옴 RNA의 분해되지 않은 밴드 및 GAPDH mRNA의 분해되지 않은 밴드를 나타내었다.
본 발명의 다른 변화 또는 양태가 또한 상기 기술 및 실시예로부터 당해 분야의 통상의 기술을 지닌 자에게 명백할 것이다. 즉, 상기 양태는 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 고려되어서는 안된다.

Claims (38)

  1. 약 3%w/w 내지 약 98%w/w 범위의 최종 농도의 페놀, 및 최종 조성물의 pH를 pH 3.6 내지 pH 4.0 미만의 범위로 유지시키기에 충분한 완충액을 포함하는, 정제된 RNA를 분리하기 위한 페놀-함유 조성물.
  2. 3%w/w 내지 30%w/w 미만 범위의 최종 농도의 페놀, 및 최종 조성물의 pH를 pH 3.9 내지 pH 5.5의 범위로 유지시키기에 충분한 완충액을 포함하는, 정제된 RNA를 분리하기 위한 페놀-함유 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 완충액이 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트, 프탈레이트, 타르트레이트, 락테이트 또는 이들의 혼합물 중의 하나 이상으로부터 선택된 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 리보뉴클레아제 억제제를 추가로 포함하는 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 페닐에탄올, 프로필렌 페녹시톨, 티몰, 부틸페놀 또는 이들의 혼합물 중의 하나 이상으로부터 선택된 페놀 유도체를 5%w/w 이하의 최종 농도로 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리알코올, 모노알코올 및 구아니딘 염 중의 하나 이상으로부터 선택된 페놀 가용화제를 추가로 포함하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 조성물의 밀도를 증가시키기에 충분한 1%w/w 내지 5%w/w 범위 농도의 하나 이상의 유기 화합물을 추가로 포함하는 조성물.
  8. 하나 이상의 리보뉴클레아제 억제제, 및 조성물의 pH를 pH 3.6 내지 pH 4.0 미만의 범위로 유지시키기에 충분한, 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트, 프탈레이트, 타르트레이트, 락테이트 또는 이들의 혼합물 중의 하나 이상으로부터 선택된 완충액을 포함하는, 정제된 RNA를 분리하기 위한 페놀을 함유하지 않는(phenol-free) 수성 조성물.
  9. 제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세제를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 무기 또는 유기 염 및 킬레이트제를 추가로 포함하는 조성물.
  11. 10%w/w 내지 40%w/w 범위의 최종 농도의 하나 이상의 소수성 유기 용매, 및 상 분리 동안에 pH를 pH 3.6 내지 pH 4.0 미만의 범위로 유지시키기에 충분한 하나 이상의 산, 및 임의의 산 가용화제를 포함하는, 상 분리에 의해 정제된 RNA를 분리하는데 사용하기 위한, 페놀을 함유하지 않는 상 분리 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 유기 용매가 하나 이상의 클로로포름, 사염화탄소, 브로모클로로프로판, 브로모나프탈렌 또는 브로모아니솔인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 산이 하나 이상의 포름산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 아미노카프로산, 락트산 또는 클로로페닐아세트산인 조성물.
  14. a) 생물학적 시료를, 10%w/w 내지 60%w/w 범위의 최종 농도의 페놀 및 하나 이상의 리보뉴클레아제 억제제를 포함하는 시약으로 처리하는 단계,
    b) 당해 시료를 하나 이상의 소수성 용매와 혼합하면서 pH를 pH 3.6 내지 pH 4.0 미만의 범위로 유지시키는 단계,
    c) 정제된 RNA를 침전시키기 위해 거의 동일한 용적의 수용성 유기 용매가 가해진 수성 상으로부터 정제된 RNA를 회수하는 단계, 및
    d) 침전된 RNA를 세척하고 가용화시키는 단계를 포함하여, 생물학적 시료로부터 정제된 RNA를 분리하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, a) 단계에서의 시약이 아세테이트, 시트레이트, 포스페이 트, 프탈레이트, 타르트레이트, 락테이트 또는 이들의 혼합물 중의 하나 이상으로부터 선택된 완충액을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, a) 단계에서의 시약이 하나 이상의 리보뉴클레아제 억제제를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, a) 단계에서의 시약이 세제를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, a) 단계에서의 시약이 무기 또는 유기 염 및 킬레이트제를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제14항에 있어서, a) 단계에서의 시약이 페닐에탄올, 프로필렌 페녹시톨, 티몰, 부틸페놀 또는 이들의 혼합물 중의 하나 이상으로부터 선택된 페놀 유도체를 5%w/w 이하의 최종 농도로 추가로 포함하는 방법.
  20. 제14항에 있어서, a) 단계에서의 시약이 폴리알코올, 모노알코올 및 구아니딘 염 중의 하나 이상으로부터 선택된 페놀 가용화제를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제14항에 있어서, a) 단계에서의 시약이 조성물의 밀도를 증가시키기에 충분한 1%w/w 내지 5%w/w 범위의 농도의 하나 이상의 유기 화합물을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제14항에 있어서, 시료를 a) 단계 전에 제8항 또는 제11항에 따른 페놀을 함유하지 않는 조성물로 우선 처리하는 방법.
  23. 제14항 또는 제20항에 있어서, a) 단계에서의 시약을 완충시켜 pH를 pH 3.6 내지 pH 4.0 미안의 범위로 유지시키는 방법.
  24. 제14항 또는 제22항에 있어서, a) 단계를 pH 3.9 내지 pH 9.0 범위의 pH에서 수행한 후, 시료를 pH 3.6 내지 pH 4.0 미만의 범위의 pH로 조절하는 방법.
  25. a) 시료를, 3%w/w 내지 30%w/w 미만의 범위의 최종 농도의 페놀, 및 조성물의 pH를 pH 3.6 내지 pH 5.5의 범위로 유지시키기에 충분한 완충액을 포함하는 시약으로 처리하는 단계,
    b) 시료를 침강시키거나 여과하여 DNA, 단백질 및 세포 성분을 실질적으로 함유하지 않는 정제된 시료를 수득하는 단계,
    c) 정제된 시료를 동일한 용적의 수용성 유기 용매에 가하여 정제된 RNA를 침전시키는 단계,
    d) 침전된 RNA를 침강시키거나 여과하는 단계, 및
    e) 침전된 RNA를 세척하고 가용화시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로 부터 정제된 RNA를 분리하는 방법.
  26. a) 생물학적 시료를, 3%w/w 내지 30%w/w 미만의 범위의 최종 농도의 페놀, 하나 이상의 카오트로프(chaotrope), 및 조성물의 pH를 pH 3.6 내지 pH 5.5의 범위로 유지시키기에 충분한 완충액을 포함하는 시약으로 처리하는 단계,
    b) 당해 시료를 침강시키거나 여과하여 DNA, 단백질 및 세포 성분을 실질적으로 함유하지 않는 정제된 시료를 수득하는 단계,
    c) 정제된 시료에 하나 이상의 소수성 유기 용매, 및 정제된 시료의 pH를 pH 3.6 내지 pH 4.0 미만의 범위로 유지시키기에 충분한 농도의 완충액을 가하는 단계,
    d) 정제된 RNA를 침전시키기 위해 동일한 용적의 수용성 유기 용매가 가해진 수성 상으로부터 정제된 RNA를 회수하는 단계,
    e) 침전된 RNA를 침강시키거나 여과하는 단계, 및
    d) 침전된 RNA를 세척하고 가용화시키는 단계를 포함하여, 생물학적 시료로부터 정제된 RNA를 분리하는 2-단계 방법.
  27. 제26항에 있어서, 소수성 유기 용매가 유기 상을 상 분리 동안에 분리하기에 충분하도록 농밀한 방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 소수성 유기 용매가 카프로락톤, 에틸렌 글리 콜 디아세테이트, 폴리에틸렌 글리콜 디벤조에이트, 클로로포름, 사염화탄소, 브로모클로로프로판, 브로모나프탈렌, 브로모아니솔 또는 이들의 혼합물 중의 하나 이상으로부터 선택되는 방법.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서, 시료를 1.5X 내지 2.5X 농도의 a) 단계의 조성물로 처리하고, 수득되는 시료를 농축시키지 않은 용액에 근접하도록 희석시키는 방법.
  30. 제14항, 제22항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 침전시키기 위해 가한 용매가 하나 이상의 저급 알코올, 폴리알코올, 아세톤, 에틸렌글리콜 디아세테이트, 메틸 설폭사이드 또는 이들의 혼합물 중의 하나 이상인 방법.
  31. 용액의 pH를 최대 pH 3.3을 생성시키기에 충분한 양의 완충액을 사용하여 조절한 후 정제된 RNA를 침전시킴을 포함하여, RNA- 및 염-함유 용액으로부터 정제된 RNA를 분리하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, pH가 pH 3.0 내지 pH 2.7의 범위인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 완충액이 하나 이상의 유기산 또는 무기산인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 염이 나트륨, 칼륨, 리튬 및 구아니딘 염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 용액이 1%w/w 내지 60%w/w 농도의 페놀을 함유하는 방법.
  36. 생물학적 시료를, 1%w/w 내지 60%w/w 범위의 최종 농도의 페놀, 하나 이상의 카오트로프, 조성물의 pH를 2.0 내지 pH 9.0의 범위로 유지하기에 충분한 농도의 완충액, 10%w/w 내지 40%w/w의 농도의 하나 이상의 수용성 유기 용매를 포함하는 수성 조성물로 처리하여 시료로부터 보다 많은 분자량의 RNA를 선택적으로 침전시키는 단계, 및
    정제된 보다 많은 분자량의 RNA를 시료로부터 침전시키는 단계를 포함하여, 생물학적 시료로부터 보다 많은 분자량의 RNA를 선택적으로 침전시키는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 유기 용매의 농도를 50%w/w 이상으로 증가시키기에 충분한 추가의 유기 용매를 가하여 보다 적은 분자량의 RNA를 침전시키는 단계, 및
    정제된 보다 적은 분자량의 RNA를 시료로부터 침전시키는 단계를 이후 단계로서 추가로 포함하는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 제14항, 제22항, 제25항 및 제26항 중의 어느 한 항에 따른 생물학적 시료를 제조하여 RNA의 수용액을 수득하는 단계, 및
    RNA를 수용액으로부터 침전시키는 단계를 포함하는 방법.
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