TWI393776B - 蛋白提取緩衝液及使用該緩衝液從微生物中提取蛋白的方法 - Google Patents

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蛋白提取緩衝液及使用該緩衝液從微生物中提取蛋白的方法
本發明係關於生物化學、蛋白質工程及基因工程等領域之蛋白質提取技術。
從細胞中提取蛋白，尤其是對於那些用於生產重組蛋白的細菌宿主，通常需要使用機械手段，例如弗氏壓碎法和超音波(運用聲波製造震動)。但是，這些蛋白提取方式均需要昂貴的設備，因此在某些情况下，這些方式並非可行。在更簡單的方式，是採用非離子型洗滌劑家族的提取緩衝液，該提取緩衝液可被用於提取可溶性和不可溶性(包含體)蛋白質。儘管如此，這些緩衝液通常僅僅被用於細菌的蛋白提取，而不被用於像酵母菌和真菌等種類的微生物。
對於從酵母菌中提取蛋白來說，通常採用强還原劑條件下使用玻璃珠(直徑約0.5mm)進行機械破碎。因為酵母菌的細胞壁比細菌的細胞壁更加複雜且堅硬。另外，還需要其它的設備(如旋渦儀)，並且這種提取通常在低溫下進行(4℃)以保存提取出的蛋白。這些事實使得從具玻璃珠的酵母菌中進行蛋白提取之效率很低，因為這種方式條件過於惡劣，可能導致提出的蛋白失去活性，或者蛋白質的某些組分黏連在玻璃珠上。
不使用機械破碎方法而從酵母中提取蛋白質的提取緩衝液以前也生產過。該緩衝液係由還原劑和三(羥丙基)磷化氫或THP所組成。它們可被使用於從各種類型的酵母菌和真菌中提取蛋白。但是，它們價格昂貴，效率低，且只能用於少數特定種類的微生物。
此處所描述的發明包括不需要對細胞進行機械破壞，即可被用於從各種微生物(包括細菌、酵母菌和真菌)中提取蛋白的提取(溶解)緩衝液發明。另外，該提取過程簡單、快捷。提取出的蛋白沒有變性且保持功能性。最重要的是，所有這些蛋白與利用現有緩衝液提取的蛋白或者用機械方法提取的蛋白相比，具有相同甚至於更高的活性。
該發明包括蛋白提取緩衝液，該緩衝液發明被用於更加高效的蛋白提取。另外，該蛋白提取緩衝液被用於從各種微生物中進行全部蛋白提取。最重要的是，使用該種方法提取的蛋白，仍然有活性，功能性，並且不變性。該蛋白提取緩衝液的主要成分包括pH值範圍在5至8，濃度10至100mM的磷酸鈉緩衝液，5%(v/v)的甘油，0.05-1%(v/v)的肌氨酸。該緩衝液的最佳配方主要包含：50mM pH值7.4磷酸鈉緩衝液，5%甘油(v/v)和0.1%肌氨酸(v/v)。
本發明的詳細內容如下：
1)不加入及加入各種濃度的肌氨酸來研究蛋白提取。研究發現，在細胞量相同的情况下，不使用肌氨酸與使用濃度0.1%-0.4%肌氨酸(v/v)相比，蛋白提取量較少。當使用濃度0.1%-0.4%肌氨酸(v/v)(見第一圖)時，所得到的蛋白量是一樣的。因此，由於費用最低，濃度0.1%的肌氨酸(v/v)被用來進行進一步的分析。
2)使用50mM，pH=7.4的磷酸鈉緩衝液，濃度5%的甘油(v/v)，和濃度0.1%的肌氨酸(v/v)來製備提取緩衝液。
3)細菌細胞蛋白提取過程如下：
3.1用離心的方式(12,000xg)收集細菌細胞5分鐘。
3.2捨棄上清液。稱量細胞，獲取濕重。
3.3在細胞中加入3倍體積的蛋白提取緩衝液。(例如：100mg細胞，加入300μL蛋白提取緩衝液。)
3.4使用管尖使細胞在提取緩衝液中充分重新懸浮。為了降低溶液的黏度，可在將該混合物置於37℃溫育20分鐘前，加入1單位DNaseI。
3.5將混合物離心(12,000xg)10分鐘。收集上清液。該上清液中的蛋白將被保存於清潔的試管中以便進一步的研究。
4)酵母菌蛋白提取過程如下：
4.1將酵母菌離心(12,000xg)5分鐘。
4.2捨棄上清液。稱量細胞，獲取濕重。
4.3在細胞中加入3倍體積的蛋白提取緩衝液。(例如：100mg細胞，加入300μ蛋白提取緩衝液。)
4.4每100μL提取緩衝液中加入1μL1M DTT。
4.5劇烈的搖動或用渦旋1分鐘的方式使細胞重新懸浮。也可在室溫下，將該混合物搖動，或用旋轉機旋轉一個小時。
4.6將混合物離心(12,000xg)10分鐘。收集上清液。該上清液中的蛋白將被保存於清潔的試管中以便進一步的研究。
選擇性方法：為了更有效的提取蛋白，可將細胞-提取緩衝液混合物渦旋15分鐘。這種方法比旋轉15分鐘更有效，也比第二圖所示的旋轉或用商業緩衝液孵化60分鐘有效。
5)真菌細胞蛋白提取過程如下：
5.1在液態氮中粉碎真菌細胞。
5.2稱量細胞，獲取濕重。
5.3在細胞中加入1倍體積的蛋白提取緩衝液。(例如：100mg細胞，加入100μ蛋白提取緩衝液。)
5.4劇烈的搖動或用渦旋的方式使細胞重新懸浮。
5.5將混合物離心(12,000xg)10分鐘。收集上清液。該上清液中的蛋白將被保存於清潔的試管中以便進一步的研究。
6)該蛋白提取緩衝液可被用於細菌細胞，如：大腸桿菌，酵母菌細胞，如：釀酒酵母和嗜甲醇酵母，以及真菌細胞，如：青黴蟲(第三圖)。
7)該蛋白提取緩衝液可與DNasel一起使用，以降低細菌蛋白提取過程中溶液的濃度，酵母菌蛋白提取中的還原劑，如DDT，以及可能適用於任何細胞的蛋白酶抑制劑，從而降低提取過程中可能出現的蛋白變性。
8)該蛋白提取緩衝液可被用於從微生物，如嗜甲醇酵母中提取基因組DNA。提取出的DNA有很高的數量和質量，因此這種DNA可被用來做進一步的調查，如：利用PCR檢測細胞內存在的DNA片段。
9)從酵母菌中提取基因組DNA的過程如下：
9.1在細胞中加入3倍體積的蛋白提取緩衝液。(例如：100mg細胞，加入300μL蛋白提取緩衝液。)
9.2每100μL蛋白提取緩衝液中加入1μL的1M DTT。
9.3劇烈搖動或用渦旋1分鐘的方式使細胞重新懸浮。
9.4離心(12,000xg)10分鐘。收集上清液。
9.5使用苯酚和氯仿將蛋白從上清液中分離出。
9.6在室溫下，將DNA放於大約2.5體積的乙醇中進行沉澱20分鐘，同時含有0.75M醋酸銨(pH=7.5)的存在。
9.7離心，以收集DNA的顆粒。丟棄上清液。用70%的乙醇(v/v)沖洗DNA的顆粒。
9.8用蒸餾水在55℃下孵化10分鐘，使DNA顆粒重新懸浮。
利用該蛋白提取緩衝液，可以從酵母菌中提取基因組DNA。用RNase A溫育DNA溶液，即可將RNA從DNA溶液中分離出。得到的DNA加上合適的引子，可用於PCR分析，以放大或檢驗細胞內DNA片段的存在。
實施例1
從大腸桿菌中提取木聚糖酶的過程
從大腸桿菌中提取木聚糖酶可採用以下方式：在含有50g/mL的卡那黴素的LB培養基[0.5%(w/v)的酵母提取物，1%(w/v)的蛋白腖，1%(w/v)的氯化鈉]中培養大腸桿菌，其中包含有木聚糖酶基因(Ruanglek和Sriprang等等，2007)的重組質體。在37℃下培養細胞，直至其完全長成或OD600達到0.4-0.6。然後，把1mM IPTG加入培養好的培養基中，並將細胞晃動4個小時以使其繼續溫育。然後用離心(12,000xg)5分鐘的方式收集細胞。量取細胞的濕重，並加入3倍體積(相對於細胞濕重)的蛋白提取緩衝液。用管尖使細胞懸浮。接下來將混合物離心(12,000xg)10分鐘。上清液接下來可被用於酶活性的分析。
將90μL蒸餾水加入到10μL上清液中，可測量木聚糖酶活性。然後將160μL的基質(1%的木聚糖)加入混合物中。將該混合物放在50℃下溫育10分鐘。之後，加入170μL DNS溶液，並將混合物煮10分鐘。然後將混合物冷凍，測量540nm的吸光度。
第四圖中顯示，使用本發明中的蛋白提取緩衝液提取的木聚糖酶的活性比用進口的商業緩衝液提取的木聚糖酶的活性高3倍。這表明使用該緩衝液能提取更多的木聚糖酶，或者使用該蛋白提取緩衝液提取的木聚糖酶比用商業緩衝液提取的木聚糖酶活性高，或兩種優點都存在。
實施例2
從嗜甲醇酵母和釀酒酵母中提取β-葡萄糖苷酶的方法許多微生物，如各種真菌，可以水解生物質能，利用β-葡萄糖苷酶與內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶一起，使生物質能降解為葡萄糖。因此，β-葡萄糖苷酶主要在工業中使用，以把生物質能變為生物乙醇。在其他微生物中，比如嗜甲醇酵母和釀酒酵母中，內源性β-葡萄糖苷酶對於細胞壁的產生和循環很重要。
為研究從酵母菌中提取的β-葡萄糖苷酶的活性，酵母菌細胞將被溶解於該發明中的蛋白提取緩衝液中或進口的商業緩衝液中。3倍體積(相當於細胞濕重)蛋白提取緩衝液將被加入細胞中。然後，每100μL蛋白提取緩衝液中加入1M DTT。在進行10分鐘的離心(12,000xg)前，用劇烈搖晃或渦旋的方式使得細胞重新懸浮。得到的上清液將被用於酶活性分析。
將25μL蒸餾水加入12.5μL該上清液中，以測量β-葡萄糖苷酶的活性。然後，向混合物中加入50μl 100mMMOPs緩衝液(pH=6.0)和12.5μL 40mM硝基苯酚基-β-D-葡萄糖苷酸(pNPG)。該混合物將在50℃下孵化10分鐘。之後，加入100μL 200mM的Na2 CO3 以停止該反應。產物水平(對硝基苯酚)將通過測量405nm(OD405 )下的吸光度及使用如下公式來確定
A=εCL
當A=吸光度在405nm
ε=計算常數，約為16,900M-1 cm-1
C=該反應製造的對硝基苯酚的濃度
L=路徑長度=0.6cm
β-葡萄糖苷酶的1單位活性用每分鐘分解1μ莫耳對硝基苯酚所需酶的數量來定義。
第五圖中顯示，使用本發明的蛋白提取緩衝液從嗜甲醇酵母或釀酒酵母中提取的β-葡萄糖苷酶比用商業緩衝液提取的具有更高的活性。這表明使用發明的蛋白提取緩衝液可以提取更多的β-葡萄糖苷酶，或是所提取的β-葡萄糖苷酶功能性更强。
實施例3
使用發明的蛋白提取緩衝液從嗜甲醇酵母中提取基因組DNA及使用PCR方法放大或研究基因組DNA片段的存在本發明的蛋白提取緩衝液可被用於從嗜甲醇酵母中提取基因組DNA。該基因組DNA提取方式包括向細胞中加入3倍體積(相對於細胞濕重)蛋白提取緩衝液。然後，每100μL蛋白提取緩衝液，即向該混合物中加入1μL 1M DTT。劇烈搖晃或用渦旋的方式使細胞重新懸浮，並進行10分鐘的離心(12,000xg)。然後收集上清液。用酚/氯仿提取液將上清液中的蛋白分離出。然後，在室溫、0.75M醋酸銨(pH=7.5)存在的條件下用乙醇沉澱水合的基因組DNA片段20分鐘。將DNA的顆粒離心，並丟棄上清液。然後用70%的乙醇(v/v)清洗DNA的顆粒，並將DNA的顆粒懸浮於蒸餾水中，在55℃下溫育10分鐘。至此，使用該提取緩衝液已從酵母菌中提取出基因組DNA，正如第六圖中的泳道2和3所顯示。透過使用RNase A溫育溶液的方式將RNA從該基因組DNA的某片段中分離出來。該DNA接下來將被用於PCR分析，以放大或研究細胞內基因組DNA片段的存在。PCR中使用的引子如下：
引子
5’AOX(5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3’)和3’AOX(5’GCAAATGGCATTCTGACATCC 3’)
PCR反應的產物如第六圖中的泳道5和6所示，它們分別是泳道2和3中的來自基因組DNA模板的PCR產物。這些結果表明使用本發明的緩衝液從酵母菌中提取的基因組蛋白具有很高的質量，並可被用於進行分子遺傳學分析，如PCR。
 參考文獻
Ruanglek V,Sriprang R,Ratanaphan N,Tirawongsaroj P,Chantasigh D,Tanapongpipat S,Pootanakit K,Eurwilaichitr L(2007)Cloning L,espfession,characterization,and high cell-density pfoduction of recombinant endo-1,4-xylanase fromAspergillus niger inPichia pastoris ,Enzyme and Microbial Technology,41:19-25。
第一圖、在肌氨酸濃度不同的情况下，使用本發明的蛋白提取緩衝液從嗜甲醇酵母中提取出的蛋白。
泳道1是分子重量標準。
泳道2代表在缺少肌氨酸時，使用本發明的蛋白提取緩衝液提取出的蛋白。
泳道3代表在有0.1%肌氨酸的情况下，使用本發明的蛋白提取緩衝液提取出的蛋白。
泳道4代表在有0.2%肌氨酸的情况下，使用本發明的蛋白提取緩衝液提取出的蛋白。
泳道5代表在有0.4%肌氨酸的情况下，使用本發明的蛋白提取緩衝液提取出的蛋白。
第二圖、在劇烈的晃動或是旋轉次數不同的情况下，使用本發明的蛋白提取緩衝液從釀酒酵母中提取的葡萄糖苷酶的活性，與用商業提取液提取的β葡萄糖苷酶相比較。
第三圖、把使用本發明的蛋白提取緩衝液(泳道3)從細菌，酵母或真菌中提取蛋白的提取水平與用商業緩衝液(泳道2)的蛋白提取水平進行級別上的比較。泳道1是分子重量標準。
第四圖、使用本發明的蛋白提取緩衝液從細菌中提取的木聚糖酶的活性與用商業緩衝液提取的木聚糖酶的活性相比較。
第五圖、使用本發明的蛋白提取緩衝液從嗜甲醇酵母和釀酒酵母中提取的β-葡萄糖苷酶的活性，與用商業緩衝液提取的相比較。
第六圖、使用本發明的蛋白提取緩衝液得到的基因組DNA高質、高量，得到的DNA可被用於PCR檢測中放大或檢測DNA片段的存在。
泳道1是DNA標準(λ/HindIII marker)。
泳道2代表RNase A溫育的基因組DNA。
泳道3代表未被RN aseA溫育的基因組DNA。
泳道4是DNA標準(100bpladder)。
泳道5代表將泳道2(有RNase A的溫育)中得到的DNA作為模板所得到的PCR產品。
泳道6代表將泳道3(沒有RNase A的溫育)中得到的DNA作為模板所得到的PCR產品。
泳道7代表將蒸餾水作為模板得到的PCR產品。

Claims (13)

  1. 一種蛋白提取緩衝液，其係由以下物質組成：pH=5-8且濃度為10-100 mM的磷酸鈉緩衝液，5%v/v的甘油，和0.05-0.1%v/v的肌氨酸。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白提取緩衝液，該磷酸鈉緩衝液的濃度是50 mM且pH=7.4，甘油的濃度為5%v/v，肌氨酸的濃度是0.1% v/v。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之蛋白提取緩衝液，其係用於從微生物組織、細菌、酵母菌及真菌中提取蛋白。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之蛋白提取緩衝液，其係用於從酵母菌中提取基因組DNA。
  5. 一種使用蛋白提取緩衝液之方法，其係使用如申請專利範圍第1項至第4項所述之蛋白質提取緩衝液，包括相對於一份細菌細胞濕重而使用3份所述的蛋白提取緩衝液。
  6. 一種使用蛋白提取緩衝液之方法，其係使用如申請專利範圍第1項至第4項所述之蛋白質提取緩衝液，包括另外加入DNase I用於細菌蛋白提取。
  7. 一種使用蛋白提取緩衝液之方法，其係使用如申請專利範圍第1項至第4項所述之蛋白質提取緩衝液，包括相對於一份酵母細胞濕重而使用3份所述的蛋白提取緩衝液。
  8. 一種使用蛋白提取緩衝液之方法，其係使用如申請專利範圍第1項至第4項所述之蛋白質提取緩衝液，包括另外加入DTT用於酵母菌蛋白提取。
  9. 一種使用蛋白提取緩衝液之方法，其係使用如申請專利範圍 第3或4項所述之蛋白質提取緩衝液，其中該酵母菌是從釀酒酵母和嗜甲醇酵母中選取的。
  10. 一種使用蛋白提取緩衝液之方法，其係使用如申請專利範圍第1項至第4項所述之蛋白質提取緩衝液，進一步渦旋15分鐘，可以提高從酵母菌中進行蛋白提取的效率。
  11. 一種使用蛋白提取緩衝液之方法，其係使用如申請專利範圍第1項至第4項所述之蛋白質提取緩衝液，其中該蛋白提取緩衝液的部分與真菌細胞的濕重相同。
  12. 一種使用蛋白提取緩衝液之方法，其係使用如申請專利範圍第1項至第4項所述之蛋白質提取緩衝液，自酵母中提取基因組DNA時，包括可用苯酚和氯仿從DNA溶液(從酵母菌中提取的DNA)中提取蛋白；於含醋酸銨的情况下，用乙醇將DNA置於室溫下沉澱20分鐘；將DNA溶液離心，用70%的乙醇清洗DNA顆粒，然後把基因組DNA放在蒸餾水中在55℃下溫育10分鐘，使之重新懸浮。
  13. 如申請專利範圍第12項中所述之使用蛋白質提取緩衝液之方法，其中進一步包含使用RNase A溫育DNA溶液以除去RNA。
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