CN101979539B - 用于分离纯化的rna的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分离基本上不含DNA、称为纯RNA的完整RNA的组合物和方法。可以分离任何来源(例如，人类、其他动物、植物、病毒等)的RNA。在一个实施方式中，样品用pH值小于4的酚处理，并从水相中回收纯RNA。在另一实施方式中，从含有少量有机溶剂的酸化样品中沉淀RNA。公开了其他实施方式。通过调节pH，同样的本发明的组合物可以用于多种实施方式。通过本发明的方法得到的纯RNA可以用于不希望DNA污染的试验，例如，聚合酶链式反应。

Description

用于分离纯化的RNA的试剂和方法
本申请为2006年12月1日提交的申请号为200580017853.5标题为“用于分离纯化的RNA的试剂和方法”的申请的分案申请
技术领域
本发明是关于改善从生物学样品中分离纯化的RNA的组合物和方法。
背景技术
纯的完整RNA的分离为分子生物学、临床和生物技术应用中分析基因表达的关键步骤。为实现上述目标，已经开发了多种RNA分离的方法。最经常使用的用于RNA分离的方法基于酚提取、从离液序列高的盐溶液中沉淀以及二氧化硅吸附(Ausubel等人，2002)，参阅申请人的专利US4843155、US 5346994和US 5945515。在US 4843155中描述的方法通常被称为单步(single-step)方法，用pH为4的酚-胍溶液(phenol-guanidinesolution)提取RNA。该方法的有效和简便使单步方法成为最常用的分离RNA的方法。
在申请人的US 5346994中描述的单步方法的改良方法允许通过pH为4-6的酚-胍溶液的提取，从同一样品中同时分离RNA、DNA和蛋白质。均质处理生物学样品，并且所得匀浆用诸如氯仿或溴氯丙烷的疏水有机溶剂进行相分离。然后离心，所得混合物分为含有RNA的上层水相、相的界面和含有DNA和蛋白质的下层有机相。收集所述水相，用醇沉淀并洗涤RNA。
在US 4843155和US 5346994中描述的单步方法中，小心收集分层的水相对分离RNA的质量很关键。少量的相的界面和有机相容易和水相一起转移，导致DNA和蛋白质污染分离的RNA。并且水相的收集要求手工处理，成为实现单步方法自动化的障碍。
US 4843155和US 5346994中描述的试剂和方法提供了基本纯的、未降解的RNA。然而根据US 4843155和US 5346994分离的RNA含有残留量(residual amount)的基因组DNA，可以通过反转录聚合酶链式反应测定法(reverse transcription-polymerase chain reaction assay，RT-PCR)检测。因此根据US 4843155和US 5346994分离出的RNA还必须进一步纯化使其不含DNA(Guan等人，2003；Girotti和Zingg，2003)。所述污染基因组DNA可以用作DNA聚合酶的母板(matrix)，产生另外的扩增产物并且扰乱RNA-依赖的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。RT-PCR中的DNA污染只能通过使用一组含有基因组DNA中外显子-内含子序列的引物而部分减轻，因为所述基因组DNA存在不含内显子的假基因(pseudogene)，使所述方法不可靠(Mutimer，1998)。
单步方法的改良已经改善了分离RNA的质量。在一种改良方法中，通过加入氯化锂的沉淀步骤移除RT-PCR抑制剂(Puissant，1990；Mathy，1996)。在另一改良方法中，在盐存在下以醇沉淀RNA增加了分离RNA的纯度(Chomczynski，1995)。然而，所述这些改良不能有效去除DNA污染。
去除污染DNA的共同惯例是用脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)处理含有RNA的样品。在DNA酶处理后，所述含有RNA的样品随后用酚和氯仿萃取。在一种为了限制DNA污染的尝试中，于单步方法中包括了附加的DNA沉淀步骤。通过添加三分之一体积的95％重量/重量乙醇，从水相中沉淀出所述污染的DNA(Siebert，1993)。乙醇的终浓度为约24％重量/重量。该文作者指出，在所述低的乙醇浓度下，DNA沉淀而RNA仍然存留在溶液中。RNA通过添加更多的乙醇从溶液中沉淀出来。然而，通过分析分离的RNA在琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色的可见DNA带以及RT-PCR证明，所述方法得到的RNA仍然受DNA污染。
在另一种为了减少DNA污染并改善单步方法中RNA的质量的尝试中，Monstein(1995)在一种繁复的方法中，将酚提取的pH值提高到4.1-4.7，并用蛋白酶K处理样品，然后再进行另一循环的酚提取、沉淀和醇洗涤。这一方法不仅耗时，而且仍然必需用DNA酶处理以得到备用于RT-PCR中的不含DNA的RNA。
从DNA中分离RNA也可以通过不加胍盐(guanidine salt)的pH为4的酚提取实现(Kedzierski，1991)。然而，所述方法中不存在胍盐使得RNA对RNA酶(ribonuclease，RNase)敏感，因此降解了所述RNA。所述方法较近的改进使用了存在十二烷基硫酸钠的pH 4.2的酚提取缓冲液(Chattopadhyay等人，1993)。RNA分离方法中，使用单步方法然后硅柱(silica column)操作的结合也需要DNA酶处理(Bonham，1996)。所述双重纯化方法的应用减少了DNA污染，但是通过RT-PCR检测所得分离的RNA仍然存在基因组DNA。用于分离RNA的另一方法使用了含有10％重量/重量至60％重量/重量的酚的单相水性溶液(US专利申请20030204077)。不含离液剂(chaotrope)时，15％重量/重量至55％重量/重量的一元醇(monoalcohol)、二元醇或者多元醇用于使酚保持在水性溶液中。
因此，通过US 4843155和US 5346994中描述的方法分离的RNA中存在DNA残留量，必需通过引入DNA酶处理而扩展所述操作。这样做由于操作的时间较长且在DNA处理过程以及附加的纯化步骤中可能造成RNA不必要地降解，因此减少了所述方法的有用性。然而从RNA制品中去除残留DNA为基于微阵列基因表达测定的RT-PCR所必需。
前述分离RNA的方法，如US 4843155和US 5346994中所述，基于在pH为4或者更高条件下进行的酚提取。以前单步方法的改良没有尝试通过进行pH低于4的酚提取改善RNA质量。相反，首次用在US 4843155中的pH为4，在接下来的US 5346994中增加到pH范围4-6。类似地，Monstein(1995)所述的方法酚提取的pH值升高到4.7。另一改善所述单步方法的精心尝试提高了胍-酚提取的pH至5.2(Suzuki，2003)。
US 5973137中公开了RNA分离的单步方法一种选择，使用非离液序列高的(non-chaotropic)酸性盐。然而，所述单步酚提取法仍是用于RNA分离的最经常使用的方法。描述单步方法的出版物(Chomczynski，1987)为American Chemical Society and Institute for Scientific Information数据库中第四被引用最多的论文，以及近二十年中出版的被引用最多的论文(CAS 2003，American Chemical Society)。
因此需要提高分离RNA的纯度的新方法。
发明内容
本发明公开了能从生物学样品中分离基本不含DNA的RNA的试剂和方法，因此易于用于反转录聚合酶链式反应(reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT-PCR)。所述RNA称为基本纯的RNA，为临床、研究以及其他应用中的基因表达合适诊断所必需。
一种实施方式为使用酸性酚的相分离(phase separation)方法，RNA在水相中析出。该方式基于预料不到的发现——基本纯的RNA可以通过酚提取在pH低于4下完成分离。
另一种实施方式为DNA和蛋白质的酸性酚沉淀，RNA存留在可溶性部分中。该方式基于预料不到的发现——特定浓度的酸性酚选择性地沉淀DNA、蛋白质和其他细胞组分，使RNA保持可溶性形式。使用酸性酚用于选择性沉淀DNA和蛋白质，消除了对相分离的需要，还避免了有毒相分离有机溶剂的使用。该方法大大简化了RNA分离过程。
另一种实施方式为从含有酚、离液剂和少量有机溶剂的溶液中选择性沉淀RNA。所述实施方式可以用于选择性沉淀一直到大约200个核苷酸的RNA分子。较短的RNA分子(低分子量RNA)和/或DNA还可以被回收。DNA还可以通过升高有机溶剂的浓度至至少约50％重量/重量而从样品中回收。
另一实施方式为通过调节溶液的pH值至最大值3.3从含有至少一种盐的溶液中沉淀RNA。
通过本发明的组合物和方法分离的RNA因其高纯度可以直接用于RT-PCR，也就是说，与原有的RNA分离方法相比，本发明的方法的RNA受DNA和/或蛋白质污染少。所述原有的方法例如在US 4843155、US5346994和US 5945515中公开的方法。所述分离的RNA可以为单链(ssRNA)或双链(dsRNA)，并且可以分离自各种生物来源，包括动物、植物、酵母、细菌以及病毒。本发明的方法和本发明组合物分离的RNA可以用于分子生物学、生物技术和临床科学。此外，本发明的试剂可以单独使用，或者与分离基本纯的DNA(基本不含RNA和蛋白质的DNA)和基本纯的蛋白质(基本不含RNA和DNA的蛋白质)的其他方法结合。
通过下列详细描述和实施例明确本发明上述和其它的优点。
具体实施方式
公开了从生物学样品中制备纯RNA的方法和组合物。生物学样品为生物来源的任何样品，无论体内、体外或者离体。样品可以来源于人类、动物、植物、细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体等。纯化的RNA为通过反转录聚合酶链式反应测定的基本未降解并且不含DNA污染的RNA。
相分离
本发明的一种实施方式提供了通过在pH小于4完成含有RNA样品的酚提取而提高分离的RNA的纯度的方法和试剂。在一个实施方式中，pH的范围从约3.9到约3.6。pH小于4的酚提取比pH为4或者更高的酚提取更有效地分离RNA和DNA。
用于本发明相分离方法的所述RNA分离试剂包括酚的水性溶液以及保持pH范围在约3.6至4.0以下的缓冲剂。在一个实施方式中，pH范围在3.7至3.9之间。在RNA分离试剂中酚的有效浓度范围为从约10％重量/重量到约60％重量/重量。在一个实施方式中，所述酚的浓度范围为从约25％重量/重量到约45％重量/重量。
所述组合物还可以包括其他组分例如RNA酶抑制剂、盐、螯合剂、增溶剂、去污剂、离液剂以及酚的衍生物。
在一些实施方式中，例如培养细胞的样品中具有低RNA酶活性的RNA，可以用pH约3.6至pH小于4的酸性酚提取，并且这样可以保护RNA不受降解。然而酚可能不足以防止来自细胞RNA酶或者污染的实验室器皿的RNA降解。因此，组合物中还可以包括至少一种有效量的RNA酶抑制剂。所述RNA酶抑制剂可以存在于样品匀浆和/或酸性酚提取过程中。RNA酶抑制剂包括蛋白酶K、来自人胎盘的核糖核酸酶抑制剂、氧矾核糖核苷复合物，以及离液序列高的盐(chaotropic salt)。离液序列高的盐包括硫氰酸胍、盐酸胍，以及它们的混合物。在一个实施方式中，离液序列高的盐的有效浓度范围为从约0.5M到约6M。在另一实施方式中，离液序列高的盐的有效浓度范围为从约2M到约4M。
所述缓冲剂为醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐(phthalate)、酒石酸盐或乳酸盐中的至少一种盐。缓冲剂的浓度应当足以维持组合物的pH在约3.6至小于4.0。在一个实施方式中，所述pH的范围为约3.75至约3.85。所述缓冲剂可以在样品匀浆前或匀浆后，单独或者与相分离试剂一起加入。一些具有高缓冲能力的例子例如血液以及植物组织，可以要求额外量的酸以将pH值调整到需要的范围内。
本发明组合物还可以包括有机和无机盐例如钠、钾、锂和铵的氯化物、磷酸盐、醋酸盐和硫氰酸盐。本发明组合物可以包括螯合剂例如柠檬酸盐和乙二胺四乙酸盐(ethylenediamine tetraacetate salt)。本发明组合物可以包括去污剂例如聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylenesorbitan)、十二烷基硫酸钠和肌氨酸。所述盐、螯合剂和去污剂促进组织增溶作用和基本纯RNA沉淀。为了帮助溶解酚，所述水性组合物还可以包括增溶剂或增溶剂的混合物。增溶剂包括多元醇例如浓度从约1％重量/重量到约10％重量/重量的丙三醇，选择上限为了不增加分离的RNA中的DNA污染。增溶剂也可以包括胍盐。
本发明组合物可以包括约60％重量/重量范围内的酚，最多约5％重量/重量的比酚自身毒性低的酚衍生物。所述衍生物包括苯基乙醇、丙烯苯氧基醇(propylene phenoxytol)、百里酚或丁基酚(butylphenol)。在一个实施方式中，所述衍生物存在量范围为1％重量/重量至约5％重量/重量。所述组合物还可以包括不溶或部分水溶性的有机化合物，例如，环己醇、环己基溴化物和二氯苯甲酸。所述化合物增加了组合物的密度并取代酚，因此最小化所述组合物的毒性。
在相分离方法的一个实施方式中，通常通过匀浆或溶胞(lysis)准备本发明组合物中的样品。大量DNA和颗粒物质可以通过沉淀或过滤从匀浆或溶胞产物中除去。所述匀浆或溶胞产物通过与疏水有机溶剂或有机溶剂的混合物混合分成水相和有机相，所述有机溶剂例如氯仿、四氯化碳、溴萘、溴苯甲醚或溴氯丙烷。所述混合物可以通过离心沉淀，例如在约4℃到约10℃的温度范围内离心。上层水相含有RNA，并且相的界面和有机相含有DNA和蛋白质。
从水相中用例如低级醇的水溶性有机溶剂沉淀RNA。所沉淀的RNA通过沉降作用(sedimentation)或过滤洗涤并溶解在水、甲酰胺或缓冲液中。所述最终RNA制备物为基本纯的，即未降解并且通过RT-PCR测试基本不含DNA污染。
另外，本发明相分离方法为适合用于RNA、DNA和蛋白质的同时分离的方法。如Chomczynski，1993或TRI Reagent brochure，2003中所述，分离到相的界面和有机相的所述DNA和蛋白质可以回收。可选地，通过加入0.3体积的乙醇DNA可以从有机相和相的界面中沉淀出来，然后通过用更高量的乙醇沉淀蛋白质。例如，DNA可以用pH 7.0或者更高的水性溶液从相的界面和有机相中在提取。在提取的DNA用乙醇从水性溶液中沉淀。可以理解，本发明组合物和方法可以用于从同一样品中分离基本纯的RNA、基本纯的DNA(即，基本不含RNA的DNA)和蛋白质。全部三种组分的分离允许用于具有DNA序列变化的基因表达模式与生物学样品中的蛋白质含量的相关性，还具有很多其他应用。
在一个实施方式中，用作样品匀浆或溶胞的所述组合物可以不含一种或多种组分，在样品匀浆或溶胞后，再单独或与相分离有机溶剂(例如氯仿)一起加入到匀浆或溶胞产物中。在另一实施方式中，样品匀浆或溶胞可以在高于pH 4.0下进行，在此情况下然后加入酸或者缓冲剂到匀浆或溶胞的样品中，加入的量足以将匀浆或溶胞产物的pH控制在约3.6至低于4的范围内。所述酸或缓冲剂的量可以直接加入匀浆或溶胞产物，或者可以溶解于相分离溶剂中。当与相分离溶剂一起加入时，所述酸可以为甲酸、乙酸、三氯乙酸、氨基己酸、乳酸或氯苯乙酸。为了提高酸的溶解性，所述相分离试剂可以包括诸如乙二醇的增溶剂。
在一个实施方式中，样品的匀浆或溶胞在不含酚含有RNA酶抑制剂的溶液中进行。在匀浆或溶胞后，加入酚以达到终浓度范围为10％重量/重量至60％重量/重量，并在从约3.6到低于4的pH下进行提取。通过作为水性溶液一部分的缓冲剂、或者加入酚中的缓冲剂、或者单独加入的缓冲剂，维持所述提取过程中的pH范围。相分离后通过离心从水相中用醇沉淀RNA。洗涤沉淀的RNA并可以将其在水、缓冲液或甲酰胺中溶解。
酸性酚沉淀DNA保留RNA在上清中
本发明的一个实施方式用不产生相分离的酸性酚溶液分离基本纯的RNA。一定浓度的酸性酚选择性沉淀DNA(单链DNA(ss DNA)和双链DNA(ds DNA))、蛋白质以及其它细胞组分，而RNA仍然保持溶解形式。利用这一预料不到的现象，设计无需分离水相和有机相以及相的界面的用于分离RNA的试剂和方法。
所述酸性酚沉淀方法简化了RNA分离步骤。它也排除了在相分离方法中使用的毒性有机溶剂。所述组合物促使DNA和蛋白质在试管底部形成稳固的小球(pellet)，减少了向含有RNA的上清部分中意外转移DNA和蛋白质分子的危险。所述上清能安全地通过移液、虹吸、倾析或过滤收集，其中每一种方式都可以在RNA分离的自动化操作中自动化应用。此外所述全部的酸性酚沉淀方法可以在室温下进行，消除了对相分离方法中应用的冷冻离心机的需求。
用于酸性酚沉淀的组合物包括浓度范围为从约3％重量/重量到低于30％重量/重量的酚的水性溶液。在一种实施方式中，所述酚浓度范围为从约3％重量/重量到约25％重量/重量。在另一实施方式中，所属酚浓度在约8％重量/重量到约20％重量/重量范围内。所述酸沉淀实施方式中酚浓度低于US 4843155和US 5346994中所述的30％重量/重量的酚到60％重量/重量的酚浓度。
本发明组合物用缓冲剂或酸酸化，用量足以维持pH在约3.6至约5.5范围内。在一个实施方式中，所述pH范围从约3.9至约4.5。所述缓冲剂可以选自有机或无机缓冲剂，包括但不限于醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐和/或乳酸盐。
为了提高RNA分离的效率，酸性酚可以补充RNA酶、盐、螯合剂、酚增溶剂和/或去污剂。RNA酶抑制剂包括氧矾核糖核苷复合物和蛋白酶K，或者所述抑制剂的组合。RNA酶抑制剂还包括促溶剂和离液剂例如浓度范围约0.5M到约6M的胍盐。在另一实施方式中，所述离液剂的浓度为约1.5M至约2.5M。离液序列高的盐能维持水性溶液中的酚用作为酚的增溶剂。所述酸性酚组合物还可以包括有机和/或无机盐例如钠、钾、锂和铵的氯化物、磷酸盐、醋酸盐和硫氰酸盐。所述组合物还包括螯合剂例如柠檬酸盐和乙二胺四乙酸盐。所述组合物还含有去污剂包括例如聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylenesorbitan)、十二烷基硫酸钠和肌氨酸。所述组合物还含有最多约5％重量/重量的比酚毒性低的溶剂和试剂例如百里酚、苯基乙醇、环己醇、环己基溴化物和二氯苯甲酸。所述附加的组分促进组织增溶作用和纯RNA沉淀。
所述酸性酚沉淀试剂可以含有附加的增溶剂或增溶剂的混合物以帮助份保持在水溶液中。酚增溶剂包括乙二醇、多元醇以及低级醇。所述增溶剂可以以从约1％重量/重量到约10％重量/重量的量加入到所述酸性酚沉淀试剂中，选择上限为了不增加分离的RNA中的DNA污染。
在酸性酚沉淀方法的一个实施方式中，生物学样品在沉淀试剂中匀浆或者溶胞。离心或过滤所得匀浆或溶胞产物以去除沉淀的DNA、蛋白质以及其它细胞组分。RNA保持可溶形式，随后用诸如低级醇的水溶性有机溶剂从上清中沉淀出来。所述低级醇包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。然后洗涤并可以在水、缓冲剂或甲酰胺中溶解所述RNA小球。
在酸性酚沉淀方法的另一实施方式中，生物学样品在大约3倍(3X)至5倍(5X)浓缩的酸性酚沉淀试剂中匀浆。应用浓缩的试剂允许使用同一种试剂处理实体组织(solid tissue)以及大体积(high volume)的液体样品。大体积的液体样品可以通过加入向浓缩试剂少量水代偿。所述浓缩的试剂溶解生物学样品中的大多数组分，并且从细胞结构中有效释放RNA。例如试样可以在两倍(2X)浓缩的试剂中匀浆。匀浆之后，等体积水与所得匀浆混合。水的加入使酚、胍以及其它组分在期望的浓度内。如此创造了从含有RNA的样品中有效沉淀并去除DNA和蛋白质的条件。
离心或过滤所述匀浆或溶胞产物后，RNA保留在上清液或滤液中，而DNA、蛋白质以及其它细胞组分在试管底部形成了稳固的小球。如前面所述，RNA用水溶性有机溶剂从上清或滤液中沉淀出来。洗涤并可以在水、缓冲剂或甲酰胺中溶解所述RNA沉淀。
在本发明的一种实施方式中，在相分离方法或酸性酚沉淀方法中都可以使用单一试剂(single reagent)。所述双重作用的试剂包括用在相分离方法中的试剂组分以及用在酸性酚沉淀方法中的2X浓度试剂。如前所述，用于相分离法的pH为约3.6至低于4.0，用于酸性酚沉淀法的pH为pH为约3.6至低于5.5。因此在双重作用实施方式中，从一种方法到另一种方法的转换前，试剂pH的调节很必要。例如用于酸性酚沉淀方法的2X试剂pH为4.2，在使用相分离方法前必须进一步酸化到pH低于4。
本发明相分离方法可以用于含有高量脂肪的样本例如脂肪组织和特定肿瘤或瘤形成的组织。具有高水平污染物的样品，例如植物以及含有脂肪的组织可以使用双重作用步骤，其中包括酸性酚沉淀方法和相分离方法。在一个实施方式中，生物学样品在2X酸性酚沉淀试剂中匀浆。然后用水稀释所得匀浆达到酸性酚沉淀试剂的浓度范围(即约3％重量/重量的酚至约30％重量/重量的酚)。稀释之后，沉淀的DNA、蛋白质和其它细胞组分通过沉降作用或过滤除去。收集所得上清或滤液并与相分离溶剂混合。在一个实施方式中，每一体积上清加入0.05体积至0.1体积的相分离溶剂。所述相分离溶剂或溶剂的混合物为至少一种疏水溶剂，包括但不限于己内酯、乙二醇二乙酸酯、聚乙二醇二苯甲酸酯以及用于相分离方法的溶剂。离心所得混合物以得到上层水相、相的界面和有机相。收集含有RNA的所述水相并与一体积低级醇混合以沉淀RNA。洗涤并可以在水、缓冲液或甲酰胺中溶解所述沉淀的RNA。
所述基于本发明酸性酚溶液的提供纯化的RNA的方法，可用于使用RT-PCR的基于微点阵测试基因表达，应用于生物化学、分子生物学和临床应用。可以通过检测癌细胞以及其它类型病理样本中特异基因表达模式说明。
使用小体积有机溶剂的选择性RNA沉淀作用
如前所述，RNA可以从本发明相分离方法中的水相沉淀，并且可以从酸性酚组合物中沉淀。在每一种情况下，通过添加约一体积有机溶剂以达到约50％重量/重量的有机溶剂终浓度，沉淀RNA。然而在一些样品制备中，一体积有机溶剂共沉淀例如蛋白聚糖的多糖和蛋白质以及RNA。以前，为了避免污染物的共沉淀，一种改良所述单步RNA纯化方法的方法，通过在0.9M钠离子存在下使用25％重量/重量的乙醇沉淀RNA(Chomczynski，1995)。另一方法用13％重量/重量至23％重量/重量的有机溶剂处理不含酚的离液剂溶液，使所述溶液pH保持在6至7.5范围内沉淀RNA。
在本发明方法中，通过加入有机溶剂或溶剂的混合达到有机溶剂终浓度约10％重量/重量至约40％重量/重量，从酚-离液剂溶液中沉淀基本纯的RNA。所述有机溶剂为丙酮、四甲烯砜(tetramethylene sulfone)、低级醇、乙二醇、多元醇、丙酮、乙二醇二乙酸酯和/或二甲亚砜。当或者从相分离方法的水相中或者从酸性酚沉淀方法中不含DNA且不含蛋白质上清中沉淀RNA时，所述方法提供了基本纯的RNA。所述方法不要求向酚-离液剂溶液加入盐。
出乎预料的是，不采用较早建议的(Chomczynski，1995)用盐补入溶液，即可从约10％重量/重量至约40％重量/重量浓度的有机溶剂酚-离液剂溶液沉淀出基本纯的RNA。事实上，与醇一起加入盐降低了所述分离的RNA的纯度。10％重量/重量至40％重量/重量的乙醇从酚-离液剂溶液中单独沉淀RNA的结果也与报道相反，其中通过向酚-离液剂溶液加入0.3体积乙醇(终浓度24％重量/重量)使得DNA沉淀，而RNA保持可溶形式(Siebert，1993)。
在一个实施方式中，组合物中所述有机溶剂的终浓度为从约20％重量/重量至约25％重量/重量。在另一个实施方式中，所述组合物中有机溶剂的终浓度为从约10％重量/重量至约40％重量/重量。所述酚-离液剂溶液的pH范围为从约2.0至约9.0。在一个实施方式中，所述酚-离液剂溶液的pH范围为从约3.5至约5.0。
浓度10％重量/重量至40％重量/重量的有机溶剂沉淀被认为是较高分子量RNA的大于约200个碱基的RNA分子。低于200个碱基的RNA片段和多糖以及蛋白聚糖一起保留在溶液中。较高分子量RNA沉淀后，较小分子量RNA能通过沉淀从所述溶液中回收，通过使用额外量的有机溶剂达到约50％重量/重量或者更高例如约90％重量/重量的终浓度进行沉淀。
本发明的方法凭借用约10％重量/重量至约40％重量/重量的有机溶剂沉淀RNA，还能够用于减少RNA制品中DNA污染的量。所述RNA的选择性沉淀仅在所述溶液中存在小量污染的DNA时有效，例如每1微克RNA中少于10纳克DNA。用约10％重量/重量至约40％重量/重量的有机溶剂沉淀RNA也提高了分离的RNA的质量，这样得到高产率的基本纯的并未降解的RNA，与申请人在先专利US 4843155和US 5346994中描述的方法一致。
从含盐溶液中进行酸性RNA沉淀
从含有盐的水性溶液中，在pH低于约3.3，通过pH依赖沉淀RNA得到基本纯的RNA连同DNA。从盐溶液中在酸性pH下沉淀RNA与US5973137的报道相反。US 5973137公开在pH低于6的溶液中，非离液序列高的盐沉淀DNA，而RNA停留为可溶形式。
在本发明方法中，向RNA溶液加入足以导致pH为3.3或者更低的量的缓冲酸。在一个实施方式中，所得pH在从约3.0到约2.7范围内。所述酸可以为有机酸或无机酸。所述酸可以为盐酸、磷酸、乙酸和/或乳酸。在一个实施方式中，组合物中的盐为胍盐。
所述实施方式可以并入本发明相的分离方法和/或本发明的酸性酚沉淀方法。为了用在酸性酚沉淀方法中，酸或缓冲剂可以溶解在水中或溶解在有机溶剂中。所述酸选择性沉淀RNA，以可溶形式保留多糖和蛋白质。用于沉淀RNA的酸的量小，允许RNA分离过程中的低样品量。在一个实施方式中，所述酸的量的范围为RNA溶液的量的约0.1％重量/重量至25％重量/重量。
如本发明所述，用少量有机溶剂和酸性pH沉淀RNA，使用申请人的US 4843155和US 5346994中公开的方法还可以用于提高RNA的质量。
处理含有RNA的样品，该样品得自用少量有机溶剂沉淀的RNA或从含盐的溶液中酸性沉淀的RNA，沉淀出较高分子量的RNA。较高分子量的RNA包括核糖体核糖核酸(ribosomal RNA，rRNA，例如18S和28S的RNA)以及信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)。所述保留的低分子量RNA少于约200个核苷酸，包括转移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)、5S的RNA以及调控基因表达的小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)。较低分子量RNA通过用附加量的有机溶剂处理，从上述描述的溶液中回收。在一个实施方式中，所述样品用一体积例如甲醇、乙醇、丙醇等的低级醇处理沉淀低分子量RNA。
本发明典型的溶液和方法在下列工作实施例中描述。
实施例1：从大鼠肝相分离分离RNA
在一个实施方式中，下列组合物用于相分离RNA：4M硫氰酸胍、0.2M硫氰酸铵、5％重量/重量丙三醇、40％重量/重量苯酚、0.1％重量/重量肌氨酸、10mM柠檬酸钠以及0.1M乙酸钠的缓冲液，pH为3.8。
大鼠肝(38毫克)在1.5毫升上述组合物中匀浆。然后，向匀浆中加入0.15毫升溴氯丙烷。振荡所得混合物，并在4℃下以12000重力加速度(g)沉降15分钟。沉降后，形成水相、相的界面和下层的有机相。RNA分布到水相中，而DNA和蛋白质分布到相的界面和有机相中。
通过加入0.75毫升异丙醇从水相中沉淀出RNA。所述RNA沉淀在10000重力加速度下离心5分钟。所得小球用0.75毫升的75％重量/重量的乙醇洗涤并在10000重力加速度下离心5分钟。最终RNA小球溶解在水中，并且通过本领域技术人员公知的方法——用分光光度计测量在260/280纳米下吸光度(A260/280)检测所述RNA的浓度。
所述RNA的产量为0.22毫克。所述在260/280纳米下吸光度(A260/280)的比值为1.76，说明没有蛋白质的污染。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、肌动蛋白和c-fos基因的引物，成功地将所述分离的RNA应用于RT-PCR。用Invitrogen(Carlsbad CA)的SuperScript转录酶进行反转录，用Sigma(St.Louis MO)的Taq DNA聚合酶进行PCR。在1％琼脂糖-溴化乙锭凝胶上分析RT-PCR产物。在没有反转录作用时，分离的RNA中没有检测到DNA。用1％甲醛-琼脂糖凝胶并转移到尼龙膜上对分离的RNA进行Northern印迹分析。溴化乙锭和亚甲蓝染色显示了未降解的核糖体带(ribosomal band)。与生物素标记的探针杂交，显示了未降解的3-磷酸甘油醛脱氢酶、肌动蛋白和c-fos的mRNA带。
实施例2：从人血液中相分离的RNA分离
人血液(0.5毫升)与75微升的冰乙酸(glacial acetic acid)和5毫升的如实施例1所述的组合物混合。然后，向所得混合物中加入0.5毫升溴氯丙烷。振荡所得混合物，并在4℃下以12000重力加速度(g)沉降15分钟。沉降后，所述混合物形成水相、相的界面和下层的有机相。RNA分布到水相中，而DNA和蛋白质分布到相的界面和有机相中。
通过加入1.25毫升异丙醇从水相中沉淀出RNA。所述RNA沉淀在12000重力加速度下离心5分钟。所得小球用5毫升的75％重量/重量的乙醇洗涤并在10000重力加速度下离心5分钟。最终RNA小球溶解在水中，并且通过本领域技术人员公知的方法——用分光光度计测量A260/280检测所述RNA的浓度。
所述RNA的产量为18.9微克。所述A260/280的比值为1.70，说明没有蛋白质的污染。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶的引物，成功地将所述分离的RNA应用于RT-PCR。在没有反转录作用时，分离的RNA通过PCR没有检测到DNA污染。对分离的RNA进行Northern印迹分析显示了未降解的核糖体RNA带以及未降解的3-磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA带。
实施例3：通过相分离和酸化的溴氯丙烷分离RNA
大鼠脾(21毫克)在1毫升含有3.5M硫氰酸胍、50mM乙酸钾、43％重量/重量苯酚、0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)pH为4.1的水溶液中匀浆。所述匀浆以12000重力加速度(g)离心10分钟以去除大量DNA和微粒。所得澄清的匀浆与0.1毫升含有14％重量/重量乙酸的溴氯丙烷混合。所得混合物的pH为3.7。振荡所得混合物，并在4℃下以12000重力加速度(g)沉降15分钟。沉降后，所述混合物形成水相、相的界面和下层的有机相。RNA分布到水相中，而DNA和蛋白质分布到相的界面和有机相中。
通过加入0.5毫升乙醇从水相中选择性沉淀出RNA。所得沉淀的RNA在10000重力加速度下沉降5分钟，然后用75％重量/重量的乙醇洗涤并在10000重力加速度下沉降5分钟。最终RNA小球溶解在水中，并且通过本领域技术人员公知的方法——用分光光度计测量在260/280纳米下吸光度(A260/280)检测所述RNA的浓度。
所述RNA的产量为77微升。所述A260/280的比值为1.74，说明没有蛋白质的污染。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶的引物，成功地将所述分离的RNA应用于RT-PCR，并且没有检测到DNA污染。对分离的RNA进行Northern印迹分析显示了未降解的核糖体RNA带以及未降解的3-磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA带。
实施例4：通过相分离和在不含酚的离液剂溶液中匀浆分离RNA
大鼠骨骼肌(29毫克)在0.5毫升的3M硫酸氰胍和5mM乙酸盐的水性溶液中匀浆。所得匀浆与0.5毫升苯酚和0.1M乙酸钠缓冲液混合，pH为3.7。所得混合物与0.1毫升的溴氯丙烷振荡，并在4℃下以12000重力加速度(g)沉降15分钟。沉降后，所述混合物形成水相、相的界面和下层的有机相。RNA分布到水相中，而DNA和蛋白质分布到相的界面和有机相中。
通过加入0.5毫升含有50％重量/重量乙醇的水性溶液从水相中选择性沉淀出RNA。按实施例1中的描述洗涤、处理并检测所述RNA沉淀。
所述RNA的产量为16微克。所述A260/280的比值为1.70，说明没有蛋白质的污染。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶的引物，成功地将所述分离的RNA应用于RT-PCR，并且没有检测到DNA污染。对分离的RNA进行Northern印迹分析显示了未降解的核糖体RNA带以及未降解的3-磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA带。
实施例5：通过相分离和在1％重量/重量的十二烷基硫酸钠中匀浆分离RNA
在25平方厘米的塑料瓶中长满的人类成纤维细胞(Clonetics，SanDiego CA)的原代培养，用1.5毫升含有1％重量/重量的十二烷基硫酸钠以及10mM柠檬酸钠、pH为7.0的溶液覆盖，补充50微克/毫升的蛋白酶K。所得细胞溶液在室温(约20℃)下孵育一小时，转移到离心管中，与1.5毫升的含有12％重量/重量水的酸性酚以及100mM乙酸钠混合，pH为3.7。在4℃下离心15分钟后，所述混合物形成水相、相的界面以及有机相。相分离后，RNA分布到水相中，而DNA和蛋白质分别分布到相的界面和有机相中。
通过加入0.75毫升乙醇从水相中沉淀出RNA，并在10000重力加速度下沉降5分钟。所得RNA小球用75％的乙醇洗涤，在10000重力加速度下离心5分钟，并溶解在水中。
所述RNA的产量为18微克。所述A260/280的比值为1.71，说明没有蛋白质的污染。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶的引物，成功地将所述分离的RNA应用于RT-PCR，并且没有检测到DNA污染。对分离的RNA进行Northern印迹分析显示了未降解的核糖体RNA带以及未降解的3-磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA带。
实施例6：通过酸性酚沉淀分离RNA
在一个实施方式中，下列组合物用于酸性酚沉淀RNA：20％重量/重量苯酚、2M硫氰酸胍、15mM柠檬酸钠、0.1M氯化锂、0.05％重量/重量肌氨酸、1.5％重量/重量丙三醇以及醋酸钠缓冲液，pH为4.2。大鼠肝(52毫克)在1毫升上述组合物中匀浆。所述匀浆于室温(约20℃)下在10000重力加速度下离心5分钟以去除沉淀的DNA、蛋白质和细胞组分。
所得上清液转移至以干净试管中，与1毫升乙醇混合以沉淀RNA。沉淀的RNA在10000重力加速度下离心5分钟，用75％重量/重量的乙醇洗涤并溶解在水中。
所述RNA的产量为187微克。所述A260/280的比值为1.74，说明没有蛋白质的污染。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶的引物，成功地将所述分离的RNA应用于RT-PCR，并且没有检测到DNA污染。对分离的RNA进行Northern印迹分析显示了未降解的核糖体RNA带以及未降解的3-磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA带。
实施例7：使用两倍浓度的试剂通过酸性酚沉淀分离RNA
大鼠肝(47毫克)在1毫升浓度为实施例6所指出浓度2倍的实施例6所述试剂中匀浆。所述浓缩的试剂包括添加的1％重量/重量苯基乙醇。所得匀浆与1毫升水混合形成沉淀试剂。
所述沉淀的DNA、蛋白质和其它细胞组分通过在于室温(约20℃)下在10000重力加速度下离心5分钟沉降。所得上清转移至洁净试管，与1毫升乙醇混合沉淀RNA。沉淀的RNA在10000重力加速度下沉降5分钟，用75％重量/重量的乙醇洗涤，并溶解在水中。
所述RNA的产量为178微克。所述A260/280的比值为1.77，说明没有蛋白质的污染。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶的引物，成功地将所述分离的RNA应用于RT-PCR，并且没有检测到DNA污染。对分离的RNA进行Northern印迹分析显示了未降解的核糖体RNA带以及未降解的3-磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA带。
实施例8：通过本发明的两步程序分离RNA
大鼠脑(61毫克)在1毫升实施例7中所述的2倍浓缩试剂中匀浆。所得匀浆与1毫升水和混合，并将所得混合物于室温(约20℃)下在10000重力加速度下离心5分钟去除沉淀的DNA、蛋白质和细胞组分。所得上清转移到清洁试管，并与0.05毫升溴氯丙烷混合。离心所述混合物，分成上层水相、相的界面和有机相。
所述含有RNA的水相转移到新的试管，用异丙醇中的5M乳酸酸化到pH为2.9。所述RNA沉淀在10000重力加速度下沉降5分钟，用75％重量/重量的乙醇洗涤，并溶解在水中。
所述RNA的产量为33微克。所述A260/280的比值为1.77，说明没有蛋白质的污染。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶的引物，成功地将所述分离的RNA应用于RT-PCR，并且没有检测到DNA污染。对分离的RNA进行Northern印迹分析显示了未降解的核糖体RNA带以及未降解的3-磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA带。
根据上述说明书和实施例，本发明的其它变化或实施方式对本领域普通技术人员而言也是很明显的。因此，上述实施方式不能被理解为是对本发明范围的限制。

Claims (21)

1.一种从生物学样品中分离纯化的RNA的方法，该方法包括：
a)用包括终浓度范围从10％重量/重量至60％重量/重量的酚以及至少一种核糖核酸酶抑制剂的试剂处理所述生物学样品，
b)将步骤a)的混合物与至少一种疏水溶剂和缓冲液混合，所述缓冲液的浓度足以维持pH范围为3.6≤pH≤3.9，
c)通过沉降从步骤b)所获得的混合物中分离水相，并通过用等体积水溶性有机溶剂来沉淀而从水相回收纯化的RNA，其是通过反转录聚合酶链反应测定而不显示DNA存在的RNA，以及
d)洗涤并溶解所述沉淀的RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液选自醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐、乳酸盐或其混合物中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)中所述试剂还包括去污剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)中所述试剂还包括螯合剂和盐，所述盐是无机盐或有机盐。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)中所述试剂还包括酚的衍生物，所述酚的衍生物选自苯基乙醇、丙烯苯氧基醇、百里酚、丁基酚或其混合物中的至少一种，所述酚的衍生物终浓度上限为5％重量/重量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)中所述试剂还包括酚的增溶剂，所述酚的增溶剂选自多元醇、一元醇和胍盐中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)中所述试剂还包括浓度范围从1％重量/重量至5％重量/重量的至少一种选自环己醇、环己基溴化物和二氯苯甲酸的有机化合物，其足以增加所述试剂的密度。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)前，所述生物学样品首先用不含酚的水性组合物进行处理以分离纯化的RNA，所述不含酚的组合物包括至少一种核糖核酸酶抑制剂以及足以维持所述组合物的pH范围在3.6≤pH≤3.9的缓冲液，其中所述缓冲液选自醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐、乳酸盐或其混合物中的至少一种。
9.根据权利要求1或6所述的方法，其中，(a)中所述试剂是缓冲的，以维持pH范围为3.6≤pH≤3.9。
10.根据权利要求1或8所述的方法，其中，所述步骤(a)在从3.9至9.0的pH范围进行，并且然后将所述生物学样品pH范围调节为3.6≤pH≤3.9。
11.根据权利要求1或8所述的方法，其中，所加入的用于沉淀RNA的溶剂为低级醇、多元醇、丙酮、乙二醇二乙酸酯、二甲亚砜或其混合物中的至少一种。
12.一种用于从生物学样品分离纯化的RNA的含酚组合物，该组合物包括当加入所述生物学样品时终浓度范围从10％重量/重量至60％重量/重量的酚以及足以酸化并维持所述生物学样品的pH范围在3.6≤pH≤3.9的缓冲液。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述缓冲液选自醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐、乳酸盐或其混合物中的至少一种。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述组合物还包括至少一种核糖核酸酶抑制剂。
15.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述组合物还包括酚的衍生物，所述酚的衍生物选自苯基乙醇、丙烯苯氧基醇、百里酚、丁基酚或其混合物中的至少一种，所述酚的衍生物终浓度上限为5％重量/重量。
16.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述组合物还包括酚的增溶剂，所述酚的增溶剂选自多元醇、一元醇和胍盐中的至少一种。
17.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述组合物还包括浓度范围从1％重量/重量至5％重量/重量的至少一种选自环己醇、环己基溴化物和二氯苯甲酸的有机化合物，其足以增加所述组合物的密度。
18.根据权利要求12所述的组合物，还包括去污剂。
19.根据权利要求12所述的组合物，还包括螯合剂和盐，所述盐是无机盐或有机盐。
20.一种从生物学样品中选择性沉淀较高分子量RNA的方法，该方法包括：
用权利要求12的水性组合物处理生物学样品以从所述生物学样品中选择性沉淀较高分子量RNA，所述组合物还包括至少一种离液剂和浓度从10％重量/重量至40％重量/重量的至少一种水溶性有机溶剂，并
从所述生物学样品中沉淀纯化的较高分子量RNA。
21.权利要求20所述的方法，还包括随后加入附加的有机溶剂以沉淀较低分子量RNA的步骤，所述附加的有机溶剂足以使有机溶剂的浓度增加至至少50％重量/重量，以及从所述生物学样品中沉淀纯化的较低分子量RNA的步骤。
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