CN103080311A

CN103080311A - 分离dna污染物降低的经纯化的rna的方法

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Publication number: CN103080311A
Application number: CN2011800427707A
Authority: CN
Inventors: G·克里斯托夫
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2010-09-06
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2031-09-06
Also published as: CN103080311B; WO2012032034A1; DK2614147T3; JP2013539367A; JP6096661B2; ES2559117T3; EP2426201A1; EP2614147A1; US9487550B2; EP2614147B1; US20130225801A1

Abstract

本发明涉及从含RNA和DNA的样品中分离RNA的方法，所述方法包括：a)向样品中添加包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物;b)添加不溶于水的有机溶剂并分离所得相，因此形成包含水相、任选的中间相和有机相的多相混合物，其中RNA聚集于所述水相且DNA和蛋白质聚集于所述有机相和/或中间相。c)从所述水相分离所述RNA。其中在分离所述各相前添加至少一种阳离子去污剂。已发现，添加至少一种阳离子去污剂显著降低所述含RNA的水相中的DNA含量。因此，本发明使得简便地分离含显著较少DNA污染物的纯RNA。

Description

分离DNA污染物降低的经纯化的RNA的方法

本发明涉及从含RNA和DNA的样品中分离经纯化的RNA的方法，其中经纯化的RNA中DNA污染物含量降低。另外，本发明涉及用于所述目的的组合物和方法。

分离纯化的、完整的RNA是分子生物学、临床和生物技术应用中基因表达分析的关键步骤。现有技术中发展了许多达到该目标的方法。分离RNA最常用的方法是基于苯酚提取、用离液盐沉淀以及二氧化硅吸附的方法。例如在US4,843,155和US2008/057560中描述了使用离液盐的基于苯酚－氯仿的方法。相应方法使得从同一样品中分离纯RNA，或分离RNA、DNA和任选的蛋白质。相应方法的原理是将样品于含苯酚和离液剂的变性组合物中匀化。该匀化物通过添加不溶于水的有机溶剂，例如氯仿，来分相。接着离心，所述混合物分成含RNA的水相以及含DNA和蛋白质的中间相和有机相。为分离RNA，收集所述水相并从中分离RNA，例如通过在所述水相中加入醇来沉淀RNA。

相应方法提供了基本上纯化的、未降解的RNA。然而，根据相应基于苯酚－氯仿的方法所分离的RNA中含DNA残量，该残量可通过例如逆转录聚合酶链反应试验（RT-PCR）检测。所述残留DNA污染物会干扰所纯化RNA的下游应用。这就产生了问题，因为污染DNA可作为DNA聚合酶的模版，因此可能产生附加的扩增产物并因此影响RNA－依赖性RT-PCR的实施。因此，使用相应方法分离的RNA必须进一步纯化来得到不含DNA的纯化RNA。

因此，可尝试通过降低纯化RNA中的DNA污染物含量来改进现有技术中分离的RNA的品质。一种移除污染DNA的常用实践是用DNA酶处理含RNA的样品。然而，实施相应的DNA酶处理有缺点，因为其增加了成本和处理步骤，而且DNA酶可能包含痕量RNA酶，因而产生RNA降解的风险。其他降低DNA污染物的尝试包括从水相中沉淀DNA的附加步骤。改进的方法中另外还使用了核酸结合固相以及需要合适的结合条件来将DNA结合到所述固相，以将DNA污染物从含RNA的水相中移除。然而，相应方法也有缺点，因为其必须使用额外的核酸结合固相以及额外的处理步骤因而增加了成本。另一种降低DNA污染物的方法是基于在苯酚提取期间将pH值降至4以下（例如请参考US2008/0057560）然而，所述方法中分离的RNA中的DNA污染物也没有得到令人满意的降低。

因此，本发明的一个目的是特别提供一种从含RNA、DNA和任选的蛋白质的样品中分离RNA的方法，所述方法产生纯RNA并降低经分离的RNA中DNA污染物的含量

另外，本发明的一个目的是降低含RNA的水相（尤其是通过苯酚/氯仿提取或相似的分相生产方法所获得的）中的DNA含量。

发明内容

本发明是基于以下发现：向样品中添加至少一种阳离子去污剂可显著减少经分离的RNA中DNA含量，所述样品经过以下处理：添加含离液剂和苯酚的酸性变性组合物。添加所述阳离子去污剂产生了令人意外的效果：通过添加不溶于水的有机溶剂，例如氯仿，获得含RNA的水相，所述水相中的DNA残留量显著减少。不受理论的限制，可认为添加阳离子去污剂具有以下效果：更多DNA从含RNA的水相中移除并由此导入相分离期间形成的中间相和/或有机相中。因此，通过添加阳离子去污剂，所述DNA有效地从含RNA的水相中移除并聚集在所得的中间相和/或有机相中。其显著减低了后续从所述水相中分离的RNA中DNA污染物的含量。因此，本发明提供了相对于现有技术的显著优点，并免去了从含RNA水相中去除DNA污染物的处理，例如DNA酶处理或使用特异性核酸结合相去除DNA污染物或额外的纯化步骤。

根据本发明的第一方面，提供一种从含RNA和DNA的样品中至少分离RNA的方法，所述方法包括以下步骤：

a)向样品中加入包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物;

b)加入不溶于水的有机溶剂并分离所得相，因此形成包含水相、任选的中间相和有机相的多相混合物，其中RNA聚集于所述水相且DNA聚集于所述有机相和/或中间相；以及

c)从所述水相分离所述RNA。

其中在最终分离所述各相前添加至少一种阳离子去污剂。

如上文所述，如果使用含离液剂和苯酚的酸性变性组合物制备样品，那么在最终分离各相前添加至少一种阳性去污剂可产生如下效果：含RNA的水相中的DNA污染物显著降低。

根据本发明的第二方面，提供一种用于本发明所述方法的试剂盒，包括：

a)含离液剂和苯酚的酸性变性组合物；

b)至少含一种阳离子去污剂的用于降低DNA污染物的溶液；

c)任选的核酸结合固相以及

d)任选的洗涤和洗脱缓冲液。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种降低含RNA水相中DNA含量的方法，形成所述含RNA水相的RNA分离方法涉及使用含离液剂和苯酚的酸性变性组合物，其中，将至少一种阳离子去污剂加入经所述酸性变性组合物匀化的样品中，之后通过添加不溶于水的有机溶剂将所得相分为水相、任选的中间相和有机相。

根据第四方面，本发明涉及用至少一种阳离子去污剂来降低含RNA水相中DNA含量，所述含RNA水相通过以下步骤得到：

-将样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中匀化；

-添加不溶于水的有机溶剂并且

-将混合物分成水相、任选的中间相和有机相。

其中在最终分离所述各相前添加阳离子去污剂。

根据第四方面，本发明涉及使用至少一种阳离子去污剂，通过降低含RNA水相中DNA含量，来提高任选的中间相和/或有机中DNA含量，其可通过以下步骤得到：

-将样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中匀化；

-添加不溶于水的有机溶剂并且

-将混合物分成水相、任选的中间相和有机相。

其中在最终分离所述相前添加阳离子去污剂。

如上文所述，当在含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中制备样品时，添加阳离子去污剂之后再分离所述相可显著降低含RNA水相中的DNA含量。所述方法使得例如分离到含较少DNA污染物的纯RNA。

通过以下说明书和附加的权利要求书，本领域技术人员能明白本发明的其它目的、特征和优点。然而，应当理解虽然下述详细说明，附加的权利要求和具体实施例描述了本发明的优选实施方式，其仅通过举例方式给予。通过阅读以下内容，本领域的技术人员很容易明白在本发明所公开的主旨和范围中所做的各种改变和修改。

发明详述

本发明涉及基于使用苯酚、离液剂和不溶于水的有机溶剂（例如氯仿）的RNA分离方法。在相应方法中，形成包含含有RNA的水相、任选的中间相和有机相的多相混合物。DNA和蛋白质（如果包含在样品中）包含在中间相和/或有机相中。本发明基于以下发现：如果在最终分相前添加至少一种阳离子去污剂，可显著降低含RNA水相中的DNA含量。添加至少一种阳离子去污剂具有以下效果：更多的DNA从含RNA水相中移除并因此聚集在中间相和/或有机相中。因为DNA更有效地从含RNA水相中移除，所以从相应的已去除DNA的水相中分离RNA，该RNA含更少量的DNA，因而含更少量的DNA污染物。因此，本发明针对纯化的RNA中残留DNA污染物的这一问题提供解决方法，该方法有效、简便、而且不危害RNA品质。相反，RNA品质甚至比不添加阳离子去污剂的方法更好。另外，本发明所述方法经济有效，因为该方法不必使用额外的材料例如固相或酶，如DNA结合柱或DNA酶。因此，本发明具有显著优点。

a)向样品中加入包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物;

c)从所述水相分离所述RNA。

其中在最终分离所述相前添加至少一种阳离子去污剂。

步骤a)至c)是本领域已知的分离RNA所实施的方法.在步骤a)中，样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中处理，通常是裂解和/或匀化。通过添加步骤b)中的不溶于水的有机溶剂，例如氯仿，将所得混合物分成有机相、通常有中间相（取决于样品）和水相。可用离心促进所述相的形成。在步骤c)中，将RNA从水相中分离。本发明的改进在于在混合物最终分相前添加至少一种阳离子去污剂。令人惊奇地发现，如果在制备样品时使用含离液剂和苯酚的酸性变性组合物，添加所述阳离子去污剂可显著降低含RNA水相中的DNA含量。用于本发明所述方法的试剂组合（尤其是离液剂、苯酚、阳离子去污剂和非水溶性有机溶剂）对于实现本发明的优点是至关重要的。例如，仅仅添加离液剂或阳离子去污剂无法实现本发明的益处。因此本文所述的精确组合很关键。所述优点通过本发明所教导的特定的步骤组合来实现，并通过文中提供的实施例来证实。

据一个实施方式，使用至少一种具有以下分子式的阳离子去污剂：

Y R1R2R3R4X

其中

Y是氮或磷；

R1、R2、R3和R4独立地选自于支链或非支链C1-C20烷基残基、C3-C6烯基残基、C3-C6炔基残基和/或C6-C26芳烷基残基，其中，优选R1、R2、R3或R4中至少一种是C6-C20烷基残基，且甚至更优选是至少C10烷基残基。

X是无机或有机一元酸或多元酸的阴离子。

阳离子去污剂的示例包括但不限于季铵盐、带有酰胺键的胺、聚氧乙烯烷基和脂环胺、N,N,N',N'四取代乙二胺、2-烷基1-羟乙基2咪唑啉乙氧基化胺和烷基铵盐。

根据一个实施方式，适用的阳离子去污剂包含作为极性头部基团的带有永久性电荷的季铵阳离子。优选的阳离子去污剂为十六烷基三甲基铵盐。优选阳离子去污剂包括溴化铵或氯化铵。最优选地，所述阳离子去污剂选自下组：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、四癸基三甲基溴化铵（TTAB）和十二烷基三甲基溴化铵（DTRB）或以氯替代溴的相应化合物。

其它的阳离子去污剂包括但不限于二癸基二甲基氯化铵、苯扎氯胺、正十二烷基三甲基溴化铵（DTAB)、三甲基四癸基溴化铵、N,N’二甲基十二烷基胺-N-氧化物二盐酸奥替尼啶、烷基三甲基铵盐、蜡鲸基三甲基溴化铵、氯化腊鲸基嘧啶（CPC）、聚乙氧基牛油胺（POEA）、苯扎氯胺（BAC）、苄索氯铵（BZT）、5-溴-5-硝基-1,3-二

烷、二甲基双十八烷基氯化铵、双十八烷基二甲基溴化铵（DODAB）、十六烷基三甲基溴化铵（HTAB）、氯化腊鲸基嘧啶、二甲基双十八烷基溴化铵、可可烷基二甲基苄基氯化铵、可可烷基二甲基苄基氯化铵、烷基羟乙基二甲基氯化铵、二油酸三乙醇胺酯季铵盐、二硬脂基二甲基氯化铵、二牛脂酸三乙醇胺酯季铵盐、三乙醇胺酯季铵盐。

根据一个实施方式，以某浓度添加至少一种阳离子去污剂，得到在步骤a)中匀化的样品中，和/或步骤b)中添加不溶于水的有机溶剂后所得的混合物中的阳离子浓度，该阳离子浓度选自下组：按总体积计0.01%到10%、0.03%到7.5%、0.03%到5%、0.04%到2.5%、0.04%到2%和0.03%到1.7%。优选地，阳离子去污剂或阳离子去污剂混合物包括选自下组的浓度：至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%和至少0.15%。如上文所述，也可使用阳离子混合物，优选CTAB和TTAB混合物。

根据一个优选实施例，以溶液形式加入至少一种阳离子去污剂。在所述溶液中，所述阳离子去污剂优选包括选自下组的浓度：按溶液总体积计0.1%至20%、0.5%至10%、0.1%至5%、0.5%至5%、0.1%至3%、0.5%至3%，并最优选以下浓度：按溶液总体积计0.1%至1%和0.5%至1%。使用阳离子混合物的情况下同样适用。

包含至少一种阳离子去污剂的所述溶液可包含其他组分，例如盐。包含于所述溶液中的所述盐优选地选自下组：碱性金属盐、例如氯化钠、氯化锂、氯化钾、氯化铵、醋酸钠、硝酸钠、硫酸铵、硫酸钠、硫酸锂、硫酸钾和其混合物。添加相应的盐对于在溶液中保留阳离子去污剂尤其有利。优选地，溶液中的所述盐浓度选自下组：0至10M、优选0.5至5M、更优选0.5至1.5M。

分离所述相前添加阳离子去污剂的方法有数种选择。根据一个实施方式，在步骤a)中，向样品中添加酸性变性组合物前、添加酸性变性组合物时或添加酸性变性组合物后添加阳离子去污剂。阳离子去污剂也可包含在酸性变性组合物中。另外，所述阳离子可在步骤b)中与不溶于水的有机溶剂一起添加或分别同时添加。然而，在最终实施分相前添加阳离子去污剂是至关重要的，其可使阳离子去污剂在降低含RNA水相中的DNA含量中发挥作用。由于最终分相是关键，实施初始相分离然后向水相中添加阳离子去污剂并最后分离所述相也在本发明的范围中，例如，通过离心来使阳离子去污剂和残留DNA从水相中移除至有机和/或中间相中。然而，尤其为了减少处理步骤，优选在添加不溶于水的有机溶剂的同时或之前添加阳离子去污剂。根据一个优选实施方式，在样品与酸性变性组合物混合之后并在添加不溶于水的有机溶剂之前单独添加阳离子去污剂。如实施例所示，尤其是在步骤a)之后和步骤b)之前添加至少一种阳离子去污剂达到良好结果。

可通过沉降获得相分离。根据一个实施方式，通过将样品离心形成多相混合物。这里，优选将样品在较低温度下和低于室温的温度下离心。优选的温度是≤15°C、≤10°C，并尤其优选更低的温度例如≤7°C、≤5°C和≤4°C。已发现，在较低温度下离心有助于相分离，因此，在使用阳离子去污剂时促进含RNA水相中DNA含量降低。

为了从所述水相中分离RNA，基本上可使用本领域现有技术中任何从水溶液中分离RNA的任何已知方法。优选的RNA分离方法是通过向所述水相中添加至少一种醇从而沉淀得到RNA。根据一个实施方式，相应经沉淀的RNA可通过将水相离心然后倾析上清液回收。

优选地，所述水相与至少一种醇混合，并用所述混合物接触核酸结合固相以助于核酸纯化。

关于核酸结合固相，可使用任何能结合核酸的材料，因此其包括各种能在合适条件下结合核酸的材料。适用于本发明的固相示例包括但不限于：包括二氧化硅和硅质固相的化合物（所述硅质固相包括但不限于：硅石颗粒、二氧化硅、硅藻土、玻璃、烷基二氧化硅、硅酸铝和硼硅酸盐）、硝酸纤维素、重氮化纸、羟基磷灰石（也称为羟基磷灰石）、尼龙、金属氧化物、氧化锆、氧化铝、聚合载体、二乙基氨基乙基-和三乙基氨基乙基衍生载体、疏水性层析树脂（例如苯基-或辛基琼脂糖）等。术语固相不用于表示其形式和设计的任何限制。因此，术语固相包括多孔或非多孔的、渗透性的或非渗透性的合适材料，包括但不限于膜、滤纸、薄片、颗粒、磁性颗粒、珠子、凝胶、粉、纤维等。根据一个实施方式，固相表面不修饰，例如不用官能团修饰。优选地，使用核酸结合膜。合适的膜包括但不限于亲水膜、疏水膜、和通过离子交换结合核酸的膜。示例包括但不限于二氧化硅膜和其它含二氧化硅的膜、尼龙膜、纤维素膜例如硝酸纤维素膜。优选多孔膜。另外，优选使用含二氧化硅或由二氧化硅组成的膜。

关于醇，优选使用短链支链或非支链醇，其中优选1至5个碳原子。示例为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。也可使用醇的混合物。优选的醇选自异丙醇和乙醇，因为所述醇对沉淀RNA尤其有效。

用于分离RNA的醇浓度取决于经分离的总RNA中是否含小RNA。在还需要纯化小RNA（例如miRNA）的情况下，推荐使用较高的醇浓度。当经分离的总RNA中不需要包含相应的小RNA的情况下，优选较低的醇。与水相混合时，所述醇浓度在所得混合物中的范围是10%v/v至90%v/v。为分离含有小RNA的总RNA，使用以下醇浓度很有益处：≥40%v/v，优选≥50%v/v。当不需要包含小RNA时，所述醇浓度优选≤40%v/v。因此，与水相混合时，所述醇浓度可选自下组，至少20%，至少30%v/v，至少40%v/v，至少50%v/v和至少60%v/v。当与水相混合时，优选的醇浓度范围是20%v/v至90%v/v或30%v/v至85%，优选的范围是30%v/v至70%v/v。

本文所用的术语“样品”从广义上来讲，其意在包括各种含有核酸的来源。所述样品可以是生物样品但术语也包括其它样品，例如含有核酸的人工样品。样品示例包括但不限于全血、血制品、红血细胞、白血细胞、暗黄层、擦拭物（包括但不限于口颊擦拭物、咽喉擦拭物、阴道擦拭物、尿道擦拭物、宫颈擦拭物、咽喉擦拭物、直肠擦拭物、病灶擦拭物、脓肿擦拭物、鼻咽擦拭物等）、尿液、痰液、唾液、精液、淋巴液、羊水、脑脊液、玻璃体液、腹膜渗出液、胸腔积液、囊内积液、滑液、玻璃体液、眼房液、囊液、洗眼液、眼抽出物、血浆、血清、肺灌洗液、肺抽出物；组织，包括但不限于：肝、脾脏、肾、肺、肠、脑、心、肌肉、胰腺；细胞培养物，以及裂解物、提取物、或从上述样品中获得的细胞、或可能存在样品上或样品中的任何细胞和微生物以及病毒等。从临床或法医设置中获得的含核酸的材料也在术语“样品”想要表示的含义中。另外，技术人员会明白裂解物、提取物或获自任何上述示例样品的经处理的材料或部分也在术语“样品”的范围中。优选地，所述样品是衍生自人、动物、植物、细菌或真菌的生物样品。优选地，所述样品选自下组：细胞、组织、细菌、病毒和体液（例如血液、血制品（例如暗黄层、血浆和血清）、尿液、溶液、痰液、粪便、CSF和精液）、上皮擦拭物、活检标本、骨髓样品和组织样品，优选器官组织样品例如肺、肾或肝。本发明所述方法尤其适合从组织样品中分离RNA，尤其是器官组织样品。根据本发明的一个实施方式，所述组织不是血液。根据一个实施方式，所述样品不是细菌样品或衍生自细菌的样品。

术语“小核酸”和“各种小核酸”尤其是指长度小于1000nt、500nt、400nt、300nt、100nt或小于70nt的核酸，包括但不限于miRNA、siRNA和其它短干扰核酸，snoRNA、snRNA、tRNA、hnRNA、循环核酸、基因组DNA或RNA片段、降解的核酸、核酶、病毒RNA或DNA、感染源的核酸、扩增产物、修饰的核酸、质粒或细胞器核酸、人工核酸例如寡居苷酸。

所述酸性变性组合物包含离液剂和苯酚，该组合物可如现有技术，例如US4,843,155或US5,346,994中所述的那样。

任何可用于酸性变性组合物的离液剂导致蛋白质或核酸变性，例如但不限于：虽然保持其初级结构完整性但改变蛋白或核酸的二级、三级或四级结构。优选地，所述离液剂选自下组：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠和脲。优选地，使用离液盐。具体地，可使用盐酸胍和/或硫氰酸胍作为离液剂。

所述酸性变性组合物中包含的离液剂的浓度可选自下组：0.1至饱和极限、0.1至6M、0.5至4M、0.5至3M以及0.5至2M。

优选地，所述酸性变性组合物中包含的苯酚的浓度可选自下组：按酸性变性组合物的总体积计，10%v/v至70%v/v、20%v/v至60%v/v和30%v/v至50%v/v。优选地，所述苯酚浓度的范围在35％v/v至40％v/v之间。

所述变性组合物的pH值为酸性，可以是≤6，优选≤5。优选地，酸性变性组合物的pH值范围在3至6之间，更优选地在4至5之间。

另外，所述酸性变性组合物可包含缓冲液，所述缓冲液的含量可足够维持所述组合物在酸性pH。所述缓冲液可以是以下物质中的至少一种盐：醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、酒石酸盐或乳酸盐，并可例如选自下组：磷酸钠、醋酸钠和柠檬酸钠。优选地，使用醋酸钠。

所述酸性变性组合物可包含增溶剂，所述增溶剂用于，尤其在4°C，维持溶液中的苯酚，并实现或维持作为单相溶液的溶剂。合适的增溶剂是甘油。根据一个实施方式，所述增溶剂的浓度为约2至10％，优选约5％。

另外，所述酸性变性组合物可包含硫氰酸盐组分，优选硫氰酸铵或硫氰酸钠。可确信，所述附加的硫氰酸组分增强了生物样品中的RNA提取。所述硫氰酸盐组分的浓度可以是0.1至1M，优选0.4M。

根据一个实施方式，所述酸性变性组合物具有以下特性：

-包含苯酚，所述苯酚浓度高于30％，优选高于35％并最优选35至40％。

-pH为4.3至6，优选4.5至5。

-包含离液盐，所述离液盐浓度为0.5至4M，优选0.5至3M；以及

-优选地，包含至少一种选自下组的其它试剂：缓冲液、增溶剂和硫氰酸盐化合物；优选实施例和浓度如上文所述。

优选地，所述酸性变性组合物结合了上述所有优选特性。

合适的不溶于水的有机溶剂包括但不限于：己内酯、乙二醇二乙酸酯、聚乙二醇二苯甲酸酯、氯仿、四氯化碳、溴氯丙烷、溴萘、溴苯甲醚、环己基溴、二溴丙烷、二氯苯甲酸或其混合物。优选的不溶于水的有机溶剂为氯仿。

根据本发明所述方法也可包含一个或多个附加步骤，以下论述了一些非限制性选择。

如果需要，可用本发明所述方法从有机相和/或中间相中回收蛋白质（若样品中包含）和/或DNA，例如可通过向有机相中添加较低浓度的醇来沉淀蛋白质并通过沉降回收蛋白质。可从中间相和/或有机相中回收DNA，例如通过以下方法：用预定量的溶剂洗涤、沉降DNA并从DNA中去除任何苯酚和盐污染物。从中间相和/或有机相中分离DNA和/或蛋白质的合适方法在现有技术中是已知的，所以这里不需要进一步叙述。根据本发明实施分离DNA的方法还有提高DNA产率的有益效果，因为DNA更有效地从水相中移除并因此聚集在中间相和/或有机相中，从而分离DNA。

另外，在从水相中分离RNA时可实施一个或多个洗涤步骤。优选地，在使用固相的情况下，当RNA结合到核酸结合固相时实施所述洗涤步骤。为所述目的可使用常规洗涤溶液。推荐使用不会导致RNA从核酸结合固相上释放的洗涤溶液。另外，在不使用结合相的情况下可洗涤含RNA的团块。根据一个实施方式，用于洗涤的溶液包括至少一种离液剂、至少一种醇、至少一种去污剂和/或至少一种缓冲组分。适用于洗涤溶液的离液剂包括但不限于盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍和碘化钠。另外，可用的离液盐包括离液阴离子，所述离液阴离子选自下组：三氯乙酸盐、高氯酸盐和三氟乙酸盐。所述离液盐的示例是碱性盐，例如高氯酸钠、三氯乙酸钠和三氟乙酸钠。关于用于洗涤的醇，可用于洗涤，在所述的洗涤溶液中的醇是短链分支或非分支醇，优选1至5个碳原子的醇。示例为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。优选使用异丙醇和/或乙醇。优选地，所述洗涤溶液包含至少10％醇和至少900mM离液盐，优选至少2M离液盐。另外，所述洗涤溶液可包含去污剂。

本发明还提供了一种适用于本发明所述方法的试剂盒。所述试剂盒包含：

a)含离液剂和苯酚的酸性变性组合物；

b)降低水相中DNA的溶液，所述溶液包含至少一种离液剂和优选地一种盐。

c)任选的核酸结合固相以及

d)任选的洗涤和洗脱缓冲液。

所述酸性变性组合物优选具有上述特性。这里是指上述公开内容。另外，用于降低DNA的溶液有具有上述特性。这里也指上述公开内容。

根据本发明的另一方面，本发明提供一种降低含RNA水相中的DNA含量的方法，形成所述含RNA水相的RNA分离方法涉及使用含离液剂和苯酚的酸性变性组合物，其中，将至少一种阳离子去污剂加入经所述酸性变性组合物匀化的样品中，之后通过添加不溶于水的有机溶剂将所得相分为水相、任选的中间相和有机相。

本发明还涉及使用至少一种离子去污剂来降低含RNA水相中DNA含量的用途，所述含RNA水相通过以下步骤得到：

-将样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中匀化；

-添加不溶于水的有机溶剂并且

-将混合物分成水相、任选的中间相和有机相。

其中在最终分离所述相前添加离子去污剂。关于离子去污剂，可使用阴离子去污剂，例如SDS，优选使用阳离子去污剂。如上文所述，所述去污剂优选阳离子去污剂，因为阳离子去污剂就在含RNA水相中降低DNA含量这点上提供了最好结果。关于酸性变性组合物的其它详细内容，本发明所述方法就去污剂和其进一步使用详情都在上文中进行了叙述。这里是指上述公开内容。优选地，所述酸性变性组合物结合了上述所有优选特性。

本发明涉还及使用至少一种阳离子去污剂，通过降低含RNA水相中DNA含量，来提高中间相和/或有机中DNA含量的用途，其通过以下步骤得到：

-将样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中匀化；

-添加不溶于水的有机溶剂并且

-将混合物分成水相、任选的中间相和有机相。

其中在最终分离所述相前添加阳离子去污剂。

关于酸性变性组合物和阳离子去污剂的详细内容以及相关优点在上文中已详细描述。这里是指应用于本文的相关公开内容。

实施例

实施例1：

不同去污剂从大鼠肝脏中分离RNA时去除基因组DNA的作用，该作用通过以下方法评估：

1.使用TissueRuptor匀浆机，使用27mlQiazol试剂，一种含酸性酚和离液盐的试剂，匀化270mg经RNAlater稳定的肝组织。

2.将1000μl所得匀浆液分装进2ml的Eppendorf管。因此，每个样品使用10mg组织

3.相分离前将8μl（5μg）基因组DNA加入Qiazol试剂。

4.在下一步骤中，向所述匀浆液加入100μl以下去污剂（一式两份）：

-曲通X-100[100%]

-吐温20[20%]

-十六烷基三甲基溴化铵[1%],CTAB

-四癸基三甲基溴化铵[1%],TTAB。

不添加去污剂作为参照（“参照”）。

然后加入200μl氯仿并涡旋振荡。

5.将样品以12.000xg在4°C下离心15分钟，所得水相移入新的Eppendorf管。

6.向每份水相中加入1.5倍体积无水乙醇，然后混合。

7.将混合物转至RNeasy小柱（恰根公司（Qiagen））上，然后以8.200xg离心15秒，接着用700μlRWT缓冲液（恰根公司（Qiagen））洗涤，再以8.200xg离心15秒。

8.用500μlRPE缓冲液(恰根公司（Qiagen）)将上述柱子洗涤两次，分别以8.200xg离心15秒和2分钟，接着以最大速度进行1分钟的最终离心步骤。

9.经8.200xg离心1分钟，被结合的RNA洗脱至30μl的无RNA酶水中。使用NanoDrop（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））对RNA浓度进行光谱测定。结果示于表1。

表1：使用曲通X-100,、吐温20、CTAB或TTAB作为去污剂分离得到的RNA的定量。使用NanoDrop分光仪（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））进行核酸定量。

可见，所有方案变体都得到了良好RNA产率。然而，采用分光仪的方法不能严格区分RNA和DNA，因此“RNA产率”是由RNA以及DNA决定的。相比参照方法和使用非阳离子去污剂曲通和吐温的方法，使用本发明所述方法时，纯RNA产率得到改进，这是由于当使用本发明所述方法时分离RNA中的DNA含量显著降低，如下述表3和相应的图1所示。

10.使用Agilent BioAnalyzer分析RNA完整性，以此比较所测去污剂对RNA完整性的影响。结果示于表2。

表2：较高RIN（RNA完整数）值表示较高水平的RNA完整性。RIN值范围在10(完整RNA)和1（完全降解的DNA）之间。

表2显示，通过本发明所述方法得到最高RIN值。因此，根据本发明所述方法分离的RNA的RNA完整性好于通过参照方法和加入非阳离子去污剂的方法所分离的RNA的RNA完整性。

11.用无RNA酶的水将所述RNA样品进行1:50稀释，然后在25μl反应体积中，分别采用含转录酶和不含转录酶的QuantiTect RT-PCR试剂盒（恰根公司（Qiagen）），用10pmole基因－特异性引物和探针（PGK1引物混合物，PGK1探针）进行逆转录：

(1)30分钟50°C

(2)15分钟95℃

(3)15秒95°C

(4)1分钟60°C，重复步骤(3)、(4)进行40个循环。

得到的Ct和ΔCt值示于表3和图1a)（Ct值）和1b)(ΔC值)中。

表3：使用实施例1分离的RNA来实施qRT-PCR所得到的结果。“-RT”表示对照反应，其不包含逆转录，“+RT”表示包含逆转录的qRT-PCR反应。

	Ct-RT	Ct+RT	ΔCt
				曲通	35,42	24,27	11,15
吐温	37,31	24,47	12,84
				CTAB	39,61	24,55	15,06
TTAB	39,45	24,42	15,03
				参比	37,29	24,36	12,93

“-RT”反应中，仅仅NDA污染物可作为模板，由此在PCR中扩增（RNA在“-RT”反应中不进行逆转录，因此不能作为模板）。因此，含有少量DNA的样品中，在更多次循环后到达阈值，因此Ct值更高。因此，“-RT”反应中的Ct值越高，模板含量越低，因而经分离的RNA中的DNA污染物含量也越少。通过本发明所述方法达到最高Ct值。为了确保Ct值较高并不是由于核酸的总产率较低引起的，测定了“+RT”反应中的Ct值，其中，对RNA进行逆转录并因而可作为PCR模板所有“+RT”反应中的Ct值都较低，这是因为其中经逆转录的RNA（和DNA污染物）可作为PCR模板，因而阈值相比“-RT”反应较早到达。从结果中可见，得到的Ct值与所有所测样品大约相同。

ΔCt值(ΔCt=(“-RT”反应的Ct值)-(“+RT”反应的Ct值))表明了所述两个反应的差异，因而表明了经分离的RNA中DNA污染物含量。ΔCt值越高，经分离的RNA中DNA污染量越低。表3和图1a)和b)表明，根据本发明向其中添加阳离子去污剂而分离的RNA中包含的DNA污染物含量相比参照方法显著降低。因此，DNA污染物通过本发明所授方法被有效降低。其它的非阳离子去污剂不能降低DNA污染物含量。相反地，它们导致了经分离的RNA中DNA的增加，从ΔCt值可看出，它们甚至比参照方法中的ΔCt值更低。

实施例2：

进行以下实验对从不同组织分离RNA时共同纯化的基因组DNA量进行评估，其中，向匀浆液直接添加去污剂同时使用Qiazol试剂：

1.使用TissueRuptor匀浆机，将200mg经RNAlater稳定的肺、肾、心脏、脾脏和脑组织在8mlQiazol试剂中匀化。

2.将匀浆液，每份1000μl（相当于每份样品25mg组织），分装进2mlEppendorf管中,并向其添加100μl以下去污剂储存溶液：

-十六烷基三甲基溴化铵[1%],CTAB

-四癸基三甲基溴化铵[1%],TTAB。

不添加去污剂作为参照（“参照”）。

然后加入200μl氯仿并涡旋振荡。

3.将样品以12.000xg在4°C下离心15分钟，所得水相移入新的Eppendorf管。

4.用1.5倍体积无水乙醇与所述上清液混合，将该水相转至RNeasy小柱(恰根公司（Qiagen）)上，然后以8.200xg离心15秒，接着用700μlRWT缓冲液（恰根公司（Qiagen））洗涤，再以8.200xg离心15秒。

5.用500μlRPE缓冲液(恰根公司（Qiagen）)将上述柱子洗涤两次，以8.200xg分别离心15秒和2分钟，接着以最大速度进行1分钟的最终离心步骤。

6.经8.200xg离心1分钟，被结合的RNA洗脱至30μl的无RNA酶水中。使用NanoDrop（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））对RNA浓度进行光谱测定。结果示于表4。

表4：不使用去污剂(“-“)、使用[1%](“CTAB”)或使用[1%](“TTAB”)，经RNAlater稳定的各组织中所分离的RNA定量。使用NanoDrop分光仪（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））进行RNA定量。

可见，所有方案的产率都很好但通过本发明所述方法分离的RNA含有较少的DNA，因此，纯RNA产率得到提高，这也如下述表6中所示的那样。

7.使用Agilent BioAnalyzer2100评估RNA完整性，结果示于表5中。

表5：用Agilent BioAnalyzer2100对实施例2中分离的RNA进行RNA完整性评估。

如之前所述，当使用本发明所述的方法时，所述RIN与参考方法相当或甚至更好。

8.按照以下比例用无RNA酶的水稀释RNA样品：肺1:80、肾1:100、心脏1:50、脾脏1:100、心脏1:50。每种稀释液取2μl，分别采用含逆转录酶和不含逆转录酶的QuantiTect RT-PCR试剂盒（恰根公司（Qiagen）），在25μl的反应体积中，用10pmole基因－特异性引物和探针(PGK1引物混合物，PGK1探针)进行逆转录。

(1)30分钟50°C

(2)15分钟95°C

(3)15秒95°C

(4)1分钟60°C，重复步骤(3)、(4)，进行40个循环。

所得的Ct和ΔCt值示于表6和相应的图2a)和2b)中。

表6：采用“QuantiTect RT-PCR”试剂盒(恰根公司（Qiagen）)，用基因－特异性引物PGK1引物混合物、PGK1探针进行qRT-PCR从而共同纯化得到的基因组DNA定量。“–RT”表示不含逆转录酶的反应，“+RT”表示含逆转录的反应。

肺	Ct-RT	Ct+RT	ΔCt
				-	35,79	23,26	12,53
CTAB	37,69	23,75	13,94
				TTAB	36,61	23,41	13,20
肾	Ct-RT	Ct+RT	ΔCt
				-	36,02	20,10	15,92
CTAB	37,92	20,89	17,03
				TTAB	37,61	20,50	17,11
心脏	Ct-RT	Ct+RT	ΔCt
				-	34,03	20,85	13,18
CTAB	36,67	21,09	15,58
				TTAB	36,32	21,10	15,23
脾脏	Ct-RT	Ct+RT	ΔCt
				-	33,27	21,68	11,60
CTAB	35,14	21,78	13,36
				TTAB	34,55	21,59	12,97
脑	Ct-RT	Ct+RT	ΔCt
				-	35,69	21,44	14,25
CTAB	36,52	21,22	15,31
				TTAB	37,13	21,46	15,67

根据较高的ΔCt值（也可参见图2b）可推断，本发明所述方法显著降低了分离自不同组织样品的RNA中DNA污染物含量因此，本发明所述方法尤其适合从不同组织中分离纯RNA。

实施例3：

使用Qiazol试剂从递增的组织量中分离RNA，其中根据以下步骤向匀浆液中直接添加阳离子去污剂：

1.使用TissueRuptor匀浆机，将5mg、10mg、20mg、30mg和50mg(a)经RNAlater稳定的肝脏或(b)冷冻肝脏在1ml Qiazol试剂中匀化。

2.加入100μl的下述去污剂储存溶液：

-十六烷基三甲基溴化铵[1%],CTAB

-四癸基三甲基溴化铵[1%],TTAB。

不添加去污剂作为参照（“参照”）。

然后加入200μl氯仿并涡旋振荡。

5.用500μl RPE缓冲液(恰根公司（Qiagen）)将上述柱子洗涤两次，分别以8.200xg离心15秒和2分钟，接着以最大速度进行1分钟的最终离心步骤。

6.经8.200xg离心1分钟，将被结合的DNA洗脱至30μl的无RNA酶的水中。使用NanoDrop（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））对RNA浓度进行光谱测定。结果示于表7和表8以及图3和图4中。

表7：从递增量的经RNAlater稳定的肝组织中分离RNA。组织量从5mg至50mg不等。并以柱状图显示了所述RNA产率（见图3）。

表8：从递增量的冷冻肝组织中分离RNA。组织量从5mg至50mg不等。还以柱状图显示了所述RNA产率（见图4）。

7.使用Agilent BioAnalyzer2100评估RNA完整性，结果示于表9和表10中。

表9：用Agilent BioAnalyzer2100检测经RNAlater稳定的组织中所分离RNA的RNA完整性：

表10：用Agilent BioAnalyzer2100检测分离自冷冻组织样品的RNA的RNA完整性：

可见，通过本发明所述方法分离的RNA的RIN值极佳。

8.用不含RNA酶的水将所述RNA样品进行1:70稀释。每种稀释液取2μl，分别采用含逆转录酶和不含逆转录酶的QuantiTect RT-PCR试剂盒（恰根公司（Qiagen）），在25μl的反应体积中，用10pmole基因－特异性引物和探针(PGK1引物混合物，PGK1探针)进行逆转录。

(1)30分钟50°C

(2)15分钟95°C

(3)15秒95°C

(4)1分钟60°C，重复步骤(3)、(4)进行40个循环。

所得的Ct和ΔCt值列于表11a)和b)中，并显示在柱状图5a)和b)中。

表11a)和b)：使用“QuantiTect RT-PCR”试剂盒（恰根公司（Qiagen））,用qRT-PCR实验评估在分离RNA时共同纯化并因此成为污染物的基因组DNA，所述的RNA分离是不使用去污剂(“-“)、使用CTAB或使用TTAB，根据所示的递增的组织量，从经RNAlater稳定((a))和冷冻的肝组织((b))中分离RNA。图5a)和b)中显示的柱状图表明，根据示于表11a)和b)中的ΔCt值，基因组DNA减少。

b)

实施例4：

评估不同量的阳离子去污剂在分离RNA时对共同纯化的基因组DNA的作用，其中将所述去污剂直接添加到根据下述方法所得的含四种单独RNA制品的匀浆液中：

1.使用TissueRuptor匀浆机，将930mg经RNAlater稳定的肝脏在31ml Qiazol试剂中匀化。

2.将匀浆液，每份1000μl（相当于30mg肝脏），分装进2ml Eppendorf管，所述样品中不添加去污剂或添加递增量的1%CTAB储存溶液：50μl、100μl、150μl、200μl，然后加入200μl氯仿并漩涡振荡。

5.用500μl RPE缓冲液(恰根公司（Qiagen）)将上述柱子洗涤两次，以8.200xg分别离心15秒和2分钟，接着以最大速度进行1分钟的最终离心

步骤。

6.经8.200xg离心1分钟，被结合的RNA洗脱至30μl的无RNA酶水中。使用NanoDrop（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））对RNA浓度进行测定。结果列于表12和图6。

表12：在提取RNA时递增量的CTAB对RNA回收的影响。每种条件下进行四次单独地RNA分离。“参照”表示在RNA分离时不添加CTAB。

结果还示于图6。相比参照方法，本发明所述方法中的RNA产率下降，这可能是由于经分离的RNA中基因组DNA减少了，而并非是由于RNA的减少，这尤其可通过qRT-PCR实验（见图7）和本文中其它实施例来支持。

7.使用Agilent BioAnalyzer2100评估RNA完整性。结果示于表13。

表13：CTAB量的增加对RNA完整性的影响。用不含RNA酶的水将RNA洗脱物进行1:10的稀释，并使用Agilent Bioanalyzer2100分析。

8.用无RNA酶的水将所述RNA样品进行1:90稀释，然后在25μl反应体积中，分别采用含转录酶和不含转录酶的QuantiTect RT-PCR试剂盒（恰根公司（Qiagen）），用10pmole基因－特异性引物和探针（PGK1引物混合物，PGK1探针）进行逆转录：

(1)30分钟50°C

(2)15分钟95°C

(3)15秒95°C

(4)1分钟60°C，重复步骤(3)、(4)进行40个循环。

所得的Ct和ΔCt值示于表14和相应的图7中。

表14：使用“QuantiTect RT-PCR”试剂盒，通过qRT-PCR实验，定量分析在分离RNA时通过增加CTAB量所移除的基因组DNA（恰根公司（Qiagen）），通过提高CTAB量用qRT-PCR对所述基因组DNA去除进行评估。根据实施例4进行qRT-PCR实验。

	Ct-RT	Ct+RT	Δct
				参照：	36,79	23,46	13,33
50μl CTAB	38,21	23,57	14,64
				100μl CTAB	38,61	23,73	14,88
150μl CTAB	39,35	23,60	15,75
				200μl CTAB	38,77	23,55	15,22

结果还示于图7。可见，增加CTAB量会经分离的RNA中DNA污染物的降低增加。

实施例5：

为了比较使用两种不同的阳离子去污剂溶液（CTAB和缓冲液“BB”(恰根（Qiagen）公司，含1%CTAB和一种盐))在从组织分离RNA期间对共同纯化的基因组DNA的影响，实施以下实验：

1.分别使用TissueRuptor匀浆机，将425mg经RNAlater稳定的脾脏和425mg冷冻脾脏在31mlQiazol试剂中匀化。

2.将匀浆液，每份1000μl，分装进2mlEppendorf管中，向匀浆液直接添加100μl以下储存溶液：

-十六烷基三甲基溴化铵[1%],CTAB

-恰根（Qiagen）缓冲液BB(NaCl中1%CTAB)

不添加去污剂作为参照（“参照”）。

然后加入200μl氯仿并涡旋振荡。

6.经8.200xg离心1分钟，被结合的RNA洗脱至30μl的无RNA酶水中。使用NanoDrop（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））对RNA浓度进行光谱测定。结果示于表15。

表15：经RNAlater稳定的（“RNAlater”）或冷冻的（“冷冻”）的脾脏分离的RNA定量，其中使用两种不同的含阳离子去污剂组合物，该组合物直接添加至匀浆液中。“参照”表示不添加去污剂或缓冲液。使用四个独立的RNA制品来用于每种测试条件。

7.使用Agilent BioAnalyzer2100评估RNA完整性，见表16。

表16：比较根据实施例5从经RNAlater稳定的和冷冻的脾脏中分离的RNA的RNA完整性。在将其于Agilent Bioanalyzer2100上分析前，用不含RNA酶的水将RNA洗脱物进行1:10的稀释。

可见，通过本发明所述方法从所述组织中分离RNA，RNA的完整性得到改进。

8.用无RNA酶的水将所述RNA样品进行1:100稀释，然后在25μl反应体积中，在10μM的浓度下，分别采用含转录酶和不含转录酶的QuantiTect RT-PCR试剂盒（恰根公司（Qiagen）），用10pmole基因－特异性引物和探针（PGK1引物混合物，PGK1探针）进行逆转录：

(1)30分钟50°C

(2)15分钟95°C

(3)15秒95°C

(4)1分钟60°C，重复步骤(3)、(4)进行40个循环。

所得的Ct和ΔCt值示于表17和相应的图8中。

表17：比较从经RNAlater稳定的（“RNAlater”）和冷冻的（“冷冻”）脾脏中共同纯化的基因组DNA，其中使用CTAB或BB缓冲液作为添加剂。“参照”表示使用Qiazol试剂但不添加CTAB或缓冲液BB。“-RT”和“+RT”表示使用逆转录酶和不使用逆转录酶的qRT-PCR实验。

	Ct-RT	Ct+RT	Δct
				RNAlater参照	34,04	23,62	10,42
RNAlater CTAB	35,39	23,57	11,83
				RNAlater BB	35,59	23,25	12,34

冷冻参照	34,02	24,19	9,83
				冷冻CTAB	35,42	24,01	11,41
冷冻BB	35,81	24,15	11,66

根据表17和图8可推断，本发明所述方法通过降低DNA污染物含量改进了RNA从所述组织中分离的RNA的纯度。可根据提高的ΔCt值推断出这点。

实施例6：

本文中，可根据以下方法分离RNA：使用QIAzol的参照方法（包含苯酚和离液盐，但不含CTAB）、本发明方法（其中向匀浆物中添加CTAB）、以及现有技术，其中现有技术只使用苯酚和CTAB，不使用离液剂（参加，例如EP1219707）。本实施例表明，将包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物与阳离子去污剂组合，这对降低DNA污染物含量并从样品中，尤其是麻烦的样品例如组织样品中，有效分离纯RNA起关键作用。使用两种不同的方法将RNA从含RNA的水相中分离－通过沉淀的方法和通过含二氧化硅膜的RNAeasy小柱（Qiagen公司）纯化的方法。

6.1.通过以下方法获得使用QIAzol分离RNA时所得的含RNA水相：

1.关于本实验，使用TissueRuptor，将2份100mg经RNAlater稳定的脾脏和肺组织在9ml Qiazol试剂中匀化。

2.将匀浆物分装为900μl等分或1000μl等分置入2ml Eppendorf管。

3.在每份900μl样品中添加100μl恰根QIAGEN公司的缓冲液BB（包含1%CTAB和盐）。仅使用QIAzol并不添加去污剂作为参照方法。向所有样品中添加180μl氯仿，漩涡振荡，然后在室温孵育2－3分钟。然后将样品以12.000xg在4℃下离心15分钟，所得水相移入新的Eppendorf管。

6.2.通过以下方法获得使用EP1219707所述方法分离RNA时得到的含RNA水相：

1.将2份100mg经RNAlater稳定的肺及脾脏组织分别在9ml的含下述组分的溶液中匀化：8ml的pH4.3的苯酚、2ml10%CTAB、500μl的pH4.0的2M乙酸钠和9.48ml无RNA酶的水。

2.然后将匀浆物（1000μl）移入2mlEppendorf管中。匀浆物中的组织含量和其它方法相同。加入200μl氯仿，然后涡旋振荡并在室温下孵育2－3分钟。然后将所述样品以12.000xg在4°C下离心15分钟。

3.将水相移入新的Eppendorf管，在-20°C过夜储存以至进一步处理。

6.3.通过沉淀从含RNA的水相中分离RNA。

根据6.1和6.2获得的水相通过以下方法进一步处理：

1.通过以下方法沉淀RNA：加入500μl异丙醇，混合，在室温孵育10分钟，然后以12.000xg在4°C下离心15分钟。

2.弃上清，添加1ml75%乙醇将RNA团块洗涤一次，涡旋振荡，然后以7500xg在4°C下离心5分钟。

3.弃上清，将团块空气干燥并在60°C，在30μl无RNA酶的水中重悬10分钟。

4.用Nanodrop（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））定量分析所得的RNA，见表19。

表18：显示了根据实施例6.3沉淀的RNA结果。“苯酚和CTAB”指根据EP1219707使用苯酚和CTAB的方法，“QIAzol无CTAB”指使用QIAzol的参照方法，其中不添加CTAB，“QIAzol和CTAB”指根据本发明所述的方法。

结果显示，根据EP1219707的方法不适用于从组织样品中分离RNA，其中所述方法使用苯酚和CTAB但不使用离液剂。

6.4.通过使用RNeasy小柱(恰根公司（Qiagen）)从含RNA的水相中分离RNA。

根据上述的6.1和6.2获得所述水相。然后根据以下方法处理所述水相：

1.用1.5倍无水乙醇与所述水相混合，然后转至RNeasy小柱（恰根公司（Qiagen））上，并以8.200xg离心15秒。然后用700μlRWT缓冲液（恰根公司（Qiagen））洗涤，然后以8.200xg离心15秒。

2.用500μlRPE缓冲液(恰根公司（Qiagen）)将上述柱子洗涤两次，以8.200xg分别离心15秒和2分钟，接着以最大速度进行1分钟的最终离心步骤。

3.通过以8.200xg离心1分钟，将被结合的RNA洗脱至30μl的无RNA酶的水中，用Nanodrop（赛默飞世尔公司（ThermoScientific））光谱测定RNA浓度，见表19。

表19：显示了根据实施例6.4分离到的RNA结果，使用了与表18中相同的参照。

6.5.测定经分离的RNA中基因组DNA的含量。

通过以下步骤进行qRT-PCR来评估根据6.3或6.4分离的RNA中基因组DNA污染物的含量：

1.将来自脾脏的RNA样品稀释至大约30ng/μl，那些来自肺的样品稀释至大约10ng/μl。

根据EP1219707使用苯酚制剂制备的RNA样品不用稀释用于后续的qRT-PCR。

2.取2μl RNA样品作为模板，在20μl的反应体积中，用10pmole引物和探针（PGK1primer混合物，PGK1探针）在使用“QuantiFast探针RT PCR预先混合物（QuantiFast Probe RT PCR master mix）”的RotoGeneQ实时PCR机器中（恰根公司（Qiagen））进行qRT-PCR。将每份样品进行数次独立的qRT-PCR反应。循环条件是：

(1)10分钟50°C

(2)5分钟95°C

(3)10秒95°C

(4)30秒60°C，重复步骤(3),(4)进行40个循环

Ct和ΔCt的平均值示于表20。

表20：比较根据实施例6.3和6.4制备RNA时共同纯化的基因组DNA，使用了与表18和表19中相同的参照。

可见，通过本发明所述方法达到了最佳结果，其致使显著降低经分离RNA中的DNA含量并增加了所分离的（纯）RNA含量。

Claims

1.一种从含RNA和DNA的样品中至少分离RNA的方法，所述方法包括：

a)向样品中加入包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物;

b)加入不溶于水的有机溶剂并分离所得相，因此形成包含水相、任选的中间相和有机相的多相混合物，其中RNA聚集于所述水相且DNA和蛋白质聚集于所述有机相和/或中间相；以及

c)从所述水相分离所述RNA，

其中在最终分离所述各相前添加至少一种阳离子去污剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种阳离子去污剂具有以下一种或多种特性：

a)包含带有永久性电荷的季铵阳离子；

b)包含溴化铵并/或

c)选自下组：CTAB、TTAB和DTRB。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述至少一种阳离子去污剂以溶液的形式添加。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶液具有一种或多种以下特性：

a)所包含的至少一种阳离子去污剂的浓度选自下组：0.1%至10%、0.1%至5%、0.1%至3%和0.1%to1%；和/或

b)包含盐，所述盐优选选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、硝酸钠、氯化锂、硫酸铵、硫酸钠、硫酸锂、硫酸钾及其组合。

5.如权利要求1至4中的任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中通过将混合物在较低温度下离心来形成多相混合物，所述温度选自下组：≤15°C的温度、≤10°C的温度、≤7C的温度、≤5°C的温度和≤4°C的温度。

6.如权利要求1至5中的任一项所述的方法，其特征在于，通过向所述水相中添加至少一种醇来分离水相中所述的RNA。

7.如权利要求1至6中的任一项所述的方法，其特征在于，将所述水相与醇混合并将所述的混合物与核酸结合固定相接触来结合RNA。

8.如权利要求1至7中的任一项所述的方法，其特征在于，所述醇选自下组：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇和/或以选自下组的浓度添加：至少20％、至少30％v/v、至少40％v/v、至少50％v/v和至少60％v/v。

9.如权利要求1至7中的任一项所述的方法，其特征在于，所述包含离液剂和苯酚的酸性变性组合物具有一种或多种以下特性：

a)所述离液剂是离液盐；

b)所述离液剂选自下组：盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠和脲；

c)所包含的离液剂的浓度选自下组：0.1至6M、0.5至4M、0.5至3M；

d)所包含的苯酚的浓度选自下组：10%v/v至70%v/v、20%v/v至60%v/v和30%v/v至50%v/v；

e)包含足够量的缓冲液以维持所述组合物在酸性pH；

f)包含增溶剂来维持苯酚于溶液中；

g)包含硫氰酸组分；并/或

h)pH低于6；优选pH≤5。

10.如权利要求1至9中的任一项所述的方法，其特征在于，所述不溶于水的有机溶剂是氯仿。

11.用于权利要求1至10中的任一项所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)含离液剂和苯酚的酸性变性组合物；

b)用于降低含RNA水相中DNA含量的溶液，其包含至少一种阳离子去污剂；

c)任选的核酸结合固相以及

d)任选的洗涤和洗脱缓冲液。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，包含权利要求9中定义的酸性变性组合物和/或具有权利要求4中b）所限定的特性的溶液。

13.一种降低含RNA水相中DNA含量的方法，形成所述含RNA水相的RNA分离方法涉及使用含离液剂和苯酚的酸性变性组合物，其中，将至少一种阳离子去污剂加入经所述酸性变性组合物匀化的样品中，之后通过添加不溶于水的有机溶剂将所得相分为水相、任选的中间相和有机相。

14.使用至少一种阳离子去污剂来降低含RNA水相中DNA含量，所述水相通过以下方法获得；

-将样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中匀化；

-添加不溶于水的有机溶剂并且

-将混合物分成水相、任选的中间相和有机相，

其中在最终分离所述各相前添加阳离子去污剂。

15.使用至少一种阳离子去污剂，通过降低含RNA水相中DNA含量，来提高中间相和/或有机中DNA含量，所述含RNA水相通过以下步骤得到：

-将样品置于含离液剂和苯酚的酸性变性组合物中匀化；

-添加不溶于水的有机溶剂并且

-将混合物分成水相、任选的中间相和有机相，

其中在最终分离所述各相前添加阳离子去污剂。