CN113151254A - 一种从绵羊毛干中提取线粒体dna的方法 - Google Patents
一种从绵羊毛干中提取线粒体dna的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151254A CN113151254A CN202110522354.2A CN202110522354A CN113151254A CN 113151254 A CN113151254 A CN 113151254A CN 202110522354 A CN202110522354 A CN 202110522354A CN 113151254 A CN113151254 A CN 113151254A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tube
- collection
- hair shaft
- qiaamp
- sheep
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004919 hair shaft Anatomy 0.000 title claims abstract description 93
- 241001494479 Pecora Species 0.000 title claims abstract description 73
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000011492 sheep wool Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 37
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 13
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 10
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000004898 kneading Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- HQQADJVZYDDRJT-UHFFFAOYSA-N ethene;prop-1-ene Chemical compound C=C.CC=C HQQADJVZYDDRJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 15
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 14
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 3
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 101150087323 COI gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法。用去离子水及无水乙醇对绵羊毛干进行洗涤与浸泡处理，待晾干后用剪刀剪碎，得到毛干碎屑样本，利用inhibitEX Buffer、蛋白酶K溶液、二硫苏糖醇溶液及Buffer AL对样品进行孵育消化，随后离心取上清液加无水乙醇溶解杂质，最后将混合液移入QIAamp收集柱中，用Buffer AW1和Buffer AW2进行洗涤，最终用Buffer ATE将DNA洗脱得到绵羊毛干线粒体DNA。本发明实现了对绵羊毛干中线粒体DNA的充分提取，浓度高杂质少，提高毛干线粒体DNA的提取效率及纯度，有利于后续鉴定及各种分子生物学实验研究等，适用性广，简单且易于操作。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域的一种线粒体DNA提取方法，具体涉及一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法。
背景技术
动物毛发由毛干和毛根两部分组成，主要成分为角蛋白，这种结构使其具有不易腐烂的特点，也因此毛发成为了考古学和法医学的常用对象之一，其中所携带的遗传物质为考古发现和法医鉴定提供了许多信息。比如，利用绵羊皮毛作为纺织纤维在我国有着悠久的历史，在诸多考古遗址中都有毛纤维纺织品文物的发现，提取其中的DNA来科学有效地鉴定纺织品文物中绵羊皮毛的种类，对追溯纺织品起源和研究人类文明具有十分重要的意义。
毛发中的DNA主要集中在毛根的毛囊细胞中，毛干部分仅含有少量线粒体DNA，因而一般利用毛发进行遗传物质提取时常选用毛根部分。虽然在从绵羊体上采集的或脱落的毛发中绝大多数都带有完整的毛囊，但在考古学和法医学鉴定中，常常会发生毛囊己经丢失或者毛根部分己经被破坏的情况，因此则需特定地针对毛干样本进行线粒体DNA的提取。但因毛干几乎所有成分都是角蛋白，从中提取遗传物质相对比较困难，但作为绵羊组织，毛干具有细胞结构，如果提取方法得当仍可以获得一定量的DNA。
现阶段市面上仍缺少专门针对绵羊毛干线粒体DNA提取和纯化的试剂盒，目前常见的毛干DNA提取方法有蛋白酶K法裂解结合酚-氯仿抽提、煮沸和冷却使细胞破裂蛋白质变性而获得DNA、纳米磁珠法等，以上方法操作复杂，样本需求量大，提取效率低，纯度低，还会存在色素干扰等问题，导致分子生物学相关研究受到限制，影响下游工作。本发明针对以上问题，结合QiaGen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒，进一步针对绵羊毛干的特点进行调整和改良，能利用少量样本得到量足且纯度较高的线粒体DNA，以支持进一步的分子生物学相关研究，并为特殊样本的线粒体DNA提取提供技术参考。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，分别从样本的前处理、消化体系和抽提方法进行了改进，旨在提高毛干线粒体DNA的回收效率和纯度、减少色素污染物对下游实验的干扰等。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)绵羊毛干的预处理：对绵羊毛干进行预处理，得到后续绵羊毛干。
(2)绵羊毛干的裂解消化：向每个装有毛干样品的EP管中加入800μl的inhibitEXBuffer试剂，涡旋1min至混合均匀，95℃加热5min，涡旋15s，接着向每个EP管中加入50μl的蛋白酶K溶液、50μl的二硫苏糖醇溶液和500μl的Buffer AL试剂，涡旋混匀，再56℃孵育至消化完全(24h以上)，获得毛干消化液；
(3)绵羊毛干线粒体DNA的抽提，获得DNA溶液提取结果。
所述(1)具体为：
称取约0.50g绵羊毛干样品，放入培养皿中，用去离子水冲洗揉搓至无明显杂质脏污后，换干净去离子水浸泡30min，后将毛干从水中取出，用滤纸吸干水分，放入新的培养皿中，加无水乙醇冲洗揉搓1遍，换新无水乙醇浸泡30min，后将毛干从无水乙醇中取出，用滤纸吸干乙醇，放入新的培养皿中；晾干后用剪刀将毛干剪成1mm左右小段，分装至1.5ml的EP管中，具体实施的每管约0.05g(因洗涤和剪碎过程中有毛干损失，大约分装6-7管)。
在所述(2)的孵育过程中，定时翻动EP管，并视情况补加蛋白酶K溶液和二硫苏糖醇溶液，二者每次补加量为10μl。具体判断是否消化完全，若没有消化完全，则进行补加。
所述步骤(2)中，蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml，二硫苏糖醇溶液浓度为2mol/L。
所述(3)具体为：
(3.1)将每一管毛干消化液离心1min析出沉淀，将上清液转移至2ml的EP管中，加600μl的无水乙醇，涡旋15s后获得混合液；
(3.2)接着取600μl混合液到QIAamp收集柱中，收集柱下装有收集管，盖上盖子，离心1min，将QIAamp收集柱从原有收集管取出，舍弃原有收集管，将QIAamp收集柱放置到新的一个收集管；
(3.3)不断重复步骤(3.2)对混合液分批依次同样处理，直到混合液的所有均被同一个QIAamp收集柱离心过滤，最终的收集管作为第一收集管，此时的第一收集管为新的收集管；
(3.4)小心打开第一收集管上的QIAamp收集柱的盖子并加500μl的Buffer AW1试剂到QIAamp收集柱的薄膜上，盖上盖子，离心1min，将QIAamp收集柱从第一收集管中取出转移到一个新的2ml的第二收集管中，舍弃第一收集管；
(3.5)小心打开QIAamp收集柱的盖子并加500μl的Buffer AW2试剂到QIAamp收集柱的薄膜上，盖上盖子，离心3min，将QIAamp收集柱从第二收集管中取出转移到一个新的2ml的第三收集管中，舍弃第二收集管；
(3.6)再将QIAamp收集柱离心3min，将QIAamp收集柱从第三收集管中取出放到一个新的1.5ml EP管中，舍弃第三收集管；
(3.7)取50μl的在56℃下加热5min的Buffer ATE试剂添加到1.5ml的EP管上的QIAamp收集柱的薄膜上，常温孵育1min，然后离心1min，从而将DNA洗脱至1.5ml的EP管中，EP管中的溶液为DNA溶液；
重复取EP管中的DNA溶液加至QIAamp收集柱中，常温孵育1min，然后离心1min，从而再次将DNA洗脱至1.5ml的新EP管中，取出1.5ml的新EP管上的QIAamp收集柱，新EP管中的溶液作为最终的DNA溶液。
QIAamp收集柱薄膜是QIAamp收集柱中的滤膜。
所述(3)中的离心条件均为14,000rpm，15-25℃。
6、根据权利要求5所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：
所述步骤(3.7)中，Buffer ATE溶液是在56℃下加热5min后加入到EP管，这样能提高洗脱效果，提高浓度。
7、根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：
所述步骤(2)和(3)中的inhibitEX Buffer试剂、Buffer AL试剂、Buffer AW1试剂、Buffer AW2试剂、Buffer ATE试剂均为QiaGen公司的QIAamp Fast DNA Stool MiniKit试剂盒中的试剂。
本发明方法通过特殊预处理绵羊毛干、优化消化体系和消化提取步骤，能够更好地，降低提纯干扰，提高DNA回收效率和纯度。
相对现有技术，本发明具有的有益效果是：
本发明提供的从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，首先将毛干用去离子水和无水乙醇多次浸泡清洗，以尽量消除毛干本身所带的污染物对DNA纯度的影响，接着将毛干预处理成碎屑，增大毛干接触消化液的面积，促进毛干消化裂解，然后采用由inhibitEXBuffer试剂、蛋白酶K溶液、二硫苏糖醇溶液、Buffer AL试剂组成的裂解液对毛干碎屑进行裂解处理，可以极大的提高消化效率，而且56℃下长时间孵育有助于让毛发中的蛋白充分水解释放出DNA。
再采用QIAamp收集柱对毛干消化液进行吸附、洗涤、洗脱处理来提取毛干的线粒体DNA，利用收集柱能够过滤和洗涤掉大量的杂质。在洗脱时将Buffer ATE试剂56℃加热5min可以有效提高DNA回收效率。
本发明可实现对绵羊毛干中线粒体DNA的充分提取，浓度高杂质少，有利于后续鉴定及各种分子生物学实验研究等，适用性广，简单且易于操作。
附图说明
图1为从实施例1中得到的绵羊线粒体DNA经特异性引物PCR扩增后的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例以及对比例对本发明作进一步说明。
实施例：
(1)绵羊毛干的预处理
称取绵羊毛干样品0.15g，放入培养皿中，用去离子水冲洗揉搓3遍，至无明显杂质脏污后，换干净去离子水浸泡30min，后将毛干从水中取出，用滤纸吸干水分，放入新的培养皿中，加无水乙醇冲洗揉搓1遍，换新无水乙醇浸泡30min，后将毛干从无水乙醇中取出，用滤纸吸干乙醇，放入新的培养皿中进一步晾干。后用剪刀将毛干剪成1mm左右小段，分装至3个1.5ml EP管中，每管约0.01g，分装后称量样品总重量为0.04g。
(2)绵羊毛干的裂解消化
向每个装有毛干样品的EP管中加入600μl的inhibitEX Buffer试剂(因样品量较少而调整了试剂添加量)，涡旋1min至混合均匀，95℃加热5min，涡旋15s，接着向每个EP管中加入20μl的蛋白酶K溶液、20μl的二硫苏糖醇溶液和600μl的Buffer AL试剂(因样品量较少而调整了各个试剂的添加量)，涡旋混匀，56℃孵育24h，期间定时翻动EP管，并补加了蛋白酶K溶液10μl。孵育结束后获得毛干消化液。
(3)绵羊毛干线粒体DNA的抽提
(3.1)将每一管毛干消化液离心(14,000rpm，15-25℃，1min)析出沉淀，将每一管上清液分别转移至2ml的EP管中，每一管分别加600μl的无水乙醇，涡旋15s后获得混合液；
(3.2)接着取600μl混合液到QIAamp收集柱中(收集柱下装有收集管)，盖上盖子，离心(14,000rpm，15-25℃，1min)，将QIAamp收集柱从原有收集管中取出，舍弃原有收集管，将QIAamp收集柱放置到新的一个收集管；
(3.3)不断重复步骤(3.2)对每一管混合液依次进行同样处理，直到混合液的所有均被同一个QIAamp收集柱离心过滤，最终的收集管作为第一收集管，此时的第一收集管为新的收集管；
(3.4)小心打开第一收集管上的QIAamp收集柱的盖子并加500μl的Buffer AW1试剂到QIAamp收集柱的薄膜上，盖上盖子，离心(14,000rpm，15-25℃，1min)，将QIAamp收集柱从第一收集管中取出放到一个新的2ml的第二收集管中，舍弃第一收集管；
(3.5)小心打开QIAamp收集柱的盖子并加500μl的Buffer AW2试剂到QIAamp收集柱的薄膜上，盖上盖子，离心(14,000rpm，15-25℃，3min)，将QIAamp收集柱从第二收集管中取出放到一个新的2ml的第三收集管中，舍弃第二收集管；
(3.6)离心QIAamp收集柱(14,000rpm，15-25℃，3min)，将QIAamp收集柱从第三收集管中取出放到一个新的1.5ml EP管中，舍弃第三收集管；
(3.7)取100μl的在56℃下加热5min的Buffer ATE试剂添加到1.5ml EP管上的QIAamp收集柱的薄膜上，常温孵育1min，然后离心(14,000rpm，15-25℃，1min)，从而将DNA洗脱至1.5ml EP管中，1.5ml EP管中的溶液作为DNA溶液。重复取1.5ml EP管中的DNA溶液加至QIAamp收集柱中，常温孵育1min，然后离心(14,000rpm，15-25℃，1min)，从而再次将DNA洗脱至1.5ml EP管中，取出1.5ml新EP管上的QIAamp收集柱，1.5ml新EP管中的溶液作为最终的DNA溶液。
(4)PCR扩增绵羊线粒体DNA片段
以所提取的绵羊毛干线粒体DNA为模板，设计引物(Forward-primer：AACCCGGAACTCTACTCGGA；Reverse-primer：ACCTGCCAGATGTAGGGAGA)扩增绵羊线粒体DNA上COⅠ基因上的一段长度为335bp的片段。结果经2％琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1，在250bp-500bp两条带之间有清晰明显的特异性条带，与预期产物相近，经双向测序并BLAST比对后确定为目的基因产物。
(5)Qubit荧光计测定实施例DNA产物浓度
测定结果显示，实施例所得的100μl DNA溶液的浓度为0.122ng/μl。
对比例：
(1)绵羊毛干的预处理
称取0.27g绵羊毛干，直接放入培养皿中，不清洗浸泡，仅作剪碎处理，分装至3个2ml EP管中。
(2)绵羊毛干的裂解消化
(2.1)在3个装有绵羊毛干样品的EP管中分别添加1ml InhibitEX Buffer试剂，涡旋1min至混合均匀。95℃加热5min，涡旋15s，得到毛干消化液3管。
(2.2)取3个1.5ml EP管分别加入15μl蛋白酶K溶液。
(2.3)将(2)所得的3管毛干消化液离心(14,000rpm，15-25℃，1min)析出沉淀。
(2.4)将(3.2)所得的上清液转移至(3.1)中含蛋白酶K的EP管中，每个EP管加200μl的Buffer AL试剂，涡旋15s，在70℃下孵育10min，再在每个EP管中分别添加200μl无水乙醇，涡旋混匀，得到三管混合液。
(3)绵羊毛干线粒体DNA的抽提
(3.1)取600μl混合液到QIAamp收集柱中(收集柱下装有收集管)，盖上盖子，离心(14,000rpm，15-25℃，1min)，将QIAamp收集柱从原有收集管中取出，舍弃原有收集管，将QIAamp收集柱放置到新的一个收集管；
(3.2)不断重复步骤(3.4)对每一管混合液依次进行同样处理，直到混合液的所有均被同一个QIAamp收集柱离心过滤，最终的收集管作为第一收集管，此时的第一收集管为新的收集管；
(3.3)小心打开第一收集管上的QIAamp收集柱的盖子并加500μl的Buffer AW1试剂到QIAamp收集柱的薄膜上，盖上盖子，离心(14,000rpm，15-25℃，1min)，将QIAamp收集柱从第一收集管中取出放到一个新的2ml的第二收集管中，舍弃第一收集管；
(3.4)小心打开QIAamp收集柱的盖子并加500μl的Buffer AW2试剂到QIAamp收集柱的薄膜上，盖上盖子，离心(14,000rpm，15-25℃，3min)，将QIAamp收集柱从第二收集管中取出放到一个新的2ml的第三收集管中，舍弃第二收集管；
(3.5)离心QIAamp收集柱(14,000rpm，15-25℃，3min)，将QIAamp收集柱从第三收集管中取出放到一个新的1.5ml EP管中，舍弃第三收集管；
(3.6)取100μl的Buffer ATE试剂添加到1.5ml EP管上的QIAamp收集柱的薄膜上，常温孵育1min，然后离心(14,000rpm，15-25℃，1min)，从而将DNA洗脱至1.5ml EP管中，取出1.5ml EP管上的QIAamp收集柱，1.5ml EP管中的溶液作为最终的DNA溶液。
(4)Qubit荧光计测定对比例DNA产物浓度
测定结果显示，对比例所得的100μl DNA溶液的浓度为0.0224ng/μl。
对比例和实施例的区别在于：
一、绵羊毛干的预处理中，对比例并未利用去离子水及无水乙醇进行洗涤和浸泡处理。
二、绵羊毛干的裂解消化中，所用试剂的种类、剂量以及消化的步骤、时间均不同。
三、绵羊毛干线粒体DNA的抽提中，对比例并未对Buffer ATE试剂进行加热处理，且并没有进行重复洗脱DNA这一步骤。
四、实施例原始样品共0.15g，提取得到0.122ng/μl的DNA溶液100μl，即得到12.2ngDNA，提取效率为81.33ng/g，即从每克原始样品中，可以提取81.33ngDNA。对比例原始样品共0.27g，提取得到0.0224ng/μl的DNA溶液100μl，即得到2.24gDNA，提取效率为8.30ng/g，即从每原始样品中，可以提取8.30ngDNA。实施例相较于对比例的提取效率有明显提高。
Claims (7)
1.一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于，方法步骤如下：
(1)绵羊毛干的预处理：
(2)绵羊毛干的裂解消化：向每个装有毛干样品的EP管中加入inhibitEX Buffer试剂，涡旋至混合均匀，加热，涡旋，接着向每个EP管中加入蛋白酶K溶液、二硫苏糖醇溶液和Buffer AL试剂，涡旋混匀，再孵育至消化完全，获得毛干消化液；
(3)绵羊毛干线粒体DNA的抽提，获得DNA溶液提取结果。
2.根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述(1)具体为：
称取绵羊毛干样品，放入培养皿中，用去离子水冲洗揉搓至无明显杂质脏污后，换干净去离子水浸泡，后将毛干从水中取出，用滤纸吸干水分，放入新的培养皿中，加无水乙醇冲洗揉搓1遍，换新无水乙醇浸泡，后将毛干从无水乙醇中取出，用滤纸吸干乙醇，放入新的培养皿中；晾干后用剪刀将毛干剪成小段，分装至EP管中。
3.根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：在所述(2)的孵育过程中，定时翻动EP管，并视情况补加蛋白酶K溶液和二硫苏糖醇溶液。
4.根据权利要求1或3所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml，二硫苏糖醇溶液浓度为2mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述(3)具体为：
(3.1)将毛干消化液离心析出沉淀，将上清液转移至EP管中，加无水乙醇，涡旋15s后获得混合液；
(3.2)接着取600μl混合液到QIAamp收集柱中，收集柱下装有收集管，盖上盖子，离心，将QIAamp收集柱从原有收集管取出，舍弃原有收集管，将QIAamp收集柱放置到新的一个收集管；
(3.3)不断重复步骤(3.2)对混合液分批依次处理，直到混合液的所有均被QIAamp收集柱离心过滤，最终的收集管作为第一收集管；
(3.4)打开第一收集管上的QIAamp收集柱的盖子并加Buffer AW1试剂，离心，将QIAamp收集柱从第一收集管中取出转移到一个新的的第二收集管中；
(3.5)打开QIAamp收集柱的盖子并加Buffer AW2试剂，离心，将QIAamp收集柱从第二收集管中取出转移到一个新的2ml的第三收集管中；
(3.6)再将QIAamp收集柱离心，将QIAamp收集柱从第三收集管中取出放到一个新的1.5ml EP管中；
(3.7)取在56℃下加热5min的Buffer ATE试剂添加到EP管上，常温孵育，然后离心，从而将DNA洗脱至EP管中，EP管中的溶液为DNA溶液；
重复取EP管中的DNA溶液加至QIAamp收集柱中，常温孵育，然后离心，从而再次将DNA洗脱至新EP管中，取出新EP管上的QIAamp收集柱，新EP管中的溶液作为最终的DNA溶液。
6.根据权利要求5所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(3.7)中，Buffer ATE溶液是在56℃下加热5min后加入到EP管。
7.根据权利要求1所述的一种从绵羊毛干中提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)和(3)中的inhibitEX Buffer试剂、Buffer AL试剂、Buffer AW1试剂、Buffer AW2试剂、Buffer ATE试剂均为QiaGen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒中的试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110522354.2A CN113151254A (zh) | 2021-05-13 | 2021-05-13 | 一种从绵羊毛干中提取线粒体dna的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110522354.2A CN113151254A (zh) | 2021-05-13 | 2021-05-13 | 一种从绵羊毛干中提取线粒体dna的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113151254A true CN113151254A (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=76874859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110522354.2A Pending CN113151254A (zh) | 2021-05-13 | 2021-05-13 | 一种从绵羊毛干中提取线粒体dna的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113151254A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154751A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-15 | 东北林业大学 | 一种高效的提取毛干中dna的方法 |
| CN113430276A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-09-24 | 浙江大学 | 一种基于coⅰ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法 |
-
2021
- 2021-05-13 CN CN202110522354.2A patent/CN113151254A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154751A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-15 | 东北林业大学 | 一种高效的提取毛干中dna的方法 |
| CN113430276A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-09-24 | 浙江大学 | 一种基于coⅰ基因鉴别绵羊毛与山羊毛的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 佚名: "《QIAGEN》", 28 February 2020 * |
| 吕雪峰等: "DNA技术在羊毛羊绒鉴别中的应用", 《安徽农业科学》 * |
| 张弘等: "指甲游离缘及毛发中核DNA抽提方法的探讨", 《中国循证儿科杂志》 * |
| 程喜平等: "毛发核酸提取和应用近况", 《岭南皮肤性病科杂志》 * |
| 蔡大伟等: "一种简便高效的古代动物毛皮DNA提取方法", 《吉林大学学报(理学版)》 * |
| 金美菊: "羊绒羊毛纤维线粒体DNA提取方法研究", 《毛纺科技》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107604003A (zh) | 一种基于线性化crispr‑cas9慢病毒载体基因敲除试剂盒及其应用 | |
| CN111154751B (zh) | 一种高效的提取毛干中dna的方法 | |
| CN108410861B (zh) | 一种皮张中古dna的提取方法及试剂盒 | |
| CN108048449B (zh) | 一种提取基因组dna的试剂盒 | |
| CN108642048A (zh) | 一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒及提取方法 | |
| CN110904098A (zh) | 一种裂解结合液及粪便磁珠法核酸提取 | |
| CN101117634A (zh) | 一种分离棉花叶绿体dna的方法 | |
| CN105063016A (zh) | 一种从黄酒麦曲中提取微生物总dna的方法 | |
| CN113151254A (zh) | 一种从绵羊毛干中提取线粒体dna的方法 | |
| CN111454939A (zh) | 一种桑树基因组dna的高效提取方法 | |
| CN111088330A (zh) | 一种neb二代建库试剂盒的使用方法和浅层测序文库的构建方法 | |
| CN107151666A (zh) | 一种水体中微生物dna的提取方法 | |
| CN114703173A (zh) | 一种λ噬菌体DNA提取试剂盒及提取方法 | |
| CN108795904B (zh) | 一种表达高酶活淀粉酶的方法 | |
| KR20180064085A (ko) | Ｐｃｒ용 ｄｎａ의 간단하고 신속한 추출방법 | |
| CN112646806A (zh) | 一种土壤dna快速提取方法及试剂盒 | |
| CN111575277A (zh) | 一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮dna的方法 | |
| CN111647589A (zh) | 大戟二烯醇合酶及其编码基因与应用 | |
| CN111961662B (zh) | 一种dna提取液以及芝麻叶片基因组dna的提取方法 | |
| CN105821033B (zh) | 一种纤维素降解菌群的宏基因组的提取方法 | |
| CN115058415B (zh) | 一种快速、高质量、通用型基因组dna提取试剂盒及dna提取方法 | |
| CN108795903B (zh) | 一种高酶活淀粉酶的表达方法 | |
| CN107988206A (zh) | 一种高效提取土壤微生物dna的方法 | |
| CN114574480B (zh) | 一种提取水体表面混合摇蚊科昆虫蜕皮总dna的方法 | |
| CN113604364B (zh) | 一种棘孢木霉菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210723 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |