CN105385735A - 鸡血抗菌肽的制备方法 - Google Patents
鸡血抗菌肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105385735A CN105385735A CN201510851151.2A CN201510851151A CN105385735A CN 105385735 A CN105385735 A CN 105385735A CN 201510851151 A CN201510851151 A CN 201510851151A CN 105385735 A CN105385735 A CN 105385735A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chicken blood
- antibacterial peptide
- antimicrobial peptide
- preparation
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了鸡血抗菌肽的制备方法。该方法包括如下步骤：(1)取鸡血，进行血细胞破碎后加入菠萝蛋白酶进行酶解；(2)向酶解液中加入乙酸浸提，离心取上清，调节pH至6.0±0.5，获得鸡血抗菌肽粗提物；(3)鸡血抗菌肽粗提物纯化；(4)冷冻干燥。实验证明，利用本发明的方法从鸡血中提取的抗菌肽对大肠杆菌、嗜水气单胞菌、绿脓杆菌等常见的致病菌有明显的抑制作用。本发明为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。本发明方法具有操作方便快捷、设备简单、分离提取率高、成本低的优点，可应用于大规模地从新鲜鸡血中分离纯化抗菌肽的生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及鸡血抗菌肽的制备方法。
背景技术
抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类分子量在4KD左右，具有抗菌活性的碱性多肽物质。迄今为止，在不同动物组织中已发现了很多具有抗菌作用的蛋白质和多肽，已有70多种抗菌多肽的结构被测定，抗菌肽的概念得到了极大的扩展。
抗菌肽是生物体内诱导表达具有广谱抗菌活性的小分子多肽。这些多肽是生物体
非专一性的免疫应答产物，是生物体内免疫系统的重要成分。国内外关于鸡源抗菌肽的研究，主要针对鸡小肠中的抗菌肽，而血中抗菌肽的提取及抗菌活性研究在国内外却很少有报道。目前，我国鸡的饲养量很大，屠宰鸡的下脚料鸡血很多，对其进行抗菌肽的提取和研究，是对资源的利用和再开发，是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供鸡血抗菌肽的制备方法，其制备方法条件温和、无污染、效率高。为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案：
鸡血抗菌肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)取鸡血，进行血细胞破碎(目的是释放血红蛋白)后加入菠萝蛋白酶进行酶解；
(2)向酶解液中加入乙酸浸提，离心取上清，调节pH至6.0±0.5(如6.0)，获得鸡血抗菌肽粗提物；
(3)将所述鸡血抗菌肽粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰；
(4)将步骤(3)收集的具有抗菌活性的洗脱峰上样于SephadexG-25凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，获得鸡血抗菌肽溶液；
(5)将步骤(4)收集的鸡血抗菌溶液冷冻干燥。
在所述方法的步骤(1)中，所述菠萝蛋白酶与所述鸡血的配比可为750-35000U：100ml(如1750-3500U：100ml，具体如3500U:100mL)；所述酶解的温度可为70～90℃(如70℃)，时间可为4～6h(如4h)。另外，在本发明中，所述进行血细胞破碎具体通过采用组织捣碎机搅拌所述鸡血实现的。
在本发明中，所述菠萝蛋白酶的酶活为3500U/mg。相应的，所述菠萝蛋白酶与所述鸡血的配比可为0.5-10mg：100ml(如0.5-1mg：100ml，具体如1mg:100mL)。
在所述方法的步骤(2)中，所述向酶解液中加入乙酸具体可为：向所述酶解液中加入等体积的5％(体积百分含量)的乙酸水溶液；所述浸提具体可为：4～37℃(如4℃～10℃，再如4℃)震荡16-20h(如16h)；所述离心为：6600g-10000g(如10000g)4～10℃(如4℃)离心20min～30min(如20min)。
在所述方法的步骤(3)中，所述洗脱液具体可为：pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm2·h。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)的洗脱过程中共产生两个洗脱峰，所述具有抗菌活性的洗脱峰实际为第二个洗脱峰。所述抗菌活性具体体现为抗如下细菌中的至少一种：大肠杆菌(如ACTT25922)、绿脓杆菌(如ACTT27853)、嗜水气单胞菌(GenebankIDSequenceID:gb|KJ156374.1|)。
在所述方法的步骤(4)中，所述洗脱液具体可为：pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；所述洗脱的速度具体可为10.0mL/cm2·h。
在本发明的一个实施例中，步骤(4)的洗脱过程中只产生一个洗脱峰，该洗脱峰即为纯化后的鸡血抗菌肽样品。
在所述方法的步骤(3)中，SephadexG-100凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言，本发明中所采用的SephadexG-100凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0061-02)。所述上样的上样量为10ml；所述洗脱的洗脱体积为1-1.5L。
在所述方法的步骤(4)中，SephadexG-25凝胶柱的柱长度和柱内径比为8:1。具体而言，本发明中所采用的SephadexG-25凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0033-1。所述上样的上样量为10ml；所述洗脱的洗脱体积为1-1.5L。
在上述方法中，所述鸡血即可为新鲜的鸡血，也可以为经冷冻后融化的鸡血。
利用如上所述方法提取得到的鸡血抗菌肽也属于本发明的保护范围。
具体而言，本发明具有以下优点：
1、本发明方法实现了从鸡血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。
2、采用本发明方法提取的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌、抗病毒、促生长和调节免疫等广泛而稳定的功能特点。
3、与同类方法相比，本发明方法操作方便，设备简单，提取周期短，而且分离提取率高。
4、本发明所开发产品的原料来源丰富，生产成本低，可以使鸡血得到高值化利用。因此本发明的应用不仅可以带来良好的经济效益，而且还具有良好的生态效益，进而还具有重要的公共卫生学意义，符合构建节约环保型社会的理念。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、从鸡屠宰场收集新鲜鸡血，组织捣碎机搅拌均匀(同样可以将采集的鸡血冷冻待用时融化后再按上步骤进行)，此步骤的目的是破碎血细胞，释放血红蛋白，冻融之后效果更佳。
2、向步骤1处理过的鸡血中加入菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶与鸡血的配比为1mg木瓜蛋白酶/100ml鸡血原液，混匀，在70℃条件下酶解4h，以得到酶解液。
3、向步骤2的酶解液加入等体积的5％乙酸(体积百分含量，溶剂为水)，4℃震荡浸提16h，8000r/min(相当于10000g)4℃离心20min，留取上清，调其pH值至6.0，即为鸡血抗菌肽的粗提物。
4、4℃下将鸡血抗菌肽粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱(柱长与内径比为
8:1，SephadexG-100凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0061-02)进行层析，上样量为10ml，洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液，洗脱的速度为10.0mL/cm2·h，洗脱体积为1L。核酸蛋白检测仪检测，自动收集器收集后，记录仪记录。
鸡血粗提物经SephadexG-100凝胶柱层析后出现2个洗脱峰。将洗脱峰各收集管的组分取20μL进行抑菌试验。采用琼脂糖弥散方法(检测菌在琼脂平板上
的终浓度为106CFU/ml)对收集的洗脱液进行检测，检测收集液对大肠杆菌ACTT25922株的抗菌作用，以等体积的20000IU的青链霉素溶液替代抗菌肽作为阳性对照，以及以等体积的0.2mol/L的醋酸钠洗脱液替代抗菌肽作为阴性对照。收集具有抑菌作用的洗脱液。
5、将步骤4获得的有效的抗菌肽(合并的具有抑菌作用的洗脱液，即经SephadexG-100凝胶柱层析后收集的第9-16管)浓缩之后进一步用SephadexG-25凝胶柱(柱长与内径比为8:1，本发明中所采用的SephadexG-25凝胶柱为Pharmacia公司产品，其产品目录号为17-0033-1)进行层析，上样量为10ml，洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液，洗脱的速度为10.0mL/cm2·h，洗脱体积为1L。核酸蛋白检测仪检测，自动收集器收集后，记录仪记录。收集具有抑菌作用的洗脱液，将其置于-20℃条件下保存。
6、将步骤5获得的有效的抗菌肽溶液冷冻干燥。
实施例1获得的鸡血抗菌肽的抗菌试验
采用琼脂糖弥散法，对实施例1从鸡血中提取的鸡血抗菌肽进行抗菌活性检测，测定抑菌圈直径大小，具体操作同实施例1步骤4中相关描述。供试细菌有：大肠杆菌ACTT25922、绿脓杆菌ACTT27853株、嗜水气单胞菌(GenebankIDSequenceID:gb|KJ156374.1|)。针对每个供试细菌均同时以等体积的20000IU的青链霉素溶液替代抗菌肽，以及以等体积的0.2mol/L的醋酸钠洗脱液替代抗菌肽的阴性对照。
实验重复三次，结果取平均值。
结果表明，实施例1从鸡血中提取的鸡血抗菌肽对各供试菌株均有明显的抑制作用，而阴性对照均无抗菌活性。
Claims (5)
1.鸡血抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)取鸡血，进行血细胞破碎后加入菠萝蛋白酶进行酶解；
(2)向酶解液中加入乙酸浸提，离心取上清，调节pH至6.0±0.5，获得鸡血抗菌肽的粗提物；
(3)将所述鸡血抗菌肽的粗提物上样于SephadexG-100凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集具有抗菌活性的洗脱峰；
(4)将步骤(3)收集的具有抗菌活性的洗脱峰上样于SephadexG-25凝胶柱，采用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，获得所述鸡血抗菌肽溶液；
(5)将步骤(4)收集的鸡血抗菌肽溶液冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的鸡血抗菌肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述菠萝蛋白酶与所述鸡血的质量配比为1750-35000U：100ml；和/或步骤(1)中，所述酶解的温度为70～90℃，时间为4～6h。
3.根据根据权利要求1所述的鸡血抗菌肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述向酶解液中加入乙酸为：向所述酶解液中加入等体积的体积百分含量为5％的乙酸水溶液；和/或步骤(2)中，所述浸提为4～37℃震荡16-20h；和/或步骤(2)中，所述离心为6600～10000g4℃离心20～30min。
4.根据根据权利要求1中所述的鸡血抗菌肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；和/或所述洗脱的速度为10.0mL/cm2·h。
5.根据权利要求1中所述的鸡血抗菌肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述洗脱液为pH为6.0的浓度为0.2mol/L的乙酸钠水溶液；和/或所述洗脱的速度为10.0mL/cm2·h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510851151.2A CN105385735A (zh) | 2015-11-25 | 2015-11-25 | 鸡血抗菌肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510851151.2A CN105385735A (zh) | 2015-11-25 | 2015-11-25 | 鸡血抗菌肽的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105385735A true CN105385735A (zh) | 2016-03-09 |
Family
ID=55418512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510851151.2A Pending CN105385735A (zh) | 2015-11-25 | 2015-11-25 | 鸡血抗菌肽的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105385735A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148463A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-11-23 | 柳州市柳南区安顺养殖协会 | 一种驼牛血抗菌肽的制备方法 |
| CN106148464A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-11-23 | 柳州市柳南区安顺养殖协会 | 一种新疆褐牛血抗菌肽的制备方法 |
| WO2022058962A1 (en) * | 2020-09-17 | 2022-03-24 | Universidade Católica Portuguesa - Ucp | New hydrolysates to control infections, methods and uses thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101353686A (zh) * | 2008-09-09 | 2009-01-28 | 浙江大学 | 血红素和脱色血球蛋白粉的生产方法 |
| CN103858971A (zh) * | 2014-04-01 | 2014-06-18 | 四川省石棉县田湾河野生资源开发有限公司 | 一种水解鸡血蛋白-肉味苏打饼干及其制作方法 |
| CN104164467A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-26 | 中国农业大学 | 一种从鸡血中提取抗菌肽的方法 |
| CN105249124A (zh) * | 2015-09-08 | 2016-01-20 | 浙江海洋学院 | 金枪鱼血抗疲劳冲剂及其制备方法 |
-
2015
- 2015-11-25 CN CN201510851151.2A patent/CN105385735A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101353686A (zh) * | 2008-09-09 | 2009-01-28 | 浙江大学 | 血红素和脱色血球蛋白粉的生产方法 |
| CN103858971A (zh) * | 2014-04-01 | 2014-06-18 | 四川省石棉县田湾河野生资源开发有限公司 | 一种水解鸡血蛋白-肉味苏打饼干及其制作方法 |
| CN104164467A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-26 | 中国农业大学 | 一种从鸡血中提取抗菌肽的方法 |
| CN105249124A (zh) * | 2015-09-08 | 2016-01-20 | 浙江海洋学院 | 金枪鱼血抗疲劳冲剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张艳梅等: "猪血中抗菌肽类物质的分离纯化和抗菌活性研究", 《科技导报》 * |
| 潘晓倩等: "响应面法优化猪血红蛋白抗菌肽的制备工艺", 《肉类研究》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148463A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-11-23 | 柳州市柳南区安顺养殖协会 | 一种驼牛血抗菌肽的制备方法 |
| CN106148464A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-11-23 | 柳州市柳南区安顺养殖协会 | 一种新疆褐牛血抗菌肽的制备方法 |
| WO2022058962A1 (en) * | 2020-09-17 | 2022-03-24 | Universidade Católica Portuguesa - Ucp | New hydrolysates to control infections, methods and uses thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101294188B (zh) | 乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途 | |
| CN102618614B (zh) | 一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法 | |
| CN105154508A (zh) | 一种抗菌肽的制备方法 | |
| CN105385735A (zh) | 鸡血抗菌肽的制备方法 | |
| CN105254740A (zh) | 一种生物活性多肽nqfyqkf及其制备与应用 | |
| CN104480092A (zh) | 一种从刀豆中提取尿素酶的方法 | |
| CN109468357A (zh) | 一种脾氨肽的制备方法 | |
| JP2014504160A (ja) | ナマコの腸の自己消化による活物質の製造方法 | |
| CN104212862A (zh) | 一种林蛙蛋白和骨钙的提取方法 | |
| CN101412993A (zh) | 一种纳豆激酶固体发酵方法 | |
| CN104164467B (zh) | 一种从鸡血中提取抗菌肽的方法 | |
| CN104311645A (zh) | 具有抑菌活性的螺旋藻多肽p1及其应用 | |
| CN100425624C (zh) | 一种同步提取肝素钠和猪肠粘膜抗菌肽的方法 | |
| CN103656607A (zh) | 一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中的脑蛋白水解物及其制备方法 | |
| CN105255861B (zh) | 直接提取牛奶中3种致病菌dna的方法及试剂盒 | |
| CN103130869A (zh) | 超声波辅助黄粉虫幼虫蛋白酶解制备的降血压肽及制备方法 | |
| CN102839162A (zh) | 一种碱性磷酸酶的制取方法 | |
| CN104387459A (zh) | 一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法 | |
| CN105254739A (zh) | 一种生物活性多肽gtqytd及其制备与应用 | |
| CN101773522B (zh) | 一种动物肠黏膜提取物及其制备方法与应用 | |
| CN102816226A (zh) | 一种猪小肠抗菌肽pr39的制备方法 | |
| CN105200107B (zh) | 瘤背石磺肌肉粗蛋白的提取方法 | |
| CN113604508A (zh) | 一种饲用牡丹籽粕的发酵改良方法及其发酵产物和应用 | |
| CN105061575B (zh) | 一种金枪鱼肝脏抗菌肽及其制备方法和用途 | |
| CN100453641C (zh) | 利用罗非鱼内脏提取sod酶的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160309 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |