CN105061575B - 一种金枪鱼肝脏抗菌肽及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金枪鱼肝脏抗菌肽及其制备方法，该抗菌肽的氨基酸序列为Thr‑Gln‑Ala‑Ala‑Phe‑Gln‑Lys‑Phe‑Leu‑Ala‑Val‑Ala‑Thr‑Ser‑Gln‑Leu‑Gly‑Lys‑Gln‑Tyr‑His‑Tyr‑Trp，MALDI‑TOF‑MS检测分子量为2686.66 Da。制备时以金枪鱼肝脏作为原料，经肝脏预处理、粗蛋白抽提、酶解、超滤和色谱制备，得抗菌肽。该抗菌肽对革兰氏阴性菌（G‑）和革兰氏阳性菌（G+）均有抑制作用，具有广谱抑菌性，可用于制备抗菌药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种金枪鱼肝脏抗菌肽，本发明还涉及该抗菌肽的制备方法。
背景技术
抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是广泛分布于细菌、病毒和各种动植物体内一类具有抗菌活性的多肽类物质，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。目前，抗菌肽来源主要有：从生物体中直接提取、化学合成、基因工程和酶解法。食物源蛋白为原料酶解制备抗菌肽的研究，主要集中在乳源蛋白方面，而以其他食源蛋白为原料，通过酶解方式获得具有抗菌活性的多肽的研究报道相对较少。
金枪鱼是世界远洋渔业的重要作业鱼种之一，据国际粮农组织（FAO）渔业统计年鉴的数据，近5 年大洋金枪鱼世界年产量均在650 万吨以上，在金枪鱼加工过程中产生约占总重量8%的肝脏，未被有效利用，既浪费了海洋资源，也对生态环境产生了巨大压力。基于此，申请人以金枪鱼肝脏为原料，利用酶解技术制备抗菌肽，既增加了金枪鱼资源的利用率，也为海洋抗菌药物的开发提供候选药物。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种金枪鱼肝脏抗菌肽，该抗菌肽对革兰氏阴性菌（G-） 和革兰氏阳性菌（G+）均有抑菌作用。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种金枪鱼肝脏抗菌肽的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼肝脏抗菌肽，其特征在于该抗菌肽的氨基酸序列为Thr-Gln-Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-Val- Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly-Lys-Gln-Tyr-His-Tyr-Trp（TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW），MALDI-TOF-MS检测分子量为2686.66 Da。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼肝脏抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）金枪鱼肝脏的预处理：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼中取出后，按照固液比1 g：3～5mL加入沸腾的乙酸溶液（1%）中5～8 min，然后用高速组织捣碎机匀浆。
2）金枪鱼肝脏粗蛋白的提取：将匀浆加热至20～30℃，在功率为200～300W, 频率为50～80kHz 超声波发生器内超声提取30～45 min，9 000 r/min离心15～25 min，取上清液，冷冻干燥，得金枪鱼肝脏粗蛋白。
3）金枪鱼肝脏粗蛋白的酶解：将金枪鱼肝脏粗蛋白按照固液比1 g：3～5mL加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.5～7.5），按照肝脏粗蛋白质量的1.5～2.5%加入蛋白酶，于温度55～65℃下酶解2～4 h，得酶解产物。
4）金枪鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物依次经超滤和层析，得到金枪鱼肝脏抗菌肽。
作为优选，所述步骤3）中的蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥2.0×104 U/g。
再改进，所述步骤4）的超滤和层析的具体过程为：
超滤：将金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物采用5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5 kDa部分，得超滤酶解液；
大孔树脂纯化：将得到的超滤酶解液制成浓度为10～20 mg/mL溶液，以3～5 mL/min加入到大孔树脂层析柱，然后用60%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得大孔树脂精制多肽。
凝胶层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为10～20 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌（Escherichia coli）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）抑制率最高组分为凝胶层析酶解物。
高效液相色谱制备：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据对大肠杆菌（Escherichia coli）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）抑制率得1个高活性抗菌肽TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW。
优选，所述大孔树脂为AB-8。再优选，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述RP-HPLC条件为：进样量20～25 μL；色谱柱为Zorbax C18；流动相：40%乙腈；洗脱速度0.8～1.0 mL/min；紫外检测波长215 nm。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）以金枪鱼肝脏为原料，提高了金枪鱼资源的利用率，减少了环境污染。
（2）制备的抗菌肽（TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW）对革兰氏阴性菌（G-）（大肠杆菌（Escherichia coli）、荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa））和革兰氏阳性菌（G+）（金黄色葡萄球（Staphylococcus aureus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea））均有抑菌作用。
（3）以食物源蛋白酶解所得的抗菌肽具有安全性高、来源丰富的优点，应用前景广阔。
附图说明
图1 是本发明大孔树脂精制多肽的葡聚糖凝胶G-25层析图；
图2 是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的反相高效液相色谱（RP-HPLC）图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种金枪鱼肝脏抗菌肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼肝脏预处理"蛋白抽提"酶解"超滤"大孔树脂精制"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"抗菌肽。
实施例：
1）金枪鱼肝脏的预处理：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼中取出后，按照固液比1 g：4mL加入沸腾的乙酸溶液（1%）中5 min，然后用高速组织捣碎机匀浆。本实施例采用的金枪鱼优选鲣鱼。
2）金枪鱼肝脏粗蛋白的提取：将匀浆加热至25℃，在功率为300W, 频率为60kHz超声波发生器内超声提取45 min，9 000 r/min离心20 min，取上清液，冷冻干燥，得金枪鱼肝脏粗蛋白；
3）金枪鱼肝脏粗蛋白的酶解：将金枪鱼肝脏粗蛋白按照固液比1 g：4mL加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH7.0），按照肝脏粗蛋白质量的2.5%加入中性蛋白酶，于温度60℃下酶解3 h，得酶解产物；
4）金枪鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物依次经超滤和层析，得到金枪鱼肝脏抗菌肽。
①超滤：将金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物采用5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5 kDa部分，得超滤酶解液；
②AB-8大孔树脂纯化：将得到的超滤酶解液制成浓度为15 mg/mL溶液，以3 mL/min加入到大孔树脂层析柱，然后用60%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得大孔树脂精制多肽。
③葡聚糖凝胶G-25层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌（Escherichia coli）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）抑制率最高组分为凝胶层析酶解物（F3）。
④高效液相色谱制备：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化（RP-HPLC条件：进样量20 μL；色谱柱为ZorbaxC18；流动相：40%乙腈；洗脱速度0.8 mL/min；紫外检测波长215 nm），根据对大肠杆菌（Escherichia coli）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）抑制率得1个高活性抗菌肽。
⑤结构测定：高活性抗菌肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Thr-Gln-Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly-Lys-Gln-Tyr-His-Tyr-Trp，MALDI-TOF-MS检测分子量为2686.66 Da。
表1抗菌肽（TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW）的抑菌谱（n ＝ 3）
| 实验用菌 | 抑菌圈直径（mm） |
| 革兰氏阴性菌（G<sup>-</sup>） | |
| 大肠杆菌（<i>Escherichia coli</i>） | 18.61±1.28 |
| 荧光假单孢菌（<i>Pseudomonas fluorescens</i>） | 16.75±1.17 |
| 绿脓杆菌（<i>Pseudomonas aeruginosa</i>） | 15.37±1.18 |
| 革兰氏阳性菌（G<sup>+</sup>） | |
| 金黄色葡萄球（<i>Staphylococcus aureus</i>） | 14.63±1.13 |
| 巨大芽孢杆菌（<i>Bacillus megaterium</i>） | 13.74±1.38 |
| 藤黄八叠球菌（<i>Sarcina lutea）</i>） | 15.16±0.75 |
注：灭菌打孔器（ 直径=4mm） 打孔，每孔加入抗菌液20 μL；表中数据为抑菌圈直径平均值±标准差（n=3）。
⑥抑菌活性测定：如表1所示：抗菌肽对革兰氏阴性菌（G-）（大肠杆菌（Escherichia coli）、荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa））和革兰氏阳性菌（G+）（金黄色葡萄球（Staphylococcus aureus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea））均有抑菌作用，具有广谱抑菌性，其中对G-菌抑菌效果总体强于G+菌。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江海洋学院
<120> 一种金枪鱼肝脏抗菌肽及其制备方法和用途
<130> 2015-wb-1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Thr Gln Ala Ala Phe Gln Lys Phe Leu Ala Val Ala Thr Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gly Lys Gln Tyr His Tyr Trp
20
Claims (1)
1.一种金枪鱼肝脏抗菌肽，其特征在于该金枪鱼肝脏抗菌肽的氨基酸序列为Thr-Gln-Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly-Lys-Gln-Tyr-His-Tyr-Trp；所述的金枪鱼肝脏抗菌肽MALDI-TOF-MS检测分子量为2686.66Da。
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