CN101773522B

CN101773522B - 一种动物肠黏膜提取物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101773522B
Application number: CN2010101176826A
Authority: CN
Inventors: 周志刚; 赵旭民; 姚斌; 刘玉春; 张宇婷; 何夙旭; 曹雅男; 石鹏君
Original assignee: Feed Research Institute Caas; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute Caas; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-03-03
Filing date: 2010-03-03
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2030-03-03
Also published as: CN101773522A

Abstract

本发明公开了一种动物肠黏膜提取物及其制备方法与应用。该动物肠黏膜提取物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)取离体动物小肠，刮取肠壁黏膜层，离心，收集沉淀；2)将所述沉淀加入水中，然后向重蒸水中加入胰蛋白酶，进行酶解I，酶解结束后，灭酶、冷却；接着再向重蒸水中加入木瓜蛋白酶，进行酶解II，酶解结束后，灭酶、冷却；最后离心取上清液，得到肠黏膜酶解液；3)向肠黏膜酶解液中加入质量浓度为5％-10％的乙酸溶液，搅拌浸提，然后将浸提液离心，收集上清液；将所述上清液的pH值调节到6.0-7.0，冷冻干燥，得到动物肠黏膜提取物。试验证明，该肠黏膜提取物对细菌(如大肠杆菌)具有抗菌活性。

Description

一种动物肠黏膜提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种动物肠黏膜提取物及其制备方法与应用。

背景技术

我国是肠衣及肝素生产和出口大国，肠衣及肝素加工所用肠主要源于猪肠、羊肠等动物消化道组织，肠衣加工工艺分为传统手工刮取及酶解，由于手工刮取费时费力、效率低下，并且无法利用肝素，目前逐渐被淘汰，而酶解法加工过程中的废水排放量极大，废水中氮含量丰富，化学耗氧量(COD值)高，不宜直接排放。因此开发一种新的酶解工艺以提高排放废物利用价值具有重要的意义。

抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)是生物体内存在的一种具有抗菌活性的小分子多肽，与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统。由于其抗菌谱广，能杀死抗生素耐药菌株，且其杀菌机制使病原菌不易产生耐药性突变，因此抗菌肽有望开发成为新一代抗细菌、真菌、病毒和抗癌的药物。由于其应用前景广阔，已成为生命科学领域一个研究热点，研究主要集中在抗菌肽的分离与提纯、基因工程克隆与表达抗菌肽基因等方面。目前已有大量利用基因工程技术在微生物中直接表达抗菌肽基因的研究，但由于抗菌肽对宿主菌有很强的杀伤力而不能获得表达产物；这就需要以融合蛋白的形式表达抗菌肽基因，但存在表达效率低等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物肠黏膜提取物(抗菌肽)及其制备方法。

本发明所提供的动物肠黏膜提取物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)取离体动物小肠，刮取肠壁的黏膜层，离心，收集沉淀；其中，所述动物小肠为除人外的动物小肠，如猪小肠、羊小肠；

2)将步骤1)得到的沉淀加入水中，然后向所述水中加入胰蛋白酶，进行酶解I，酶解结束后，灭酶、冷却；接着再向所述水中加入木瓜蛋白酶，进行酶解II，酶解结束后，灭酶、冷却；最后离心取上清液，得到肠黏膜酶解液；

3)向所述肠黏膜酶解液中加入质量浓度5％-10％的乙酸溶液，搅拌浸提，然后将浸提液离心，收集沉淀和上清液；

4)将所述上清液的pH值调节到6.0-7.0，冷冻干燥，得到动物肠黏膜提取物。

其中，步骤2)中所述胰蛋白酶的加入量可为3000-4000U/g沉淀，所述木瓜蛋白酶的加入量可为3000-5000U/g沉淀。

步骤2)中所述酶解I的条件如下：酶解温度37-40℃，酶解时间3-6h，酶解pH值为6.5-7.5；所述酶解II的条件如下：酶解温度37-40℃，酶解时间3-6h，酶解pH值为6.5-7.5。

步骤2)中所述沉淀与水的质量比可为1∶5-1∶10；步骤2)中所述灭酶的条件为沸水浴灭酶5-10min；步骤2)中所述离心的条件为10000-12000g离心12-15min。

步骤3)中所述乙酸溶液的加入量为所述肠黏膜酶解液体积的1-2倍，优选为1倍；所述搅拌浸提的温度为4-10℃，优选为4℃，时间为12-24h，优选为12h；

上述步骤3)中所述离心的条件均为：10000-12000g离心10-15min。

为了进一步提高回收率，还可按照步骤3)的方法对步骤3)收集的沉淀进行一次或多次浸提，具体方法如下：向步骤3)离心收集的沉淀中加入质量浓度为5％-10％的乙酸溶液，搅拌浸提，然后将浸提液离心，收集沉淀和上清液；将所述上清液与步骤3)收集的上清液合并。

为了提高所制备的动物肠黏膜提取物的纯度，上述方法还包括下述纯化的步骤：

a)将步骤4)得到的动物肠黏膜提取物溶于双蒸水，用截留分子量为10KD的超滤管超滤，收集超滤液；

b)将超滤液利用SephadexG-100层析柱进行纯化，收集具有抑菌作用的洗脱液，冷冻干燥，得到纯化的动物肠黏膜提取物。

上述SephadexG-100柱层析的洗脱液可为0.2M、pH7.0的乙酸钠溶液；洗脱液的流速可为1-1.5mL/min。

本发明的另一个目的是提供动物肠黏膜提取物的用途。

本发明所提供的动物肠黏膜提取物的用途是动物肠黏膜提取物在制备抗菌药物中的应用。

以本发明所提供的动物肠黏膜提取物为活性成分制备的抗菌药物也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种动物肠黏膜提取物及其制备方法。试验证明，该肠黏膜提取物对细菌(如大肠杆菌)具有抗菌活性。本发明的方法适用于肠衣-肝素加工工艺改进，可利用该方法从肠衣-肝素加工废水中提取制备动物肠黏膜提取物(饲用抗菌肽)。肠衣-肝素加工首先是用物理的方法刮去动物肠衣以外的其它成分，得到肠衣；再加入胰蛋白酶处理从肠衣上剥下的成分，控制酶解的温度和时间，加入吸附树脂进行吸附，回收树脂，从回收的树脂中提取肝素钠；经过上述步骤处理后得到的废水中含有大量蛋白质，其中也包括具有抑菌作用的抗菌肽成分。但是由于蛋白酶对底物的作用有高度的专一性，采用单酶解时只能对几个固定的氨基酸位点进行水解，使得水解效率不高，抗菌肽的回收效率降低。采用多种酶同时降解又会导致多种蛋白酶之间互为底物且相互水解，降低酶活性，进而影响降解的效率，增加成本。利用本发明的方法可以避免以上缺点，且该方法工艺简单，既能提高产业附加值，又可减轻环境污染。

附图说明

图1为猪肠道粘膜抗菌肽粗提物经SephadexG-100凝胶柱的层析洗脱曲线图。

图2为实施例2中制备的牛血清蛋白的标准曲线图。

图3为不同处理方法获得的猪肠道粘膜抗菌肽粗提物对大肠杆菌的抑菌试验效果图。

图4为纯化的猪肠黏膜提取物与粗提物的抑菌试验效果对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、两步酶法制备猪肠黏膜提取物

1)50ml离心管(15.5g)取样称重(25.4g)，样品为剥取的小肠内壁经离心后的沉淀，去除了样品中水分，样品重为9.9g。

2)向上述离心管中加入50ml水，然后向所述水中加入3.6g(3000-4000U)胰蛋白酶(Sigma，T1426)，37℃水浴pH值为7.0-7.5条件下酶解6h，沸水浴灭酶5min，冷却；接着再向所述重蒸水中加入0.8g(3000-5000U)木瓜蛋白酶(Sigma，P3250)，37℃水浴pH值为6.5-7.5条件下酶解6h，沸水浴灭酶10min，冷却；最后以10,000g的转速离心15min收集上清液，得到肠黏膜酶解液。

3)向所述肠黏膜酶解液中加入等体积质量浓度为5％的乙酸溶液，4℃搅拌浸提过夜，将浸提液以10,000g离心15min，收集上清液；将沉淀悬起加入等体积质量浓度为5％的乙酸溶液，在4℃搅拌浸提过夜，将浸提液以10,000g离心15min，收集上清液；合并两次上清液并进行冷冻干燥，得猪肠黏膜提取物。

采用紫外分光光度法测定蛋白回收率。上述步骤1)到步骤2)的蛋白回收率为82.7％；步骤3)的蛋白回收率为38.37％。

对比例1、其它方法制备猪肠黏膜提取物

50ml离心管取样称重，样品为剥取的小肠内壁经离心后的沉淀，去除了样品中水分；向离心管中加入50ml水，按照下述不同方法进行处理。

表1

将上述方法处理后的样品，沸水浴煮沸10min，冷却；最后以10,000g的转速离心15min收集上清液，得到肠黏膜酶解液。

向所述肠黏膜酶解液中加入等体积质量浓度为5％的乙酸溶液，4℃搅拌浸提过夜，将浸提液以10,000g离心15min，收集上清液；将沉淀悬起加入等体积质量浓度为5％的乙酸溶液，在4℃搅拌浸提过夜，将浸提液以10,000g离心15min，收集上清液；合并两次上清液，将上述蛋白溶液分别进行冷冻干燥，得到对比例1、对比例2、对比例3三种处理的猪肠黏膜提取物。

蛋白回收率测定：

将对比例1、对比例2、对比例3、实施例1得到的猪肠黏膜粗提物各0.87g、0.61g、0.16g、0.76g，分别溶于26ml水中。

所得样品溶液的体积如下：1(对比例1).26ml；2(对比例2).24.5ml；3(对比例3).23ml；4(实施例1).26ml。

标准曲线的绘制：以各管相应标准牛血清白蛋白含量(mg)为横坐标、A₅₉₅为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。

所得标准曲线方程如下：y＝15.132x+0.0199，R²＝0.996(y：ΔOD；x：mg)

测定样品量为20ul，其结果为20ul中的蛋白含量，结果见表2。

表2蛋白浓度测定结果

由表2结果可知，实施例1、对比例1、对比例2、对比例3得到的猪肠黏膜提取物经冷冻干燥浓缩、溶解后的蛋白浓度，即肠黏膜粗提取物的蛋白浓度。

实施例3、抗菌活性测定

采用琼脂糖弥散法进行抗菌试验，具体方法如下：

在培养皿上倾倒一层底层琼脂(10ml)。底层琼脂含1％琼脂糖，0.022％营养肉汤粉，10mmol/L PBS(pH7.4)，及对数生长期的大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)(1.0×10⁶/ml)。在底层琼脂上打直径3mm的圆孔，(根据表2结果，即根据蛋白浓度的比例计算每孔加入粗提物的体积，以保证每孔加入的蛋白量一致)分别取出4.4μl，6μl，20μl，5.4μl，加水补齐至20μl，每孔加入20μl稀释后的实施例2中测定蛋白回收率的样品溶液。37℃孵育3h后，在底层琼脂上覆盖一层2×营养琼脂，37℃继续孵育过夜，观察测量抗菌环的直径，结果见图3，图3中1号为对比例1样品，2号为对比例2样品，3号为对比例3样品，4号为实施例1样品。

由图3可知，对比例1、对比例2样品没有抗菌环出现；对比例3、实施例1样品有抗菌环出现，其中，对比例3样品的抑菌圈直径约8mm；实施例1样品的抑菌圈直径约9mm；但是由实施例2可知，实施例1样品的蛋白回收率是对比例3的3.7倍，所以实施例1得到的产品中具有抑菌活性的物质含量较高且抑菌效果好。

实施例4、猪肠黏膜提取物的纯化及抑菌活性测定

将实施例1制备的猪肠黏膜粗提物溶于双蒸水，用截留分子量为10KD的超滤管超滤，收集超滤液。将所述超滤液上样于SephadexG-100凝胶过滤柱(Ф1.0x30.0cm)。用0.2M，pH7.0乙酸钠以流速1mL/min进行洗脱，每管收集3mL，共收集20管。

以层析流出液的体积为横座标，以相应的A_595nm值为纵座标，作出洗脱曲线图，见图1。用琼脂糖弥散法检测洗脱液的抗菌活性，图1中箭头所指洗脱峰具有抗菌活性。

将具有抑菌作用的洗脱液进行合并，冷冻干燥，得到纯化的猪肠黏膜提取物。将纯化的猪肠黏膜提取物与粗提物的抑菌效果进行对比，结果见图4，图4中，a为第10管洗脱液即27-30ml；b为第13管洗脱液即36-39ml，c为纯化的猪肠黏膜提取物(第11、12管洗脱液即30-36ml)；d为猪肠黏膜粗提物。由图4可知，纯化后的猪肠黏膜提取物的抑菌效果明显优于猪肠黏膜粗提物。

Claims

1.一种制备动物肠黏膜提取物的方法，包括下述步骤：

1)取离体动物小肠，刮取肠壁的黏膜层，离心，收集沉淀；其中，所述动物小肠为猪小肠或羊小肠；

3)向所述肠黏膜酶解液中加入质量浓度为5％-10％的乙酸溶液，搅拌浸提，然后将浸提液离心，收集沉淀和上清液；

4)将步骤3)得到的上清液的pH值调节到6.0-7.0，冷冻干燥，得到动物肠黏膜提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述胰蛋白酶的加入量为3000-4000U/g沉淀，所述木瓜蛋白酶的加入量为3000-5000U/g沉淀。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述酶解I的条件如下：酶解温度37-40℃，酶解时间3-6h，酶解pH值为6.5-7.5；所述酶解II的条件如下：酶解温度37-40℃，酶解时间3-6h，酶解pH值为6.5-7.5。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述沉淀与水的质量比为1∶5-1∶10；步骤2)中所述灭酶的条件为沸水浴灭酶5-10min；步骤2)中所述离心的条件为10000-12000g离心12-15min。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述乙酸溶液的加入量为所述肠黏膜酶解液体积的1-2倍；所述搅拌浸提的温度为4-10℃，时间为12-24h；步骤3)中所述离心的条件为：10000-12000g离心10-15min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述乙酸溶液的加入量为所述肠黏膜酶解液体积的1倍；所述搅拌浸提的温度为4℃，时间为12h。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在步骤3)后步骤4)前至少重复一次下述操作：向步骤3)离心收集的沉淀中加入质量浓度为5％-10％的乙酸溶液，搅拌浸提，然后将浸提液离心，收集沉淀和上清液；将所述上清液与步骤3)收集的上清液合并。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括下述纯化的步骤：

a)将所述步骤4)得到的动物肠黏膜提取物溶于双蒸水，用截留分子量为10KD的超滤管超滤，收集超滤液；

b)将超滤液利用SephadexG-100层析柱进行纯化，收集具有抑菌作用的洗脱液，冷冻干燥，得到纯化的动物肠黏膜提取物；SephadexG-100柱层析的洗脱液为0.2M、pH7.0的乙酸钠溶液，洗脱液流速为1-1.5mL/min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述具有抑菌作用的洗脱液是按照下述方法收集得到的：将所述超滤液上样于规格为Φ1.0×30.0cm的SephadexG-100凝胶过滤柱，用0.2M，pH7.0乙酸钠以流速1mL/min进行洗脱，收集第30-36ml的洗脱液。

10.按照权利要求1-9中任一所述方法制备得到的动物肠黏膜提取物。

11.权利要求10所述的动物肠黏膜提取物在制备抗菌药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述抗菌药物为抗细菌药物。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。