CN104480092A - 一种从刀豆中提取尿素酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从刀豆中提取尿素酶的方法，主要解决了现有技术中工艺复杂，产品的失活率高，回收率低，不适合工业化生产。该从刀豆中提取尿素酶的方法包括以下步骤：1]提取；2]沉降；3]中和；4]微滤；5]超滤。该方法工艺简单，易操作，可有效地降低产品的失活率，且成本低，污染小，样品回收率高，有利于工业化生产。

Description

一种从刀豆中提取尿素酶的方法
技术领域
本发明涉及一种酶的提取纯化方法，具体涉及一种通过膜分离提取纯化尿素酶的方法。
背景技术
尿素酶，又名脲酶，一种含镍的寡聚酶，其广泛存在于各种植物、动物、细菌、真菌及人体中。具有绝对专一性，可催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，将尿素转变成可供有机体使用的氮源。
尿素酶易溶于水，不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂，常温常压下不稳定，对温度、pH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。
尿素酶作为重要的生物制剂在医学、畜牧业、环保等方面都有很广泛的应用。如利用尿素酶可以处理尿素废水，临床上可用于诊断血清中尿素氨等。随着我国经济、科技的迅速发展，尿素酶的需求量也越来越大。
查阅相关专利，国内对于从刀豆中提取纯化尿素酶的专利鲜见报道，仅在中国专利CN 85104238A中提及了一种提取尿素酶的方法，即将洋刀豆用弱酸性的磷酸盐缓冲液提取，但是未提及如何对其进行纯化。
国内有关尿素酶的提取方面的文献报道较多，主要集中在从微生物中提取纯化尿素酶，如“幽门螺杆菌尿素酶的纯化及其单克隆抗体的研制”。从植物中提取纯化的文献相对较少，如下：
1.庄一义在“从巨豆粉提取尿素酶”一文中提到了一种提取纯化尿素酶的方法，将巨豆用氯仿和丙酮脱脂，然后采用低浓度的丙酮进行提取，冷冻放置使其沉淀，沉淀经缓冲液溶解后葡聚糖凝胶柱分离即可得到高活性的尿素酶。
2.刘东凯等人在“大豆脲酶的提取及其影响因素研究”一文中也提及了有关尿素酶提取的方法并对其影响因素进行了考查，确定最佳提取方法，采用30％乙醇从大豆中提取尿素酶，固液比为1：10，最适pH值为7。
3.崔有宏等人在“黄豆脲酶的提取与性质研究”一文中采用醋酸盐缓冲液对黄豆粉进行提取，然后通过亚硫酸钠盐析，其沉淀再经磷酸盐缓冲液溶解，透析，DEAE-纤维素柱色谱分离，洗脱液冷冻干燥后即可得到比活为67.15IU/mg的尿素酶产品。
4.林丽云等人在“黄豆脲酶的提取及其活性测定”一文中对黄豆中尿素酶的提取进行了研究，黄豆粉碎成豆粉，经低浓度有机试剂提取，然后用乙醇分级沉淀，磷酸盐缓冲液溶解，葡聚糖凝胶柱层析，磷酸盐缓冲液洗脱，冷冻干燥即可得到较纯且活性相对较高的脲酶。
国外对于从植物中提取纯化尿素酶的文献报道相对较多，主要如下：
1.Hsien-Yi Sung等人在“A Procedure for Purifying Jack Bean Urease forClinical Use”中提到了一种纯化尿素酶的方法，采用20％丙酮(含1mM EDTA和1mM巯基乙醇)进行提取，离心，清液调节丙酮浓度至31-35％，然后再经氢氧化钠碱化，再40℃热处理5min，离心，清液用柠檬酸调节至等电点附近，离心收集沉淀，再用磷酸盐缓冲液中和后冷冻干燥即可得的活性为411IU/mg蛋白质(240IU/mg干品)。经过上述纯化后尿素酶可提高14.7倍，活性收率63％，原料收率0.67％。
2.Prem P.Sehgal等人在“Purification and Properties of Urease Derived fromHydrated Seeds of Jack Bean,Canavalia ensiformis(L)DC”提到了有关尿素酶的提取纯化方法，刀豆粉经水提取(含0.05％巯基乙醇)，丙酮沉淀，硫酸铵盐析，再用丙酮沉淀，然后进行DEAE-Celltlosc层析分离即可得到比活为1000-1070IU/mg蛋白质的尿素酶，活性收率为25-30％，经过上述纯化后活性提高100-130倍。
3.Robert L.Blakeley等人在“Jack Bean Urease(EC 3.5.1.5).A NewPurification and Reliable Rate Assay”中研究了尿素酶的提取方法，将刀豆原料用预先冷冻的氯仿和丙酮脱脂，然后采用30％的丙酮(含巯基乙醇)提取，冷藏48h，然后0℃离心，磷酸盐缓冲液溶解沉淀，离心，上清液经透析后进行葡聚糖凝胶柱分离，洗脱液再经离子交换色谱或电泳或硫酸铵溶液进行透析，利用这种方法可对尿素酶进行纯化。
上述文献中提到了几种对尿素酶的提取纯化方法，但是大部分都是通过柱层析的方法，增加了提取成本，延长了整个工艺的实施时间。有的工艺中多次采用低含量丙酮，导致回收成本大幅度提高，且造成一定的环境污染。
发明内容
为了解决背景技术中所存在的技术问题，本发明提供一种从刀豆中提取尿素酶的方法，该方法工艺简单，易操作，可有效地降低产品的失活率，且成本低，污染小，样品回收率高，有利于工业化生产。
本发明的技术方案：
一种从刀豆中提取尿素酶的方法，包括以下步骤：
1]提取
向刀豆粉中加入浓度为0.05-0.2M缓冲液提取0.5-2h，离心，收集上清液；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、BTP缓冲液或Tris-Hcl缓冲液；所述缓冲液的PH为6.8-7.5；所述缓冲液的投料量为刀豆粉末的3-10倍量；
2]沉降
向步骤1所得的上清液中加入酸性试剂，调节PH至5.8-6.2，冷藏，离心，然后收集上清液，继续用同一酸性试剂调节上清液PH至4.8-5.2，再冷藏，收集沉淀；
所述酸性试剂为盐酸、柠檬酸或醋酸；
3]中和
向步骤2所得沉淀中加入浓度为0.01-0.1M与步骤1相同的缓冲液中和，然后离心处理，继续加入同一缓冲溶液进行二次中和，离心，收集清液；
所述缓冲液的PH为7.2-8.0；
4]微滤
将步骤3所得清液用陶瓷膜微滤，再加入清液0.2-0.4倍量的蒸馏水或浓度为0.01M与步骤1相同的缓冲液进行透析，收集透过液和透析液；
所述的陶瓷膜孔径为500-1200nm；
5]超滤
将步骤4所得的透过液和透析液用截留分子量在80-200KDa的有机膜进行超滤，同时用浓度为0.01-0.1M与步骤1相同的缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液，然后冷冻干燥，既得尿素酶；
所述缓冲液用量为透过液和透析液总质量的2-5倍；所述有机膜为PP膜、PES膜、PAN膜或PVDF复合膜。
上述步骤1中，向刀豆粉末中加入8倍量的浓度为0.1M且PH为7.0的磷酸盐缓冲液提取1h，离心，收集上清液；所述的磷酸盐缓冲液包含30％的丙酮、1mM EDTA和1mM巯基乙醇。
上述步骤2中，向步骤1所得上清液中加入柠檬酸，调节PH至6.0，冷藏，离心，然后收集上清液，继续用柠檬酸调节上清液PH至5.0，再冷藏，收集沉淀。
上述步骤3中，向步骤2所得沉淀中加入浓度为0.02M且PH 7.5的磷酸盐缓冲液中和，然后离心处理，继续加入磷酸盐缓冲液中和，离心，收集清液。
上述步骤4中，将步骤3所得清液用孔径为800nm的陶瓷膜微滤，再加入清液0.3倍量的蒸馏水进行透析，收集透过液和透析液。
上述步骤5中，将步骤4所得透过液和透析液合并后用截留分子量100KDa的PES膜进行超滤，同时用浓度为0.02M pH 7.0的磷酸盐缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液，然后冷冻干燥，既得尿素酶；所述缓冲液用量为透过液和透析液总质量的3倍。
本发明的优点：
1.使用膜元件进行纯化，可有效地缩短整个提取纯化过程，降低纯化过程中活性的降解，且产品流动性好，活性收率高。
2.膜设备占地面积小，可节约成本，大幅度提高生产效率，且操作维护简单，可实现连续化工业生产。
3.该方法中甚少使用有机试剂，避免了对环境的污染，利于环保，生产安全性高。
具体实施方式
实施例1
取刀豆粉末50Kg，加入150Kg 0.05M pH7.5的Tris-Hcl缓冲液(包括30％丙酮和1mM EDTA及1mM巯基乙醇)常温搅拌提取2h，离心，收集上清液，用柠檬酸调至pH为6.2，冷藏，收集上清液，再用柠檬酸调节pH至5.2，冷藏，离心收集沉淀。向上述沉淀中加入0.1M pH 8.0Tris-Hcl缓冲液将其中和，离心，沉淀采用同样的方式再次中和，收集两次中和液共39.6Kg。
中和液经1200nm陶瓷膜微滤，每次加入2Kg蒸馏水进行透析，共添加原液20％的透析液(即7.9Kg)，得到透过液和透析液共37.3Kg，浓缩液8.7Kg。将上述透过液和透析液用100KDa的PP膜进行超滤，同时加入186.5Kg 0.01MTris-Hcl缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液共7.8Kg，冷冻干燥即可得到379g尿素酶产品，比活为305.9IU/mg，其活性收率为64.2％。
实施例2
取刀豆粉末50Kg，加入150Kg 0.2M pH6.8的BTP缓冲液(包括30％丙酮和1mM EDTA及1mM巯基乙醇)常温搅拌提取0.5h，离心收集上清液。用盐酸调至pH为5.8，冷藏，离心，上清液再用盐酸调节pH至4.8，冷藏，离心收集沉淀。向上述沉淀中加入0.01M pH 7.2BTP缓冲液将其中和，离心，沉淀采用同样的方式再次中和，收集两次中和液共42.9Kg。
经500nm陶瓷膜进行微滤，每次加入2.1Kg 0.01M BTP缓冲液进行透析，共加入原液40％的透析液(即17.2Kg)，得到透过液和透析液共47.2Kg，浓缩液10.3Kg。将上述透过液和透析液合并后用80KDa的PAN膜进行超滤，同时加入94.4Kg 0.1M BTP缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液共8.2Kg，冷冻干燥即可得到387.2g尿素酶产品，比活为310IU/mg，其活性收率为66.5％。
实施例3
取刀豆粉末50Kg，加入500Kg 0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液(包括30％丙酮和1mM EDTA及1mM巯基乙醇)常温搅拌提取1h，离心，收集上清液。用醋酸调至pH为6.0，冷藏，离心，上清液再用醋酸调节pH至5.0，冷藏，离心收集沉淀。向上述沉淀中加入0.02M pH7.5磷酸盐缓冲液将其中和，离心，沉淀采用同样的方式再次中和，收集两次中和液共94.7Kg。
中和液经800nm陶瓷膜微滤，每次加入4.7Kg蒸馏水进行透析，共加入原液30％的透析液(即28.4Kg)，得到透过液和透析液共101.3Kg，浓缩液共16.3Kg。将上述透过液和透析液经200KDa PVDF膜超滤，使用202.6Kg 0.02M磷酸盐缓冲液进行等流量透析，得到浓缩液共8.9Kg，冷冻干燥即可得到379.3g尿素酶产品，比活为312.7IU/mg，其活性收率为65.7％。
实施例4
取刀豆粉末50Kg，加入400Kg 0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液(包括30％丙酮和1mM EDTA及1mM巯基乙醇)常温搅拌提取1h，离心，收集上清液。向原酶液中加入柠檬酸调至pH为6.0，冷藏，离心，向其上清液中继续加入一定量的柠檬酸调节pH至5.0，冷藏，离心收集沉淀。向上述沉淀中加入0.02M pH 7.5磷酸盐缓冲液将其中和，沉淀进行二次中和，收集两次中和液共110Kg。
上述中和液经800nm陶瓷膜进行微滤，每次加入5.5Kg蒸馏水进行透析，共添加原液30％的透析液(即33Kg)，得到透过液和透析液共121.5Kg，浓缩液15.7Kg。将上述透过液和透析液用100KDa的PES膜进行超滤，同时加入364.5Kg 0.02M磷酸盐缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液共7.2Kg，冷冻干燥即可得到396g尿素酶产品，比活为325.1IU/mg，其活性收率为71.3％。
实施例5
取刀豆粉末50Kg，加入400Kg 0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液(包括30％丙酮和1mM EDTA及1mM巯基乙醇)常温搅拌提取1h，离心，收集上清液。用柠檬酸调至pH为6.0，冷藏后离心，上清液再用柠檬酸调节pH至5.0，冷藏，离心收集沉淀。向上述沉淀中加入0.02M pH7.5磷酸盐缓冲液将其中和，离心，沉淀进行二次中和，合并两次中和液共118.3Kg。
中和液经800nm陶瓷膜微滤，每次加入5.9Kg蒸馏水进行透析，共加入原液30％的透析液(即35.5Kg)，得到透过液和透析液共124.7Kg，浓缩液共21Kg。将上述透过液和透析液合并后经80KDa PES膜超滤，使用374.1Kg0.02M磷酸盐缓冲液进行等流量透析，得到浓缩液共8.1Kg，冷冻干燥即可得到400.2g尿素酶产品，比活为302.3IU/mg，其活性收率为67％。
实施例6
取刀豆粉末50Kg，加入400Kg 0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液(包括30％丙酮和1mM EDTA及1mM巯基乙醇)常温搅拌提取1h，离心，收集上清液。用柠檬酸调至pH为6.0，冷藏后离心，上清液再用柠檬酸调节pH至5.0，冷藏，离心收集沉淀。向上述沉淀中加入0.02M pH 7.5磷酸盐缓冲液将其中和，离心，沉淀进行二次中和，收集两次中和液共108.7Kg。
中和液经1200nm陶瓷膜微滤，加入32.6Kg蒸馏水进行透析，分6次加入，每次加入5.4Kg，共得到透过液和透析液120.3Kg，浓缩液15.3Kg。将上述透过液和透析液用100KDa的PES膜进行超滤，同时加入360.9Kg 0.02M磷酸盐缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液共8.5Kg，冷冻干燥即可得到403.9g尿素酶产品，比活为304.7IU/mg，其活性收率为68.2％。
用陶瓷膜微滤后，当进行透析时，必须保证料液中磷酸盐的浓度在0.01M以上。
通过上述实施案例的数据说明，与先前专利中的工艺进行对比，结果如下所示：

Claims (6)

1.一种从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1]提取
向刀豆粉中加入浓度为0.05-0.2M缓冲液提取0.5-2h，离心，收集上清液；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、BTP缓冲液或Tris-Hcl缓冲液；所述缓冲液的PH为6.8-7.5；所述缓冲液的投料量为刀豆粉末的3-10倍量；
2]沉降
向步骤1所得的上清液中加入酸性试剂，调节PH至5.8-6.2，冷藏，离心，然后收集上清液，继续用同一酸性试剂调节上清液PH至4.8-5.2，再冷藏，收集沉淀；
所述酸性试剂为盐酸、柠檬酸或醋酸；
3]中和
向步骤2所得沉淀中加入浓度为0.01-0.1M与步骤1相同的缓冲液中和，然后离心处理，继续加入同一缓冲溶液进行二次中和，离心，收集清液；
所述缓冲液的PH为7.2-8.0；
4]微滤
将步骤3所得清液用陶瓷膜微滤，再加入清液0.2-0.4倍量的蒸馏水或浓度为0.01M与步骤1相同的缓冲液进行透析，收集透过液和透析液；
所述的陶瓷膜孔径为500-1200nm；
5]超滤
将步骤4所得的透过液和透析液用截留分子量在80-200KDa的有机膜进行超滤，同时用浓度为0.01-0.1M与步骤1相同的缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液，然后冷冻干燥，既得尿素酶；
所述缓冲液用量为透过液和透析液总质量的2-5倍；所述有机膜为PP膜、PES膜、PAN膜或PVDF复合膜。
2.根据权利要求1所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤1中，向刀豆粉末中加入8倍量的浓度为0.1M且PH为7.0的磷酸盐缓冲液提取1h，离心，收集上清液；所述的磷酸盐缓冲液包含30％的丙酮、1mM EDTA和1mM巯基乙醇。
3.根据权利要求2所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤2中，向步骤1所得上清液中加入柠檬酸，调节PH至6.0，冷藏，离心，然后收集上清液，继续用柠檬酸调节上清液PH至5.0，再冷藏，收集沉淀。
4.根据权利要求3所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤3中，向步骤2所得沉淀中加入浓度为0.02M且PH 7.5的磷酸盐缓冲液中和，然后离心处理，继续加入磷酸盐缓冲液中和，离心，收集清液。
5.根据权利要求4所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤4中，将步骤3所得清液用孔径为800nm的陶瓷膜微滤，再加入清液0.3倍量的蒸馏水进行透析，收集透过液和透析液。
6.根据权利要求5所述的从刀豆中提取尿素酶的方法，其特征在于：所述步骤5中，将步骤4所得透过液和透析液合并后用截留分子量100KDa的PES膜进行超滤，同时用浓度为0.02M pH 7.0的磷酸盐缓冲液进行等流量透析，收集浓缩液，然后冷冻干燥，既得尿素酶；所述缓冲液用量为透过液和透析液总质量的3倍。
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