CN108118049A - 一个从动物组织中快速提取rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及一个从动物组织中快速提取RNA的方法。该方法主要包括两个大步骤：第一步是从组织中快速分离细胞。步骤为：将组织切成小块，称重；加入PBS，研磨均匀，得到组织匀浆；低速离心，让比较大的组织残渣沉淀下来，单个的细胞仍然悬浮在上清中；取带有悬浮的细胞的上清加PBS混匀，离心去上清，得到的沉淀即为分离出来的细胞。第二步是用核酸提取试剂从细胞中快速提取RNA。步骤为：向细胞中加入核酸提取试剂，混匀；室温静置以裂解细胞；75℃加热10分钟；将样品放在冰上冷却，即为制备好的RNA，可用于基因表达水平检测或基因克隆等工作。本发明的方法优点是操作简单，速度快，使用的试剂成本低而且基本无毒无异味。

Description

一个从动物组织中快速提取RNA的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及一个从动物组织中快速提取RNA的方法。

背景技术

生物医学研究和临床上进行基因表达水平检测或基因克隆等工作之前，都要将核酸从生物样品中提取出来。这里提到的生物样品，包括培养的细胞、动植物组织、体液（如血液、痰液、组织液等）、微生物样品等。众所周知，核酸包括DNA和RNA。DNA是遗传信息的携带者，而RNA是将DNA携带的遗传信息转变为有功能的蛋白质的中间桥梁；另外，RNA在生物体内还有多种复杂的调节功能。当需要检测基因表达水平，以研究相关的生物学功能的时候，RNA是极其重要而且常用的研究对象。检测的第一步就是将RNA从生物样品中提取出来。当需要深入研究某种蛋白质的结构、功能时，通常需要克隆编码这个蛋白质的基因。mRNA（信使RNA）是进行基因克隆的常用模板。要得到mRNA，也需要从生物样品中提取RNA。

在上面提到的各种生物样品中，动植物组织是非常重要的研究对象。这是因为生物学研究的最终目标是解释完整的生物体内发生的各种现象；医学的目的是治疗疾病促进人体健康。这些必然要求研究的样品能够真实准确地反映活的生物体内的状况和生物学过程。在各种生物样品中，组织样品无疑是最符合这个要求的，最能够反映生物体的状况。因此，随着当前研究的进步，从组织中提取RNA并进一步检测基因表达的需求越来越多。

目前常用的组织RNA提取试剂（如TRIzol试剂）都采用酚、胍盐、表面活性剂、氯仿等作为样品裂解、RNA纯化试剂；常用的操作方法有手工法和吸附柱法等。这些传统的操作方法的突出缺点是耗时较多，完成一次RNA提取需要至少一个小时，加上逆转录的时间则为两个小时甚至更久，完全无法满足现在日益增长的高通量检测需求。而且，几种传统的操作方法都比较复杂，要对相关的操作人员进行严格的培训。例如手工法和吸附柱法都需要经过多次的离心和液体吸取等操作，需要操作人员具有相当的能力才能完成。另外，传统的RNA提取试剂多数都具有较强的毒性和腐蚀性，还有强烈的刺激性气味，对操作人员的健康和环境都有很大的危害。因此，为了满足越来越多的科研和临床检测需求，迫切需要快速、经济的组织RNA提取方法来取代传统方法。

目前，对于培养的细胞已经有了快速的RNA提取方案。如美国EZBioscience，Ambion，德国Qiagen品牌都有易用的Cell to cDNA（细胞到cDNA）试剂盒，能够在半小时到一小时之内完成RNA提取和逆转录的过程，相比传统方法节省了大约一个小时的时间。但是，至今为止仍然没有一个从组织中提取RNA的简单、快速方法，主流的方法仍然是传统的TRIzol法，操作复杂费时。而在现实中，基础研究中为了检测生物体内发生的基因表达变化，从而更好地了解相关的生物学过程，需要从组织中提取RNA；临床上采集到病人的组织样本，为了检测疾病相关基因表达，从而达到个体化精准诊断、治疗的目的，同样需要从组织中提取RNA。这样，快速增长的从组织中快速提取RNA的需求，和传统的TRIzol法的低效率之间的矛盾日益突出；国内外各试剂厂商至今也并没有推出能够满足需求的真正快速、稳定且价格合理的组织RNA提取试剂盒或方法。

为了解决这个矛盾，得到一个从动物组织中快速提取RNA的方法，本发明申请人首先尝试了用现有的细胞到cDNA试剂盒提供的裂解液直接处理组织。实验结果表明这个方法从组织中提取RNA的效果很差；TRIzol法的缺点则是耗时长，操作复杂，试剂毒性大。于是在简单利用现有试剂盒不成功的情况下，本发明申请人深入研究了各种现有的组织RNA提取方法（主要是TRIzol法）的原理，对RNA提取中各步骤的作用进行了解析，证明了基于TRIzol法的工作原理无法得到更加快速的RNA提取方法。最终，我们大胆放弃了TRIzol法的工作原理，基于全新的原理重新构建了组织RNA提取流程，提出了一个从动物组织中快速提取RNA的方法。

本发明提供的方法克服了现有试剂和方法的缺陷，适用于从动物组织中快速提取RNA。本发明提供的方法操作简单，结果稳定可靠，可以在30分钟之内快速高效地从动物组织中提取出RNA，用于后续的基因表达水平检测或基因克隆等工作。

发明内容

本发明的目的是提供一个从动物组织中快速提取RNA的方法。适用的范围为脊椎动物；组织包括神经组织、肌肉组织、上皮组织、结缔组织。

首先，本发明申请人对目前常用的组织RNA提取方法（主要是TRIzol法）的步骤和原理进行了研究，总结出组织RNA提取的流程大致可以分为以下几步：1.组织裂解：通用的做法用是将组织块在含有强变性剂酚和胍盐的裂解液中研磨粉碎，将其中的RNA释放出来；2.RNA与杂质的分离：采用吸附或离心的方法将RNA与DNA、蛋白质等杂质分离；3.RNA的洗脱或溶解。

进一步分析，由于第一步的组织裂解中用了强变性剂，对各种酶的活性都有严重的抑制作用，所以组织中的RNA虽然在裂解的过程中被释放出来了，但是这个裂解产物是无法直接用于逆转录和PCR等后续的实验和检测的。这是因为逆转录和PCR反应都依赖于酶的催化，而裂解产物中的变性剂会将这些酶失活，使逆转录和PCR反应无法进行。因此，为了将溶液中的变性剂及其它杂质去掉，后面需要一系列繁琐的步骤将RNA分离出来并溶解在合适的溶液里以进行后面的检测。由于RNA的分离需要多步操作，每一步都有一定的难度且消耗相当的时间，所以整个RNA提取过程需要消耗的时间长达一个小时以上，而且对于不同的组织类型、因操作者的熟练程度不同，得到的RNA数量和质量都有较大差别并且波动较大。最关键的问题是这些步骤无法省略，简化的余地有限。所以说根据这些方法的原理是无法开发出快速的RNA提取方法的。

目前新一代的基于其它原理的RNA提取试剂如美国EZBioscience品牌的Cell tocDNA（细胞到cDNA）试剂盒摒弃了酚和胍盐，裂解液处理细胞后，裂解产物可以直接做逆转录反应，免去了耗时的RNA分离、溶解或洗脱操作，因此整个实验速度大大加快，仅需半小时就可以用细胞制备出cDNA。这个速度比传统的TRIzol法快了3倍以上。

我们希望能够利用这类试剂达到从组织中快速提取RNA的目的。但是，经过本发明申请人的尝试，虽然该试剂盒提供的细胞裂解液在处理细胞时性能良好，实验中直接用此细胞裂解液处理组织，然后取一部分裂解产物进行逆转录却得不到理想的结果。这一方面可能是细胞裂解液的处理能力比较弱，无法真正有效地裂解组织中的细胞；另一方面组织中大量的血液、结缔组织等对细胞裂解液的工作也可能存在严重的干扰。而且，厂商也并未说明此试剂盒可以用于组织的RNA提取。其它品牌的同种试剂盒的说明书也只是说明产品可以用于细胞，而没有说明可以用于处理组织。

相应地，本发明申请人也对细胞的核酸提取方法进行了研究，并且已经另案申请了发明专利（专利名称“一种用于从细胞中提取核酸的方法和试剂”，专利申请号2016108773755）。此试剂与前面提到的商品化试剂盒功能类似，可以从细胞中快速提取核酸，但不适用于组织的RNA提取。

简单总结一下，目前的困难是：要想用传统的TRIzol法直接裂解组织，从中提取RNA，无法克服的问题是裂解产物中存在强变性剂，不能直接用于逆转录等后续实验，因此不得不进行一系列繁琐的操作来提纯RNA；商品化的细胞到cDNA试剂盒的问题是试剂盒提供的细胞裂解液不能很好地处理组织样品。

这样，在明确TRIzol法本身没有大的改进余地的状况下，我们还是要想办法利用本发明申请人发明的核酸提取试剂快速高效的优点。我们通过实验测试，已经知道本核酸提取试剂可以从细胞中快速提取出核酸，但不能有效地从组织中提取出RNA。分析其原因，应该是组织的结构致密且复杂，成分也很复杂多样，超出了核酸提取试剂的能力范围。要解决这个问题，可以先将组织进行一定的处理，将致密的结构打散，去掉多余的干扰成分，使其符合核酸提取试剂的要求。

要想将组织转变为可以用核酸提取试剂处理的状态，直接想到的就是将细胞从组织中分离出来，然后用核酸提取试剂处理分离出来的细胞。这个思路的可行性在于：首先，已经有很多种从组织中分离细胞的方法可以借鉴；其次，组织是由细胞构成的，组织的功能由细胞行使。对组织中RNA进行检测时，实际上要检测的是细胞中的RNA。先把细胞分离出来，理论上可以排除细胞外成分（如血液、组织液等）的影响，对提高结果的准确度有利，并不会使结果产生偏差。

从组织中分离细胞已经有多种成熟的方法。一般通用的基本步骤是先将组织切成小块，然后加胰酶、胶原酶消化，再过滤除去未消化干净的组织块，离心得到单个的细胞。通过这一系列的操作，能够得到数量较多的活细胞。但是，这个方法还是过于复杂，消耗的时间也比较多，因此并不符合本发明的需要。实际上，上述的方法目的在于从组织中分离出细胞并进行培养，一系列的复杂操作旨在提高细胞的回收率和细胞活力。本发明的最终目的是从细胞中提取RNA，只要能够从组织中得到足够数量的细胞，并且细胞的完整性未受到破坏就可以了，并不要求高的细胞回收率和细胞活力。因此，根据需要，本发明借鉴已有的方法，进行了多次尝试之后，对细胞分离方法进行了大胆的简化，总结出了一个适用于本发明的快速步骤。这个步骤与本发明申请人发明的核酸提取方法（专利名称“一种用于从细胞中提取核酸的方法和试剂”，专利申请号2016108773755）结合到一起，就形成了一个简单快速的从组织中提取RNA的完整方法。

本发明提供的从组织中快速提取RNA的方法主要分两大步：

第一步是从组织中分离细胞，步骤为：

1.将组织切成小块，称重。组织块的重量应控制在5~500mg之间；优选的重量范围在10~200mg之间；更优选的重量范围在10~100mg之间；最优选的重量范围在10~50mg之间。

2.按比例加入PBS，在尽量短的时间内研磨均匀，得到组织匀浆。组织块的重量与PBS的体积比例在每10mg组织加20~1000μl PBS之间；优选的比例在每10mg组织加50~500μlPBS之间；更优选的比例在每10mg组织加50~200μl PBS之间；最优选的比例在每10mg组织加80~120μl PBS之间。

3.组织匀浆低速离心，让比较大的组织残渣沉淀下来，单个的细胞仍然悬浮在上清中。离心转速在100~600转/分钟之间；优选的离心转速在200~500转/分钟之间；更优选的离心转速在200~400转/分钟之间；最优选的离心转速在300转/分钟。离心时间在10秒~30分钟之间；优选的离心时间在10秒~10分钟之间；更优选的离心时间在30秒~5分钟之间；最优选的离心时间为1分钟。

4.取带有悬浮的细胞的上清至新的离心管，加PBS混匀。上清与PBS的体积比在10:1~1:100之间；优选的比例在1:1~1:50之间；更优选的比例在1:2~1:20之间；最优选的比例在1:9。离心去上清，得到的沉淀即为分离出来的细胞。离心转速在100~10000转/分钟之间；优选的离心转速在500~5000转/分钟之间；更优选的离心转速在1000~3000转/分钟之间；最优选的离心转速在1500转/分钟。离心时间在30秒~30分钟之间；优选的离心时间在30秒~10分钟之间；更优选的离心时间在1分钟~5分钟之间；最优选的离心时间为3分钟。

第二步是用核酸提取试剂处理细胞，得到RNA：

1.向细胞中加入核酸提取试剂，混匀。核酸提取试剂的配制方法本发明人已经另案申请专利（专利名称“一种用于从细胞中提取核酸的方法和试剂”，专利申请号2016108773755）。现提供一个优选的配方如下：

1% Triton X-100；

1U/μL鼠源RNA酶抑制剂；

10mmol/L DTT；

1mmol/L EDTA；

10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。

2. 室温静置10分钟以裂解细胞。

3.75℃加热10分钟以失活RNA酶。

4.将样品放在冰上冷却，即为制备好的RNA。此溶液可以直接用于基因表达水平检测或基因克隆等操作，也可保存于-20℃或-80℃以待后续的实验使用。

综上所述，本发明提供的从动物组织中快速提取RNA的方法主要包括两个大步骤：第一步是从组织中快速分离细胞；第二步是用核酸提取试剂从细胞中快速提取RNA。本发明的方法优点是操作简单，速度快（可以在半小时内完成组织RNA提取），使用的试剂成本低而且基本无毒无异味。本发明的方法与目前常规的TRIzol法或吸附柱法相比，可以节省约一半的时间，且操作大大简化成本大大降低。因此本发明市场前景非常可观。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的方法作一具体说明。提供的实施例只是为了从操作上说明本发明的一个实现方法，有经验的技术人员可以根据本发明所述的原理对具体的试剂配方和实验步骤作出一定的改动或优化而不偏离本发明的精神。因此不能根据下面所提供的实施例而对本发明作出限定。

实施例一：从小鼠肝组织中分离细胞

1.解剖后将小鼠肝组织切成半个绿豆大小的块（重量在10~50mg之间），放入称过重并标记好的离心管中，称重。

2.按每10mg组织加100μl PBS的比例，向盛有组织块的离心管中加入预冷的PBS，在冰上研磨均匀。研磨时间尽量控制在2分钟以内。

3.取新的离心管，加入100μl组织匀浆，300转/分钟离心1分钟。

4.取10μl上清至新的离心管，加90μl PBS混匀，1500转/分钟离心3分钟。

5.小心地去掉上清，沉淀即为分离出的细胞，备用。

实施例二：核酸提取试剂的配制

按照本发明申请人已经提出的方法（专利名称“一种用于从细胞中提取核酸的方法和试剂”，专利申请号2016108773755），配制核酸提取试剂。配方如下：

1% Triton X-100；

1U/μL鼠源RNA酶抑制剂；

10mmol/L DTT；

1mmol/L EDTA；

10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。

实施例三：从分离出的细胞中提取RNA

1.向按照实施例一所述方法得到的细胞沉淀中加入100μl核酸提取试剂（配方见实施例二），用移液器反复吹吸几次，充分悬浮细胞，使细胞均匀分散开。

2.室温静置10分钟，使细胞充分裂解并将核酸释放到溶液中。

3.75℃加热10分钟以失活RNA酶。

4.冰上放置，使溶液冷却。此溶液可直接用于基因表达水平检测或基因克隆等操作，也可保存于-20℃或-80℃以待后续的实验使用。

实施例四：以提取的RNA为模板检测基因表达水平

配制如下的反应体系：

提取的RNA溶液（参见实施例三）2μL；

引物（Oligo dT或随机引物）2μL；

dNTP mix（2.5 mmol/L each）4μL；

10×RT buffer（100 mmol/L Tris pH 8.3，250 mmol/L KCl，30 mmol/L MgCl₂，50mmol/L DTT）2μL；

MMLV-RT 25U；

加双蒸水（不含RNA酶）补足20μL。

混合均匀后42℃孵育15~60分钟以合成cDNA。

根据要检测的基因，选择合适的引物，以上一步合成的cDNA为模板进行实时定量PCR反应检测基因表达情况。具体的操作和仪器使用可参照相应的厂家提供的说明书。由于与此相关的检测所需知识对于专业人员来说已经属于常识，并且与本发明并无直接关系，在此不作进一步的详细描述。

Claims (8)

1.一个从动物组织中快速提取RNA的方法，其特征在于，所述的RNA提取方法主要分为两个大步骤：第一步是从组织中快速分离细胞；第二步是用核酸提取试剂从细胞中快速提取RNA。

2.根据权利要求1所述的从动物组织中快速提取RNA的方法，其特征在于，所述的动物为脊椎动物。

3.根据权利要求1所述的从动物组织中快速提取RNA的方法，其特征在于，所述的组织包括神经组织、肌肉组织、上皮组织、结缔组织。

4.根据权利要求1所述的从动物组织中快速提取RNA的方法，其特征在于，所述的从组织中快速分离细胞的步骤为：将组织切成小块，称重；按比例加入PBS，在尽量短的时间内研磨均匀，得到组织匀浆；组织匀浆低速离心，让比较大的组织残渣沉淀下来，单个的细胞仍然悬浮在上清中；取带有悬浮的细胞的上清至新的离心管，加PBS混匀，离心去上清，得到的沉淀即为分离出来的细胞。

5.根据权利要求1所述的从动物组织中快速提取RNA的方法，其特征在于，所述的核酸提取试剂配方为：

1% Triton X-100；

1U/μL鼠源RNA酶抑制剂；

10mmol/L DTT；

1mmol/L EDTA；

10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。

6.根据权利要求1所述的从动物组织中快速提取RNA的方法，其特征在于，所述的用核酸提取试剂从细胞中快速提取RNA的步骤为：向细胞中加入核酸提取试剂，混匀；室温静置10分钟以裂解细胞；75℃加热10分钟以失活RNA酶；将样品放在冰上冷却，即为制备好的RNA。

7.根据权利要求1所述的从动物组织中快速提取RNA的方法，其特征在于，从动物组织中提取出的RNA可用于基因表达水平检测或基因克隆等工作。

8.根据权利要求1所述的从动物组织中快速提取RNA的方法，其特征在于，从动物组织中提取出的RNA可直接用于基因表达水平检测或基因克隆等操作，也可保存于-20℃或-80℃以待后续的实验使用。