CN107760773A - 一种对胚胎培养液进行scRRBS分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种对胚胎培养液进行单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序（Single‑cell reduced‑representation bifulfite sequencing，scRRBS）的方法。本发明采用“试管婴儿”操作中的医疗废弃物（囊胚培养液）为原料，可同时对胚胎的染色体非整倍性状况及DNA甲基化状况进行双重分析，从表观遗传及胚胎与培养环境的反应的全新角度评估胚胎的发育潜能，为在辅助生殖中选择“正确”的胚胎提供了新的参考，对提高“试管婴儿”周期的成功率提供了强力支持。

Description

一种对胚胎培养液进行scRRBS分析的方法

技术领域

本发明涉及生物医学和分子细胞生物学领域，具体涉及一种对胚胎培养液进行单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序（Single-cell reduced-representation bifulfitesequencing，scRRBS）的方法，其利用表观遗传学分析技术对囊胚培养液解析胚胎染色体状态及DNA甲基化状态。

背景技术

自1978年7月，第一例“试管婴儿”路易斯·布朗诞生，2010年其开创者Robert G.Edwards获得诺贝尔医学与生理学奖，近四十年来，全球已有数百万试管婴儿诞生，“试管婴儿”一词已广为人知。虽然随着技术的飞速发展，试管婴儿技术也经历了一代二代，如今已进入三代，但总体成功率依然达不到人们的期望，目前成功率一般也就40%左右。

试管婴儿技术涉及到妇产科学、男科学、生殖生理学、遗传学、胚胎学及发育生物学等多个学科，同时也必须依赖实验室技术与临床学科。一个试管婴儿周期包括父母双方全面检查、促排卵获得健康卵子、获得精子、体外受精、受精卵及胚胎培养、选择合适的胚胎移植等过程及移植后的产前系列监测检查等直到健康婴儿诞生。在如此长达一年左右的周期中，诸多因素影响到胚胎的发育潜能，而胚胎发育潜能则是这一个周期能否成功的重要原因。

目前选择胚胎评估胚胎发育潜能的主要标准是形态学标准，这一标准虽然不尽统一，但已为广大医务人员及患者接受。随着技术的发展及临床分析的深入，研究人员发现大多数流产的主要原因是胚胎的染色体非整倍性。形态学正常的胚胎其染色体整倍性不一定正常，这是导致移植后失败的重要原因。各种非整倍性筛查（PGS）应运而生，其通过对胚胎部分细胞的染色体筛查，选择染色体正常的胚胎移植以提高成功率。

然而，采用PGS技术后，仍然有“正常”的优质胚胎移植后失败。这是因为辅助生殖体外受精后，胚胎要在体外培养3-5天，在这段时间中，从受精卵到桑椹胚期或者囊胚期都是在非母体状况下进行，因此胚胎的发育严重受到培养环境的影响。在胚胎发育的早期，胚胎表观遗传状况发生剧烈的变化，这一变化可能受到外界环境的影响而发生异变，从而影响胚胎的发育潜能，并导致一些形态学优质、染色体状态正常的胚胎因表观遗传受到干扰而降低了发育潜能，并导致移植后失败。而目前的植入前筛查中，都没有对胚胎的表观遗传状况进行分析。

同时，目前主流的PGS采用的是囊胚阶段的滋养层细胞活检，这种活检虽然尚未证明对胚胎及试管婴儿有害，但在操作技术上要求较高，操作不当会引起胚胎停育等后果。

CN105368936A采用胚胎培养后的废液为材料，试图做到无创检测，但仍然只是对染色体状态进行分析。

综上所述，目前主流评价胚胎发育潜能的技术有如下不足：

活检取样对胚胎对操作技术要求较高，即便操作良好，也会对胚胎造成一定的损伤，若是操作失误，很可能会伤及胚胎，导致严重后果

滋养层细胞可能存在嵌合的情况，所取少数3-5个细胞可能不能完全代表胚胎，进而造成误判。

仅仅从染色体状态进行评估，忽略了在胚胎早期十分重要的表观遗传变化，不能为更全面评估胚胎发育潜能提供更多的参考。

因此，急需一种无创且同时提供多角度参考检测胚胎发育潜能的新方法。

发明内容

本发明对现有检测技术进行的全新的改进，引进表观遗传学分析方法，利用囊胚培养液对胚胎的染色体状况及甲基化状况同时进行分析，不但对胚胎无创伤，样本获取简单，更从多角度评估胚胎发育潜能，更加安全可靠。

本发明提供了一种全新的对胚胎培养液进行单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序（Single-cell reduced-representation bifulfite sequencing，scRRBS）的方法，包括如下步骤：

（1）无创样本的获得：通过单精子胞浆内注射法（ICSI）获得受精卵，受精卵在卵裂球培养基中培养3天到卵裂球期后，再将胚胎转入囊胚培养基中培养至第5天直至发育到囊胚成熟阶段。对囊胚进行人工皱缩使其排出囊胚腔内液，转移囊胚到新的培养液或进入冷冻流程，将剩下的培养液全部转移到PCR管中备用。

（2）scRRBS测序文库构建：根据培养液样本体积，按比例加入裂解缓冲液及裂解酶，混匀孵育后灭活裂解酶，对裂解产物进行MspⅠ酶切、末端修复加A、接头连接与开环处理、CT转化处理及纯化回收、PCR扩增、纯化与第二次扩增、回收目的产物；

（3）文库测序：采用二代测序或核酸芯片、免疫印迹检测等技术对测序结果进行解析，分析胚胎染色体状况和DNA甲基化谱状况，评估胚胎发育潜能。

其中，步骤（1）中，将颗粒细胞彻底拆除干净是关键，可确保培养液中没有来自胚胎以外的DNA的干扰；第3天将胚胎转入囊胚培养时有必要用囊胚培养基洗涤数次以尽可能去除干净非胚胎来源DNA干扰；囊胚培养中进行胆囊胚培养，每个囊胚培养液滴大小在5-50μl之间，每个培养液样本收取体积5-50μl之间。

步骤（2）中，裂解缓冲液的主要成分包括终浓度2-200mM Tris-EDTA、1-50mM KCl、0.1wt%-5wt%的表面活性剂如Triton X-100、SDS、Tween-20、NP40中的一种或多种。

裂解酶选自蛋白酶K、Qiagen Protease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶及溶菌酶中的一种或多种，所用酶浓度为1-30μg/ml。孵育温度为37-65℃，时间为30min到12h，失活温度为不超过80℃，时间为10-45min

Msp I酶切体系中，缓冲液优选Tango缓冲液，作为参照DNA的非甲基化λDNA加入量为样本中DNA的大约1%，酶切温度37℃，时间1-6小时，失活温度60-80℃，时间10-30min。

末端修复及加A使用DNA聚合酶Klenow片段，缓冲液优选Tango缓冲液，反应温度为37℃，修复时间为20-60min，60-80℃失活5-30min。

接头连接使用甲基化接头，用T4 DNA连接酶连接，优选处理流程：16℃预连接30min，然后4℃连接过夜或不低于8小时，连接完成后50-75℃处理20min使酶失活。

在一个特定的实施方案中，所述接头是一个发夹结构的序列，以保证接头的稳定性及方便与目的片段的连接，在发夹的环状结构中有一个特别的U碱基，可以作为USER酶的底物，因此，用USER酶37℃处理20-50min（优选30min）即可打开所述接头的环状结构。

使用重亚硫酸盐进行CT转化，优选使用Invitrogen MethylCode Kit，并参照试剂盒说明说进行

在一个特定的实施方案中，PCR扩增使用KAPA HiFi U+master Mix、Phusion high-fidelity(HF) PCR master Mix with HF buffer的一种或两种。第一次扩增程序如下：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，6-12个循环；72℃，5min；4℃保存。

完成第一次扩增后，扩增产物优选经过0.5-1.5倍体积XP磁珠纯化，纯化产物进行第二次扩增。第二次扩增程序如下：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，15-21个循环；72℃，5min；4℃保存。

对200-700bp间的目标DNA片段进行回收。在一个特定的实施方案中，采用1.5-2%TAE或TBE琼脂糖电泳切胶回收。目标DNA片段纯化可以采用例如QIAquick gel extractionkit等试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作。

在一个特定的实施方案中，步骤（3）中使用NGS测序，主要仪器为XTEN、NEXT-seq、Highseq-2500等Illumina系列及相应的试剂耗材，参照仪器及试剂耗材SOP进行操作。

本发明的另一方面提供了一种对胚胎进行染色体非整倍性状况及DNA甲基化状况的双重分析的方法，包括使用本发明的方法对胚胎培养液进行单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序。

在某些特定的实施方案中，还包括根据染色体非整倍性状况及DNA甲基化状况的分析结果对胚胎的发育潜能进行评估的步骤。

本发明采用“试管婴儿”操作中的医疗废弃物（囊胚培养液）为原料，可同时对胚胎的染色体非整倍性状况及DNA甲基化状况进行双重分析，该分析结果可以用于多种目的，既可用于胚胎植入前筛查，也可用于实验室中对胚胎发育的相关研究等。与目前主流的滋养层细胞活检相比，具有对胚胎无创安全的优势；与正在研发中的利用培养液进行染色体状况（染色体非整倍性）的无创PGS分析相比，在提供同样的染色体非整倍性检测分析的同时还可以从DNA甲基化的角度分析，从而从表观遗传及胚胎与培养环境的反应的全新角度评估胚胎的发育潜能，为在辅助生殖中选择“正确”的胚胎提供了新的参考，对提高“试管婴儿”周期的成功率提供了强力支持。

附图说明

图1是样本A和样本B两个胚胎的滋养层（TE）采用常规PGS实验程序获得的测序数据进行的染色体非整倍性分析。

图2是样本A和样本B两个胚胎的培养液（SM）采用scRRBS实验程序获得的测序数据进行的染色体非整倍性分析。

图3是样本A和样本B两个胚胎的滋养层（TE）和对应培养液（SM）采用scRRBS实验程序获得的数据进行的甲基化谱分析（仅展示了第5条染色体的局部），SD为参考甲基化谱。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的方案进行清楚完整的描述，但本发明并不受其限制，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围；同样地，实施例的附图仅仅是本发明一部分实施例的附图，本领域技术人员根据这些附图所获得的其他附图，也都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

取2例单精子注射胚胎样本（记为样本A和样本B），分别对对应的囊胚滋养层活检细胞及囊胚培养液进行PGS和scRRBS测序分析染色体状态及DNA甲基化状态，具体操作如下：

1. 样本获取：

选取合格的MⅡ期成熟卵细胞，尽可能将附着于卵细胞外的颗粒细胞彻底拆除，再选取健康的精子，采用单精子注射获得受精卵，在G1培养基（卵裂球培养基，William A CookAustrialia Pty Ltd）中培养3天至卵裂球期，将胚胎于新鲜G2培养基（囊胚培养基，William A Cook Austrialia Pty Ltd）内洗涤数次以去除可能的残留颗粒细胞，然后转入10-20μl新鲜的G2培养基微滴中，每个微滴培养一个胚胎。

在G2培养基中培养到第5天，在显微镜下刺激囊胚使囊胚皱缩5-15min，将培养液（10-20μl）小心收集于PCR管中，将囊胚转入新的培养基取滋养层细胞做对照活检后，转入新的培养基或是进入冷冻流程。

2. scRRBS甲基化文库构建

根据培养液样本的体积，加入10×裂解缓冲液及1/20体积的蛋白酶，使终浓度为10mMTris-1mM EDTA，KCl 10mM，CaCl₂ 1mM，Triton-X 100 1%，蛋白酶2mg/ml。混匀后离心收集于管底。

将样本置于在PCR仪中，55℃ 4h裂解细胞释放DNA，75℃ 30min使蛋白酶失活。

向裂解产物中加入MspⅠ、10×Tango缓冲液、非甲基化λDNA至终浓度为酶切MspⅠ5U、1×Tango缓冲液、非甲基化λDNA为样本DNA估计量的1%左右。样本置于PCR仪中，37℃4h，80℃ 20min。

向酶切产物中加入DNA聚合酶Klenow片段、10×Tango缓冲液、末端修复dNTP mix至终浓度分别为5U、1×、40μM。充分混匀，稍离心收集于管底，PCR仪上37℃ 40分钟，75℃15分钟。

向修复产物中加入T4 DNA连接酶、10×Tango缓冲液、ATP、甲基化接头（NEBNextMultiplex Oligos for Illumina Methylated Adaptor Index Primers Ste1），混匀后，置于PCR仪上，16℃ 30分钟，4℃过夜或不低于8小时，完成后，65℃，20min使酶失活。加入USER酶，37℃酶切30min断开环状结构。

参照Invitrogen MethylCode Kit说明书操作，进行CT转化，简而言之，向连接产物中加入重亚硫酸盐转化混合物至总体积150μl，混匀后稍离心收集于管底，PCR仪上98℃，变性10分钟，64℃，重亚硫酸盐转化2.5小时，4℃放置至20小时继续转化。转化产物经离心柱结合、洗涤、纯化洗脱回收，洗脱液20-30μl用于扩增。

转化产物经纯化后用于第一次PCR扩增，采用50μl体系，加入2×Kapa HiFi Ｕ+master Mix 25μl，15μM NEB Universal primer及Index primer各0.5μl，24μl纯化产物。参照如下反应扩增：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，6个循环；72℃，5min；4℃保存。产物用0.8×XP磁珠纯化PCR产物，以40μl水洗涤。

第二次PCR扩增，采用100μl体系，加入2×Kapa HiFi U+master Mix 50μl，15μMNEB Universal primer及Index primer各5μl，40μl纯化产物。参照如下反应扩增：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，18个循环；72℃，5min；4℃保存。

扩增产物上2% TAE琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下200-700bp间的带，采用QIAquick gel extraction kit纯化回收文库DNA。回收操作详见QIAquick gelextraction kit说明书。

获得文库后采用X-TEN双向150循环测序。

获得的数据采用甲基化分析流程解析数据，获得样本的DNA甲基化状态；同时数据采用通用PGS分析流程，分析样本的染色体非整倍性状态。从图1和图2的PGS散点图可以发现，无论对于样本A还是样本B，对培养液与滋养层进行PGS分析的结果复合度相当高，因此使用两者都可以对胚胎的染色体状态做出准确的判断。同时对样本A和样本B的甲基化谱与Human hg19参考基因组数据库中对应的胚胎甲基化谱做了对比（图3），图中仅仅展示了第5条染色体的局部甲基化状况，但也能初步分析其变化，为判断胚胎发育潜能提供参考。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其它各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种对胚胎培养液进行单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序（scRRBS）的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获取胚胎培养液：受精卵在卵裂球培养基（例如William A Cook Austrialia PtyLtd的G1培养基）中培养到卵裂球期后转入囊胚培养基（例如William A Cook AustrialiaPty Ltd的G2培养基）中培养至囊胚成熟阶段，对囊胚进行人工皱缩使其排出囊胚腔内液，将培养液全部转移到PCR管中备用；

（2）构建胚胎培养液的scRRBS测序文库：将步骤（1）的培养液样本先后经过裂解酶裂解、裂解产物MspⅠ酶切、末端修复及加A、接头连接与接头开环处理、CT转化处理及纯化回收、PCR扩增、纯化与第二次扩增、回收目的产物；

（3）对步骤（2）构建的scRRBS测序文库进行测序。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤（1）中，受精卵的获取方法如下：选取合格的MⅡ期成熟卵细胞，尽可能将附着于卵细胞外的颗粒细胞彻底拆除，再选取健康的精子，采用单精子注射获得受精卵。

3.根据权利要求1所述的方法，步骤（1）中，将受精卵在G1培养基中培养至卵裂球期后，将胚胎于囊胚培养基内洗涤数次以去除可能的残留颗粒细胞，然后转入5-50μl（优选10-20μl）新鲜的囊胚培养基微滴中，每个微滴培养一个胚胎。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）的裂解酶裂解中，裂解酶选自蛋白酶K、Qiagen Protease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶及溶菌酶中的一种或多种，所用酶浓度为1-30μg/ml；裂解缓冲液的包括2-200mM Tris-EDTA、1-50mM KCl、0.1wt%-5wt%的表面活性剂（优选Triton X-100、SDS、Tween-20、NP40中的一种或多种）。

5.根据权利要求4的方法，其中，裂解酶孵育温度为37-65℃，时间为30min到12h，失活温度为不超过80℃，时间为10-45min。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）的Msp I酶切中，缓冲液为Tango缓冲液，作为参照DNA的非甲基化λDNA加入量为样本中DNA质量的大约1%，酶切温度37℃，时间1-6小时，失活温度60-80℃，时间10-30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）的末端修复及加A使用DNA聚合酶Klenow片段，缓冲液为Tango缓冲液，反应温度为37℃，修复时间为20-60min，60-80℃失活5-30min。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）的接头连接使用甲基化接头，用T4 DNA连接酶连接，16℃预连接30min，然后4℃连接过夜或不低于8小时，连接完成后50-75℃处理20min使酶失活；所述接头是一个发夹结构的序列，在发夹的环状结构中有一个U碱基，用USER酶37℃处理20-50min（优选30min）打开所述接头的环状结构。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）中使用重亚硫酸盐进行CT转化，优选使用Invitrogen MethylCode Kit。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）的PCR扩增使用KAPA HiFi U+masterMix、Phusion high-fidelity(HF) PCR master Mix with HF buffer的一种或两种。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，第一次扩增程序如下：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，6-12个循环；72℃，5min；4℃保存；第二次扩增程序如下：98℃，2min；98℃，20s，60℃，30s，72℃，60s，15-21个循环；72℃，5min；4℃保存。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，完成第一次扩增后，扩增产物经过0.5-1.5倍体积XP磁珠纯化。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）中对200-700bp间的目标DNA片段进行回收，优选地，采用1.5-2%TAE或TBE琼脂糖电泳切胶回收。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中使用NGS测序。

15.一种对胚胎进行染色体非整倍性状况及DNA甲基化状况的双重分析的方法，包括使用权利要求1-14中任一项所述的方法对胚胎培养液进行单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序。

16.根据权利要求15所述的方法，还包括根据染色体非整倍性状况及DNA甲基化状况的分析结果对胚胎的发育潜能进行评估的步骤，所述方法用于非诊断目的。