一种基于RAD-seq对胚胎进行无创PGS的方法
技术领域
本发明涉及一种基于RAD-seq对胚胎进行无创PGS的方法。
背景技术
RAD标记是紧连限制性内切酶酶切位点的一段短的DNA序列标签,广泛分布于整个基因组。随着研究的不断深入,基于RAD-seq的技术,根据使用酶的数量及酶的特点又划分为ddRAD、2b-RAD、ezRAD等,这些方法在文库构建的难易程度、酶切标签的基因组覆盖度等方面存在一定差异。
目前,限制性酶切位点相关DNA测序(restriction-site-associated DNAsequencing,RAD-seq)已成功应用于SNP标记的开发、动植物重要经济性状的QTL定位、超高密度遗传图谱的构建、群体遗传结构、系统演化分析和辅助全基因组de novo测序等研究领域。
胚胎植入前非整倍体筛查(Preimplant Genetic Screening,PGS)是辅助生殖中第三代试管婴儿技术的核心技术。通过PGS分析,可以将胚胎中携带有各种非整倍体变异(CVN)的胚胎筛选掉,选择核型正常的胚胎进行移植,大大提高辅助生殖的成功率。
目前用于PGS分析的技术都是基于单细胞全基因组扩增(WGA)建库技术上的。目前主流的WGA技术主要有三种,包括MDA、MALBAC、SurePlex(也称PicoPlex,原理与MALBAC类似)技术。这三种方法,各有优缺点,都能够用于PGS分析,且称为目前业界的主流产品。SurePlex技术相较于其他两种技术,操作简单快速,高稳定性和可重复性,已经成为目前PGS扩增的标准。
2016年有研究者采用MALBAC技术对囊胚培养液中的基因组DNA片段进行全基因组扩增(WGA),通过二代测序分析胚胎染色体的非整倍体,结果显示,无创染色体筛查(NICS)技术的灵敏度为88.2%,特异性为84%,表明囊胚培养液中DNA与胚胎细胞DNA有着密切联系。Liu等报道在对88枚胚胎及对应的培养液进行WGA,发现活检细胞与其对应培养液在D3的一致率为64.52%,D6时检测结果的一致率达到90%,并通单核苷酸多态性(SNP)以及IVSII654基因突变位点分析证实培养液中的cDNA起源于胚胎细胞,可以利用培养液在染色体水平对胚胎的遗传物质进行检测。
综上所述,胚胎培养液中的DNA是存在的,而利用胚胎培养液中DNA进行PGS的最大优势在于取材方便,避免了细胞活检对胚胎发育潜在的影响,能够真正实现单胎移植,降低多胎妊娠的发生率,帮助患者选择遗传物质正常的胚胎。
但是在体外培养过程中多进行单胎培养,一个胚胎的培养液中虽然含DNA但量极少且培养液成分复杂,这使得培养液中DNA的提取及分析非常困难,虽然可以经过WGA扩增增加DNA的含量,但也会出现假阴性结果和假阳性的结果,导致结果误判。因此需要有不同于目前基于WGA的检测体系以改善检测结果。
综上所述,目前主流评价胚胎发育潜能的技术有如下不足:目前主流的PGS采用的是囊胚阶段的滋养层细胞活检,这种活检虽然尚未证明对胚胎及试管婴儿有害,但在操作技术上要求较高,操作不当会引起胚胎停育等后果;滋养层细胞可能存在嵌合的情况,所取少数3-5个细胞可能不能完全代表胚胎,进而造成误判。
因此,急需一种无创检测胚胎发育潜能的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于RAD-seq对胚胎进行无创PGS的方法。
本发明保护一种制备DNA文库的方法,包括以下步骤:以囊胚培养液为样本构建DNA文库;构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断。所述DNA文库为胚胎的DNA文库。
本发明还保护一种对胚胎进行RAD-seq的方法,包括以下步骤:
(1)以囊胚培养液为样本构建DNA文库;构建文库的过程中采用两种限制性内切酶进行基因组DNA的打断;
(2)对步骤(1)构建的DNA文库进行测序。
所述囊胚培养液为将卵裂球期胚胎培养至囊胚成熟阶段后收集的培养液。
所述囊胚培养液的制备方法如下:将卵裂球期胚胎置于囊胚培养基(例如G2培养基)中培养至囊胚成熟阶段,在显微镜下刺激囊胚使囊胚皱缩5-15min,然后取走囊胚,收集剩余的培养液,即为囊胚培养液。所述囊胚培养基具体可为囊胚培养基微滴。所述微滴具体可为5-50μl微滴,更具体可为10-20μl微滴。每个微滴培养一个胚胎。
所述卵裂球期胚胎的制备方法如下:取MⅡ期成熟卵细胞,取精子,采用单精子注射获得受精卵,在卵裂球培养基(例如G1培养基)中培养至卵裂球期。
以囊胚培养液为样本构建DNA文库依次包括如下步骤:
①取囊胚培养液,采用裂解酶进行细胞裂解以释放DNA,然后进行酶灭活;
②加入两种限制性内切酶进行酶切,然后进行酶灭活;
③DNA片段补平和加A;
④加接头;
⑤PCR扩增,得到文库溶液。
所述PCR扩增可为两次PCR扩增。第一次PCR扩增,回收DNA片段。第二次PCR扩增,回收200-500bp的DNA片段。
所述步骤①中,裂解酶的工作浓度可为1-30mg/ml。所述步骤①中,细胞裂解条件可为37-65℃孵育30min-12h。所述步骤①中,酶灭活条件可为60-80℃孵育10-45min。所述步骤①具体为:取囊胚培养液,加入10×buffer A和裂解酶(使buffer A在体系中的浓度为1×,裂解酶在体系中的浓度为2mg/ml),混匀后离心于管底,50℃孵育3h,然后75℃孵育30min。
所述步骤②中,酶切条件可为37℃-75℃处理1-6小时。所述步骤②中,酶灭活条件可为60-80℃孵育10-45min。所述步骤②具体为:取7.5-10μl前一步骤的产物,加入两种限制性内切酶和10×buffer B(体系中,buffer B的浓度为1×,两种限制性内切酶的的含量均为9U),先75℃孵育2h再37℃孵育2h,然后80℃孵育20min。
所述步骤③中,在37℃条件下进行DNA片段补平和加A。所述步骤③具体为:完成前一步骤后,加入Klenow、10×buffer B和末端修复dNTP mix(体系总体积为20μl,用Nuclease-free Water补齐;体系中,Klenow的含量为5U,buffer B的浓度为1×,dATP的浓度为40μM、dCTP的浓度为4μM、dGTP的浓度为4μM),混匀后离心至管底,37℃孵育40分钟,然后75℃孵育15分钟。末端修复dNTP mix提供的有效成分为dATP、dCTP和dGTP。
所述步骤④中,借助T4DNA连接酶加接头。所述步骤④中,先16℃预连接30min,然后4℃连接过夜或不低于8小时。所述步骤④具体为:完成前一步骤后,加入T4DNA Ligase、10×buffer B、ATP和adapter(体系总体积为25μl,用Nuclease-free Water补齐;体系中,T4DNA Ligase的含量为30U,buffer B的浓度为1×,ATP的浓度为1mM,adapter的浓度为0.15μM),混匀,先16℃孵育30分钟然后4℃孵育8小时,然后65℃孵育20min,然后加入1μlUSER酶,37℃孵育30min。
第一次PCR扩增采用的酶可为如下酶中的一种或任意组合:KAPA Phusion high-fidelity(HF)PCR master Mix with HF buffer、KFX HiFi DNA Polymerase、TransTaqDNA Polymerase High Fidelity、Pfu DNA Polymerase。第一次PCR扩增的反应体系可为(50μl):5×KAPA HiFi fridelity buffer 10μl,10mM dNTP Mix 1.5μl,KAPA HiFiHotStart DNA Polymerase 1μl,10μM Universal primer 0.5μl,10μM Index primer 0.5μl,所有前一步骤的产物,用ddH2O补足体积。第一次PCR扩增的反应程序可为:98℃2min;98℃20s、60℃30s、72℃60s,6-12个循环(具体可为6个循环);72℃5min。第一次PCR扩增结束后,用过0.5-1.5×XP磁珠(具体可为0.8×XP磁珠)纯化PCR产物,以32.5μl水洗涤。第一次PCR扩增中,每个样本的DNA片段被加上了独有的标签序列。
第二次PCR扩增采用的酶可为如下酶中的一种或任意组合:KAPA Phusion high-fidelity(HF)PCR master Mix with HF buffer、KFX HiFi DNA Polymerase、TransTaqDNA Polymerase High Fidelity、Pfu DNA Polymerase。第二次PCR扩增的反应体系可为(50μl):5×KAPA HiFi fridelity buffer 10μl,10mM dNTP Mix 1.5μl,KAPA HiFiHotStart DNA Polymerase 1μl,10μM Universal primer 2.5μl,10μM Index primer 2.5μl,32.5μl前一步骤的产物。第二次PCR扩增的反应程序可为:98℃2min;98℃20s、60℃30s、72℃60s,15-21个循环(具体可为18个循环);72℃5min。第二次PCR扩增结束后,用0.8-1.0×XP磁珠(具体可为0.8×XP磁珠)纯化,然后回收200-500bp的DNA片段。
所述两种限制性内切酶可为如下限制性内切酶中的任意两种:MspⅠ、ApekI、EcoRI、Xma I、TaqαI和Hind III。所述两种限制性内切酶具体可为限制性内切酶MspⅠ和限制性内切酶ApekI。
所述测序具体可为NGS测序。
所述测序具体可为Nextseq550单端75循环测序。
测序数据可采用通用PGS分析流程,分析各个样本的染色体非整倍性状态。
根据染色体非整倍性状态分析结果可对胚胎的发育潜能进行评估。
所述方法用于非诊断目的。
本发明还保护一种用于制备DNA文库的试剂盒,包括两种限制性内切酶。所述DNA文库为胚胎的DNA文库。所述两种限制性内切酶可为如下限制性内切酶中的任意两种:MspⅠ、ApekI、EcoR I、Xma I、TaqαI和Hind III。所述两种限制性内切酶具体可为限制性内切酶MspⅠ和限制性内切酶ApekI。所述试剂盒还可包括用于破碎细胞的试剂。所述试剂盒还可包括用于DNA片段补平和加A的试剂。所述试剂盒还可包括用于加接头的试剂。所述试剂盒还可包括用于PCR扩增的试剂和用于DNA片段回收的试剂。所述用于破碎细胞的试剂可为裂解酶。所述用于破碎细胞的试剂具体可为裂解酶和10×buffer A。所述用于DNA片段补平和加A的试剂可为Klenow和末端修复dNTP mix。所述用于DNA片段补平和加A的试剂具体可为Klenow、10×buffer B和末端修复dNTP mix。末端修复dNTP mix提供的有效成分为dATP、dCTP和dGTP。所述用于加接头的试剂可为T4DNA Ligase和adapter。所述用于加接头的试剂具体可为T4DNA Ligase、10×buffer B、ATP、adapter和USER酶。所述用于PCR扩增的试剂可为如下酶中的一种或任意组合:KAPA Phusion high-fidelity(HF)PCR master Mix withHF buffer、KFX HiFi DNA Polymerase、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity、PfuDNA Polymerase。所述用于PCR扩增的试剂具体可为KAPA HiFi HotStart DNAPolymerase、Universal primer和Index primer。所述用于PCR扩增的试剂具体可为5×KAPA HiFi fridelity buffer、dNTP Mix、KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase、Universal primer和Index primer。所述用于DNA片段回收的试剂具体可为XP磁珠,例如0.5-1.5×XP磁珠(具体可为0.8×XP磁珠)、0.8-1.0×XP磁珠(具体可为0.8×XP磁珠)。
本发明还保护一种用于对胚胎进行RAD-seq的试剂盒,包括两种限制性内切酶。所述两种限制性内切酶可为如下限制性内切酶中的任意两种:MspⅠ、ApekI、EcoR I、Xma I、TaqαI和Hind III。所述两种限制性内切酶具体可为限制性内切酶MspⅠ和限制性内切酶ApekI。所述试剂盒还可包括用于破碎细胞的试剂。所述试剂盒还可包括用于DNA片段补平和加A的试剂。所述试剂盒还可包括用于加接头的试剂。所述试剂盒还可包括用于PCR扩增的试剂和用于DNA片段回收的试剂。所述用于破碎细胞的试剂可为裂解酶。所述用于破碎细胞的试剂具体可为裂解酶和10×buffer A。所述用于DNA片段补平和加A的试剂可为Klenow和末端修复dNTP mix。所述用于DNA片段补平和加A的试剂具体可为Klenow、10×buffer B和末端修复dNTP mix。末端修复dNTP mix提供的有效成分为dATP、dCTP和dGTP。所述用于加接头的试剂可为T4DNA Ligase和adapter。所述用于加接头的试剂具体可为T4DNA Ligase、10×buffer B、ATP、adapter和USER酶。所述用于PCR扩增的试剂可为如下酶中的一种或任意组合:KAPA Phusion high-fidelity(HF)PCR master Mix with HF buffer、KFX HiFiDNA Polymerase、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity、Pfu DNA Polymerase。所述用于PCR扩增的试剂具体可为KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase、Universal primer和Index primer。所述用于PCR扩增的试剂具体可为5×KAPA HiFi fridelity buffer、dNTPMix、KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase、Universal primer和Index primer。所述用于DNA片段回收的试剂具体可为XP磁珠,例如0.5-1.5×XP磁珠(具体可为0.8×XP磁珠)、0.8-1.0×XP磁珠(具体可为0.8×XP磁珠)。
本发明还保护一种用于胚胎植入前非整倍体筛查的试剂盒,包括两种限制性内切酶。所述两种限制性内切酶可为如下限制性内切酶中的任意两种:MspⅠ、ApekI、EcoRI、XmaI、TaqαI和Hind III。所述两种限制性内切酶具体可为限制性内切酶MspⅠ和限制性内切酶ApekI。所述试剂盒还可包括用于破碎细胞的试剂。所述试剂盒还可包括用于DNA片段补平和加A的试剂。所述试剂盒还可包括用于加接头的试剂。所述试剂盒还可包括用于PCR扩增的试剂和用于DNA片段回收的试剂。所述用于破碎细胞的试剂可为裂解酶。所述用于破碎细胞的试剂具体可为裂解酶和10×buffer A。所述用于DNA片段补平和加A的试剂可为Klenow和末端修复dNTP mix。所述用于DNA片段补平和加A的试剂具体可为Klenow、10×buffer B和末端修复dNTP mix。末端修复dNTP mix提供的有效成分为dATP、dCTP和dGTP。所述用于加接头的试剂可为T4DNA Ligase和adapter。所述用于加接头的试剂具体可为T4DNA Ligase、10×buffer B、ATP、adapter和USER酶。所述用于PCR扩增的试剂可为如下酶中的一种或任意组合:KAPA Phusion high-fidelity(HF)PCR master Mix with HF buffer、KFX HiFiDNA Polymerase、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity、Pfu DNA Polymerase。所述用于PCR扩增的试剂具体可为KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase、Universal primer和Index primer。所述用于PCR扩增的试剂具体可为5×KAPA HiFi fridelity buffer、dNTPMix、KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase、Universal primer和Index primer。所述用于DNA片段回收的试剂具体可为XP磁珠,例如0.5-1.5×XP磁珠(具体可为0.8×XP磁珠)、0.8-1.0×XP磁珠(具体可为0.8×XP磁珠)。
本发明还保护两种限制性内切酶在制备用于制备DNA文库的试剂盒中的应用。所述DNA文库为胚胎的DNA文库。所述两种限制性内切酶可为如下限制性内切酶中的任意两种:MspⅠ、ApekI、EcoR I、Xma I、TaqαI和Hind III。所述两种限制性内切酶具体可为限制性内切酶MspⅠ和限制性内切酶ApekI。
本发明还保护两种限制性内切酶在制备用于对胚胎培养液进行RAD-seq的试剂盒中的应用。所述两种限制性内切酶可为如下限制性内切酶中的任意两种:MspⅠ、ApekI、EcoRI、Xma I、TaqαI和Hind III。所述两种限制性内切酶具体可为限制性内切酶MspⅠ和限制性内切酶ApekI。
本发明还保护两种限制性内切酶在制备用于胚胎植入前非整倍体筛查的试剂盒中的应用。所述两种限制性内切酶可为如下限制性内切酶中的任意两种:MspⅠ、ApekI、EcoRI、Xma I、TaqαI和Hind III。所述两种限制性内切酶具体可为限制性内切酶MspⅠ和限制性内切酶ApekI。
所述囊胚为人囊胚。
所述胚胎为人胚胎。
所述卵细胞为人卵细胞。
所述精子为人精子。
以上任一所述裂解酶可为如下酶的任意一种:蛋白酶、蛋白酶K、QiagenProtease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和溶菌酶。
以上任一所述裂解酶也可为如下酶的任意几种的组合:蛋白酶、蛋白酶K、QiagenProtease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和溶菌酶。
10×Buffer A为10×裂解缓冲液。10×Buffer A包括如下组分:2-200mM Tris-EDTA、1-50mM KCl、0.1%-5%(质量百分含量)的表面活性剂。所述表面活性剂为如下物质中的一种或任意组合:Triton X-100、SDS、Tween-20和NP40。10×Buffer A具体可为:含25mM KCl和2.5%(质量百分含量)Triton X-100的10×Tris-EDTA缓冲液。
10×Buffer B包括:10-40mM Tris-acetate,1-10mM乙酸镁,1-100mM乙酸钾,0.1-1mg/ml BSA。10×buffer B具体可为:含20mM Tris-acetate、5mM乙酸镁,50mM乙酸钾,0.5mg/ml BSA,余量为水。
本发明提供了一种基于限制性酶切位点相关DNA测序(restriction-site-associated DNA sequencing,RAD-seq)技术对胚胎培养液进行染色体非整倍体分析的方法。本发明采用“试管婴儿”操作中的囊胚培养液为原料,对胚胎的染色体非整倍性状况进行分析,进而评估胚胎的发育潜能,为在辅助生殖中选择“正确”的胚胎提供了新的方法。
附图说明
图1为囊胚培养液样本A进行步骤二和步骤三后的结果。
图2为细胞样本A进行步骤四后的结果。
图3为囊胚培养液样本B进行步骤二和步骤三后的结果。
图4为细胞样本B进行步骤四后的结果。
图5为囊胚培养液样本C进行步骤二和步骤三后的结果。
图6为细胞样本C进行步骤四后的结果。
图7为囊胚培养液样本D进行步骤二和步骤三后的结果。
图8为细胞样本D进行步骤四后的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
G1培养基(卵裂球培养基):William A Cook Austrialia Pty Ltd。
G2培养基(囊胚培养基):William A Cook Austrialia Pty Ltd。
蛋白酶(Protease):QIAGEN公司,货号为19155,7.5Anson units per vial(7.5g)。产品链接:https://www.qiagen.com/us/shop/lab-basics/enzymes/qiagen-protease/#orderin ginformation。
Klenow(3′→5′exo-):enzymatics公司,货号为P7010-LC-L,5000U/ml。产品链接:http://www.enzymatics.com/products/klenow-3-5-exo-low-concentration/。
T4DNA Ligase:Thermo scientific公司,货号为EL0013,30U/μL。产品链接:https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/EL0013?SID=srch-hj-EL0013。
USER酶、adapter、Universal primer和Index primer均为NEB的货号为E7335L的试剂盒中的组件。NEB的货号为E7335L的试剂盒的产品链接:https://international.neb.com/search#q=e7335s&t=_BD3F1B0F-DB56-4EF7-AC3E-FEAA9BDC74A4&sort=relevancy。
10×Buffer A:含25mM KCl和2.5%(质量百分含量)Triton X-100的10×Tris-EDTA缓冲液。
10×buffer B:含20mM Tris-acetate、5mM乙酸镁,50mM乙酸钾,0.5mg/ml BSA,余量为水。
实施例、
一、样本获取
1、选取合格的人的MⅡ期成熟卵细胞(尽可能将附着于卵细胞外的颗粒细胞彻底拆除),选取健康的人的精子,采用单精子注射获得受精卵(制备四个受精卵,依次命名为样本A、样本B、样本C和样本D),在G1培养基中培养至卵裂球期,将胚胎于新鲜G2培养基内洗涤数次以去除可能的残留颗粒细胞。
2、完成步骤1后,将胚胎转入新鲜的G2培养基微滴中,每个10-20μl微滴用于培养一个胚胎,培养至囊胚成熟阶段,在显微镜下刺激囊胚使囊胚皱缩5-15min,然后一方面将囊胚转入新的G2培养基取滋养层细胞(即为细胞样本,按照与受精卵对应的关系,依次命名为细胞样本A、细胞样本B、细胞样本C和细胞样本D)后进入冷冻流程,另一方面将剩余的囊胚培养液(10-20μl)收集于PCR管中(即为囊胚培养液样本,按照与受精卵对应的关系,依次命名为囊胚培养液样本A、囊胚培养液样本B、囊胚培养液样本C和囊胚培养液样本D)。
二、RAD-seq文库构建
1、裂解细胞释放DNA
取步骤一得到的囊胚培养液样本,加入10×buffer A和蛋白酶(使buffer A在体系中的浓度为1×,蛋白酶在体系中的浓度为2mg/ml),混匀后离心于管底,50℃孵育3h(目的是裂解细胞释放DNA),然后75℃孵育30min(目的是使酶失活)。
2、DNA打断
完成步骤1后,取7.5-10μl产物,加入限制性内切酶MspⅠ、限制性内切酶ApekI和10×buffer B(体系中,buffer B的浓度为1×,限制性内切酶MspⅠ、限制性内切酶ApekI的含量均为9U),先75℃孵育2h再37℃孵育2h,然后80℃孵育20min(目的是使酶失活)。
3、DNA片段补平和加A
完成步骤2后,加入Klenow、10×buffer B和末端修复dNTP mix(体系总体积为20μl,用Nuclease-free Water补齐;体系中,Klenow的含量为5U,buffer B的浓度为1×,dATP的浓度为40μM、dCTP的浓度为4μM、dGTP的浓度为4μM),混匀后离心至管底,37℃孵育40分钟,然后75℃孵育15分钟(目的是使酶失活)。
末端修复dNTP mix提供的有效成分为dATP、dCTP和dGTP。
4、加接头
完成步骤3后,加入T4DNA Ligase、10×buffer B、ATP和adapter(体系总体积为25μl,用Nuclease-free Water补齐;体系中,T4DNA Ligase的含量为30U,buffer B的浓度为1×,ATP的浓度为1mM,adapter的浓度为0.15μM),混匀,先16℃孵育30分钟然后4℃孵育8小时,然后65℃孵育20min(目的是使酶失活),然后加入1μl USER酶,37℃孵育30min。
5、进行第一次PCR扩增,然后用0.8×XP磁珠纯化PCR产物,以32.5μl水洗涤。
反应体系(50μl):5×KAPA HiFi fridelity buffer 10μl,10mM dNTP Mix 1.5μl,KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 1μl,10μM Universal primer 0.5μl,10μMIndex primer 0.5μl,所有步骤4的产物,用ddH2O补足体积。
反应程序:98℃2min;98℃20s、60℃30s、72℃60s,6个循环;72℃5min;4℃保存。
每个样本的DNA片段被加上了独有的标签序列。
6、进行第二次PCR扩增,然后用0.8×XP磁珠纯化,然后回收200-500bp的DNA片段,得到文库溶液。
反应体系(50μl):5×KAPA HiFi fridelity buffer 10μl,10mM dNTP Mix 1.5μl,KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 1μl,10μM Universal primer 2.5μl,10μMIndex primer 2.5μl,32.5μl步骤5的产物。
反应程序:98℃2min;98℃20s、60℃30s、72℃60s,18个循环;72℃5min;4℃保存。
三、进行PGS测序分析染色体状态
1、取步骤二制备的文库溶液,用去离子水调整浓度,得到DNA浓度为2nM的样本溶液。
2、将各个样本溶液混合,然后采用Nextseq550单端75循环测序。
获得的数据采用通用PGS分析流程,分析各个样本的染色体非整倍性状态。
四、sureplex-veriseq法检测细胞样本
取步骤一得到的细胞样本,采用SurePlex DNA Amplification System和VeriSeqPGS Kit并按说明书操作,通过sureplex-veriseq法检测细胞样本。
SurePlex DNA Amplification System的产品链接:https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/sureplex.html。
VeriSeq PGS Kit(Illumina公司产品)的产品链接:https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/veris eq-pgs.html。
图1为囊胚培养液样本A进行步骤二和步骤三后的结果。图2为细胞样本A进行步骤四后的的结果。样本A为女性正常。
图3为囊胚培养液样本B进行步骤二和步骤三后的结果。图4为细胞样本B进行步骤四后的的结果。样本B为男性正常。
图5为囊胚培养液样本C进行步骤二和步骤三后的结果。图6为细胞样本C进行步骤四后的的结果。样本C为男性异常。
图7为囊胚培养液样本D进行步骤二和步骤三后的结果。图8为细胞样本D进行步骤四后的的结果。样本D为女性异常。
从图1/图2、图3/图4、图5/图6、图7/图8的PGS散点图可以发现,对于样本A、样本B、样本C和样本D来说,囊胚培养液和滋养层细胞进行PGS分析的结果复合度相当高,都可以对胚胎的染色体状态做出准确的判断。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其它各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。