CN105296602B - 一种快速构建血浆dna测序文库的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于构建血浆DNA测序文库的方法，包括以下步骤：1)抽提血浆DNA；2)任选将血浆DNA进行末端补平，获得末端补平后的血浆DNA；3)将任选末端补平后的血浆DNA进行3’悬A，获得3’悬A后的血浆DNA；4)将3’悬A后的血浆DNA与测序接头连接，获得连接产物；5)对连接产物进行纯化，获得纯化产物。本发明也提供用于构建血浆DNA测序文库的试剂盒。本发明大大简化了血浆DNA测序文库的构建流程，除去了由于PCR扩增造成的环境以及样本间的污染，降低了血浆DNA文库构建对环境的要求，同时也除去了由于PCR过程造成的基因组覆盖的不均一性，使得血浆样本文库构建更加低成本、高效、快速，血浆DNA测序结果更加真实、有效。
Description
技术领域
本发明涉及用于构建血浆DNA测序文库的方法和试剂盒，更具体地，本发明涉及用于构建高通量测序的血浆DNA文库构建的方法和试剂盒。
背景技术
随着科技的进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对基因组测序，需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，高通量测序(也称第二代测序)技术应运而生。高通量测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等。到目前为止，HiSeq2000每个run可以达到6个人基因组30X覆盖的测序通量，约600G/run数据，在测序时间上Hiseq2500可以达到平均每8分钟读取一个碱基的速度。而且随着第二代测序技术的成熟，将其应用于临床的研究迅猛发展。
血浆DNA又称循环DNA，是血液中的细胞外DNA，长约几十到几百核苷酸，可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在，也可以是游离的DNA片段。正常情况下，血浆DNA来源于少量衰老死亡细胞的DNA释放。健康状态下，循环DNA的生成与清除处于动态平衡状态，维持在较恒定的低水平。循环DNA能反映人体内细胞新陈代谢的状况，是健康评判的一个重要指标。外周血循环DNA量和质的改变与多种疾病(包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、器官功能衰竭等)关系密切，作为一种无创性检测指标，有望成为某些疾病早期诊断、病情监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。
自从母体血液中的胚胎DNA被发现之后，无创伤地直接诊断和检测胚胎染色体异常性成了一个重大的研究课题。2008年，卢煜明教授及其团队率先使用高通量测序检测孕妇血浆DNA，统计染色体比例关系，血浆中微量的胚胎DNA的染色体数目的变化能被检测出来(Chiu，Chan et al.2008)。随着检测技术的逐渐完善成熟，各国都在致力于将该实验室技术转为临床应用。另有研究发现，癌症病人的癌细胞凋亡产物(包括断裂游离的癌细胞DNA)会释放到的血液中，随血液循环系统运送到全身，血浆DNA中携带有癌细胞基因组的全部遗传信息(Schwarzenbach，Hoon et al.2011)。近期，卢煜明教授发现通过对癌症病人血浆DNA进行高通量测序，以统计重复区甲基化状况，可以有效区分癌症患者和健康人群(Chan，Jiang et al.2013)。
测序效率的提升和多样品混合测序的普及对样品的制备效率提出了更高的要求，特别是大量临床样品制备；而现有的临床血浆样品制备方法的发展一直赶不上测序能力的提高。因此，第二代高通量测序临床血浆DNA样品的制备效率和成本，成为高通量测序能否得以普及的关键。
第二代高通量测序的血浆DNA样品的制备过程本质上是将符合测序长度的DNA插入到已有的测序载体中，即在待测序DNA两端连上已知的测序接头序列。目前血浆DNA文库的构建主要包括先将提取的血浆DNA进行末端修复及5’末端磷酸化、然后进行末端悬A、连接接头、PCR等主要步骤(图1)，其中，在各个步骤之间几乎都需要进行纯化步骤。这种血浆DNA测序文库的构建方法共需要6种主要的酶，4种酶反应体系，并经过4次清洁纯化，因而成本较高，操作复杂，对环境要求苛刻，易形成气溶胶的污染，同时对实验者分子生物学的操作能力要求很高，实现多样品同时处理的难度较大。此外，PCR过程导致的气溶胶污染极易造成测序样本的污染，同时PCR过程也会引入一定的碱基偏好性，从而测序结果在基因组上的覆盖度也会不均匀，导致最终判定结果的不准确性。
发明内容
鉴于目前血浆DNA测序文库构建过程中所遇到的问题，本发明人发现了新的更加简化、更加快速、更加均一的血浆DNA测序文库的构建方法，其可适用于多种第二代测序平台，包括但不限于如Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和Life Technologies/SOLIDsystem、PGM、Proton等测序平台。
本发明是基于以下的事实：本发明人发现，血浆DNA连接上测序接头后无须经过PCR扩增即可进行上机测序，现有实验流程的PCR扩增步骤并不是必需的，也无需使用PCR反应聚合酶。本发明人还发现现有实验流程中的末端补平、末端悬A和连接测序接头三步可以在一个反应体系中完成，中间不需经过纯化步骤且血浆DNA末端补平过程可不经5’末端磷酸化处理，最终连接反应纯化后即可得到待上机测序的文库。依据本发明，生物体内断裂的血浆DNA在低至2ng的条件下依然可以构建出很好的血浆DNA文库，得到有效的测序结果，而且本发明第一次将PCR free技术应用于极低量(小于10ng)血浆DNA。
因此，本发明的一个方面是提供一种用于构建血浆DNA测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)抽提血浆DNA；
2)任选将血浆DNA进行末端补平，获得末端补平后的血浆DNA；
3)将任选末端补平后的血浆DNA进行3’悬A，获得3’悬A后的血浆DNA；
4)将3’悬A后的血浆DNA与测序接头连接，获得连接产物；
5)对连接产物进行纯化，获得纯化产物。
因此，根据本发明，纯化产物不需PCR扩增反应步骤即可获得所述血浆DNA测序文库。
根据本发明一个优选的实施方式，上述将3’悬A后的血浆DNA与测序接头连接以获得连接产物的步骤4)通过选自以下的一种或两种酶来进行：T4DNA连接酶和T7DNA连接酶。
根据本发明一个优选的实施方式，所述测序接头为双链的测序接头。
本发明中所述双链接头是由两条单链DNA退火而得，其中一条为通用序列，即该条DNA的序列是固定的，在不同的文库应用中是完全一致的，如下文中所示通用适配子(universal adaptor)。另外一条为带有index的序列，即该条DNA的序列有自己特定的碱基，一般3-8个特定碱基，用以区分不同的接头序列，特定碱基之外的序列是固定的，如下文中所示index适配子。
本发明中所用接头序列示例如下：
UniversalAdapter
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’
Indexadaptor
5’GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
上述仅仅是适用于本发明的接头序列的一个示例。本领域的技术人员可以根据测序平台的不同，例如Illumina，Ion Torrent，Roche454为本发明的血浆DNA文库连接不同和合适的接头序列。
根据本发明一个实施方式，在所述抽提血浆DNA之后、但在所述将血浆DNA与测序接头连接之前，对抽提得到的血浆DNA进行末端悬A并对经末端悬A的血浆DNA进行纯化。优选地，所述末端悬A采用klenow ex-酶、或Taq酶、或klenow ex-酶与Taq酶的组合。优选地，末端悬A和测序接头的连接可以在一个反应体系中进行，即，在末端悬A后可无需进行纯化，而是直接进行测序接头的连接，连接反应之后对血浆DNA进行纯化，即可得到待上机测序的血浆DNA文库。其中末端悬A采用Taq酶。
根据本发明另一个实施方式，在所述抽提血浆DNA之后、但在所述将血浆DNA与测序接头连接之前，对抽提得到的血浆DNA进行末端补平和末端悬A。其中，所述末端补平和所述末端悬A可以在两个反应体系中进行，即，在末端补平后，需经过纯化后再进行末端悬A；可替换地且为优选地，所述末端补平和所述末端悬A在一个反应体系中进行，在末端补平和末端悬A之后对血浆DNA进行纯化，其中所述末端补平采用T4DNA聚合酶，所述末端悬A采用Taq酶；或者更加优选地，所述末端补平和所述末端悬A、以及所述将血浆DNA与测序接头连接三者仅仅在一个反应体系中进行，连接反应之后对血浆DNA进行纯化，即可得到待上机测序的血浆DNA文库。在最优选的实施方式中，血浆DNA只需一个反应体系，一步纯化即可得到最终的测序文库。其中所述末端补平采用T4DNA聚合酶，所述末端悬A采用Taq酶。
本发明的另一个方面是提供一种用于构建血浆DNA测序文库的试剂盒，包含：
-任选地将血浆DNA进行末端补平的试剂，包括dNTP、用于末端补平的酶、和末端补平缓冲液；
-进行3’悬A的试剂，包括dATP、用于末端悬A的酶、和末端悬A缓冲液；
-与测序接头连接的试剂，包括测序接头、连接酶、和连接缓冲液；和
-对连接产物进行纯化的试剂和装置。
因此，根据本发明，所述试剂盒不需要包含用于PCR扩增反应的聚合酶。
根据本发明一个实施方式，本发明提供一种用于构建血浆DNA测序文库的试剂盒，所述试剂盒的一个重要特征在于，与所述接头连接之后的血浆DNA经纯化后即为待上机测序文库，无需经过PCR扩增的步骤。
根据本发明的试剂盒，优选地，所述连接酶为选自以下中的一种或两种：T4DNA连接酶、T7DNA连接酶。
根据本发明的试剂盒，所述测序接头为双链的测序接头。
在一种实施方式中，优选地，所述用于末端悬A的酶为klenow ex-酶、或Taq酶、或klenow ex-酶与Taq酶的组合。
在另一种实施方式中，本发明的试剂盒包含：--对抽提得到的血浆DNA进行末端补平和末端悬A的试剂，包括用于末端补平的酶、dNTP、末端补平缓冲液、dATP、用于末端悬A的酶、末端悬A缓冲液；以及在末端补平和末端悬A之后对血浆DNA进行纯化的试剂和器械；其中，所述末端补平和所述末端悬A在一个反应体系中进行，且所述用于末端补平的酶为T4DNA聚合酶，所述用于末端悬A的酶为Taq酶。
在又一种实施方式中，本发明的试剂盒包含：--对抽提得到的血浆DNA进行末端补平和末端悬A的试剂，包括用于末端补平的酶、dNTP、末端补平缓冲液、dATP、用于末端悬A的酶、末端悬A缓冲液；以及将血浆DNA与测序接头连接的试剂，包括测序接头、连接酶、和连接缓冲液；其中，所述末端补平和所述末端悬A、以及所述将血浆DNA与测序接头连接在一个反应体系中进行，且所述用于末端补平的酶为T4DNA聚合酶，所述用于末端悬A的酶为Taq酶。
根据一种实施方式，本发明所述试剂盒不包含用于PCR扩增反应的聚合酶，也可以不包含末端修复以及3’悬A后的纯化试剂及装置。
根据一种实施方式，所述对连接产物进行纯化的试剂选自无菌dH2O或洗脱缓冲液；对连接产物进行纯化的装置选自纯化柱、Qiagen 柱、纯化磁珠或Beckman Ampure XPbeads。
本发明基于连接接头之后的血浆DNA可以上机测序这一发现，在现有血浆DNA测序文库的构建方法中省却了PCR反应步骤，也不再使用PCR反应聚合酶。并且，在此基础上，本发明优选通过利用普通的Taq聚合酶代替klenow ex-酶进行末端悬A步骤，使得多种反应体系可以兼容，由此可以将末端补平、末端悬A、连接接头的步骤仅仅在一个反应体系中完成，省却了中间的纯化步骤。因此本发明大大简化了血浆DNA测序文库的构建流程，降低了由于人为操作导致的样本混淆及污染，更适合血浆DNA文库构建的大规模操作。同时本发明除去了由于PCR扩增造成的环境以及样本间的污染，降低了血浆DNA文库构建对环境的要求，同时也除去了由于PCR扩增过程造成的碱基偏好性和基因组覆盖的不均一性以及测序结果的不准确性。本发明使得血浆样本文库构建更加低成本、高效、快速，血浆DNA测序结果更加真实、有效。因此，本发明更适合于大规模实验操作和血浆DNA序列分析。
附图说明
图1示出了现有技术中普遍采用的第二代高通量血浆DNA测序文库的构建方法。
图2示出了根据本发明的一种实施方式的第二代高通量血浆DNA测序文库的构建方法。
图3示出了现有技术以及根据本发明的一种实施例两种不同文库构建方式的比较。
图4示出了根据本发明实施例1-4的四种不同文库构建方式的比较。
具体实施方式
如前文所述，目前适用于第二代高通量测序平台的血浆DNA文库的构建，主要包括以下步骤(请参见附图1)：提取血浆DNA(步骤101)→对提取的血浆DNA进行末端修复(补平)、5’末端磷酸化、并纯化(步骤102)→对5’磷酸化平末端DNA片断进行3’悬A、并纯化(步骤103)→使3’悬A的DNA与测序接头连接(步骤104)→对连接产物进行纯化，以去除未连接的接头(步骤105)→对纯化后的产物进行聚合酶链反应(PCR)(步骤106)→对PCR产物进行纯化，以获得血浆DNA测序文库(步骤107)。其中，在各个步骤之间几乎都需要进行纯化步骤，并且血浆DNA最终需要经过PCR扩增反应。因此，在第二代血浆DNA测序文库的构建方法中共需要6种主要的酶，4种酶反应体系，并经过4次清洁纯化，1次PCR扩增反应。因而成本较高，操作复杂，对环境要求苛刻，易形成气溶胶的污染，同时对实验者分子生物学的操作能力要求很高，实现多样品同时处理的难度较大。此外，PCR过程导致的气溶胶污染极易造成测序样本的污染，同时PCR过程也会引入一定的碱基偏好性，从而测序结果在基因组上的覆盖度也会不均匀，导致最终判定结果的不准确性。
本发明人经过反复的实验发现，连接接头之后的血浆DNA无需进行PCR扩增即可进行上机测序，现有实验流程中的PCR扩增步骤并不是必需的。因此，本发明构建血浆DNA测序文库的一个重要特点是不包含PCR扩增步骤。
在此基础上，本发明人还发现，依赖于对末端悬A中所用酶的选择，现有实验流程中的末端补平、末端悬A和连接测序接头三步反应可以不必在三个反应体系中进行，而是可以仅仅在一个反应体系中进行，中间不需要纯化步骤。
图2示出了根据本发明的一种实施方式的第二代高通量血浆DNA测序文库的构建方法，其主要包括以下步骤：提取血浆DNA(步骤201)→对提取的血浆DNA进行末端补平悬A(步骤203)→对3’悬A的血浆DNA与测序接头进行连接(步骤204)→对连接接头之后的血浆DNA进行纯化，以获得血浆DNA测序文库(步骤207)。根据本发明的另一种实施方式，步骤203还可以在两个反应体系中完成，既先进行步骤202--对抽提的血浆DNA进行末端修复、5’末端磷酸化，再进行步骤203--对5’磷酸化平末端DNA片断进行3’悬A；或者在步骤203和步骤204之间经过纯化。
与现有技术中用于构建血浆DNA测序文库的方法相比，本发明的方法只需一个反应体系，一步纯化，而且无需PCR过程，即可得到最终的上机测序文库，显著地简化了血浆DNA测序文库的构建流程，除去了由于PCR步骤引入的碱基偏好性以及基因组覆盖度的不均匀，从而使得血浆样品文库的构建更加低成本、高效、快速，血浆DNA的测序结果更加真实有效，便于大规模使用。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
实施例1的血浆DNA测序文库的构建方法主要包括以下步骤(请参考图4)：
(1)抽提血浆DNA：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于抽提血浆DNA的方法、和试剂进行此步骤。
(2)末端补平，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于末端补平以及随后清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可利用T4DNA聚合酶、Klenow酶作为用于末端补平的酶。
(3)末端悬A，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于末端悬A以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可以使上步产物在klenow ex-(New England Biolabs)(是一种改进的Klenow酶，其3’-5’外切活性缺失)的作用下将双链末端悬出A碱基。
(4)与测序接头连接，之后对产物进行清洁纯化，即可得到血浆DNA测序文库：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于连接接头以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可在T4DNA连接酶、T7DNA连接酶或两种酶的组合的作用下，使末端悬A产物与双链测序接头连接。其中，测序接头可商购或自行合成而获得。
本发明中所用接头序列示例如下：
UniversalAdapter
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’
Indexadaptor
5’GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
此外，在高通量测序之前，还需要对上述文库进行以下操作：
(5)利用qPCR方法对测序文库进行定量；文库浓度需大于等于20pM方可上机。
(6)根据上机通道的安排及标签序列的不同将样品等量混合；
(7)样品上机。
以下示出利用根据本发明实施例1的方法进行血浆DNA样品测序的一个具体实例。
步骤1：抽提血浆DNA约5ng。
步骤2：制备如表1所示的末端补平反应混合液，在20℃温浴30分钟；在纯化柱上纯化DNA样品，并在32μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。其中，本文中所使用的洗脱缓冲液为10mM Tris-Cl，pH8.0，但适用于本发明的洗脱缓冲液并不局限于此。
表1
步骤3：制备如表2所示的用于在3’加多聚腺嘌呤尾的反应混合液，在37℃温浴30分钟；在纯化柱上纯化DNA样品，并在37μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表2
步骤4：制备如表3所示的DNA片段连接测序接头的反应混合液，在20℃温浴15分钟，65℃温浴10分钟，保持在4℃；用Beckman Ampure XP beads回收连接后的血浆DNA样本，并用22μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表3
步骤5：文库定量及混合：取1μL文库qPCR定量，文库浓度大于等于20pM为质控合格；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取1μL混合样品qPCR定量。
步骤6：上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM；按照Illmina Hiseq2000操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例1构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。
实施例2
实施例2的血浆DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例1，不同之处在于，实施例2省却了末端补平的步骤，将抽提得到的血浆DNA直接进行末端悬A、并纯化(请参考图4)。
以下示出利用根据本发明实施例2的方法进行血浆DNA样品测序的一个具体实例。
步骤1：抽提血浆DNA约5ng。
步骤2：制备如表4所示的反应混合液，在37℃温浴30分钟，以在DNA片段的3’末端加多聚腺嘌呤尾；在柱上纯化DNA样品，并在37μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表4
步骤3：制备如表5所示的DNA片段连接测序接头的反应混合液，在20℃温浴15分钟，65℃温浴10分钟，保持在4℃；用Beckman Ampure XP beads回收连接后的血浆DNA样本，并用22μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表5
步骤4：文库定量及混合：取1μL文库qPCR定量，文库浓度大于等于20pM为质控合格；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取1μL混合样品qPCR定量。
步骤5：上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM；按照Illmina Hiseq2000操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例2构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。
实施例3
实施例3的血浆DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例1，不同之处在于，在实施例3中，末端补平和末端悬A在一个反应体系中进行，末端补平和末端悬A之间不进行清洁纯化步骤，其中末端悬A采用普通Taq酶代替常用的klenow ex-酶，以使两种反应的缓冲体系得以兼容(请参考图4)。
以下示出利用根据本发明实施例3的方法进行血浆DNA样品测序的一个具体实例。
步骤1：抽提血浆DNA约5ng。
步骤2：制备如表6所示的反应混合液，在37℃温浴20分钟(末端补平)，并在72℃温浴20分钟(末端悬A)，从而在一个反应体系中进行末端补平和末端悬A；在纯化柱上纯化DNA样品，并在37μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。根据适用于不同设计需要的不同的反应混合液的组成，末端补平和末端悬A的温度和时间可以有所不同。
表6
步骤3：制备如表7所示的DNA片段连接测序接头的反应混合液，在20℃温浴15分钟，65℃温浴10分钟，保持在4℃；用Beckman Ampure XP beads回收连接后的血浆DNA样本，并用22μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表7
步骤4：文库定量及混合：取1μL文库qPCR定量，文库浓度大于等于20pM为质控合格；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取1μL混合样品qPCR定量。
步骤5：上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM；按照Illmina Hiseq2000操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例3构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。
实施例4
实施例4的血浆DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例1，不同之处在于，在实施例4中，末端补平、和末端悬A、以及与测序接头的连接，三者在一个反应体系中进行，末端补平和末端悬A之间、以及末端悬A和测序接头连接之间不进行清洁纯化步骤，其中末端悬A采用普通Taq酶代替常用的klenow ex-酶，以使三种反应的缓冲体系得以兼容(请参考图4)。
以下示出利用根据本发明实施例4的方法进行血浆DNA样品测序的一个具体实例。
步骤1：抽提血浆DNA约5ng。
步骤2：制备如表8所示的反应混合液，在37℃温浴20分钟(末端补平)，72℃温浴20分钟(末端悬A)，以完成末端补平和末端悬A，此时不进行纯化步骤。
表8
步骤3：向上步反应溶液中加入另外的反应试剂，制备如表9所示的DNA片段连接测序接头的反应混合液，在20℃温浴15分钟，65℃温浴10分钟，保持在4℃；用Beckman AmpureXP beads回收连接后的血浆DNA样本，并用22μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表9
步骤4：文库定量及混合：取1μL文库qPCR定量，文库浓度大于等于20pM为质控合格；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取1μL混合样品qPCR定量。
步骤5：上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM；按照Illmina Hiseq2000操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例4构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。
此外，本发明还提供用于根据本发明的实施例1-4构建血浆DNA测序文库的试剂盒。根据不同的实施例，该试剂盒可包含用于对血浆DNA末端进行补平修复的酶；用于为DNA的3’端加上腺嘌呤的酶，包括T4DNA聚合酶、Klenow酶、DNA聚合酶、Taq酶和klenow ex-(3’-5’外切活性缺失)；用于接头连接的酶，包括T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、或它们的组合；和各种酶所需要的缓冲液；以及末端补平所需的dNTP、末端悬A所需的dATP、接头连接所需的双链测序接头等等。
由于本发明发现在血浆DNA测序文库的构建中可以不进行PCR扩增反应步骤，因而，本发明试剂盒的一个重要特征是，可以不包含对血浆DNA进行PCR扩增反应的聚合酶。
此外，由于本发明通过采用Taq酶进行末端悬A，可以实现末端补平和末端悬A在一个反应体系中进行，或者末端补平和末端悬A、连同测序接头连接三步反应在一个反应体系中进行，因而，本发明的试剂盒可以不包含末端补平后纯化的试剂和器械和/或不包含末端悬A后纯化的试剂和器械，从而可降低文库构建成本，简化了文库构建流程。
本发明的试剂盒在必要情况下，还包含用于纯化末端补平产物的试剂和器械；用于纯化末端悬A产物的试剂和器械；用于纯化测序接头连接产物的试剂和器械；纯化试剂可包括无菌dH2O或洗脱缓冲液；纯化器械可包括纯化柱、Qiagen柱、纯化磁珠、BeckmanAmpure XP beads。所使用的纯化试剂和器械不局限本文中所列出的具体的试剂和器械，本领域中常用的各种纯化试剂和器械均可根据技术人员的判断而应用于本发明中。
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。例如，上述末端悬A步骤和连接测序接头的步骤也可以两反应一体系进行，即，可以对提取的血浆DNA进行末端悬A步骤，在其后无需进行纯化步骤，可直接进行连接接头的步骤。另外，虽然示出的用于连接测序接头的酶为T4DNA连接酶和/或T7DNA连接酶，但还可以单独使用T7DNA连接酶或其与T4DNA连接酶的组合。而血浆DNA测序文库构建中所涉及的反应缓冲液等可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (8)
1.用于第二代高通量测序平台的血浆DNA测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)抽提得到小于10ng的血浆DNA；
2)将血浆DNA进行末端补平，获得末端补平后的血浆DNA；
3)将末端补平后的血浆DNA进行3’悬A，获得3’悬A后的血浆DNA；
4)将3’悬A后的血浆DNA与测序接头连接，获得连接产物；
5)对连接产物进行纯化，获得纯化产物，
其中所述纯化产物不需PCR扩增反应步骤即可获得所述血浆DNA测序文库，
其中所述步骤2)和3)在一个反应体系中进行，中间没有纯化步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)通过选自以下的一种或两种酶来进行：T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序接头为双链的测序接头。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3’悬A采用klenow ex-酶、Taq酶、或klenow ex-酶与Taq酶的组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)采用T4 DNA聚合酶进行；且所述步骤3)采用Taq酶进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)和4)之间进行纯化步骤；或步骤2)、3)和4)在一个反应体系中进行，中间没有纯化步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤2)采用T4 DNA聚合酶进行；所述步骤3)采用Taq酶进行；且所述步骤4)采用T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶进行。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二代高通量测序平台选自Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和Life Technologies/SOLID system、PGM或Proton。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 102299 Beijing City, Changping District science and technology park life road No. 4 Building No. 5 hospital 8 layer 801 Applicant after: Beijing Berry Genomics Biotechnology Co., Ltd Address before: 100015 Beijing City, Chaoyang District Shun Street No. 6 Building No. 19 hospital Applicant before: Beijing Berry Genomics Co., Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1220994 Country of ref document: HK |
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 102299 Beijing City, Changping District science and technology park life road No. 4 Building No. 5 hospital 8 layer 801 Applicant after: Beijing Berry Genomics Co., Ltd. Address before: 102299 Beijing City, Changping District science and technology park life road No. 4 Building No. 5 hospital 8 layer 801 Applicant before: Beijing Berry Genomics Biotechnology Co., Ltd |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20190702 Address after: 100015 Beijing Chaoyang District, Jingshun East Street, 6 Courtyard 9 Floor 1, 101, 2 floors 201 Applicant after: Beijing Berry Hekang Medical Laboratory Co., Ltd. Address before: 102299 8th Floor 801, No. 5 Building, No. 4 Life Garden Road, Changping District Science Park, Beijing Applicant before: Beijing Berry Genomics Co., Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |