CN104877991A

CN104877991A - 一种用于动物组织基因组rna快速提取试剂盒及提取方法和应用

Info

Publication number: CN104877991A
Application number: CN201510333221.5A
Authority: CN
Inventors: 李海利; 王克领; 朱文豪; 杨宁; 徐照学; 许峰; 候自花; 师丽刚
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-06-17
Filing date: 2015-06-17
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明涉及一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒及提取方法和应用，包括裂解液、冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和焦碳酸二乙酯水溶液；提取时先将固体状动物组织研磨，液体状动物组织直接提取；样品经过裂解后，基因组RNA被吸附在RNA吸附柱上，然后用焦碳酸二乙酯水溶液冲洗即可得到全基因组RNA。本试剂盒可用于动物组织的基因组RNA的提取和纯化；整个提取过程只需5分钟；提取效率高、检测灵敏度高，为早期诊断各类 RNA细菌或病毒病原体感染和早期诊断提供可靠的实验依据；本发明适用于所有科研单位、临床病原检测、分子遗传学研究、临床基因诊断及动物疾病诊断和疾病控制中心使用，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

Description

一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒及提取方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒及提取方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

分子生物学研究中提取纯化RNA是分子试验的第一步，各种临床检测或科研中均需要提取纯化RNA。目前，国内外已有多种基于RT-PCR技术检测RNA的试剂盒应用于临床诊断和检测中，这些试剂盒所提供的RNA提取方法主要是苯酚-氯仿提取法。苯酚和氯仿是RNA提取过程的变性剂，反复抽提可以去除蛋白质、盐类和杂质。但苯酚和氯仿对人体有较大的毒性，挥发性较强，并且整个提取过程步骤繁琐，耗时较长，往往容易导致RNA降解，并且增加能耗和试验成本，对下游实验往往造成不利的影响。

全基因组是细胞或组织中包括编码序列和非编码序列在内的全部基因信息。几乎所有的生命信息均可以从全基因组中发现，包括与动物疾病相关的基因表达与调控。目前，病原学检测与分子诊断是临床检测中常见的技术，其敏感性与特异性与RNA提取的纯度和浓度有很大关系，直接决定了检测的结果。在动物疾病检测与分子诊断中，高灵敏度与特异性的分子诊断已逐步取代血清学检查。因而，获取高纯度与高浓度的基因组RNA是动物病原菌科研和临床检测中的第一步，其决定了扩增结合和诊断的特异性。

RNA提取是分子生物学研究中常用的一种技术，目前市场上有多种RNA提取方法。动物组织中含有大量的蛋白质、盐类及杂质，其性质与核酸的性质非常相似，难以从提取的RNA中分离出，在动物组织RNA提取的过程中，很容易与RNA共同沉淀，并且难以分离，往往造成提取的RNA纯度和浓度不够，影响了后续的扩增和测序。

为降低或清除动物组织中的蛋白质、盐类及杂质，现有的RNA提取过程中常常有污染，并且步骤繁琐，提取时间较长，如高氯酸钠法、SDS法和尿素法等提取方法，同时这些方法需要的样本量较大，并且苯酚类等有机物容易在RNA溶液中残留，特别是在后续的RT-PCR扩增过程中会干扰扩增过程，影响扩增结果，使得这些方法的应用受到限制。

对于动物组织而言，采用分子生物学法研究其病原菌诊断，首先要进行的是样品中细菌或病毒的RNA提取。能获取不同种类病毒的RNA，以及基因组的完整性、纯度和浓度，是从动物组织中提取RNA用于动物病原菌诊断研究的首要目标。因此，需要一种适于用于动物基因组RNA快速提取试剂盒，才能满足当前快速分子诊断的需求，保障畜牧业的健康发展。

发明内容

本发明的目的：在于提供一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒，本试剂盒试剂组成简化，操作简便、省工省时，整个提取过程只需5分钟，可以满足样品较多和快速提取RNA的需求，为动物病原菌快速诊断和养殖业的健康发展提供技术支持和理论基础。

还提供了所述的用于动物组织基因组RNA的快速提取试剂盒的提取方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒，包括以下试剂：裂解液、冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和重量比0.5~1.5%的焦碳酸二乙酯水溶液，其中裂解液、冲洗液1、冲洗液2的成分为：

裂解液：浓度为40~60 mM 的Tris-HCl，重量比0.5~1.5%的溴化十六烷基三甲胺，重量比0.5~1.5%的十二烷基肌氨酸，重量比3~7%的聚乙烯基吡咯烷酮，浓度为0.35~1.25 M 的氯化钠；

冲洗液1：浓度为5~15 mM 的EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；

冲洗液2：浓度为40~60 mM的 Tris-HCl，体积比75%的乙醇，pH 7.0。

所述的用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒中：焦碳酸二乙酯水溶液的浓度为1%；

裂解液：浓度为50 mM 的Tris-HCl，重量比1%的溴化十六烷基三甲胺，重量比1%的十二烷基肌氨酸，重量比5%的聚乙烯基吡咯烷酮，浓度为0.7 M 的氯化钠；

冲洗液1：浓度为10 mM 的EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；

冲洗液2：浓度为50 mM 的Tris-HCl，体积比75%的乙醇，pH 7.0。

一种利用RNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法，包括以下步骤：

（1）将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取；

（1）取液体状20 μl~100 μl 的动物组织，或取研磨后成糊状的动物组织20 mg~100 mg，加500 μl 裂解液，70℃水浴2 min，12000 rpm 30 S，分离出上清液；

（2）将上清液转入离心管中，加500 μl 无水乙醇，分次转到RNA纯化柱上，12000 rpm 离心30 S；得到粗提的RNA----，倒掉收集管中的废液；

（3）用500 μl 冲洗液1冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液；

（4）用600 μl 冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm 离心30 S，倒掉收集管中的废液；

（5）用500 μl 冲洗液2冲洗纯化柱，12000 rpm离心30 S，倒掉收集管中的废液；

（6）再次12000 rpm离心30 S；

（7）将RNA纯化柱转到另一离心管，加50 μl 焦碳酸二乙酯水溶液，12000 rpm 离心30 S，即可得到病毒及组织基因组的RNA，于-20℃保存备用。

所述固体状的动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏；液体状的动物组织为全血、血浆、血清或动物分泌物。

所述的试剂盒在用于动物组织基因组RNA快速提取中的应用。

本发明的积极有益效果：

本发明的动物组织基因组RNA快速提取试剂盒，可以快速提取动物组织的RNA，用于动物病原菌的快速诊断，又可以用于分子遗传学研究、临床基因诊断及动物疾病诊断。本发明亦的试剂盒可以用于其他同类组织RNA的提取和病原菌的诊断。

本试剂盒试剂组成简化，操作简便、省工省时，整个提取过程只需5分钟，可以满足样品较多和快速提取RNA的需求，为动物病原菌快速诊断和养殖业的健康发展提供技术支持和理论基础。

本发明的试剂盒用于提取动物组织（如心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏）、全血、血浆、血清和动物分泌物（乳液、鼻液）的基因组RNA，此基因组RNA可用于RT-PCR反应，RAPD、AFLP、RFLP及病毒基因组扩增。

本发明适用于科研单位、临床病原检测、分子遗传学研究、临床基因诊断及动物疾病诊断和疾病控制中心，具有广阔的市场前景和较好的经济效益。

具体实施方式

实施例1：一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒及提取方法

（1）试剂盒试剂：包括裂解液、冲洗液1、冲洗液2和无水乙醇和1%（重量比）的焦碳酸二乙酯水溶液。

各试剂成分：

裂解液：浓度为50 mM的Tris-HCl，1%（重量比）的溴化十六烷基三甲胺，1%（重量比）的十二烷基肌氨酸，5%（重量比）的聚乙烯基吡咯烷酮，0.7 M 的氯化钠；

冲洗液1：浓度为10 mM 的EDTA，70%（体积比）的乙醇，pH 7.0；

冲洗液2：浓度为50 mM 的Tris-HCl，75%（体积比）的乙醇，pH 7.0。

用该试剂盒提取动物组织如心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏等，这些动物组织需要先研磨成糊状，然后进行提取，提取步骤如下：

（1）取研磨后的动物组织20mg，加500 μl 裂解液，70℃水浴2 min，12000 rpm 30 S，分离出上清液；

（2）将上清液转入离心管中，加500 μl 无水乙醇，分次转到RNA纯化柱上，12000 rpm 离心30 S；倒掉收集管中的废液；

（6）再次12000 离心30 S，得到基因组RNA；

（7）将RNA纯化柱转到另一离心管，加50 μl 1%的DEPC水溶液，12000 rpm 离心30 S，即可得到高纯度的病毒及组织基因组的RNA，于-20 ℃保存备用。

实施例2：一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒及提取方法，和例1基本相同，不同之处在于：

（1）试剂盒试剂：包括裂解液、冲洗液1、冲洗液2和无水乙醇和0.5%（重量比）的焦碳酸二乙酯水溶液。

各试剂成分：

裂解液：40mM Tris-HCl，0.5%（重量比）的溴化十六烷基三甲胺，0.5%（重量比）的十二烷基肌氨酸，3%（重量比）的聚乙烯基吡咯烷酮，0.35 M 的氯化钠；

冲洗液1：5 mM 的EDTA，70%（体积比）的乙醇，pH 7.0；

冲洗液2： 40 mM Tris-HCl，75%（体积比）的乙醇，pH 7.0。

提取步骤同例1。

实施例3：一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒及提取方法

（1）试剂盒包括裂解液、冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和1%（重量比）的焦碳酸二乙酯水溶液。

各试剂成分：

裂解液：50 mM Tris-HCl，1%（重量比）的溴化十六烷基三甲胺，1%（重量比）的十二烷基肌氨酸，5%（重量比）的聚乙烯基吡咯烷酮，0.7 M 的氯化钠；

冲洗液1：10 mM 的EDTA，70%（体积比）的乙醇，pH 7.0；

冲洗液2：50 mM Tris-HCl，75%（体积比）的乙醇，pH 7.0。

按以下程序进行操作提取动物组织（心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏）、全血、血浆、血清、动物分泌物（乳液、鼻液）的基因组RNA：

（1）取液体状50 μl，加500 μl 裂解液，70℃水浴2 min，12000 rpm 30 S，分离出上清液；

（6）再次12000 离心30 S，得到基因组RNA；

（7）将RNA纯化柱转到另一离心管，加50 μl 1%的DEPC水溶液，12000 rpm 离心30 S，即可得到高纯度的病毒及组织基因组的RNA，于-20℃保存备用。

实施例4：一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒及提取方法，和例1基本相同，不同之处在于：

（1）试剂盒包括裂解液、冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和0.5%（重量比）的焦碳酸二乙酯水溶液。

各试剂成分：

裂解液：60 mM Tris-HCl，重量比1.5%的溴化十六烷基三甲胺，重量比1.5%的十二烷基肌氨酸，重量比7%的聚乙烯基吡咯烷酮，浓度为1.25 M 的氯化钠；

冲洗液1：15 mM 的EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；

冲洗液2：60 mM Tris-HCl，体积比75%的乙醇，pH 7.0。提取步骤同例3。

提取的基因组RNA浓度测定结果，见下表1。

注：RNA 浓度单位为ng/μl；吸光度比值为RNA在260 nm和280 nm处的吸光度比值（260/280），通过吸光度比值来判断RNA的纯度，从上表可以看出，吸光度值在1.8~2.0之间，说明提取的RNA纯度较好。

表中样品1、2、3、4、5分别为使用该试剂盒从20 mg心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏中提取约0.96 μg、1.11 μg、1.02 μg、1.06 μg、0.97 μg 基因组；样品6、7、8、9、10分别为使用该试剂盒从50 μl全血、血浆、血清、乳液、鼻液中提取约1.13 μg、1.08 μg、1.06 μg、1.08 μg、1.01 μg基因组。

以上所述为本发明的较佳实例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。本发明不限于上述实施例所表达的组合方式。如果批量生产，可按上述配方成比例放大。

Claims

1.一种用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下试剂：裂解液、冲洗液1、冲洗液2、无水乙醇和重量比0.5~1.5%的焦碳酸二乙酯水溶液，其中裂解液、冲洗液1、冲洗液2的成分为：

冲洗液1：浓度为5~15 mM 的EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；

冲洗液2：浓度为40~60 mM的 Tris-HCl，体积比75%的乙醇，pH 7.0。

2.根据权利要求1所述的用于动物组织基因组RNA快速提取试剂盒，其特征在于，其中：焦碳酸二乙酯水溶液的浓度为1%；

冲洗液1：浓度为10 mM 的EDTA，体积比70%的乙醇，pH 7.0；

冲洗液2：浓度为50 mM 的Tris-HCl，体积比75%的乙醇，pH 7.0。

3.一种利用权利要求1或2 的RNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（6）再次12000 rpm离心30 S；

4.根据权利要求3的所述RNA快速提取试剂盒提取动物组织基因组的方法，其特征在于，所述固体状的动物组织为心脏、肝脏、肺脏、脾脏或肾脏；所述液体状的动物组织为全血、血浆、血清或动物分泌物。

5.权利要求1或2所述的试剂盒在用于动物组织基因组RNA快速提取中的应用。