DE3014036A1 - Immunanalyse mit magnetischen traegern - Google Patents
Immunanalyse mit magnetischen traegernInfo
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Description
Iinmunanalyse mit magnetischen Trägern
Die Erfindung betrifft ein Verfahren der Immunanalyse mit
magnetischen Trägern, -und zu ihrer Durchführung geeignete Stoffe.
Die Immunanalyse ist ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse eines Stoffes in einer Flüssigkeit
auf Grund der für diesen Stoff spezifischen Antikörper. Infolge der hohen spezifischen Natur der Antikörper, können
sehr kleine Stoffmengen, insbesondere in der Körperflüssigkeit, Blut usw., bestimmt werden. In einigen Analyseverfahren
wird der Antikörper ein Antigen oder Hapten gekennzeichnet, z.B. mit fluorgenen Stoffen, US-PS 3,940,475, mit
Enzymen, US-PS 3,654,090, oder mit Radioisotopen, US-PS 3,555,153.
Meist erfordert der Vorgang eine immunchemische Komplexbildung
zwischen einem Antigen und seinem Antikörper,
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wobei eines derselben gekennzeichnet ist und im Wettbewerb einen Teil des unbekannten Stoffs verdrängt. Zur Quantifizierung
des gekennzeichneten Stoffs muß das Komplexprodukt abgetrennt werden, was einfacher ist, wenn einer der Stoffe
in immobilisierter, unlöslicher Form vorliegt. So können Antigene, Antikörper oder Haptene ohne wesentlichen Verlust
biologischer Aktivität an verschiedene, wasserunlösliche Träger angeheftet oder in diese eingebaut werden, s. US-PS
3,555*153 und 3,652,761 (organische bzw. anorganische Träger).
Die hierbei vorhandene feste Phase kann durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt werden. Dies wird als "festphasige
Immunanalyse" bezeichnet. Ein immobilisiertes Antikörperkompositum liegt immer dann vor, wenn Antikörper in irgendeiner
Weise mit unlöslichen Trägern verbunden sind.
Ein unlöslicher Träger ist z.B. poröses Glas, insbesondere Glas geregelter Porengröße, das durch Auslaugen eines Borsilikats
erhalten wird, vgl. hierzu Filbert, Immobilized Enzyms for Industrial Reactors, Kap. 3 (1975). Obwohl unporöses
Glas ebenfalls geeignet ist, wird poröses Glas wegen der größeren Oberfläche pro Volumen bevorzugt.
Festphasige Träger werden aus zwei Gründen vorwiegend in feinteiliger
Form verwendet. Bei der quantitativen Analyse werden bekannte Konzentrationen mit den Analyseproben verglichen und
als Standardwerte benützt. Durch Bindung an feinteilige Trägerpartikel
und sachtes Rühren der Dispersion enthalten gleiche
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entnonmene Volumenteile der verschiedenen Ansätze die gleichen
zu analysierenden Stoffmengen. Der zweite Grund hängt mit der erforderlichen Inkubation der Ansätze zusammen. Wenn der immobilisierte
Stoff in Suspension gehalten wird, kann er leichter ohne zu starke Diffusion von den Umsetzungsteilnehmern erreicht
werden. Andererseits können zu feine Partikel nicht zentrifugiert werden. Es werden daher überwiegend poröse Glaspartikel
von 0,5 - 3/um Durchmesser und 50 - 70 % Volumenporösität verwendet.
Da die bisherigen Analysemethoden ein Zentrifugieren mit Abgießen von Hand oder auf mechanische Weise erfordern,
ist die Trennung zeitraubend, und kann je nach Zahl der Proben und Art der Zentrifuge 10 Minuten und länger dauern. Deshalb
wurde bereits daran gedacht, die Trennung magnetisch vorzunehmen. Durch Anlagen eines Magnetfeldes werden die magnetischen
Trägerpartikel festgehalten, während der flüssige Teil entfernt wird. Nach der US-PS 3,933,997 werden Anti-Digoxin-Antikörper
an Eisenoxidpartikel mit Silan gekoppelt, oder Antikörper werden an polymerüberzogenes Eisenoxid kovalent gebunden,
Nye, in Clin. Chem, Acta, 69:387 (1976). Guesdon verwendet magnetische
Polyacrylamid-agarose-magnetit-Perlen für die enzymatische
Immunanalyse, s. Immunochem. 14:443 (1977) und Ithokissios u.a. beschreiben in Clin. Chem. Acta. 84:69 (1978)
und 23/11,2072 (1979) magnetische Mikropartikel einer magnetische
Stoffe enthaltenden Proteinmatrix,
Die US-PS 3,970,518 und 4,018,886 verwenden einen monomolekularen
Antikörper- oder Proteinüberzug auf magnetischen Partikeln von Kolloidgröße bis zu 10/um zum Nachweis biologischer
O3QO43/O80S
Partikel die mit dem Überzug in Umsetzung treten. Es werden
ferromagnetisch, ferrimagnetische und superparamagnetische
Stoffe oder Oxide wie Ferrite, Perovskite, Chromite oder Magnetbleiverbindungen erwähnt, jedoch nur 1 /um große, mit
Rinderserumeiweiß überzogene Nickelpartikel näher in Betracht gezogen. Das reine Magnetmaterial hat aber eine große Dichte.
Nachteilig ist ferner die Anhaftung der Magnetpartikel nach Entzug des Magnetfeldes.
Die US-PS 3,985,649 beschreibt ferromagnetische Partikel eines mit einem Glasträger überzogenen ferromagnetischen Kerns, oder
an den Träger geklebten Partikeln oder aus feinteiligen ferromagnetischen Stoffen und einem polymeren Träger geformten
Mischpartikeln, an die zur Radioimmunanalyse geeignete biologisch
aktive Stoffe gebunden werden können.
Die von einem Magnetfeld auf suspendierte magnetische Partikel ausgeübte Kraft bewegt diese in Richtung der stärkeren Feldbereiche
(z.B. den Magnetpol), wobei die Größe der Kraft sowohl vom Feldgefälle als auch von dem Magnetismus im Partikel
abhängen. Pur eine rasche Trennung sind daher eine starke
Trennvorrichtung (Magnet) und stark magnetisierbare Partikel günstig.
Die Erfindung hat ein Verfahren zur rationelleren, magnetischen Trennung mit biologisch aktiven Stoffen besetzter Träger bei
der festphasigen Immunanalyse zur Aufgabe. Aufgabe der Erfindung ist ferner ein zur Durchführung des Verfahrens geeignetes
030043/0885
-τ-
Reaktionsmittels für die Immunanalyse aus einem wasserunlöslichen,
chemisch trägen Träger und einem mit ihm verbundenen biologischen Stoff.
Die Aufgabe wird durch das Verfahren der Erfindung dadurch gelöst, daß der Träger aus Partikeln aus in unmagnetischer
Matrix dispergiertem feinteiligen magnetischen Material besteht,
und die Abtrennung des Trägers von der Flüssigkeit auf magnetischem Wege erfolgt.
Das zur Durchführung des Verfahrens geeignete Reaktionsmittel ist gekennzeichnet durch wasserunlösliche, träge, Trägerpartikel
aus in einer unmagnetischen Matrix diepergierten, feinteiligen magnetischen Material, welche auf ihrer Oberfläche
einen biologischen Stoff tragen.
Das magnetische Material ist beispielsweise ein Glas oder
kristallhaltiges Material, vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise
porös und/oder superparamagnetisch. Es kann auch eine
Matrix für die Dispergierung der magnetischen Partikel aus Glas oder einem anderen Material verwendet werden, welches
beständig, wasserunlöslich und chemisch träge bei der angestrebten Verwendung ist, wie z.B. organische Kunststoffe,
Glaskeramik, oder andere überwiegend kristalline Keramiken.
Als magnetisches Glas werden Partikel der für die feetphasige
Immunanalyse üblichen Größe mit auf ein Magnetfeld ansprechenden genügenden Magnetstoffen bezeichnet. Ihre Herstellung durch
O3OCU3/Q88B
-tr- 30H036
.3· .- ^ichtI
Einbau magnetischer Partikel in Größen unter 1000 Ä, vorzugsweise
unter 500 S in Glas oder Kristallen ist in der Patentanmeldung P 3o 13 915.2 beschrieben.
Die Herstellungsmöglichkeit derartiger poröser Körper beruht auf Glaszusammensetzungen, welche durch Wärmebehandlung zwei
chemisch verschiedene, verbundene Glasphasen unterschiedlicher Löslichkeit getrennt werden können. Die Erhitzung reicht vom
Transformationsbereich des Glases bis unter die Mischbarkeitstemperatur der beiden Phasen. Durch Ätzen wird eine der Phasen
herausgelaugt, wodurch untereinander verbundene oder kontinuierliche Poren entstehen. In erster Linie in Frage kommen
hier die Borsilikate, die beim Erhitzen in eine kieselsäurereiche und eine boratreiche Phase zerfallen. Nur die Letztere
ist in Mineralsäuren gut lösbar. Bei der Wärmebehandlung können auch Kristalle entstehen. Euren Bildung eisenhaltiger Kristalle
wird das Endprodukt magnetisch. Gleichzeitig Können auch andere, nieat eisenhaltige Kristalle entstehen, ixi awar mengenmäßig von
vereinzelten, den Glascharakter erhaltenden bis zu überwiegender, eine Glaskeramik bildenden Kristallphase. Diese Kristalle
können auch die eisenhaltigen Kristalle enthalten oder einschließen. Die Produkte sind also entweder Gläser, die in der
Glasstruktur nur eisenhaltige Kristalle enthalten, oder kristallhaltig, also Körper die noch andere, nicht eisenhaltige
Kristalle in mehr als nur Spurenmengen enthalten.
- 7 Ö30043/088S
BAD ORIGINAL
Die bevorzugten Glaszusammensetzungen liegen im Alkali-Eisenoxid-Boroxid-Silikatsystem,
und im besonders günstigen Falle enthalten sie, in Gew.-% auf Oxidbasis, etwa:
3 - 15 % Na2O und/oder K2O, 10 - 25 % Pe2O3, 10 - 40 % B3O3,
und 35 — 70 90 SiO2. Hieraus erzeugte poröse Körper schließen
die magnetischen Kristalle in einer glasigen Kieselsäurestruktur ein. Die magnetischen Kristalle bestehen meist aus
Magnetit (Pe3O.) und/oder festen Lösungen aus Magnetit und
Gamma-Fe^O^. Werden wahlweise Oxide wie CoO, NiO, MnO, ZnO
beigegeben, so entstehen durch Wärmebehandlung feste Ferritlösungen. Das glasig-kristalline Skelett schließt dann die
magnetischen Kristalle ein. Die Glasphase besteht im wesentlichen aus glasiger Kieselsäure, die Kristallphase aus kieselsäurehaltigen
Stoffen. Auch hier bestehen die magnetischen Kristalle aus Magnetit und/oder festen Lösungen von Magnetit
und Gamma-Pe203, und/oder festen Perritlösungen mit magnetitähnlicher
Kristallstruktur.
Für unporöse Körper kann entweder die Auslaugung unterbleiben, oder es werden Körper gebildet, die keine auslaugbare Phase
bilden. Dies kann unter dem Gesichtspunkt der Unlöslichkeit und Beständigkeit von Vorteil sein, zumal wenn die bei der
Analyse verwendeten Flüssigkeiten auslaugbare Stoffe rasch angreifen.
Die Zeichnung zeigt ein Schaubild, welches die Standardwertlinie zweier Versuche miteinander vergleicht. Im ersten Versuch
wurde für eine Analyse des die Schilddrüse stimulierenden
Ö3 0Ö43/0D85
— 8 — BAD ORIGINAL
U036
Hormons glasgeregelter Porengröße verwendet. Im Vergleichsversuch wurde superparamagnetisch.es Glas hergestellt nach dem
vorstehend beschriebenen Verfahren der Patentanmeldung vom gleichen Anmeldetag, ebenfalls mit geregelter Porengröße
verwendet. In beiden Fällen wurde die Trennung durch Zentrifugieren vorgenommen. Die einander ähnlichen Kennlinien belegen
die funktioneile Gleichwertigkeit der Gläser bei dem Protexnbindungsversuch. Weitere Versuche ergaben die Möglichkeit
der magnetischen Trennung mit einer schwachen, magnetischen Trennungsvorrichtung.
Die Erfindung ist grundsätzlich in allen Verfahren der festphasigen
Immunanalyse anwendbar, in denen ein partikelförmiger wasserunlöslicher Träger durch die magnetischen Partikel ersetzt
werden kann. So kann in den im Handel erhältlich, fertig gelieferten Ansätzen zur quantitativen Bestimmung von Thyroxin
in Seren, freiem, nicht dem Proteintransport dienenden Thyroxin oder Thyrotropin das dort verwendete Glas geregelter Porengröße
durch magnetische Partikel ersetzt werden. Dies gilt auch für die fluorgenen und enzymatischen Analyseverfahren der US-PS
3»654,O9O und 3,940,475, 2.B. bei der Bestimmung humanen Immunoglobulins
.
Der magnetische Träger kann aus verdünnt-magnetischem Material,
also einem durch die träge unmagnetische Matrix "verdünnten11
magnetischen Stoffen, bestehen, oder, nach bevorzugter Ausbildung superparamagnetisch sein, nämlich aus magnetischen
030ÖU/08IS - 9 -
j NAOHQgRElCHTj
Partikeln "bestehen, welche nach Ende des Magnetisierungs- und
Entmagnetisierungszyklus (Hystereseschleife) derart niedrigen
Restmagnetismus aufweisen, daß sie nach Abbau des Magnetfeldes nicht aneinanderhaften. Die normalerweise nach Beeinflussung
magnetischer Partikelsuspensionen durch ein Magnetfeld zu erwartende Agglomeration tritt dann nicht ein.
Superparamagnetische Partikel können durch Dispersion sehr feinteiliger magnetischer Partikel in einer unmagnetischen
Matrix, erhalten werden. Dies ist meist bei Partikelgrößen des dispergierten magnetischen Materials oder der Kristallite
bis zu 175 Ä, etwa 100 - 175 Ä der Fall. Jedoch ist auch bei
G-rößen bis zu etwa 500 S der Restmagnetismus so gering, daß
auch diese Partikel noch als superparamagnetisch bezeichnet werden können, die Partikel also nach Abbau des Magnetfeldes
nicht mehr agglomerisieren. Dieser Größenbereich ist in erster Linie für Kristalle mit magnetitähnlicher Struktur gedacht und
die kritische G-röße der dispergierten Partikel ist je nach dem verwendeten magnetischen Material etwas verschieden. Auch andere
Verfahren zur Herstellung superparamagnetischer Partikel sind geeignet. Auch Kristallite bis zu 1000 £ können ohne größere
Agglomeration verwendet werden, obwohl sie nicht superparamagnetisch sind. Im allgemeinen sind die Partikel um so agglomerationsfeindlicher,
je stärker sie magnetisch verdünnt sind.
Wie in der gleichlaufenden Patentanmeldung P 30 15 915.2
ausgeführt, zeigen poröse Körper aus magnetischem Glas und kristallhaltigen Material mit magnetischen Kristallen einer
030043/OS8S
->*'·· 301A036
Koerzitivkraft kleiner als 100 Örsted eine gewisse Agglomeration,
sind aber verwendbar. Kristallite in Größen unter 500 S, möglichst nicht über 200 A und einer Koerzitivkraft kleiner als
40 Örsted werden bevorzugt. Die Magnetkörper dieser Patentanmeldung sind als magnetisch verdünnt zu bezeichnen.
Die bevorzugte Matrix entsteht aus den Alkali-Eisen-Borsilikatgläsern der Patentanmeldung P 30 13 915.2. Geeignet sind auch
anorganische, feuerfeste Stoffe oder organische Polymere wie Polymethylmetacrylat, Polystyrol, Polypropylen, Polytetrafluoräthylen,
Nylon oder Azetpolymere. Außer Magnetit sind als magnetisches Material auch Stoffe wie Gamma-Eisenoxid, Ferrite,
z.B. Zink- oder Kobaltferrit, Magnetbleie wie Bleiferrit, Bariumferrit usw. geeignet.
Metallische Magnetkristalle sind ihres stärkeren Magnetismus wegen an sich günstiger als Ferrite oder Oxide, weil geringere
Massen benötigt werden, und für superparamagnetische Träger sollen die Partikel etwa 50 Ä oder kleiner sein. Derart feinteilige
Metalle sind aber chemisch so aktiv, daß sie nur schwer in Polymere eingebaut werden können. Andererseits zeigt die
Patentanmeldung P 30 13 915.2 ein Verfahren zur Ausfällung oxidischer, magnetischer Stoffe aus einer Glasschmelze, und
zur Regelung der Kristallgröße durch Wärmebehandlung. Da nur ein Teil des Eisens oder sonstiger magnetischen Stoffe im
glasbildenden Ansatz magnetische Kristalle im Glas bildet, und ihr Volumenanteil meist weniger als 20 % ausmacht, können
0300A3/08ÖS - 11 -
derart schwach magnetische Partikel durch einen außen an die diese Partikel in Suspension haltende Flüssigkeit angelegten
schwachen Magnet unschwer getrennt werden.
Zur Bestimmung superparamagnetischen Verhaltens genügt Anlegen und Wegnahme eines Magnets. Haften die Partikel bei Suspension
in einer Flüssigkeit nicht mehr aneinander so sind sie superpar amagne ti s ch .
Die magnetischen Trägerpartikel können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Das magnetische Material kann während der
Polymerisierung oder Verarbeitung in der Matrix dispergiert werden. Für anorganische Stoffe sind die Verfahren der Glasherstellung
häufig anwendbar, für bevorzugte Verfahren siehe die Patentanmeldung P 30 13 915.2.
Der Größenbereich der Trägerpartikel liegt meist bei etwa 4/um,
bei durchschnittlichen Größen von 1 - 2/um.
Nach besonders günstiger Ausbildung sind die Trägerpartikel porös. Die Poren können kontinuierlich oder unterbrochen sein,
solange sie von außen zugänglich bleiben. Sie können in verschiedener Weise erzeugt werden, z.B. durch Einblasen bei organischen
Polymeren, oder Auslaugen, Porengröße und -volumen kann dem Glas geregelter Porengröße entsprechen, z.B. 350 1000
Ä, z.B. etwa 550 Ä und 0,25 - 1,5 ml Porenvolumen pro g,
z.B. 0,7 ml/g. Besonders im Falle von Glas und kristallinen
0 3 0 0 4 3 / 0 S ö S - 12 -
./15.
30H036
Stoffen ist das magnetische Material gleichmäßig in einem porösen Skelett dispergiert. Diese Partikelgrößen und Porenmerkmale
sind nur als Beispiele aufzufassen. Nach einer Ausbildung der Erfindung ist das magnetische Material nicht
superparamagnetiseh, sondern verdünnt magnetisch, mit weniger als 20 Volumen-% magnetisches Material in der Matrix, wenn
die Partikel auch leicht zusammenhaften, was aber weniger stark in magnetisch verdünnten Stoffen als in feinteiligem,
normal magnetischen Material wie Fe^O. der Pail ist. Nach Abbau
des Magnetfeldes und Redispersion der verdünnt magnetischen Glas- oder Kristallpartikel kann durch leichtes Rühren der
Flüssigkeit eine gute Dispersion aufrechterhalten werden. Die Partikelgrößen können den vorstehend Erwähnten entsprechen.
Vorzugsweise sind sie porös. Zur Herstellung sind die Glasherstellungsverfahren,
mit oder ohne Auslaugen, geeignet. Durch geeignete Matrizen können die gewünschten Größen unmittelbar
hergestellt werden, oder, besonders bei anorganischen Stoffen, es wird das Material zerkleinert und klassiert.
Die folgende Tabelle zeigt für die magnetischen Eigenschaften wichtigen Angaben einiger Glasbeispiele.
- 13 030043/0885
30H036
Beispiel- Magne- Koer- Rema- +)Volu-
Nr. tisches zitiv- nenz menan-
Sätti- kraft emu/g teil an
gungs- in magne-
moment Örsted tischen
Poren- Porosität größe in ml/g
Wsat emu/g |
Hc | 9 | 0 | - | Kristal len |
300-1800 | 500 | 0,30 | |
1 | 10,3 | 239 | 6 | - | 0,056 | unporös | 2100 | ||
2 | 14,4 | - | 0 | ,002 | 0,084 | ti | 270 | ||
3 | 6,0 | - | ,6 | 0,033 | 500 | 0,30 | |||
4 | 22,6 | - | ,003 | 0,138 | 0,37 | ||||
VJl | 5,55 | 16 | - | 0,030 | 0,3 | ||||
6 | 10,1 | 9 | 0,057 | 0,5 | |||||
7 | 6,6 | 0,037 | |||||||
+) Schätzung auf Grund der magnetischen Sättigungsmoments
(zweite Spalte) des Glasbeispiels, unter Annahme eines per se gegebenen magnetischen Sättigungsmoments magnetischer
Kristalle von 90 emu/g und einer magnetischen
Kristalldichte von 4,8 g/ccm, und einer Dichte der
Giasmatrize von 2,2 g/ccm.
Kristalldichte von 4,8 g/ccm, und einer Dichte der
Giasmatrize von 2,2 g/ccm.
030043/O8ÖS
- 14 -
Die mit den magnetischen Partikeln durchgeführte festphasige Immunanalyse entspricht der üblichen Methode mit Ausnahme der
hier magnetisch erfolgenden Trennung anstelle des üblichen Zentrifugierens. Wird die Analyse mit Reagenzgläsern durchgeführt,
so kann die Trennung mit einem dicht an das Reagenzglas geführten Permanentmagnet oder Elektromagnet bewirkt
werden. Der Magnet kann die Partikel in beliebiger Richtung anziehen und halten, z.B. kann der Magnet so gehalten werden,
daß er senkrecht zur Längsachse des Reagenzglases liegt und die magnetischen Partikel an eine der Seitenwände zieht.
Die Flüssigkeit kann dann abgesaugt werden. Sodann wird erneut eine flüssige Probe in das Reagenzglas gegeben, das magnetische
Feld entfernt, und die magnetischen Partikel werden dispergiert. Für mehrere, entsprechend ausgerichtete Reagenzgläser
kann ein entsprechend starker Magnet genügen.
Bisweilen muß mit einem oberflächenaktiven Mittel oder dergleichen
gearbeitet werden, um alles magnetische Material abtrennen zu können. Besonders bei Verwendung schwächerer Magneten
bei schwächer magnetischem Material sammelt sich dieses genügend an bestimmten, begrenzten Stellen des Gefäßes an,
aber beim Absaugen oder Abgießen der Flüssigkeit wird der nasse Knoten oder Klumpen aus magnetischem Material durch die
Oberflächenspannung von der Gefäßwand in die Flüssigkeit gezogen. Um dies zu vermeiden, kann eine kleine Menge eines
oberflächenaktiven Materials oder Waschmittels eingeführt werden, um die Oberflächenspannung abzubauen. In vielen Fällen
ist dies Bestandteil der Umsetzungsteilnehmer, und wird bei
03ÖQ43/088S
. /f . [N/\OHUgRBwJ:-frj
Zusammenstellung der Standardreagenzien für Immunprüfungen mit
verdünnt-magnetischen Partikeln und schwachen Magneten von vorneherein berücksichtigt.
Der Oberflächenspannungseffekt ist besonders zu beachten, wenn
der mengenmäßige Anteil der festen Phase klein ist.
Magnetische Trenner können für einzelne oder Batterien von Reagenzgläsern ausgelegt werden, wobei für die Trennung
Mehrerer meist besonders ausgelegte Polstücke mit weniger Permanent- oder Elektromagneten in Anwendung gelangen. Als
Beispiel wurde eine starke magnetische Trennvorrichtung mit zwei Magneten hergestellt. Durch eine Mindestfeldstärke in
der Versuchsflüssigkeit von etwa zwei Kilo-Örsted wird eine
gute Magnetisierung aller Partikel sichergestellt. Die Partikel werden auf eine senkrechte, oberhalb der Bodenfläche
endende Linie auf der Gefäßinnenfläche gezogen. Als Beispiel für eine schwache Trennung wurde eine Trennvorrichtung für
14 Reagenzgläser mit Permanentmagneten hergestellt. Die Mindestfeldstärke von etwa 700 Örsted reicht aus, um die Partikel
auf wenigstens die Hälfte ihrer Sättigungsniagnetisierung zu bringen. Das durchschnittliche Feldgefälle beträgt etwa 1000
Örsted pro cm. Diese Trennvorrichtung zieht die Partikel, auch die am Boden befindlichen, auf die Seitenwände.
Das Magnetfeld kann durch eine Abschirmung entfernt werden, oder die Feststoffe werden durch den Magnet im Reagenzglas
gehalten und die Flüssigkeit durch eine Öffnung ausfließen gelassen, oder die Trennung wird auf andere, dem Fachmann geläufige
Weise bewirkt. Ö30043/0886
Der biologische Stoff, sei es ein Antigen, Hapten, Antikörper
oder Enzym, kann auf den Trägerpartikeln in bekannter Weise immobilisiert werden, s. die US-PS 3,652,761 oder "Immobilized
Enzyms for Industrial Reactors, Kap. 3, S. 52, 53. Auch kann die Oberfläche der Matrixstoffe in bekannter Weise modifiziert
werden.
Mit der "umgekehrten" Radioimmunprüfung nach US-PS 4,098,876 wurde TSH bestimmt (s. das Beispiel 1 dieser Patentschrift).
Die Trägerpartikel bestanden aus Glas geregelter Porengröße. Der Versuch wurde sodann mit den magnetischen Trägerglaspartikeln
nach Nr. 1 der vorstehenden Tabelle, und mit den folgenden Merkmalen wiederholt:
Porengrößenbereich | 300 - 1800 Ä |
Porenvolumen - | 0,3 ml/g |
Partikelgröße | 2/um |
Magnetisches | |
Sättigungsmoment | 10,3 emu/g |
Magnetisches Moment | |
bei 700 Örsted | 6,8 emu/g |
Koerzitivkraft | 9 Örsted |
Volumen-% der | |
magnetischen Kristalle - | 5,6 %. |
Bei der Herstellung wurde darauf geachtet, daß die Eigenschaften des magnetischen Glases denen des Glasträgers geregelter
03ÖCU3/088S
- 17 -
-Vf-
Porengröße möglichst entsprechen, mit Ausnahme der Dispersion der feinen magnetischen Kristalle in dem meist aus Kieselsäure
bestehenden Glasskelett.
Für beide Versuche vrurden die Dosisstandard-Kennlinien der
Zeichnung erstellt. Auf der Senkrechten ist der gebundene Prozentsatz, auf der Waagerechten sind die TSH/ml in internationalen
Mikroeinheiten abgetragen. Die obere Kennlinie
wurde für den Versuch mit Standardglas geregelter Porengröße, die untere Kennlinie für den Versuch mit magnetischem Glas
geregelter Porengröße erhalten. Beide Kennlinien sind praktisch identisch.
Eine Übereinstimmung ergab sich auch bei einem Vergleichsversuch der Radiοimmunprüfung für T-4 mit unporösem, magnetischen
Glas nach Kr. 2 der vorstehenden Tabelle mit magnetischer Trennung, und Standardglas geregelter Porengröße mit
Zentrifugieren.
0300U/088S
Claims (17)
1. Verfahren zur festphasigen Immunprüfung bei dem ein biologischer
Stoff mit einem wasserunlöslichen, tragen, partikelförmigen
Träger komplexgebunden und der partikelförmigen Träger von einer Flüssigkeit getrennt wird, dadurch gekennzeichnet,
daß der Träger aus Partikeln aus in unmagnetischer Matrix dispergiertem feinteiligen magnetischen Material besteht,
und die Abtrennung des Trägers von der Flüssigkeit auf magnetischem Wege erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel porös sind.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die unmagnetische Matrix aus einer kristallinen Keramik,
einem organischen Polymer, einem kristallhaltigen Material, einem Glas, insbesondere einem Alkali-Eisen-Borsilikat besteht.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Material aus Gamma-Eisenoxid, Magnetit,
einem Ferrit, oder Mischungen derselben besteht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet,
daß das magnetische Material in einer dem Träger superparamagnetische Eigenschaften verleihenden Form vorliegt.
030043/088$ - 19 -
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet,
daß das magnetische Material weniger als 20 VoIumen-%
des Trägers ausmacht.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet,
daß der biologische Stoff ein Antigen, ein Hapten, ein Enzym oder ein Antikörper ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet,
daß der Flüssigkeit während der Abtrennung ein oberflächenaktives Mittel zugesetzt wird.
9. Reaktionsmittel für die festphasige Immunanalyse, gekennzeichnet
durch wasserunlösliche, träge, Trägerpartikel aus in einer unmagnetischen Matrix dispergierten, feinteiligem
magnetischen Material, welche auf ihrer Oberfläche einen biologischen Stoff tragen.
10. Reaktionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der biologische Stoff ein Antigen, ein Hapten, ein
Enzym oder ein Antikörper ist.
11. Reaktionsmittel nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die unmagnetische Matrix aus einem kristallhaltigen Material, kristalliner Keramik, einem organischen
Polymeren oder aus Glas, insbesondere einem Alkali-Eisen-Borsilikat besteht.
30Η036
12. Reaktionsmittel nach Ansprüchen 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet,
daß das magnetische Material aus Gamma-Eisenoxid, Magnetit, einem Ferrit oder Mischungen derselben besteht.
13. Reaktionsmittel nach einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Material in einer den
Trägerpartikeln superparamagnetische Eigenschaften verleihenden Form vorliegt.
14. Reaktionsmittel nach einem der Ansprüche 9-13, dadurch
gekennzeichnet, daß das magnetische Material weniger als 20 Volumen-% der Trägerpartikel ausmacht.
15. Reaktionsmittel nach einem der Ansprüche 9-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel porös sind.
16. Reaktionsmittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel aus einem porösen Skelett aus glasiger
Kieselsäure, in welcher das magnetische Material dispergiert ist, bestehen.
17. Reaktionsmittel nach einem der Ansprüche 9-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel aus das magnetische Material
in kristalliner Form einschließenden, glasig-kristallinen Skelett bestehen, deren glasige Phase im wesentlichen aus
Kieselsäure, und deren kristalline Phase im wesentlichen aus einem kieselsäurehaltigen Material besteht.
030043/0885
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