ES2242374T3

ES2242374T3 - Particulas magneticas perfeccionadas, sus procedimientos de obtencion , y sus utilizaciones en la separacion de moleculas.

Info

Publication number: ES2242374T3
Application number: ES99900498T
Authority: ES
Inventors: Abdelhamid Elaissari; Christian Pichot; Bernard Mandrand
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1998-01-06
Filing date: 1999-01-06
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2019-01-06
Also published as: DE69925241D1; FR2773416B1; JP2002501175A; JP4443762B2; EP1046037A1; AU1973499A; CA2316824A1; US6521341B1; EP1046037B1; FR2773416A1; ATE295540T1; DE69925241T2; WO1999035500A1

Abstract

Partícula magnética y termosensible, la cual tiene un tamaño predeterminado, comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0, 05 y 10 m, la cual comprende: - un núcleo interno de material compuesto, constituido por una partícula orgánica o inorgánica, sólida, que contiene, en su seno, una carga magnética, y - una capa externa a base de un polímero, susceptible de poder interactuar con por lo menos una molécula biológica, siendo el polímero externo termosensible, y presentando una temperatura crítica inferior de solubilidad (LCST) predeterminada, que se encuentra comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10 y 100°C y, de una forma preferente, entre 20 y 60°C. caracterizado por el hecho de que se encuentra presente una capa intermedia entre el núcleo interno y la capa externa, que aísla la carga magnética del citado núcleo interno, con relación a la citada capa externa funcionalizada, y que, ésta, se encuentra constituida por un polímero reticulado, preparado a partir de por lo menos un monómero funcional o no funcional, que pueda polimerizar, con el fin de proporcionar un polímero y un agente de reticulación.

Description

Partículas magnéticas perfeccionadas, sus procedimientos de obtención, y sus utilizaciones en la separación de moléculas.

La presente invención, se refiere a partículas magnéticas termosensibles, que tienen un tamaño predeterminado, el cual se encuentra comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,05 y 10 \mum, y que comprenden, por una parte, un núcleo interno de un material compuesto (composite) y, por otra parte, una capa externa a base de un polímero susceptible de poder interaccionar con por lo menos una molécula biológica. La invención, se refiere, igualmente, a los procedimientos de obtención y utilizaciones de tales tipos de partículas.

En la exposición que se facilita a continuación, el término "material compuesto" o "composite", es sinónimo de un compuesto magnético, tal como la ferrita, o complejo, tal como la ferrita, distribuida o incorporada en una matriz polímera, o recubierta por ésta.

Este núcleo interno de material compuesto, puede tener un diámetro comprendido dentro de unos márgenes situados entre 20 nm, y 10 \mum.

El diagnóstico biológico, consiste en apaciguar una enfermedad, a partir de análisis de extracciones biológicas (orinas, sangre, líquido cefalorraquídeo, sedimento, esputo, etc...). En éste ámbito de investigaciones, se pretende, principalmente, poder proceder a extraer y concentrar, en unas condiciones compatibles con los tests de ensayo de actividad de ciertas proteínas o de los ácidos nucleicos, con el fin de evidenciar la presencia, en las personas enfermas, de una proteína o de una secuencia de ADN ó de ARN particular. En el caso de las proteínas, los procedimientos actualmente utilizados, consisten en introducir, en el medio, una gran cantidad de sales que conllevan la precipitación de las proteínas y, a continuación, separar proteínas y sales, por centrifugación. Pero, estos procedimientos, son muy pesados y, además, las proteínas de esta forma extraídas, son a menudo desnaturalizadas, es decir, que éstas han perdido sus propiedades biológicas. Esto explica el interés demostrado, desde hace algunos años, en los látex magnéticos, en el sector biomédico.

En efecto, los soportes polímeros en forma de látex, se utilizan de una forma muy extendida, debido al hecho de que, éstos, presentan numerosas ventajas, de una forma particular, la ventaja consistente en ofrecer una gran superficie específica (varias decenas de m^{2}), por gramo de partícula.

El estado actual de la técnica, puede definirse mediante los documentos de patente europea EP - A 0 106 873 y EP - A 0 446 260, los cuales describen partícula supermagnéticas y monodispersadas, que comprenden un núcleo poroso a base de copolímero de poliestireno / divinilbenceno, en el cual se incorporan granos de óxido de hierro magnético, y una capa externa funcionalizada, susceptible de poder interaccionar con sondas de ácidos nucleicos.

Según el procedimiento de preparación de las partículas descritas en estos documentos, los óxidos de hierro magnéticos, se incorporan mediante la precipitación de las sales correspondientes, lo cual limita la proporción de carga magnética incorporada, y no permite obtener la carga magnética más que en una inonocapa en la superficie, lo cual puede inducir a fenómenos de inhibición de las actividades biomoleculares.

Del mismo modo, el documento de patente europea EP - A 0 585 868, describe partículas magnéticas constituidas por un núcleo a base de un primer polímero y de una capa magnética que recubre el núcleo constituido por un segundo polímero, en el cual, se distribuye el material magnético a base de ferrita, y que es capaz de interaccionar con un antígeno o con un anticuerpo, depositándose, el material magnético, mediante precipitación de las sales de
hierro.

El material magnético incorporado, se expone directamente a los tratamientos ulteriores de las partículas, y ello viene seguido de una pérdida de carga, durante el transcurso de la utilización de las partículas, lo cual puede conllevar problemas, principalmente, de inhibición enzimática o de desnaturalización de entidades biológicas.

El documento de patente internacional WO - A - 94 / 09368, tiene por objeto la utilización de gelatina, en lugar de polímero a base de derivados de acrilamida, tal y como nosotros los preconizamos. Este documento, propone, no obstante, la aplicación de un agente de reticulación.

No obstante, la gelatina, tiene funciones totalmente diferentes de las de un polímero, tal como se reivindica. Así, de esta forma, la gelatina, no es en absoluto termo-sensible, y no se ha verificado en absoluto, el hecho de que, la reticulación de derivados de la acrilamida termosensibles, conduzca al aprisionamiento de las inclusiones magnéticas que se encuentran presentes en el núcleo interno.

Según el artículo de A. KONDO, (A. KONDO, H. KAMURA, Y K. HIGASHITANI (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41, 99 - 105) se conoce un procedimiento para la obtención de partículas magnéticas, el cual comprende un núcleo a base de un primer polímero que consiste en un poliestireno, y en el cual, se distribuye un material magnético, y una capa hidrófila, la cual recubre al núcleo, a base de un polímero termosensible, que consiste en poli(N-isopropilacrilamida). El procedimiento descrito, comprende las dos etapas siguientes. Según una primera etapa para la obtención del núcleo magnético, se procede a poner en contacto el material magnético con estireno, en presencia de un iniciador de polimerización. Según una segunda etapa para la obtención de la capa hidrófila, se procede a poner en contacto el núcleo obtenido con N-isoproprilacrilamida y ácido metacrílico, en presencia de un iniciador de polimerización precedente. Sobre las partículas de esta forma obtenidas, se fija albúmina de suero bovino para, a continuación, proceder al aislamiento de anticuerpos dirigidos contra la albúmina de suero bovino presentes en la muestra.

Este documento, propone partículas magnéticas, que comportan inclusiones de materia magnética presentes al nivel del núcleo interno y / o de la capa externa. En el bien entendido, si la citada capa externa comporta inclusiones, éstas podrán transferirse al medio reactivo, y perjudicar a eventuales aplicaciones y utilizaciones en sector de la bioquímica y / o del diagnóstico que necesiten reacciones específicas. Además de ello, no existe ninguna utilización de agente de reticulación y, por lo tanto, ninguna formación de una capa intermedia. Si tales tipos de partículas se ponen en presencia de un disolvente, las inclusiones, se liberarán en el medio reactivo, incluso si estas inclusiones no se encuentran presentes más que al nivel del núcleo interno. Además, las citadas partículas, no son eficaces más que para las proteínas. La separación de los ácidos nucleicos, no es susceptible de poderse considerar.

Así, de este modo, con objeto de asegurar una separación que sea tan eficiente como sea posible, de estas partículas, en la muestra, los solicitantes, han recurrido a una termofloculación, según la cual, se procede a aumentar la temperatura de la muestra, la cual interviene para completar la acción de un campo magnético. Se trata del documento de patente internacional WO - A - 97 / 45202, el cual propone partículas que son superparamagnéticas, que tienen una carga magnética distribuida de una forma muy homogénea, en donde, la proporción, puede variar dentro de unos márgenes situados entre un 1 y un 80%, de una forma particular, dentro de unos márgenes situados entre el 25% y el 80%, en peso, con relación al (a los) polímero(s) que constituyen las partículas. Este documento, permite el alcanzar proporciones de carga magnética incorporada elevadas, de una forma particular, debido al hecho de que, el documento empleado, permite el repartir la carga magnética en varios niveles. De ello, resulta una ventaja considerable, a saber, la posibilidad de separar eficazmente, de la muestra, las partículas de la invención, sin tener que recurrir a la acción combinada de otra técnica de separación, tal como la floculación.

Esta invención, tiene un objetivo diferente del de la presente invención. Además, existe una capa intermedia magnética, la cual recubre un núcleo interno que no es magnético. Es de notar, además, la ausencia de capa intermedia no magnética. Esta configuración, no impide la transferencia de las inclusiones magnéticas de la capa intermedia, en el medio reactivo.

Si estas partículas responden a la mayor parte de las aspiraciones pretendidas por los biólogos, éstas comportan un cierto número de inconvenientes. Así, de esta forma, en primer lugar, las partículas, no permiten la separación de las proteínas de los ácido nucleicos, lo cual puede ser particularmente interesante, en función de los trabajo emprendidos (identificación de anticuerpos, amplificación de secuencias, etc.) y, en segundo lugar, los ácidos nucleicos. Así, de este modo, en el caso de la separación de ácidos nucleicos, las partículas en concordancia con la presente invención, no inhiben las diferentes técnicas de amplificación que pueden utilizarse (PCR, NASBA, TMA). Finalmente, no es absolutamente necesario el transferir las substancias extraídas (proteínas de ácidos nucleicos), con relación a las partículas, pudiéndose efectuar, los tests de ensayo de identificación o de amplificación, directamente después de la separación magnética.

A dicho efecto, la presente invención, se refiere a partículas magnéticas y termosensibles, las cuales tienen un tamaño predeterminado, comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,05 y 10 \mum, comprendiendo, cada partícula:

- un núcleo interno de material compuesto, constituido por una partícula orgánica o inorgánica, sólida, que contiene, en su seno, una carga magnética, y

- una capa externa a base de un polímero, susceptible de poder interactuar con por lo menos una molécula biológica, siendo el polímero externo termosensible, y presentando una temperatura crítica inferior de solubilidad (LCST) predeterminada, que se encuentra comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10 y 100ºC y, de una forma preferente, entre 20 y 60ºC.

caracterizado por el hecho de que se encuentra presente una capa intermedia entre el núcleo interno y la capa externa, que aísla la carga magnética del citado núcleo interno, con relación a la citada capa externa funcionalizada.

Según una forma preferida de realización, la capa externa, se prepara mediante polimerización de por lo menos:

- un monómero funcional o no funcional, que puede polimerizar, con objeto de proporcionar un polímero, y

- un agente de reticulación.

Según oro modo preferente de realización, la capa exterior, se prepara mediante polimerización de por lo menos:

- un monómero funcional, que puede polimerizar, con objeto de proporcionar un polímero, y

- un iniciador.

Según una variante de realización de la presente invención, el monómero funcional, se encuentra constituido, por lo menos, por un monómero catiónico, tal como el cloruro de 2-aminoetilmetacrilato.

Según otra variante de realización de la presente invención, el monómero funcional, se encuentra constituido, por lo menos, por un monómero aniónico, tal como un monómero carboxílico o sulfato.

Sea cual fuere la forma o la variante de realización, el polímero, se encuentra constituido por polímeros hidrófilos, de una forma particular, por los derivados acrilaminas y, de una forma preferente, por el poli(NIPAM) obtenido mediante polimerización de N-isopropilacrilamida (NIPAM).

Según el primer modo preferencial de realización, el agente de reticulación, se encuentra constituido por la N,N'-metilenbisacrilamida.

Según el segundo modo preferencial de realización de la presente invención, el iniciador, se encuentra constituido, por lo menos, por un iniciador catiónico, tal como el cloruro de azobis(2-amidinopropano).

Siempre según el segundo modo de preferencial de realización de la presente invención, el iniciador, se encuentra constituido, por lo menos, por un iniciador aniónico, tal como el persulfato de potasio.

En todas las formas de realización de la presente invención, precedentemente expuestas, es posible el que, la capa externa, se funcionalice mediante un grupo amina protonizado, o amidina.

En todas las forma de realización de la presente invención, precedentemente expuestas, es posible el que, la capa externa, se funcionalice mediante un grupo carboxílico o sulfato.

La presente invención, se refiere igualmente a un procedimiento para la obtención de partículas, tal y como se definen precedentemente, el cual consiste en poner en presencia y hacer reaccionar:

- un núcleo de material compuesto, constituido por una partícula orgánica o inorgánica, sólida, que contiene, en su seno, una carga magnética,

- un monómero funcional o no funcional, que puede polimerizar, con el fin de proporcionar un polímero y,

- un agente de reticulación,

hasta que, el núcleo de material compuesto, el cual constituye el núcleo interno, se encapsule y se aísle, mediante una mezcla de polímero y de agente de reticulación, y que se forme una capa externa a base de polímero susceptible de interaccionar con por lo menos una molécula biológica.

Según una forma preferente, las partículas magnéticas catiónicas, se realizan mediante encapsulación, mediante polimerización, sobre núcleos de material compuesto, de los monómeros hidrosolubles de acrilamida y / o de derivados de acrilamida, en presencia del cloruro de azobis(2-amidinopropano).

De una forma ventajosa, la polimerización, se efectúa en presencia de N,N'-metilenbisacrilamida y / o de cloruro de 2-aminoetilmetacrilato.

Según otra forma preferente, las partículas magnéticas aniónicas, se realizan mediante encapsulación por polimerización, sobre núcleos de material compuesto, de los monómeros hidrosolubles de acrilamida y / o de derivados de acrilamida, en presencia de persulfato de potasio.

De una forma ventajosa, la polimerización, se efectúa en presencia de N,N'-metilenbisacrilamida y / o de monómeros carboxílicos.

Sea cual fuere el procedimiento aplicado, previamente a la polimerización, se procede a recubrir las partículas magnéticas, obtenidas por adsorción o polimerización, mediante por lo menos una substancia que aísla la carga magnética, tal como el poliestireno y / o el polimetacrilato de metilo.

De una forma preferente, el procedimiento, consiste en utilizar reactivos, en una proporción consistente en:

- de un 10 a un 30%, de monómero hidrosoluble de acrilamida o de un derivado de acrilamida,

- como máximo un 10%, de por lo menos un agente de reticulación, y

- de un 1 a un 5%, de por lo menos un agente estabilizante,

con relación a la masa total de la partícula obtenida mediante el procedimiento.

\newpage

La invención, se refiere también a la utilización de partículas catiónicas, para inmovilizar o extraer los ácidos nucleicos o todas las entidades polielectrolíticas y para transferir y / o analizar, después de la separación magnética, los dichos ácidos nucleicos o entidades, siendo, la temperatura de utilización, constantemente inferior a la LCST.

La invención, se refiere, finalmente, a la utilización de partículas aniónicas, tales como las descritas anteriormente, arriba, para extraer las proteínas, mediante fijación sobre las partículas, cuando la temperatura es superior a la LCST, y para transferir y / o analizar, después de la separación magnética, las citadas proteínas, cuando la temperatura es inferior a la LCST.

I - Encapsulación de los núcleos de materiales compuestos o partículas magnéticas comerciales

Se comercializan numerosas partículas magnéticas. La superficie de estas partículas, es aniónica o catiónica. En cambio, su composición, no se pormenoriza nunca. Estas partículas, poseen un índice de polimolecuridad variable. En efecto, las partículas Seradyn, Spherotec y Dynal, se encuentran monodispersadas, mientras que, las del tipo Estapor, si bien tienen un diámetro medio de 1 mm, se encuentran muy polidespersadas.

Todas estas partículas, se han sometido a tests de ensayo, según los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, y éstas engendran reacciones de inhibición. Es por lo tanto necesario el proceder a modificar su superficie, para poder trabajar sobre los ácidos nucleicos.

A / Preparación del látex magnético hidrófilo catiónico

Las reacciones de encapsulación, se realizaron bajo atmósfera de nitrógeno, a una temperatura de 70ºC.

Se procedió a diluir 1 g de partículas semilla, con 40 ml de agua miliQ, previamente calentada a ebullición, y desgasificada bajo atmósfera de nitrógeno.

Se procedió a añadir estireno, simplemente, hasta, hasta que, las partículas semilla, fueran hidrófobas. Éste se añadió sólo, antes del inicio de la síntesis, y se mantuvo en contacto con el núcleo magnético de material compuesto, durante un transcurso de tiempo comprendido entre 30 y 60 minutos.

Los monómeros, se introducen en las proporciones siguientes:

- NIPAM: 0,3254 g, es decir, 32,5% / simiente (80% / polímero, si la simiente contiene un 60% de ferrita),

- MAB: 0,0274 g, es decir, 6,18 mol % / NIPAM,

- AEM: 0,0740, es decir, 15,5 mol % / NIPAM, y

- V50: 0,0061 g, es decir, 0,80 mol % / NIPAM.

ES necesario el añadir un tensioactivo, por ejemplo, 0,14 g de tritón X405.

El iniciador, se introduce con un 1 ml de agua. A continuación, se procede a añadir los monómeros. Éstos se diluyen en 9 ml y se introducen progresivamente en el reactor, es decir, en un transcurso de tiempo de 15 minutos, o éstos se introducen de una sola vez, desde el inicio de la adición del iniciador.

En el ámbito de la presente invención, se procedió a encapsular núcleos de material compuesto (composite) Estapor. Se utilizaron partículas aniónicas (las partículas EM1 100/20 y EM1 100/30), y partículas catiónicas (partículas R95-07).

Las partículas preparadas a partir de los látices consistentes en el látex EM1 100/20 y el látex EM1 100/30, permitieron la obtención de una densidad de carga comprendida dentro de unos márgenes situados entre 50 y 300 milimol de NH_{2}) por gramo de látex, según el modo de polimerización utilizado (reactor cerrado, adición diferida o en continuo).

Las partículas preparadas a partir del látex R95-07, permitieron la obtención de una densidad de carga comprendida dentro de unos márgenes situados entre 50 y 300 mmol NH_{2}, por gramo de látex, según el modo de polimerización.

Según el protocolo de adición de los monómeros en el sistema de reacción, se pueden diferenciar varios procedimientos de polimerización.

1. Polimerización en reactor cerrado, denominada "batch" (por lotes)

Se procede a introducir los monómeros en el reactor, antes del inicio de la reacción, con los otros ingredientes y sin adición ulterior.

Debido a la diferencia de reactividad de los monómeros, este procedimiento conduce a menudo a la aparición de una deriva o desviación de la composición. Ésta, se manifiesta mediante la obtención de macromoléculas que tienen composiciones que varían considerablemente, en función de la conversación. Este procedimiento, se revela como poco eficaz, para la incorporación en superficie, debido al hecho de que se arriesga el que se pierda una parte importante del monómero funcional, bien ya sea en el interior de las partículas, o bien ya sea en forma de polímero hidrosoluble. Cuando la copolimerización se efectúa en forma "batch" (por lotes), con monómeros de naturaleza polar, se obtienen partículas más pequeñas, en gran número, pero con una conversión limitada. Este comportamiento, se encuentra unido a la importante solubilidad en el agua, de estos monómeros, y éste se atribuye a la preponderancia del mecanismo de nucleación homogénea.

2. Polimerización en semicontínuo

Se procede a introducir, en el reactor, por lo menos una parte de los monómeros, en un transcurso de tiempo comprendido dentro de unos márgenes que van, desde el inicio de la reacción, al final de ésta. Esta adición, puede efectuarse a un velocidad fija, o bien siguiendo un perfil determinado. La finalidad, es la de controlar la adición de la mezcla de los monómeros, de tal forma que se obtenga un copolímero de composición controlada; siendo de esta forma, que uno se sitúa, a menudo, en condiciones de adición tales que, la velocidad de polimerización, sea mayor que la de la adición. Esto permite la obtención de copolímeros homogéneos en composición.

3. Polimerización por adición diferida, denominada "shot"

En el momento de una copolimerización, y una vez que la reacción está en curso, el monómero funcional sólo, o en presencia del monómero de base, se introduce en el sistema de una forma controlada. El éxito de la operación, depende por lo tanto del grado de conocimiento previo de la cinética de copolimerización. Este es un procedimiento eficaz par favorecer la incorporación superficial. La selección de las condiciones experimetales (grado de conversión, en el momento de la adición, composición y concentración de la mezcla de monómeros), permite la optimización de los rendimientos de superficie.

4. Polimerización sobre simiente

Ésta consiste en introducir el monómero funcional en el sistema que contiene un látex ya constituido y perfectamente caracterizado. El monómero funcional, puede añadirse puro o en mezcla, con el monómero a base de la simiente de siembra, en una etapa, o en semicontínuo.

Entre las diferentes técnicas de polimerización anteriormente citadas, arriba, se utilizaron únicamente la polimerización en reactor cerrado y la polimerización sobre simiente de siembra.

B / Preparación del látex magnético hidrófilo aniónico

Los látices utilizados, se encuentran constituidos por un corazón de poliestireno y de ferrita, lo cual les confiere propiedades magnéticas. Además, éstos, se recubren, por polimerización, con N-isopropilacrilamida (NIPAM). Se añade un reticulante, la N,N'-metilenbisacrilamida (MBA). El iniciador utilizado, es el persulfato de potasio (K_{2}S_{2}O_{8}), lo cual explica la presencia de grupos sulfatos, en la superficie del látex, y, por lo tanto, su carácter aniónico.

II - Separación de los ácidos nucleicos

La presente invención, tiene como finalidad el poner a punto un nuevo modelo de test de ensayo de diagnóstico, el cual deberá permitir el revelar, de una forma muy precoz, la presencia de genes infecciosos, en el individuo. Se trata de establecer un protocolo que permita la extracción, de una forma específica, de los ADNs o los ARNs, de tal forma que se pueda dosificarlos, habiendo previamente procedido a eliminar las proteínas presentes, en gran cantidad, en el medio de extracción. El soporte elegido, no debe inducir, en una primera etapa, la reacción de inhibición de los procedimientos de amplificación de los ADNs y de los ARNs, del tipo PCR, NASBA ó TMA. Siendo esta etapa positiva, el soporte, deberá ser capaz de aislar específicamente, los ácidos nucleicos, en una cantidad suficiente.

El soporte, debe por lo tanto ser hidrófilo, y no transferir substancias inhibitorias de las reacciones de amplificación.

Este estudio, consiste en obtener látices magnéticos, catiónicos, recubiertos de un pelusa hidrófila, constituida por N-isopropilacrilamida (NIPAM), y funcionalizada mediante el cloruro de 2-aminoetilmetacrilato (AEM).

La superficie de los núcleos de material compuesto o partículas comerciales, se modificó y, los núcleos o partículas, se encapsularon. Las principales partículas disponibles, son las partículas de Dynal, Seradyn, BioMag, Spherotec ó Estapor (marcas registradas).

La solicitud de patente francesa FR 96 / 04691, registrada el 9 de Abril de 1996, por parte del solicitante, se refiere a una separación de este tipo, de los ácidos nucleicos. Su contenido, se integra, por lo tanto, en la presente solicitud de patente.

III - Separación de las proteínas

El interés de los látices, es el de ser no únicamente termosensibles, sino también magnéticos, lo cual permite evitar las etapas de centrifugación. Un simple imán de laboratorio, permite separar las partículas magnéticas del resto del medio. Esta técnica, presenta por lo tanto el interés de ser más rápida, y más fácilmente automatizable, en la perspectiva de una eventual utilización industrial.

En una primera etapa, es necesario el optimizar las condiciones físico-químicas que permitan concentrar las soluciones que contiene la albúmina humana (HSA : Human Serum Albumine), proteína modelo. En una segunda etapa, hace falta encontrar las condiciones que permitan el concentrar el conjunto de las proteínas presentes en las orinas.

Los tests de ensayo llevados a cabo con las soluciones preparadas, a partir de HSA sola, se realizaron con un núcleo EM 1 070/60, mientras que, las aplicaciones sobre las orinas, se realizaron con un núcleo EM1 100/20.

Después del lavado de los núcleos de materiales compuestos, con agua miliQ, desgasificada, y hervida bajo nitrógeno, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, se introduce 1 g de látex estapor en solución, en 40 m^{3} de agua, en el reactor, mantenido, durante el transcurso de toda el experimento, a una temperatura de 70ºC, y bajo corriente de nitrógeno. Después de la adición de 200 ml de estireno, se deja hinchar, durante un transcurso de tiempo de 2 horas.

Se disuelven 0,0061 g de KPS, en 1 ml de agua. A continuación, se procede a añadir, cada minuto, 1 ml de una solución de 0,325 g de NIPAM, 0,027 g de MBA y 0,14 g de tritón (X-405), en 9 ml de agua; esta mezcla, se deja bajo agitación, durante por lo menos un transcurso de tiempo de 10 horas.

A continuación, se procede al lavado del látex.

Esta operación, tiene como finalidad el eliminar el tensioactivo, así como los electrolitos y las cadenas de polímeros libres, en solución. En efecto, el tensioactivo, puede conllevar perturbaciones con el reactivo de Bradford (procedimiento químico utilizado para dosificar las proteínas) y puede disminuir sus capacidades de absorción de los látices.

Al ser magnético, el látex utilizado, es muy fácil el retirar el sobrenadante, utilizando un imán, el reemplazarlo por agua miliQ, recién permutada y, a continuación, agitarla vigorosamente, utilizando un vórtice, se vuelve a iniciar este lavado, hasta que, el sobrenadante, sea límpido (se puede también verificar que la conductividad del látex, después del último lavado, sea prácticamente tan débil como la conductividad del agua miliQ ( \approx 0,02 mS)).

A / Albúmina de suero humano (HSA)

La HSA, es una proteína modelo para estudiar diferentes parámetros, tales como el pH, fuerza iónica, que permite concentrar la proteína al máximo.

Se trata de una proteína elipsoidal, de unas dimensiones aproximadas de 4 x 4 x 14 nm, y de un peso molecular cercano a los 62000 g/mol.

Su potencial zeta, (medida físico química relativa a la densidad de carga en la superficie de la partícula), varía con el pH: la proteína HSA, es catiónica, para el pH < PI (punto isoeléctrico: valor del pH para la cual, la carga neta, es cero; PI = 4,8, para HSA) y aniónico, para pH > PI).

B / Métodos de medición de la concentración en proteínas

La dosificación de las proteínas, por ejemplo, la HSA, se efectúa utilizando el reactivo de Bradford. Esta dosificación, es posible, gracias a la utilización del azul de "Coomassie" (G 250), el cual forma un complejo con las proteínas (inicialmente, de color marrón, y se colorea en azul, de un matiz cada vez más vivo, a medida que aumenta la concentración en proteínas). El complejo proteína / colorante, tiene un coeficiente de extinción muy elevado, lo cual permite tener un procedimiento muy sensible. Además, la coloración, es casi instantánea, lo cual permite una dosificación rápida.

Todas las dosificaciones de Bradford, se realizan en las mismas condiciones: 15 \mul de solución, de la cual, se desea determinar la concentración en proteínas.

+ 135 \mul de tampón adecuado (pH y fuerza iónica deseados)

+ 150 \mul de reactivo de "Coomassie".

1. Determinación de la cantidad adsorbida

La cantidad de proteínas adsorbidas Ns, viene dada por la fórmula siguiente:

Ns(mg\cdot g^{-1}) = V(C_{i}-C_{f}) / m

en donde,

C_{i}(mg/ml) = concentración inicial en proteínas de la solución, en contacto con el látex;

C_{f} = concentración final HSA, en el sobrenadante, después de absorción;

V (ml) = volumen total de la solución:

M (g) = masa de látex en solución;

2. Determinación de la cantidad desorbida

Si las proteínas se absorbían inicialmente sobre una masa m (en g) de látex, y que, después de la desorción en un volumen V (ml) se procede a determinar, por dosificación de Bradford, una concentración C (mg\cdotml^{-1}) de proteína, entonces, la cantidad desorbida, viene determinada por:

Ns(mg\cdot g^{-1}) = V\text{*}C/m

C / Optimización de los parámetros 1. Desorción de la proteína HSA

En esta parte, se procede a determinar los valores del pH, de la fuerza iónica, y de la temperatura, que permiten adsorber, sobre las partículas de látex, el máximo de proteínas.

a. Modo operativo

Las experiencias, se realizan en tubos de Eppendorf (contenido máximo : 1,5 ml).

Volumen de látex	100 \mul (es decir, 2,1 mg)
Volumen de la solución de HSA	200 \mul (masa variable)
Volumen del tampón	70 \mul

Dado que, se procede a introducir 0,2 ml de solución de HSA de una concentración dada, para un volumen total de 1 ml, la concentración real de la solución de HSA en contacto con látex, se obtiene, después de corrección, mediante un factor de dilución de 0,2.

b. Influencia de la temperatura

La influencia de la temperatura, sobre la absorción, es notable, independientemente del pH. La figura 1, muestra la variación de la cantidad de proteína adsorbida, en función de la concentración inicial en proteínas, a dos temperaturas diferentes, para un pH = 4,7, y una fuerza iónica de 0,01 mol/l.

Se observa la misma tendencia, a un valor pH de 5,7 (a una temperatura de 20ºC, la adsorción, es un 30% más débil que a una temperatura de 40ºC) y a un valor pH de 8,6.

Puesto que, únicamente la naturaleza hidrófila / hidrófoba del látex, varía con la temperatura, este estudio permite el evidenciar la influencia de las interacciones hidrófobas sobre la adsorción.

El hecho de que, las curvas, se confundan para los primeros puntos, podría ser debido al modo operativo. Para someter a test de ensayo la adsorción, a una temperatura de 40ºC, el látex, las proteínas y el tampón, se mezclaron a la temperatura ambiente y, a continuación, se calentaron hasta una temperatura de 40ºC. Puede suceder, por lo tanto, el que, para las concentraciones débiles de HSA, cuando pensábamos adsorber a una temperatura de 40ºC, las proteínas, se adsorben, sobre el látex, en su forma hidratada, puesto que, T < 32ºC.

c. Influencia del tiempo de adsorción

En las condiciones juzgadas como óptimas, para la adsorción, se realiza un estudio cinético de la cantidad adsorbida, en función del tiempo de incubación. La figura 2, muestra que, al cabo de un transcurso de tiempo de 30 minutos, se ha adsorbido ya prácticamente la cantidad máxima posible.

d. Influencia del valor pH

La adsorción, se realizó para unos valores pH correspondientes a 4,7, 5,7 y 8,6, para concentraciones en HSA, correspondientes a unos valores comprendidos entre 0 y 0,2 g\cdotl^{-1}. Para la adsorción a un valor pH = 8,6, no se puede trazar la curva para (HSA) > 0,06 g\cdotl^{-1}, debido al hecho de que, al ser muy débil la cantidad adsorbida,(C_{i}- C_{f}), es casi nula y, el procedimiento de medición, no es lo suficientemente preciso como para detectar esta pequeña variación.

Sobreponiendo las tres curvas obtenidas, se obtiene el gráfico de la figura 3, la cual evidencia:

i) la existencia de un nivel plano, para la adsorción de 50 mg de proteínas, por g de látex (saturación de los sitios de adsorción).

ii) una adsorción máxima, para pH =4,7.

Este resultado, se encuentra en concordancia con la influencia de las interacciones electrostáticas: para pH < Pl, la proteína, es catiónica y, el látex, aniónico, de lo cual acontece una atracción electrostática y una adsorción favorecida, mientras que, para pH > Pl, la proteína y el látex, son aniónicos, de lo cual acontece una repulsión electrostática que reduce la cantidad de HSA adsorbida. Este estudio, pone por lo tanto en evidencia, la influencia de las fuerzas electrostáticas sobre la adsorción.

e. Influencia de la fuerza iónica

Las curvas que proporcionan la cantidad adsorbida, en función de la fuerza iónica, para una misma concentración inicial en proteínas, se reproducen en la figura 4.

i) pH = 4,7 y (HSA) = 0,14 mg \cdot ml^{-1} y T = 40ºC

Esta curva, muestra el hecho de que, la adsorción, es máxima para una fuerza iónica débil; esto, se encuentra en concordancia con las interacciones electrostáticas atractivas, las cuales favorecen tanto más, la adsorción, en la medida que éstas sean tanto más apantalladas, a medida que disminuye la salinidad del medio.

ii) pH = 8,6 y (HSA) = 0,04 mg \cdot ml^{-1} y T = 40ºC

Esta curva, muestra el hecho de que, la adsorción, es máxima, para una fuerza iónica elevada; a un valor pH básico, las interacciones electrostáticas, son repulsivas, por lo que, la adsorción, es tanto mas grande, en la medida que estas interacciones se apantallen.

f. Influencia de la cantidad de látex

La figura 5, muestra el hecho de que, para 0,14 mg de HSA, y un látex de una tasa de sólidos de un 2,1%, se alcanza un nivel plano de la cantidad adsorbida, para un volumen de 0,125 ml de látex (es decir, 2,6 mg). Este nivel plano, corresponde a aproximadamente 50 mg de proteínas, por gramo de látex, a saber, suponiendo que, las partículas de látex, tienen un diámetro cercano a 1 mm, y una densidad de 1,85 g/cm^{3} (\Sigma = 3,24 m^{2}/g): 15 mg de HSA por m^{2} de polímero. Este resultado, se encuentra dentro de la media esperada.

g. Balance para la adsorción

Los parámetros optimizados para la adsorción son, por lo tanto:

pH = 7

Fi = 0,01 mol/l

T = 40ºC

t = 10 minutos

D / Desorción de la proteína HSA

La adsorción, se realiza en las condiciones óptimas determinadas anteriormente, arriba y, a continuación, se estudian los parámetros que gobiernan la desorción.

Los primeros tests de ensayo de adsorción, se realizaron en tubos de Eppendorf. En primer lugar, la adsorción, se conduce en las condiciones definidas anteriormente, arriba (se verifica el hecho de que se adsorben casi la totalidad de las proteínas presentes en el medio). Se procede, a continuación, a reemplazar el sobrenadante, por 1 ml de la solución, de la cual se quiere estudiar la capacidad para favorecer la desorción.

Después de un tiempo variable de desorción, la medición de la densidad óptica de este nuevo sobrenadante, permite deducir la cantidad de HSA adsorbida, es decir, la influencia del tiempo de desorción.

La desorción, se realiza de una forma mejor, a un pH básico, que a un pH ácido, y a una temperatura de 20ºC, mejor que a una temperatura de 40ºC, lo cual era previsible, en concordancia con la influencia de la temperatura y del valor pH. Además, se eligió un tiempo de adsorción reducido ( \approx 10 minutos), debido al hecho de que, este plazo de tiempo, es suficiente como para adsorber la casi totalidad de las proteínas y que, cuanto más las proteínas permanecen en contacto con el látex, menos importante es la desorción.

La influencia de otros parámetros, es menos evidente y, los resultados obtenidos, de detallan abajo, a continuación.

1. Influencia de la fuerza iónica

La figura 6, muestra la influencia de la fuerza iónica del tampón sobre la desorción.

Esta curva, hace aparecer la presencia de un máximo de desorción, mediante una fuerza iónica próxima a 0,1 mol\cdotl^{-1}. Este resultado, es bastante sorprendente. A un valor pH básico, el látex y el HSA, son aniónicos y, así, pues, las fuerzas magnéticas, son repulsivas. Con el fin de aumentar la adsorción, no hace falta apantallarlas; hace falta, a priori, una fuera iónica débil. Pero, por otra parte, cuando la fuerza iónica aumenta, la pelusa de polyNYPAM, se encuentra en un disolvente malo, es decir, se contracta y, las proteínas, se aproximan. Puesto que, éstas portan la misma carga negativa, la repulsión electrostática, conlleva la desorción de una cierta cantidad de proteínas. La existencia de dos fenómenos de influencia opuestos, justifica la existencia de un máximo.

2. Influencia del tiempo de desorción

La figura 7, muestra el hecho de que, la cantidad desorbida, aumenta ligeramente, cuando el tiempo de desorción aumenta. Nosotros, hemos elegido, mientras tanto, un tiempo de desorción bastante reducido (2h), por razones prácticas: así, de esta forma, se desorbe un porcentaje del 15% menos, con respecto a lo que se podría obtener.

3. Balance para la desorción

Los parámetros optimizados para la desorción son, por lo tanto:

pH > 8,6

Fi = 0,1 mol/l

T = 20ºC

E / Balance: concentración de soluciones que contienen HAS

La adsorción, se realiza para un volumen total de 10 ml, en las condiciones óptimas, en los tubos "Falcon". Para ello, después de la preparación de una solución de HSA, en un tampón de pH = 4,7 y de fuerza iónica 0,01 mol/l de concentración, tal como la concentración de las proteínas realmente en contacto con el látex, es decir, de 0,1 g\cdotl^{-1}, teniendo en cuenta la dilución, se introducen 27 mg de látex.

La cantidad adorbida, es de aproximadamente 0,095 ml\cdotmg^{-1} (es decir, un 95% de proteínas inicialmente presentes). Después de separación, mediante la utilización de un imán, la desorción, se realiza, a continuación, procediendo a introducir 1 ml de tampón de un valor pH = 8,6 y, después, de un valor pH = 10,8. En el primer caso, la solución obtenida, tiene una concentración en HSA, igual a 0,23 mg\cdotml^{-1} (se desorbe un porcentaje del 24% de la cantidad adsorbida) y 0,37 mg\cdotml^{-1} (Se desorbe un porcentaje del 39%), en el segundo. La concentración inicial, en estas condiciones, puede por lo tanto multiplicarse, como máximo por 3,7.

IV. Aplicación a las orinas A / Observación general

Los estudios preliminares, se efectuaron sobre un medio extremadamente simple: una sola proteína, de concentración conocida, en un medio tamponado, en donde, todos los parámetros, habían sido determinados.

En cambio, las orinas, constituyen un medio muy complejo, conteniendo varias decenas de proteínas de pesos moleculares diferentes, y rica en sales. Mientras tanto, para establecer la concentración en proteínas de las orinas, a partir de la densidad óptica, hemos utilizados las curvas de contraste establecidas para la HSA: los resultados obtenidos, no son, por lo tanto, más que cualitativos. Además, el valor pH y la concentración en proteínas de la orinas, depende de las personas y de su alimentación. Es por lo tanto necesario el determinar estos valores para cada lote de orina utilizado.

B / Resultados para orinas de testigos negativos

La primera serie de experiencias, se realizó utilizando las condiciones de los tests de ensayo preliminares. En la segunda serie, se ha procedido a modificar ciertas etapas, en función de los resultados de la primera serie.

1. Modo operativo

Después de introducción en tubos del tipo "Falcon", de 10 ml de las orinas a concentrar, y de 27 mg de látex, la mezcla, se emplazó en un baño maría, a una temperatura de 40ºC, durante un transcurso de tiempo variable. A continuación, se retiró el sobrenadante y, a continuación, se reemplazó por 1 ml de tampón a un valor pH = 4,7, el cual se retiró casi instantáneamente: esta operación, tiene como finalidad la de lavar el látex, sin, en principio, desorber.

Después de la adición de 1 ml de tampón de un valor pH = 10,6, y de una fuerza iónica de 0,01M, se deja desorber, a una temperatura de 20ºC, durante un transcurso de tiempo t_{D}. La dosificación de Bradford, del sobrenadante, permite el determinar la concentración total en proteínas desorbidas.

2. Dosificación de proteínas (mediante Bradford)

El valor pH de las orinas estudiadas, es cercano de 7 y, la concentración inicial en proteínas (para el lote estudiado), es del orden de 0,02 g\cdotl^{-1}. El análisis de los sobrenadantes, muestra que:

1) Es necesario el acidificar las orinas: a su valor natural, cercano a 7, la adsorción, no alcanza un 50% de las proteínas presentes, mientras que, ésta se aproxima a un 80%, en las orinas acidificadas a un valor pH = 4,6;

2) La etapa de lavado, conlleva la pérdida de aproximadamente un 20% de la proteínas adsorbidas: hemos procedido a suprimir, por lo tanto, esta etapa, en las experiencias siguientes.

El estudio de la influencia del tiempo de adsorción y de desorción, muestra el hecho de que, contrariamente a los resultados obtenidos en el momento del estudio preliminar sobre la HSA, es necesario el proceder a adsorber, durante un transcurso de tiempo de por lo menos 60 minutos, para alcanzar un nivel plano de adsorción. Después de un tiempo de desorción de 60 minutos, en un volumen de 1 ml, la solución obtenida, es 4 veces más concentrada en proteínas, que las orinas de partida. Este resultado, es bastante satisfactorio, debido al hecho de que, en concordancia con los tests de ensayo de concentraciones de HSA sola, incluso si, ello, es en la teoría, se podría esperar multiplicar la concentración por 10, puesto que se procede a concentrar 10 ml en 1 ml.

Mientras tanto, la finalidad final, no es la de concentrar todas las proteínas, sino de aislar la proteína que nos interesa. De ahí, el interés en analizar las diferentes muestras de esta forma obtenidas, sobre gel de electroforesis, para evidenciar la proteína o las diferentes proteínas.

V. Conclusiones

Un estudio preliminar, permitió verificar el hecho de que, la utilización de partículas de látex magnéticas y termosensibles, permite, jugando sobre diferentes parámetros físicos (pH, temperatura, fuerza iónica), el adsorber y desorber la albúmina humana (HSA). Es de esta forma posible, a partir de una solución de 10 ml, diluida, de esta proteína, el pasar a una solución de 1 ml de aproximadamente 4 veces más concentrado.

Procediendo a optimizar los parámetros, es posible el adsorber un porcentaje de hasta un 95% de proteínas. El hecho de que no se pueda concentrar más, es debido a la desorción incompleta. Con el fin de aumentar esta tasa de adsorción, es previsible el proceder a añadir tensioactivos susceptibles de intercambiarse con las proteínas adsorbidas.

La aplicación de la condiciones de concentración óptimas, para HSA, a las orinas, permite el obtener resultados parecidos. Es posible el multiplicar por cuatro, la concentración en proteínas, de un lote de orinas, procediendo a desorber en un tampón apropiado. Procediendo a liofilizar las muestras de esta forma concentradas, se puede obtener un factor multiplicativo de 100, próximo a la tasa de concentración obtenida por el procedimiento de precipitación con sulfato amónico. Mientras tanto, la solución obtenida, después de liofilización, es demasiado concentrada en sales. Una etapa de diálisis, sería por lo tanto necesaria, con el fin de reemplazar el tampón de fuerza iónica 0,1 mol/l, por un medio menos salino, a menos que se decida el proceder a desorber en un medio de fuerza iónica, casi nula, con riesgo de no desorber, más que una reducida cantidad de proteínas.

Claims

1. Partícula magnética y termosensible, la cual tiene un tamaño predeterminado, comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,05 y 10 \mum, la cual comprende:

caracterizado por el hecho de que se encuentra presente una capa intermedia entre el núcleo interno y la capa externa, que aísla la carga magnética del citado núcleo interno, con relación a la citada capa externa funcionalizada, y que, ésta, se encuentra constituida por un polímero reticulado, preparado a partir de por lo menos un monómero funcional o no funcional, que pueda polimerizar, con el fin de proporcionar un polímero y un agente de reticulación.

2. Partícula, según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que, la capa externa, se prepara mediante polimerización de por lo menos:

- un iniciador.

3. Partícula, según la reivindicación 1 ó 2,

caracterizada por el hecho de que, el monómero funcional, se encuentra constituido, por lo menos, por un monómero catiónico, tal como el cloruro de 2-aminoetilmetacrilato.

4. Partícula, según la reivindicación 1 ó 2,

caracterizada por el hecho de que, el monómero funcional, se encuentra constituido, por lo menos, por un monómero aniónico, tal como un monómero carboxílico o sulfato.

5. Partícula, según una de las reivindicaciones 1 a 4,

caracterizada por el hecho de que, el polímero, se encuentra constituido por polímeros hidrófilos, de una forma particular, por los derivados acrilaminas y, de una forma preferente, el poli(NIPAM) obtenido mediante polimerización de N-isopropilacrilamida (NIPAM).

6. Partícula, según la reivindicación 1,

caracterizada por el hecho de que, el agente de reticulación, se encuentra constituido por la N,N'-metilenbisacrilamida.

7. Partícula, según la reivindicación 2,

caracterizada por el hecho de que, el iniciador, se encuentra constituido, por lo menos, por un iniciador catiónico, tal como el cloruro de azobis(2-amidinopropano).

8. Partícula, según la reivindicación 2,

caracterizada por el hecho de que, el iniciador, se encuentra constituido, por lo menos, por un iniciador aniónico, tal como el persulfato de potasio.

9. Partícula, según las reivindicaciones 1 a 8,

caracterizada por el hecho de que, la capa externa, se funcionaliza mediante un grupo amina protonizado, o amidina.

10. Partícula, según las reivindicaciones 1 a 9,

caracterizada por el hecho de que, la capa externa, se funcionaliza mediante un grupo carboxílico o sulfato.

11. Procedimiento para la obtención de partículas, tal y como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,

caracterizado por el hecho de que, éste, consiste en

- hacer reaccionar un núcleo de material compuesto, constituido por una partícula orgánica o inorgánica, sólida, que contiene, en su seno, una carga magnética, y un monómero funcional o no funcional, que puede polimerizar, con el fin de proporcionar un polímero que constituya una capa intermedia, alrededor del núcleo de material compuesto, interno, y

- hacer reaccionar un agente de reticulación, para reticular el polímero, y

- hacer reaccionar la capa intermedia polimerizada y reticulada, con un monómero funcional que pueda polimerizar, con el fin de obtener un polímero que constituya una capa externa.

12. Procedimiento de obtención de partículas, según la reivindicación 11,

caracterizado por el hecho de que, las partículas magnéticas catiónicas, se realizan mediante polimerización, sobre núcleos de material compuesto, de los monómeros hidrosolubles de acrilamida y / o de derivados de acrilamida, en presencia del cloruro de azobis(2-amidinopropano).

13. Procedimiento, según la reivindicación 12,

caracterizado por el hecho de que, la polimerización, se efectúa en presencia de N,N'-metilenbisacrilamida y / o de cloruro de 2-aminoetilmetacrilato.

14. Procedimiento de obtención de partículas, según la reivindicación 11,

caracterizado por el hecho de que, las partículas magnéticas aniónicas, se realizan mediante polimerización de monómeros hidrosolubles de acrilamida o de derivados de acrilamida, en presencia del cloruro de persulfato de potasio.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14,

caracterizado por el hecho de que, la polimerización, se efectúa en presencia de N,N'-metilenbisacrilamida y / o de monómeros carboxílicos.

16. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15,

caracterizado por el hecho de que, la capa intermedia, se encuentra constituida por lo menos por una substancia que aísla la carga magnética, substancia ésta tal como poliestireno y / o polimetacrilato de metilo.

17. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicación 11 a 15,

caracterizado por el hecho de que, éste, consiste en utilizar reactivos, en una proporción consistente en:

- como máximo un 10%, de por lo menos un agente de reticulación, y

- de un 1 a un 5%, de por lo menos un agente estabilizante,

18. Utilización de partículas catiónicas, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 a 7 ó 9, para inmovilizar o extraer los ácidos nucleicos o todas las entidades polielectrolíticas y para transferir y / o analizar, después de la separación magnética, los citados ácidos nucleicos o entidades, siendo, la temperatura de utilización, constantemente inferior a la LCST.

19. Utilización de partículas catiónicas, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, 4 a 6, 8 ó 10, para extraer las proteínas, mediante fijación sobre las partículas, cuando la temperatura es superior a la LCST, y para transferir y/o analizar, después de la separación magnética, la citadas proteínas, cuando la temperatura es inferior a la LCST.