ES2304638T3

ES2304638T3 - Purificacion de inmunoglobulinas.

Info

Publication number: ES2304638T3
Application number: ES04809180T
Authority: ES
Inventors: Gunnar Glad; Bo-Lennart Johansson; Jean-Luc Maloisel; Nils Norrman
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2003-12-23
Filing date: 2004-12-21
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2024-12-21
Also published as: DE602004013040D1; US20070151928A1; CA2549923A1; EP1697416B1; ATE391729T1; US20100151581A1; JP2007535658A; WO2005061543A1; CN100516086C; AU2004303746A1; AU2004303746B2; JP4739233B2; SE0303532D0; DE602004013040T2; CN1898265A; EP1697416A1; US8685248B2

Abstract

Una matriz de separación que comprende un soporte poroso en el cual se han inmovilizado ligandos, opcionalmente por medio de brazos espaciadores, donde dichos ligandos comprenden una o más sulfonamidas donde un grupo R del sulfonilo es un compuesto alifático.

Description

Purificación de inmunoglobulinas.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la preparación de anticuerpos, y más específicamente a una matriz de separación para el aislamiento de anticuerpos. La invención también abarca una columna de cromatografía que comprende la matriz novedosa y un método de aislamiento de anticuerpos.

Antecedentes

El sistema inmunitario está compuesto por muchos tipos de células independientes que protegen colectivamente el organismo de las infecciones bacterianas, parasíticas, fúngicas, virales y del crecimiento de células tumorales. Los guardianes del sistema inmunitario son los macrófagos que continuamente recorren la corriente sanguínea de su anfitrión. Cuando son sensibilizados por una infección o inmunización, los macrófagos responden engullendo los invasores marcados con moléculas foráneas conocidas como antígenos. Este evento, mediado por las células T coadyuvantes, muestra una complicada cadena de respuestas que dan como resultado la estimulación de las células B. Estas células B, a su vez, producen proteínas denominadas anticuerpos, que se unen al invasor foráneo. El evento de unión entre el anticuerpo y el antígeno marca el invasor foráneo para la destrucción por medio de la fagocitosis o la activación del sistema del complemento. Existen cinco clases diferentes de anticuerpos, o inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Estas difieren no solamente en sus papeles fisiológicos sino también en sus estructuras. Desde un punto de vista estructural, los anticuerpos IgG son una clase concreta de inmunoglobulinas que han sido estudiadas extensamente, quizás debido al papel dominante que juegan en una respuesta inmunitaria madura.

La actividad biológica, que poseen las inmunoglobulinas, es explotada hoy en una gama de aplicaciones diferentes en el diagnóstico humano y veterinario, el cuidado de la salud y el sector terapéutico. De hecho, en los últimos años, los anticuerpos monoclonales y los constructos de anticuerpos recombinantes se han convertido en la clase más grande de proteínas investigada en la actualidad en pruebas clínicas y reciben la aprobación de la FDA como agentes terapéuticos y diagnósticos. De manera complementaria a los sistemas de expresión y las estrategias de producción, se diseñan protocolos de purificación para obtener anticuerpos altamente puros de una manera simple y con un coste eficaz.

Los métodos tradicionales para el aislamiento de inmunoglobulinas se basan en la precipitación reversible selectiva de la fracción de proteínas que comprenden las inmunoglobulinas mientras se dejan otros grupos de proteínas en solución. Los agentes de precipitación típicos son etanol, polietilenglicol, sales liotrópicas, esto es, anti-caotrópicas tales como sulfato de amonio y fosfato de potasio, y ácido caprílico. Típicamente, estos métodos de precipitación están proporcionando productos muy impuros a la vez que llevan tiempo y son laboriosos. Además, la adición del agente de precipitación a la materia prima hace difícil utilizar el sobrenadante para otros fines y crea un problema de eliminación, que es particularmente relevante cuando se habla de la purificación a gran escala de las inmunoglobulinas.

La cromatografía de intercambio iónico es otro método bien conocido del fraccionamiento de proteínas utilizado frecuentemente para el aislamiento de inmunoglobulinas. No obstante, puesto que los ligandos de intercambio iónico cargados reaccionarán con todos los compuestos con una carga opuesta, la selectividad de la cromatografía de intercambio iónico puede ser algo inferior que la de otras separaciones cromatográficas.

La cromatografía de afinidad con Proteína A y Proteína G es un método popular y muy difundido para el aislamiento y purificación de inmunoglobulinas, concretamente para el aislamiento de anticuerpos monoclonales, debido principalmente a la facilidad de uso y a la elevada pureza obtenida. La utilización combinada con etapas de intercambio iónico, interacción hidrófoba, filtración en hidroxiapatita y/o gel, especialmente métodos basados en proteína A ha hecho de la purificación de anticuerpos el método de elección para muchas compañías biofarmacéuticas. No obstante, a pesar de su uso común, existe una necesidad y una demanda creciente de alternativas eficaces que se dirijan a los problemas familiares asociados con los medios basados en la proteína A, tales como el coste, la pérdida y la inestabilidad a valores de pH elevados.

La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) también es un método ampliamente descrito para el aislamiento de inmunoglobulinas. Sin embargo, las matrices hidrofóbicas requieren una adición de sales liotrópicas a la materia prima para hacer que la inmunoglobulina se una eficazmente. El anticuerpo unido se libera de la matriz disminuyendo la concentración de sal liotrópica en un gradiente continuo o por etapas. Si el objeto es un producto altamente puro, se recomienda combinar la cromatografía hidrofóbica con una etapa adicional. De este modo, una desventaja de este procedimiento es la necesidad de añadir sal liotrópica a la materia prima ya que esto produce un problema y de ese modo incrementa el coste a gran escala para el usuario. Para otras materias primas distintas de los sobrenadantes de cultivo tales como suero, plasma, y yema de huevo la adición de sales liotrópicas a las materias primas será prohibitiva en algunos casos en las aplicaciones a gran escala ya que la sal podría evitar cualquier uso económicamente factible de la materia prima con la inmunoglobulina agotada. Un problema adicional en las aplicaciones a gran escala sería la recogida de varios miles de litros de desechos.

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La cromatografía de adsorción tiofílica fue introducida por J. Porath en 1985 (J. Porath et al; FEBS Letters, vol. 185, pág. 306, 1985) como nuevo principio de adsorción cromatográfica para el aislamiento de inmunoglobulinas. En esta publicación, se describe cómo la agarosa activada por divinilsulfona acoplada con diversos ligandos que comprenden un grupo mercapto libre muestran una unión específica de las inmunoglobulinas en presencia de sulfato de potasio 0,5 M, esto es, una sal liotrópica. Se postuló que el grupo sulfona, del espaciador de vinilsulfona, y el tioéter resultante en el ligando era una necesidad estructural para obtener la especificidad descrita y la capacidad para la unión de los anticuerpos. Se demostró más tarde sin embargo, que el tioéter podía ser remplazado por nitrógeno u oxígeno si el ligando comprendía adicionalmente un radical aromático (K. L. Knudsen et al., Analytical Biochemistry, vol. 201, pág. 170, 1992). Aunque las matrices descritas para la cromatografía tiofílica muestran generalmente buen funcionamiento, también tienen una desventaja principal ya que es necesario añadir sales liotrópicas a la materia prima para asegurar una unión eficiente de la inmunoglobulina, lo que es un problema por las razones mencionadas
antes.

Se han descrito otros ligandos tiofílicos acoplados a agarosa activada por epoxi (J. Porath et. al. Makromol. Chem., Makromol. Symp., vol. 17, pág. 359, 1988) y (A. Schwarz et. al., Journal of Chromatography B, vol. 664, págs. 83-88, 1995), p. ej. 2-mercaptopiridina, 2-mercaptopirimidina, y 2-mercaptotiazolina. Sin embargo, todas estas matrices de afinidad tienen todavía constantes de afinidad inadecuadas para asegurar una unión eficiente del anticuerpo sin sales liotrópicas añadidas.

En el documento US 6.498.236 (Upfront Chromatography) se hace referencia al aislamiento de inmunoglobulinas. El método descrito implica las etapas de poner en contacto una solución que comprende un detergente cargado negativamente y contiene una o varias inmunoglobulinas con una matriz en fase sólida, por medio del cual al menos una parte de las inmunoglobulinas se une a la matriz en fase sólida; y poner en contacto la matriz en fase sólida con un eluyente con el fin de liberar la inmunoglobulina o las inmunoglobulinas de la matriz en fase sólida. La solución que contiene inmunoglobulina se caracteriza adicionalmente por tener un pH en el intervalo de 2,0 a 10,0, un contenido de sal total correspondiente a una fuerza iónica de 2,0 como mucho, y sales liotrópicas a una concentración 0,4 M como mucho. Se cree que el detergente presente en la solución suprime la adherencia de otras biomoléculas a la matriz, y se puede ilustrar mediante sulfato de octilo, azul de bromofenol, octanosulfonato, laurilsarcosinato de sodio, y sulfonato de hexano. La matriz en fase sólida se define mediante la fórmula M-SP1-L, donde M designa el esqueleto de la matriz, SP1 designa un ligando que comprende un radical aromático o heteroaromático mono- o bicíclico.

Liu et al. (Yang Liu, Rui Zhao, Dihua Shangguan, Hongwu Zhang, Guoquan Liu: Novel sulfinethazine ligand used for one-step purification of immunoglobulin G from human plasma, Journal of Chromatography B, 792 (2003) 177-185) investigaron la afinidad de la sulfmetazina (SMZ) por la IgG humana. De este modo, se describe un ligando, que comprende un grupo sulfonilo donde el grupo R es un anillo heterocíclico. De acuerdo con este artículo, se inmovilizó SMZ sobre cuentas de poli(metacrilato de glicidilo) entrecruzado, no poroso, monodisperso. Después se utilizaron las cuentas en una cromatografía de afinidad de alta resolución para el aislamiento de IgG del plasma humano. La absorción máxima se obtuvo a un pH de 5,5. Las cuentas presentaban una interacción no específica mínima con otras proteínas. De este modo, los ligandos fueron capaces de adsorber los anticuerpos, mientras su interacción con otras proteínas fue solo suficiente para proporcionar el retraso de las mismas en el tampón de adsorción utilizado. Sin embargo, como es bien sabido, los compuestos éster tales como el metacrilato son fácilmente hidrolizados a valores de pH elevados. Por consiguiente, de un modo similar a las matrices de Proteína A y Proteína G, cabría esperar que la matriz de separación allí descrita desestabilizara los procedimientos de limpieza en el sitio (cip) utilizados comúnmente.

En el documento US 4.725.355 se hace referencia a un medio de purificación de fluidos corporales que comprende un soporte y un adsorbente, que incluye al menos un fármaco sulfa, para adsorber y eliminar una sustancia patogénica de un fluido corporal. El fármaco sulfa es un agente quimioterapéutico, y más específicamente una sulfonamida caracterizada por uno o varios grupos R aromáticos. El medio puede ser suministrado en una ruta de flujo de fluido corporal suministrada en un recipiente entre los puertos de entrada de fluido y de salida de fluido.

En el documento EP 0197521 se hace referencia a un adsorbente de inmunoglobulina y un aparato de adsorción. Más específicamente, se describe un adsorbente para inmunoglobulina, cuyo adsorbente comprende un portador insoluble en agua que contiene hidroxilo al cual se ha unido un compuesto diamínico. El compuesto diamínico está representado por la fórmula general:

NH_{2}(CH_{2})_{n}NH_{2}

donde n es un número entero que tiene un valor de 3 a 9. El compuesto se ha unido a través de un agente de acoplamiento de silano o un derivado del mismo, con un compuesto heterocíclico que está unido a la diamina a través de un reactivo difuncional. De este modo, los grupos R son estructuras aromáticas.

Sin embargo, todavía existe la necesidad de métodos alternativos para la purificación de anticuerpos o constructos de anticuerpos, que observen las demandas de pureza, seguridad, potencia y eficacia de coste.

Breve descripción de la presente invención

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención es una matriz de separación, que permite la adsorción de anticuerpos a una fuerza iónica baja a valores de pH casi neutros. Esto se puede lograr mediante la matriz de separación definida en la reivindicación 1.

Otro aspecto de la presente invención es una matriz de separación, que permite la adsorción altamente selectiva de anticuerpos.

Un aspecto específico de la presente invención es una matriz de separación en la cual se adsorben anticuerpos, mientras se deja que otras proteínas pasen sin una interacción esencial.

Un aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento de preparación de una matriz para la separación de anticuerpos, que comprende grupos funcionales que permiten la adsorción de anticuerpos mediante interacciones tiofílicas, hidrofóbicas y/o de enlaces de hidrógeno, cuyo método facilita la variación de la estructura del ligando. Esto se puede lograr mediante la inmovilización de aminas y/o poliaminas en un soporte poroso y una etapa posterior de sulfonilación de dichas aminas inmovilizadas.

Otro aspecto más de la invención es un método de aislamiento de anticuerpos de un líquido mediante la adsorción del mismo en una matriz de separación, cuyo método no requiere ninguna adición de detergente para lograr la adsorción.

Los aspectos y ventajas adicionales de la invención se mostrarán a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra algunos ejemplos seleccionados de aminas sulfoniladas con puntos de unión potenciales a un soporte.

Definiciones

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en la presente memoria.

El término "ligando" representa en la presente memoria las moléculas o compuestos susceptibles de interacción con compuestos diana, tales como los anticuerpos.

El término "brazo espaciador" representa en la presente memoria un elemento que distancia un ligando del soporte de una matriz de separación.

Una "amina primaria" está definida por la fórmula RNH_{2}, donde R indica un grupo orgánico.

Una "amina secundaria" está definida por la fórmula R_{2}NH, donde R indica un grupo orgánico.

El término "sulfonamida" se utiliza en su sentido convencional, esto es, para cualquier compuesto químico, que comprende una o más amidas de ácidos sulfónicos.

Un grupo sulfonilo está definido por la fórmula -S (=O)_{2}R, donde R indica un grupo orgánico.

El término "eluyente" se utiliza en su sentido convencional en este campo, esto es, un tampón de pH y/o fuerza iónica adecuados para liberar uno o más compuestos de una matriz de separación.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención es una matriz de separación que comprende un soporte poroso en el cual se han inmovilizado los ligandos, opcionalmente por medio de brazos espaciadores, donde dichos ligandos comprenden una o más sulfonamidas, donde al menos un grupo R del sulfonilo es un compuesto alifático.

En una realización, la sulfonamida se acopla al soporte poroso por medio de su nitrógeno. No obstante, la presente invención también abarca las matrices de separación que comprenden sulfonamidas que están acopladas en diferentes direcciones, esto es ligandos que son una mezcla de sulfonamidas acopladas a amidas y acopladas a sulfonas.

En una realización, dichos ligandos comprenden al menos una amina primaria o secundaria.

La matriz de separación se puede utilizar para el aislamiento, tal como la purificación o el análisis, de anticuerpos y otros compuestos que muestran propiedades de unión equivalentes, tales como proteínas de fusión que comprenden una parte de inmunoglobulina o fragmentos de anticuerpos. Los autores de la presente invención han demostrado que los anticuerpos pueden ser purificados a una alta capacidad y con una selectividad excelente utilizando una matriz de separación que comprende una o más sulfonamidas. Al contrario que en el documento US 6.498.236, mencionado antes, en el que se utilizan radicales aromáticos o heteroaromáticos como ligandos de intercambio iónico para la purificación de anticuerpos, la presente invención logra la purificación sin necesidad de añadir detergente al líquido que comprende los anticuerpos antes de su contacto con la matriz utilizando ligandos no cargados.

Como es bien sabido, una sulfonamida está comprendida por una amina, donde al menos uno de los grupos R de dicha amina es un grupo sulfonilo. En una realización de la presente matriz, el grupo R del sulfonilo es un grupo acíclico o cíclico alifático, tal como una cadena lineal de 1-4, tal como 1 o 2, carbonos y/o heteroátomos de la cual uno o más hidrógenos pueden haber sido sustituidos por heteroátomos. En una realización, el grupo R alifático del sulfonilo es un grupo metilo. En una realización alternativa, el grupo R alifático del sulfonilo es un grupo etilo.

En una realización de la presente matriz de separación, los ligandos son monoaminas sulfoniladas, tales como cisteamina o amoníaco. En una realización alternativa, los ligandos son poliaminas sulfoniladas, tales como trietilentetraamina. Tales poliaminas sulfoniladas pueden comprender cualquier número conveniente de aminas, tal como 2-10. En una realización ilustrativa, cada poliamina comprende de dos a seis aminas.

En una realización específica de la presente matriz de separación, los ligandos están presentes como unidades repetitivas de un polímero inmovilizado en el soporte. El polímero puede ser cualquier poliamina adecuada, tal como polialquilenimina. En una realización, el polímero es una polietilenamina. Como comprenderá un experto en este campo, el contenido de amina de semejante polímero puede variar, p. ej. para que comprenda aminas primarias y/o secundarias en cualquier orden deseado. De este modo, en una realización, el polímero muestra dos o más grupos ligando diferentes. Los polímeros se producen fácilmente a partir de los monómeros adecuados de acuerdo con métodos normalizados en este campo. Los métodos de acoplamiento de las poliaminas a un soporte también son bien conocidos y fácilmente realizados por el experto en este campo, por ejemplo mediante polimerización in situ o injerto de polímeros, véase p. ej. el documento PCT/SE02/02159 (Ihre et al.). Una ventaja de esta realización es que permite una optimización conveniente de las propiedades de la matriz de separación, p. ej. mediante variación de la longitud del polímero, ramificación etc.

En una realización, los ligandos son compuestos acíclicos.

El soporte poroso de la presente matriz de separación puede ser de cualquier material adecuado. En una realización, el soporte comprende un material carbohidratado entrecruzado, tal como agarosa, agar, celulosa, dextrano, quitosana, konjac, carragenano, gelán, alginato etc. El soporte se puede preparar fácilmente de acuerdo con los métodos normalizados, tales como gelatina de suspensión inversa (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964). Alternativamente, el soporte es un producto asequible comercialmente, tal como Sepharose FF (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia). De este modo, en una realización de la presente matriz, el soporte es un polisacárido entrecruzado. En una realización específica, dicho polisacárido es la agarosa. Tales materiales carbohidratados son comúnmente alilados antes de la inmovilización de sus ligandos. En resumen, se puede llevar a cabo la alilación con un éter de alilglicidilo, bromuro de alilo o cualquier otro agente de activación adecuado siguiendo los métodos normalizados.

En una realización alternativa, el soporte poroso de la presente matriz de separación comprende polímeros sintéticos entrecruzados, tales como estireno o derivados de estireno, divinilbenceno, acrilamidas, ésteres acrilato, ésteres metacrilato, ésteres vinílicos, vinilamidas etc. Los soportes de tales polímeros se producen fácilmente de acuerdo con los métodos normalizados, véase p. ej. "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70 (9), 70-75 (1988) ). Alternativamente, un producto asequible comercialmente, tal como Source (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) puede ser modificado en superficie de acuerdo con la invención. No obstante, en esta realización, la superficie del soporte se modifica preferiblemente para incrementar su carácter hidrófilo, normalmente convirtiendo la mayor parte de los dobles enlaces residuales expuestos en grupos hidroxilo.

La presente matriz de separación se encuentra en cualquier forma adecuada, tal como una matriz de cromatografía, p. ej. en forma de partículas esencialmente esféricas o un monolito; un filtro o membrana; un chip, una superficie, capilares o similares. De este modo, la presente invención también abarca una columna de cromatografía empaquetada con una matriz de separación como se ha descrito antes. En una realización ventajosa, la columna está elaborada de cualquier material convencional, tal como un plástico biocompatible, p. ej. polipropileno, o vidrio. La columna puede ser de un tamaño adecuado para la purificación de anticuerpos a escala de laboratorio o a gran escala. En una realización específica, la columna de acuerdo con la invención se proporciona con adaptadores Luer, conectores de tubos, y tuercas ciegas. De este modo, la presente invención también abarca un kit que comprende por una columna de cromatografía empaquetada con una matriz de separación como se ha descrito antes; al menos un tampón; e instrucciones escritas para la purificación de anticuerpos en compartimentos separados. En una realización específica, el presente kit también comprende los adaptadores Luer, los conectores de tubos, y las tuercas ciegas.

En un segundo aspecto, la presente invención hace referencia a un procedimiento para preparar una matriz para la separación de anticuerpos, cuyo método comprende una primera etapa de inmovilización de las aminas y/o poliaminas en un soporte poroso y una etapa posterior de sulfonilación de dichas aminas. El soporte poroso puede ser como se ha descrito antes, y se puede utilizar cualquiera de los métodos normalizados para la inmovilización, véase p. ej. Immobilized Affinity Ligand Techniques, Herman-son et al., Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia y Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992. Sin embargo, como reconocerá un experto en este campo, algunas de las matrices de separación se pueden preparar igualmente bien mediante inmovilización de sulfonamidas directamente en el soporte, dependiendo de la naturaleza del ligando.

En un tercer aspecto, la presente invención es un método de aislamiento de anticuerpos de un líquido, cuyo método comprende las etapas de

(a): proporcionar un líquido que comprende al menos un anticuerpo:

(b): poner en contacto dicho líquido con una matriz de separación que comprende un soporte poroso en el cual se han inmovilizado uno o más grupos sulfonamida, por medio de lo cual uno o más anticuerpos son adsorbidos en dicha matriz; y, opcionalmente,

(c): hacer pasar un eluyente sobre dicha matriz para liberar uno o más anticuerpos; y

(d): recuperar al menos un anticuerpo de dicha fracción de eluyente.

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En este contexto, se debe entender que el término "anticuerpos" también incluye fragmentos de anticuerpo y cualquier proteína de fusión que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. De este modo, el presente método es útil para aislar cualquier molécula de tipo inmunoglobulina, que presenta las propiedades de unión de un anticuerpo. El líquido que comprende un anticuerpo puede ser por ejemplo un líquido que se origina a partir de un cultivo celular productor de anticuerpos o un caldo de fermentación, a partir del cual se desea purificar uno o más anticuerpos deseados. Alternativamente, el líquido puede ser sangre o plasma sanguíneo, del cual se desea eliminar uno o más anticuerpos para obtener un líquido que sea puro en ese aspecto. De este modo, en una realización del presente método, el líquido proporcionado en la etapa (a) también comprende una o más de otras proteínas distintas de anticuerpos. Como se mostrará en la parte experimental más abajo, en general, el presente método permite la adsorción selectiva de anticuerpos a fuerzas iónicas relativamente bajas. Inesperadamente, los autores de la presente invención encontraron que el uso de una matriz de separación porosa que muestra uno o más grupos sulfonamida permite la adsorción de anticuerpos mientras las proteínas distintas de los anticuerpos no son adsorbidas. Por consiguiente, el presente método proporciona preparaciones puras de anticuerpos con rendimientos elevados. El experto en este campo puede seleccionar fácilmente las condiciones óptimas para cada estructura del ligando de sulfonamida utilizando la experimentación rutinaria, como se comentará en la parte experimental más abajo. Por ejemplo, es bien sabido en este campo que las propiedades de una matriz de separación se pueden optimizar por la variación de la naturaleza del gel; en este caso, el grupo R de la sulfonamida, o el grado de sustitución esto es la densidad de ligando del soporte. La concentración de sal en el tampón de adsorción también se puede optimizar para cada ligando. De este modo, en una realización de la presente invención, se proporciona la etapa de adsorción (b) a una concentración de sal Na_{2}SO_{4} de aproximadamente 0,25 M. En una realización específica, los ligandos comprenden monoaminas, y la etapa (b) se realiza a una concentración de sal Na_{2}SO_{4} por encima de aproximadamente 0,5 M.

En el presente método se puede utilizar una matriz de separación en cualquier forma adecuada, tal como una matriz de cromatografía, p. ej. en forma de partículas esencialmente esféricas o un monolito; un filtro de membrana; un chip o similar. De este modo, en una realización ventajosa, la matriz de separación de la etapa (b) se proporciona en una columna de cromatografía.

El soporte y los ligandos de la matriz de separación de la etapa (b) pueden ser cualquiera de los descritos antes.

Como se ha mencionado, la presente invención ha mostrado inesperadamente que utilizando la matriz de separación novedosa de acuerdo con la invención se permite la adsorción altamente selectiva de anticuerpos a un pH neutro. De este modo, en una realización, la etapa (b) se realiza a un pH de 6,5-8,3, tal como 7,2-7,6, p. ej. aproximadamente 7,4.

Los anticuerpos adsorbidos en la columna se liberan fácilmente mediante elución normalizada por ejemplo mediante el uso de un eluyente de fuerza iónica descendente. De este modo, en una realización, la etapa (c) es una elución en gradiente realizada añadiendo un eluyente de concentración de sal descendente a la matriz de separación, preferiblemente haciendo pasar dicho eluyente sobre la matriz. El gradiente puede ser de cualquier forma, tal como un gradiente lineal o por etapas. Otros esquemas de elución también son útiles, por ejemplo añadiendo un aglutinante competitivo al eluyente, añadiendo al eluyente un compuesto que desplace los anticuerpos adsorbidos sobre la matriz, tal como un alcohol, una sal etc. o proporcionando un cambio de temperatura, etc.

Alternativamente, la elución de la etapa (c) se realiza mediante un ajuste del pH, tal como un descenso o un aumento del pH. También se puede combinar un ajuste del pH con un gradiente de sal, como se ha comentado antes. En una realización específica, la etapa (b) se realiza a un pH por encima del pH neutro, y la etapa (c) es un gradiente de elución realizado añadiendo un eluyente de pH descendente.

El presente método es útil para recuperar cualquier clase de anticuerpo monoclonal o policlonal, tal como anticuerpos que se originan de anfitriones mamíferos, tales como ratones, roedores, primates y seres humanos, o anticuerpos que se originan de células cultivadas tales como hibridomas. En una realización, los anticuerpos recuperados en la etapa (d) son anticuerpos humanos o humanizados. Los anticuerpos pueden ser de cualquier clase, esto es seleccionados del grupo que consiste en IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. En una realización específica, los anticuerpos recuperados en la etapa (d) son inmunoglobulina G (IgG). La presente invención también abarca la purificación de fragmentos de cualquiera de los anticuerpos mencionados antes así como proteínas de fusión que comprenden tales anticuerpos.

El presente método permite la adsorción cuantitativa de anticuerpos. De este modo, en una realización, el presente método abarca un método como se ha definido antes y además una etapa (e) de determinación de la cantidad de anticuerpo espectrofotométricamente. Tales métodos y equipo útil son bien conocidos por los expertos en este campo. La presente también es útil en procedimientos analíticos.

Finalmente, la presente invención también hace referencia a una matriz de separación que comprende un soporte poroso en el cual se han inmovilizado los ligandos, opcionalmente por medio de brazos espaciadores, donde dichos ligandos comprenden uno o más grupos acetamida. Tales grupos acetamida pueden ser p. ej. trietilentetraamina. El soporte puede ser como se ha descrito antes en relación a la matriz de sulfonamida. La inmovilización de los grupos acetamida en un soporte poroso es fácilmente realizada por un experto en este campo siguiendo los métodos normalizados, tales como los referidos antes. Este aspecto de la invención también abarca un método de cromatografía líquida utilizando una matriz de separación que comprende ligandos de acetamida. Semejante método es útil para la separación de biomoléculas, tales como proteínas, virus, ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, plásmidos etc. Las condiciones adecuadas para la adsorción y la elución son fácilmente seleccionadas por el experto en este campo.

Descripción detallada de los dibujos

La Figura 1 muestra algunos ejemplos seleccionados de aminas sulfoniladas con puntos de anclaje potenciales a un soporte. Más específicamente, la figura 1 muestra de izquierda a derecha cisteamina; amoníaco (línea superior); y dietilentriamina; y trietilentetraamina (línea inferior).

Parte experimental

Los presentes ejemplos se proporcionan con fines meramente ilustrativos, y no se deben considerar limitantes del alcance de la presente invención definido por las reivindicaciones adjuntas.

Todas las referencias dadas más abajo y en cualquier parte de la presente memoria se incluyen en la presente como referencia.

Ejemplo 1 Preparación de una matriz de separación de sulfonamida

Se proporciona más abajo la preparación de una matriz de separación de acuerdo con la invención, donde los grupos R del sulfonilo son grupos alifáticos.

General:

Los volúmenes de la matriz hacen referencia al volumen del lecho sedimentado.

Los pesos de la matriz dados en gramos hacen referencia al peso seco de succión. Se entiende que estas matrices todavía son material solvatado con agua.

La agitación de la reacción a gran escala hace referencia a un agitador a motor, suspendido puesto que el uso del agitador de barra magnética es propenso a dañar las cuentas. Las reacciones a pequeña escala (hasta 20 ml o g de gel) se realizaron en viales cerrados y la agitación hace referencia al uso de una mesa con movimiento oscilatorio.

Los métodos convencionales se utilizaron para el análisis de la funcionalidad y la determinación del grado de alilación, epoxidación, o el grado de sustitución de los grupos intercambiadores iónicos de las cuentas. Estos métodos se complementaron eventualmente por medio de análisis elemental adicional de los geles en particular para el átomo de azufre.

Un modo para preparar una matriz de separación de acuerdo con la invención se ilustra más abajo, partiendo de un gel de agarosa entrecruzado (Sepharose 6 FF, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Para cada etapa, se describe un ejemplo específico.

A. Introducción de grupos alilo en la matriz

Se activó Sepharose® con alilglicidiléter como sigue: Se secó por succión una cantidad de 100 g de Sepharose® 6 FF a 78 g, se mezcló con 0,4 g de NaBH_{4}, 11 g de Na_{2}SO_{4} y 60 ml de solución acuosa al 50% de NaOH. La mezcla se agitó durante 1 hora a 50ºC. Tras la adición de 80 ml de alilglicidiléter se dejó la suspensión a 50ºC agitando vigorosa durante 20 horas más. Después de la filtración de la mezcla, el gel se lavó sucesivamente, con 500 ml de agua destilada, 500 ml etanol, 200 ml de agua destilada, 200 ml de ácido acético 0,2 M y, 500 ml de agua destilada. La titulación dio un grado de sustitución de 0,4 mmoles de alilo/ml de gel.

B. Introducción de grupos amina en la matriz

Aparte de la cisteamina, cuya inmovilización se realizó en condiciones de adición de radicales específicas, los grupos amina se introdujeron en la matriz directamente por medio de los átomos de nitrógeno de los grupos amina. En un procedimiento típico, el acoplamiento a la matriz se realizó con preferencia por medio de bromación del grupo alilo y sustitución nucleofílica en condiciones alcalinas.

Cisteamina Sepharose® (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia)

Se lavó una cantidad de 10 g de gel activado con alilo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) con dioxano y se transfirió a un recipiente de reacción que contenía una solución de cisteamina-HCl (1 g) en 12 ml de dioxano. La reacción se calentó a 70ºC y se añadió AIBN (0,9 g). La reacción se dejó 17 horas agitando a 70ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción, el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de dioxano, 3x 10 ml de etanol, 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo un gel de Cisteamina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,34 mmoles de amina/ml de gel.

Activación de alil Sepharose® por medio de bromación

Se añadió bromo a una suspensión agitada de 100 ml de Sepharose® 6 FF activada con alilo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado), 4 g de AcONa y 100 ml de agua destilada, hasta que se obtuvo un color amarillo persistente. Después se añadió formiato de sodio hasta que la suspensión se decoloró completamente. La mezcla de reacción se filtró y el gel se lavó con 500 ml de agua destilada. El gel activado se transfirió después directamente a un recipiente de reacción y adicionalmente se hizo reaccionar con el ligando apropiado.

Dietilentriamina Sepharose®

Se transfirió una cantidad de 10 g de gel activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reacción que contenía una solución de dietilentriamina (12,5 ml). La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo gel de dietilentriamina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,56 mmoles de aminas/ml de gel.

Trietilentetraamina Sepharose®

Se transfirió una cantidad de 10 g de gel activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reacción que contenía una solución de trietilentetraamina (12,5 ml). La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción, el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo gel de trietilentetraamina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,62 mmoles de aminas/ml de gel.

Pentaetilenhexamina Sepharose®

Se transfirió una cantidad de 10 g de gel activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reacción que contenía una solución de pentaetilenhexamina (12,5 ml). La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo gel de pentaetilenhexamina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,61 mmoles de amina/ml de gel.

Polietilenimina Sepharose®

Se transfirió una cantidad de 10 g de gel activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reacción que contenía una solución de 12,5 ml de polietilenimina (50% en agua). La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo un gel de polietilenimina-Sepharose® con un grado de sustitución de 0,45 mmoles de aminas/ml de gel.

Amoníaco Sepharose®

1): Se transfirió una cantidad de 10 g de gel activado con bromo (0,32 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reacción que contenía una solución de azida de sodio (1 g) en agua (3 ml) que había sido ajustada a pH 12 mediante la adición de una solución acuosa al 50% de NaOH. La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 20 ml de agua destilada y 3x 10 ml DMF. El gel drenado se redujo adicionalmente en una solución de DTE (1,5 g) y DBU (1,2 ml) en DMF (7,5 ml), se agitó durante 18h a la temperatura ambiente. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de DMF, 3x10 ml de etanol y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo un gel de amina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,21 mmoles de grupos amina/ml de gel.

2): Se transfirió una cantidad de 10 g de gel activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reacción que contenía una solución de azida de sodio (1 g) en agua (3 ml) que se había ajustado a pH 12 mediante la adición de una solución acuosa al 50% de NaOH. La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 20 ml de agua destilada y 3x 10ml de DMF. El gel drenado se redujo adicionalmente en una solución de DTE (1,5 g) y DBU (1,2 ml) en DMF (7,5 ml), se agitó durante 18h a la temperatura ambiente. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de DMF, 3x10 ml de etanol y finalmente 3x10 ml de agua destilada. Se obtuvo un gel de amina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,26 mmoles de grupos amina/ml de gel.

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C. Transformación con cloruro de sulfonilo Método general

Se lavó una cantidad de 5 g de amina acoplada a gel con 3xl0 ml de etanol seguido de 3x 10ml de DCM (diclorometano). El gel se transfirió a un vial y también se añadieron DCM (2 ml) y 3,3 equivalentes de DIPEA, y la mezcla se agitó durante 5 minutos. Después de la adición gota a gota de 3 equivalentes de cloruro de metilsulfonilo disuelto en DCM (3 ml), la mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 18h. Después de la filtración de la mezcla reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de DCM, 3x10 ml de etanol, 3x10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl 0,5 M y finalmente 3x 10 ml de agua destilada.

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Ejemplo 2 Adsorción Selectiva de IgG

Para someter a ensayo si los nuevos ligandos de sulfonamida no aromáticos de acuerdo con la invención adsorben la inmunoglobulina humana (IgG) selectivamente, se sometió a ensayo la capacidad de adsorción de IgG y tres proteínas modelo diferentes en diferentes condiciones. El principio del método de ensayo fue que las proteínas se inyectaron (15 \mul) en una columna HR5/5 (que contenía los ligandos de sulfonamida inmovilizados sobre Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) equilibrada con tampón A (que contenía una sal y un componente tampón). Después se bombearon 15 ml de tampón A a través de la columna; después se aplicó un gradiente lineal de tampón A a tampón B (conteniendo el tampón B componente tampón sin sal) (véase el método UNICORN más abajo). Los perfiles cromatográficos se controlaron después a 280, 254 y 215 nm.

Para evaluar la cantidad de muestra adsorbida y la cantidad de muestra eluida de la columna, también se inyectó la misma cantidad de muestra aplicada a la columna directamente al control y se integró la respuesta.

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Experimental

Se utilizaron seis combinaciones de adsorción (Tampón Anúm) y tampones de desorción (Tampón Bnúm):

1.: Tampón A1: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4) con Na_{2}SO_{4} 0,50 M

: Tampón B1: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4)

2.: Tampón A2: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4) con Na_{2}SO_{4} 0,25 M

: Tampón B1: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4)

3.: Tampón A3: tampón acetato 20 mM (pH 4,0) con Na_{2}SO_{4} 0,50 M

: Tampón B2: tampón acetato 20 mM (pH 4,0)

4.: Tampón A4: tampón acetato 20 mM (pH 4,0) con Na_{2}SO_{4} 0,25 M

: Tampón B2: tampón acetato 20 mM (pH 4,0)

5.: Tampón A2: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4) con Na_{2}SO_{4} 0,25 M

: Tampón B3: tampón acetato 100 mM (pH 4,0)

6.: Tampón A5: tampón Glicina 20 mM (pH 10,0) con Na_{2}SO_{4} 0,50 M

: Tampón B4: tampón Glicina 20 mM

Muestra

Las muestras utilizadas fueron seralbúmina bovina (BSA), ribonucleasa A (RIB A), transferrina (TRANSF) e inmunoglobulina humana (IgG, Gammanorm). Las proteínas se disolvieron en el tampón A a una concentración de 15 mg/ml y se aplicó solamente una proteína cada vez en la columna.

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Instrumental Aparato

Cromatografía Líquida

: Sistema (LC) : ÄKTA® Explorer (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) 10 XT o igual

: Soporte lógico: UNICORN®

: Bucle de inyección: Superloop® 15 \mul

: Columna: HR 5/5

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Parámetros del Instrumento

: Velocidad de flujo: 0,5 ml/min

: Célula detectora: 10 mm

: Longitud de onda: 280, 254 y 215 nm

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Método UNICORN®

Método principal:

: 0.00 Base CV, 1.00 {ml}, Cualquiera

: 0.00 Posición de la Columna Desviación de la Posición

: 0.00 AutoCeroUV

: 0.00 Longitud de onda 280 {nm} 254 {nm} 215 {nm}

: 1.00 Longitud de onda 280 {nm} 254 {nm} 215 {nm}

: 1.10 Inyección Parcial (1) VIAL múm., 10 núm. INJVOL1 {\mul}, No,

\hskip2cm

Sin Aire

: 1.10 AutoCeroUV

: 4.00 Posición de la Columna (Posición2) KOLONN

: 5.00 Inyección Parcial (1) VIAL Núm. 2, 10 núm.INJV02 {p1}, No,

\hskip2cm

Sin Aire

: 20.00 Gradiente 100 {% B}, 2.00 {base}

: 25.00 Gradiente 100 {% B}, 0.00 {base}

: 25.10 Gradiente 0 {% B}, 1 {base}

: 29.00 Gradiente 0 {%B}, 0 {base}

: 34.00 Gradiente 0 {% B}, 0 {base}

: 34.10 Fin del Método

Resultados y discusión 1(a) Ligandos de Sulfonamida: Adsorción a pH 7,4 y condiciones para la desorción

Para documentar si los ligandos de sulfonamida no aromáticos adsorben selectivamente las inmunoglobulinas, se aplicó IgG humana a una columna de 1 ml (HR 5/5) empaquetada con las nuevas matrices de acuerdo con la invención. Además, también se aplicaron las proteínas seralbúmina bovina (BSA), ribonucleasa A (RIB A) y transferrina (TRANSF). Se utilizaron cinco tampones diferentes con diferente pH y diferente contenido de sal (Na_{2}SO_{4}) como tampones de adsorción. En la Tabla 1 y 2, se presentan los resultados a pH 7,4 (Tampones Al y A2). Como aparece en la Tabla 1 más abajo, cuando se añadían 0,25 M de Na_{2}SO_{4} a la fase móvil, BSA, RIB A y TRANSF no eran adsorbidas en los ligandos investigados. Sin embargo, la IgG era adsorbida cuantitativamente en tres de los cuatro ligandos basados en poliaminas y el 90% de la IgG aplicada era adsorbida en el cuarto ligando, esto es el ligando basado en trietilentetraamina. Además, solamente uno de los amoníacos (monoaminas) esto es el ligando basado en cisteamina, adsorbía la IgG.

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TABLA 1

1

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Como aparece en la Tabla 2 más abajo, si se utilizaba una fase móvil con una fuerza iónica superior (Tampón A1; 0,50 M de Na_{2}SO_{4}), la transferrina era parcialmente adsorbida en algunos de los ligandos (Tabla 2) y la IgG era adsorbida en todos los ligandos. Los ligandos más selectivos fueron los ligandos de sulfonamida basados en dietilentriamina, polietilenimina y Amoníaco 1 (Tabla 2) puesto que BSA, RIB A y TRANSF no fueron adsorbidas en estos ligandos.

TABLA 2

2

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Los resultados presentados antes muestran que dependiendo de la fuerza iónica del tampón de adsorción de pH 7,4, los diferentes ligandos de sulfonamida serán óptimos para la adsorción de IgG.

Un adsorbente ideal para la inmunoglobulina no solo debe tener una selectividad significativa si no que debe ser capaz de permitir una elución eficiente. La mayoría de la IgG adsorbida podría ser desorbida fácilmente con tampón fosfato 20 mM (pH 7,4) sin sal añadida. La adsorción de IgG utilizando tampón A1 como fase móvil dio como resultado la recuperación de 70-100% de la IgG adsorbida cuando se utilizaba el tampón de adsorción B1. Sin embargo, la IgG era más difícil de hacer eluir cuando se adsorbía con tampón A2, pero se podía desorber fácilmente utilizando el tampón B3 (tampón acetato 100 mM, pH 4,0).

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1(b): Ligandos de sulfonamida: Adsorción a pH 4,0 y condiciones de desorción

Como se muestra en la Tabla 3 y 4 más abajo, la adsorción de IgG en condiciones ácidas no es claramente tan selectiva como la adsorción a pH 7,4. Utilizando tampón acetato 20 mM (pH 4,0) con la adición de Na_{2}SO_{4} 0,25 M (Tampón A4) como tampón de adsorción, los ligandos basados en cisteamina, trietilentetraamina y dietilentriamina adsorben 40, 40 y 60%, respectivamente, de la cantidad aplicada de IgG (Tabla 3). En las mismas condiciones la ribonucleasa A y la transferrina no son adsorbidas. Sin embargo, un 90, 10 y 100% de la seralbúmina bovina aplicada son adsorbidas en los ligandos basados en cisteamina, trietilentetraamina y dietilentriamina, respectivamente.

TABLA 3

3

Los resultados anteriores muestran que el ligando basado en trietilentetraamina es el más selectivo de los ligandos sometidos a ensayo para IgG. La IgG de la muestra contiene subclases de diferentes inmunoglobulinas (59% de IgG 1, 36% de IgG 2, 4,9% de IgG 3 y 0,5% de IgG 4). Si el contenido en sal del tampón de adsorción aumenta, la selectividad para IgG disminuye como resultado de la adsorción de las otras proteínas. En la Tabla 4 se presentan los resultados para el tampón A3 (tampón acetato 20 mM (pH 4,0) con Na_{2}SO_{4} 0,50 M) utilizado como tampón de adsorción. Se muestra claramente que tanto la ribonucleasa A como la transferrina son adsorbidas en algunos de los ligandos. Además, la seralbúmina bovina es adsorbida en un grado mayor con el tampón A3 que cuando se utilizaba en tampón A4 (Tabla 3 y 4). El ligando que es más selectivo cuando se utiliza el tampón A3 parece ser el que está basado en pentaetilenhexamina puesto que solamente un 10, 20 y 10% son adsorbidos de la cantidad aplicada de BSA, RIB y TRANSF, respectivamente. Esto se puede comparar con la IgG donde el 50% de la cantidad aplicada es adsorbida (Tabla 4).

TABLA 4

4

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La desorción cuantitativa de todas las muestras adsorbidas se completó fácilmente por medio de tampón B2 (tampón acetato 20 mM, pH 4,0).

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1(c): Ligandos de sulfonamida: Adsorción a pH 10,0 y condiciones para la desorción

Se han realizado unos pocos experimentos a pH 10,0, y de acuerdo con la Tabla 5 se puede observar que la IgG es adsorbida cuantitativamente en los ligandos basados en cisteamina y trietilentetraamina utilizando el tampón de adsorción A5 (tampón glicina 20 mM (pH 10,0) con Na_{2}SO_{4} 0,5 M). Sin embargo, solamente un 10% de la cantidad adsorbida de IgG podría ser eluida con el tampón de desorción B4 (tampón glicina 20 mM). Para obtener la desorción cuantitativa de IgG el pH se debe cambiar a condiciones ácidas, por ejemplo utilizando tampón de desorción B3 (tampón acetato 100 mM, pH 4,0).

TABLA 5

6

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Ejemplo 3 Comparación entre ligandos de amina modificados con CH_{3}SO_{2}CI y CH_{3}COCI (ligandos de metilsulfonamida y acetamida)

Con el fin de verificar que las estructuras de sulfonamida de acuerdo con la invención interaccionan con anticuerpos más fuertemente que los ligandos de acetamida, se prepararon dos ligandos de cada tipo basándose en los dos ligandos de amina trietilentetraamina y cisteamina (de acuerdo con el ejemplo 2, sección experimental, más arriba). En la Tabla 6 de más abajo, se presentan los resultados de la adsorción de IgG para cuatro sistemas tampón diferentes (Tampones B1-3 y B5). Como se muestra claramente en la Tabla 6, las estructuras de sulfonamida de acuerdo con la invención adsorben IgG más eficazmente en todas las condiciones investigadas en comparación con los ligandos de acetamida. El ligando de acetamida basado en cisteamina fue el único ligando que pudo adsorber IgG (50% de la cantidad aplicada) cuando se utilizaron los tampones Al y A5 como tampones de adsorción. Sin embargo, este ligando fue incapaz de adsorber IgG cuando la concentración de sal descendió de Na_{2}SO_{4} 0,5 M a 0,25 M en tampón fosfato 20 mM (pH 7,4). Ambos ligandos de metilsulfonamida adsorben IgG en todas las condiciones investigadas. Estos resultados indican claramente que los ligandos de metilsulfonamida de acuerdo con la invención son mejores adsorbentes de IgG que los ligandos de acetamida.

TABLA 6

7

Claims

1. Una matriz de separación que comprende un soporte poroso en el cual se han inmovilizado ligandos, opcionalmente por medio de brazos espaciadores, donde dichos ligandos comprenden una o más sulfonamidas donde un grupo R del sulfonilo es un compuesto alifático.

2. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 1, donde la sulfonamida se acopla al soporte poroso por medio de su nitrógeno.

3. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el grupo R es un grupo metilo.

4. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el nitrógeno de la sulfonamida o las sulfonamidas es una amina primaria o secundaria.

5. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los ligandos son monoaminas.

6. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde los ligandos son poliaminas.

7. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 6, donde cada poliamina comprende de dos a seis aminas.

8. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los ligandos están presentes como unidades repetitivas de un polímero inmovilizado en el soporte.

9. Una matriz de acuerdo con la reivindicación 8, donde el polímero es una polietilenimina.

10. Una matriz de acuerdo con reivindicación 8 o 9, donde el polímero muestra dos o más grupos ligandos diferentes.

11. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los ligandos son compuestos alifáticos.

12. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el soporte es un polisacárido entrecruzado.

13. Una columna de cromatografía empaquetada con una matriz de separación como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. Una columna de cromatografía de acuerdo con la reivindicación 13, que es sustancialmente estéril.

15. Una columna de cromatografía de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, que es desechable.

16. Un procedimiento de preparación de una matriz para la separación de anticuerpos, cuyo método comprende una primera etapa de inmovilización de aminas y/o poliaminas en un soporte poroso y una etapa posterior de sulfonilación de dichas aminas para proporcionar ligandos de sulfonamida alifáticos.

17. Un procedimiento de preparación de una matriz para la separación de anticuerpos, cuyo método comprende una primera etapa de activación de un soporte poroso y una etapa posterior de anclaje de las sulfonamidas a los sitios activados por medio de sus azufres para proporcionar ligandos de sulfonamida alifáticos.

18. Un método de aislamiento de anticuerpos de un líquido, cuyo método comprende las etapas de

(a): proporcionar un líquido que comprende al menos un anticuerpo:

(b): poner en contacto dicho líquido con una matriz de separación, que comprende un soporte poroso en el cual están inmovilizados uno o más ligandos de sulfonamida alifáticos, para adsorber uno o más anticuerpos en dicha matriz; y, opcionalmente,

(d): recuperar al menos un anticuerpo de una fracción del eluyente.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, donde el líquido proporcionado en la etapa (a) también comprende una o más proteínas distintas.

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20. Un método de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, donde la matriz de separación de la etapa (b) se proporciona en una cromatografía en columna.

21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18-20, donde la matriz de separación de la etapa (b) se define como en una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, donde la etapa (b) se realiza a un pH próximo al neutro, tal como pH 7,2-7,6, preferiblemente aproximadamente 7,4.

23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18-22, donde la etapa (c) es una elución en gradiente realizada añadiendo un eluyente de concentración de sal descendente a la matriz de separación.

24. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18-23, donde la etapa (b) se realiza a un pH neutro o por encima del mismo y la etapa (c) es una elución en gradiente realizada añadiendo un eluyente de pH descendente.

25. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18-24, donde los anticuerpos recuperados en la etapa (d) son anticuerpos humanos o humanizados.

26. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18-25, donde los anticuerpos recuperados en la etapa (d) son inmunoglobulina G (IgG).

27. Un método de determinación de la cantidad de un anticuerpo, cuyo método abarca un método como se define en una cualquiera de las etapas 18-26 y además una etapa (e) de determinación de la cantidad de anticuerpo espectrofotométricamente.