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Purificacion de inmunoglobulinas.
ES2304638T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Gunnar Glad Bo-Lennart Johansson Jean-Luc Maloisel Nils Norrman - Current Assignee
- Global Life Sciences Solutions USA LLC
Description
translated from
Purificación de inmunoglobulinas.
La presente invención se refiere al campo de la
preparación de anticuerpos, y más específicamente a una matriz de
separación para el aislamiento de anticuerpos. La invención también
abarca una columna de cromatografía que comprende la matriz novedosa
y un método de aislamiento de anticuerpos.
El sistema inmunitario está compuesto por muchos
tipos de células independientes que protegen colectivamente el
organismo de las infecciones bacterianas, parasíticas, fúngicas,
virales y del crecimiento de células tumorales. Los guardianes del
sistema inmunitario son los macrófagos que continuamente recorren la
corriente sanguínea de su anfitrión. Cuando son sensibilizados por
una infección o inmunización, los macrófagos responden engullendo
los invasores marcados con moléculas foráneas conocidas como
antígenos. Este evento, mediado por las células T coadyuvantes,
muestra una complicada cadena de respuestas que dan como resultado
la estimulación de las células B. Estas células B, a su vez,
producen proteínas denominadas anticuerpos, que se unen al invasor
foráneo. El evento de unión entre el anticuerpo y el antígeno marca
el invasor foráneo para la destrucción por medio de la fagocitosis
o la activación del sistema del complemento. Existen cinco clases
diferentes de anticuerpos, o inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG,
e IgM. Estas difieren no solamente en sus papeles fisiológicos sino
también en sus estructuras. Desde un punto de vista estructural, los
anticuerpos IgG son una clase concreta de inmunoglobulinas que han
sido estudiadas extensamente, quizás debido al papel dominante que
juegan en una respuesta inmunitaria madura.
La actividad biológica, que poseen las
inmunoglobulinas, es explotada hoy en una gama de aplicaciones
diferentes en el diagnóstico humano y veterinario, el cuidado de la
salud y el sector terapéutico. De hecho, en los últimos años, los
anticuerpos monoclonales y los constructos de anticuerpos
recombinantes se han convertido en la clase más grande de proteínas
investigada en la actualidad en pruebas clínicas y reciben la
aprobación de la FDA como agentes terapéuticos y diagnósticos. De
manera complementaria a los sistemas de expresión y las estrategias
de producción, se diseñan protocolos de purificación para obtener
anticuerpos altamente puros de una manera simple y con un coste
eficaz.
Los métodos tradicionales para el aislamiento de
inmunoglobulinas se basan en la precipitación reversible selectiva
de la fracción de proteínas que comprenden las inmunoglobulinas
mientras se dejan otros grupos de proteínas en solución. Los
agentes de precipitación típicos son etanol, polietilenglicol, sales
liotrópicas, esto es, anti-caotrópicas tales como
sulfato de amonio y fosfato de potasio, y ácido caprílico.
Típicamente, estos métodos de precipitación están proporcionando
productos muy impuros a la vez que llevan tiempo y son laboriosos.
Además, la adición del agente de precipitación a la materia prima
hace difícil utilizar el sobrenadante para otros fines y crea un
problema de eliminación, que es particularmente relevante cuando se
habla de la purificación a gran escala de las inmunoglobulinas.
La cromatografía de intercambio iónico es otro
método bien conocido del fraccionamiento de proteínas utilizado
frecuentemente para el aislamiento de inmunoglobulinas. No obstante,
puesto que los ligandos de intercambio iónico cargados reaccionarán
con todos los compuestos con una carga opuesta, la selectividad de
la cromatografía de intercambio iónico puede ser algo inferior que
la de otras separaciones cromatográficas.
La cromatografía de afinidad con Proteína A y
Proteína G es un método popular y muy difundido para el aislamiento
y purificación de inmunoglobulinas, concretamente para el
aislamiento de anticuerpos monoclonales, debido principalmente a la
facilidad de uso y a la elevada pureza obtenida. La utilización
combinada con etapas de intercambio iónico, interacción hidrófoba,
filtración en hidroxiapatita y/o gel, especialmente métodos basados
en proteína A ha hecho de la purificación de anticuerpos el método
de elección para muchas compañías biofarmacéuticas. No obstante, a
pesar de su uso común, existe una necesidad y una demanda creciente
de alternativas eficaces que se dirijan a los problemas familiares
asociados con los medios basados en la proteína A, tales como el
coste, la pérdida y la inestabilidad a valores de pH elevados.
La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC)
también es un método ampliamente descrito para el aislamiento de
inmunoglobulinas. Sin embargo, las matrices hidrofóbicas requieren
una adición de sales liotrópicas a la materia prima para hacer que
la inmunoglobulina se una eficazmente. El anticuerpo unido se libera
de la matriz disminuyendo la concentración de sal liotrópica en un
gradiente continuo o por etapas. Si el objeto es un producto
altamente puro, se recomienda combinar la cromatografía hidrofóbica
con una etapa adicional. De este modo, una desventaja de este
procedimiento es la necesidad de añadir sal liotrópica a la materia
prima ya que esto produce un problema y de ese modo incrementa el
coste a gran escala para el usuario. Para otras materias primas
distintas de los sobrenadantes de cultivo tales como suero, plasma,
y yema de huevo la adición de sales liotrópicas a las materias
primas será prohibitiva en algunos casos en las aplicaciones a gran
escala ya que la sal podría evitar cualquier uso económicamente
factible de la materia prima con la inmunoglobulina agotada. Un
problema adicional en las aplicaciones a gran escala sería la
recogida de varios miles de litros de desechos.
\newpage
La cromatografía de adsorción tiofílica fue
introducida por J. Porath en 1985 (J. Porath et al; FEBS
Letters, vol. 185, pág. 306, 1985) como nuevo principio de
adsorción cromatográfica para el aislamiento de inmunoglobulinas.
En esta publicación, se describe cómo la agarosa activada por
divinilsulfona acoplada con diversos ligandos que comprenden un
grupo mercapto libre muestran una unión específica de las
inmunoglobulinas en presencia de sulfato de potasio 0,5 M, esto es,
una sal liotrópica. Se postuló que el grupo sulfona, del espaciador
de vinilsulfona, y el tioéter resultante en el ligando era una
necesidad estructural para obtener la especificidad descrita y la
capacidad para la unión de los anticuerpos. Se demostró más tarde
sin embargo, que el tioéter podía ser remplazado por nitrógeno u
oxígeno si el ligando comprendía adicionalmente un radical aromático
(K. L. Knudsen et al., Analytical Biochemistry, vol. 201,
pág. 170, 1992). Aunque las matrices descritas para la
cromatografía tiofílica muestran generalmente buen funcionamiento,
también tienen una desventaja principal ya que es necesario añadir
sales liotrópicas a la materia prima para asegurar una unión
eficiente de la inmunoglobulina, lo que es un problema por las
razones mencionadas
antes.
antes.
Se han descrito otros ligandos tiofílicos
acoplados a agarosa activada por epoxi (J. Porath et. al. Makromol.
Chem., Makromol. Symp., vol. 17, pág. 359, 1988) y (A. Schwarz et.
al., Journal of Chromatography B, vol. 664, págs.
83-88, 1995), p. ej.
2-mercaptopiridina,
2-mercaptopirimidina, y
2-mercaptotiazolina. Sin embargo, todas estas
matrices de afinidad tienen todavía constantes de afinidad
inadecuadas para asegurar una unión eficiente del anticuerpo sin
sales liotrópicas añadidas.
En el documento US 6.498.236 (Upfront
Chromatography) se hace referencia al aislamiento de
inmunoglobulinas. El método descrito implica las etapas de poner en
contacto una solución que comprende un detergente cargado
negativamente y contiene una o varias inmunoglobulinas con una
matriz en fase sólida, por medio del cual al menos una parte de las
inmunoglobulinas se une a la matriz en fase sólida; y poner en
contacto la matriz en fase sólida con un eluyente con el fin de
liberar la inmunoglobulina o las inmunoglobulinas de la matriz en
fase sólida. La solución que contiene inmunoglobulina se caracteriza
adicionalmente por tener un pH en el intervalo de 2,0 a 10,0, un
contenido de sal total correspondiente a una fuerza iónica de 2,0
como mucho, y sales liotrópicas a una concentración 0,4 M como
mucho. Se cree que el detergente presente en la solución suprime la
adherencia de otras biomoléculas a la matriz, y se puede ilustrar
mediante sulfato de octilo, azul de bromofenol, octanosulfonato,
laurilsarcosinato de sodio, y sulfonato de hexano. La matriz en fase
sólida se define mediante la fórmula
M-SP1-L, donde M designa el
esqueleto de la matriz, SP1 designa un ligando que comprende un
radical aromático o heteroaromático mono- o bicíclico.
Liu et al. (Yang Liu, Rui Zhao, Dihua
Shangguan, Hongwu Zhang, Guoquan Liu: Novel sulfinethazine ligand
used for one-step purification of immunoglobulin G
from human plasma, Journal of Chromatography B, 792 (2003)
177-185) investigaron la afinidad de la
sulfmetazina (SMZ) por la IgG humana. De este modo, se describe un
ligando, que comprende un grupo sulfonilo donde el grupo R es un
anillo heterocíclico. De acuerdo con este artículo, se inmovilizó
SMZ sobre cuentas de poli(metacrilato de glicidilo)
entrecruzado, no poroso, monodisperso. Después se utilizaron las
cuentas en una cromatografía de afinidad de alta resolución para el
aislamiento de IgG del plasma humano. La absorción máxima se obtuvo
a un pH de 5,5. Las cuentas presentaban una interacción no
específica mínima con otras proteínas. De este modo, los ligandos
fueron capaces de adsorber los anticuerpos, mientras su interacción
con otras proteínas fue solo suficiente para proporcionar el retraso
de las mismas en el tampón de adsorción utilizado. Sin embargo,
como es bien sabido, los compuestos éster tales como el metacrilato
son fácilmente hidrolizados a valores de pH elevados. Por
consiguiente, de un modo similar a las matrices de Proteína A y
Proteína G, cabría esperar que la matriz de separación allí descrita
desestabilizara los procedimientos de limpieza en el sitio (cip)
utilizados comúnmente.
En el documento US 4.725.355 se hace referencia
a un medio de purificación de fluidos corporales que comprende un
soporte y un adsorbente, que incluye al menos un fármaco sulfa, para
adsorber y eliminar una sustancia patogénica de un fluido corporal.
El fármaco sulfa es un agente quimioterapéutico, y más
específicamente una sulfonamida caracterizada por uno o varios
grupos R aromáticos. El medio puede ser suministrado en una ruta de
flujo de fluido corporal suministrada en un recipiente entre los
puertos de entrada de fluido y de salida de fluido.
En el documento EP 0197521 se hace referencia a
un adsorbente de inmunoglobulina y un aparato de adsorción. Más
específicamente, se describe un adsorbente para inmunoglobulina,
cuyo adsorbente comprende un portador insoluble en agua que
contiene hidroxilo al cual se ha unido un compuesto diamínico. El
compuesto diamínico está representado por la fórmula general:
NH_{2}(CH_{2})_{n}NH_{2}
donde n es un número entero que
tiene un valor de 3 a 9. El compuesto se ha unido a través de un
agente de acoplamiento de silano o un derivado del mismo, con un
compuesto heterocíclico que está unido a la diamina a través de un
reactivo difuncional. De este modo, los grupos R son estructuras
aromáticas.
Sin embargo, todavía existe la necesidad de
métodos alternativos para la purificación de anticuerpos o
constructos de anticuerpos, que observen las demandas de pureza,
seguridad, potencia y eficacia de coste.
Por consiguiente, un aspecto de la presente
invención es una matriz de separación, que permite la adsorción de
anticuerpos a una fuerza iónica baja a valores de pH casi neutros.
Esto se puede lograr mediante la matriz de separación definida en la
reivindicación 1.
Otro aspecto de la presente invención es una
matriz de separación, que permite la adsorción altamente selectiva
de anticuerpos.
Un aspecto específico de la presente invención
es una matriz de separación en la cual se adsorben anticuerpos,
mientras se deja que otras proteínas pasen sin una interacción
esencial.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento de preparación de una matriz para la separación de
anticuerpos, que comprende grupos funcionales que permiten la
adsorción de anticuerpos mediante interacciones tiofílicas,
hidrofóbicas y/o de enlaces de hidrógeno, cuyo método facilita la
variación de la estructura del ligando. Esto se puede lograr
mediante la inmovilización de aminas y/o poliaminas en un soporte
poroso y una etapa posterior de sulfonilación de dichas aminas
inmovilizadas.
Otro aspecto más de la invención es un método de
aislamiento de anticuerpos de un líquido mediante la adsorción del
mismo en una matriz de separación, cuyo método no requiere ninguna
adición de detergente para lograr la adsorción.
Los aspectos y ventajas adicionales de la
invención se mostrarán a partir de la siguiente descripción
detallada.
La Figura 1 muestra algunos ejemplos
seleccionados de aminas sulfoniladas con puntos de unión potenciales
a un soporte.
Los términos "anticuerpo" e
"inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en la presente
memoria.
El término "ligando" representa en la
presente memoria las moléculas o compuestos susceptibles de
interacción con compuestos diana, tales como los anticuerpos.
El término "brazo espaciador" representa en
la presente memoria un elemento que distancia un ligando del soporte
de una matriz de separación.
Una "amina primaria" está definida por la
fórmula RNH_{2}, donde R indica un grupo orgánico.
Una "amina secundaria" está definida por la
fórmula R_{2}NH, donde R indica un grupo orgánico.
El término "sulfonamida" se utiliza en su
sentido convencional, esto es, para cualquier compuesto químico, que
comprende una o más amidas de ácidos sulfónicos.
Un grupo sulfonilo está definido por la fórmula
-S (=O)_{2}R, donde R indica un grupo orgánico.
El término "eluyente" se utiliza en su
sentido convencional en este campo, esto es, un tampón de pH y/o
fuerza iónica adecuados para liberar uno o más compuestos de una
matriz de separación.
En un primer aspecto, la presente invención es
una matriz de separación que comprende un soporte poroso en el cual
se han inmovilizado los ligandos, opcionalmente por medio de brazos
espaciadores, donde dichos ligandos comprenden una o más
sulfonamidas, donde al menos un grupo R del sulfonilo es un
compuesto alifático.
En una realización, la sulfonamida se acopla al
soporte poroso por medio de su nitrógeno. No obstante, la presente
invención también abarca las matrices de separación que comprenden
sulfonamidas que están acopladas en diferentes direcciones, esto
es ligandos que son una mezcla de sulfonamidas acopladas a amidas y
acopladas a sulfonas.
En una realización, dichos ligandos comprenden
al menos una amina primaria o secundaria.
La matriz de separación se puede utilizar para
el aislamiento, tal como la purificación o el análisis, de
anticuerpos y otros compuestos que muestran propiedades de unión
equivalentes, tales como proteínas de fusión que comprenden una
parte de inmunoglobulina o fragmentos de anticuerpos. Los autores de
la presente invención han demostrado que los anticuerpos pueden ser
purificados a una alta capacidad y con una selectividad excelente
utilizando una matriz de separación que comprende una o más
sulfonamidas. Al contrario que en el documento US 6.498.236,
mencionado antes, en el que se utilizan radicales aromáticos o
heteroaromáticos como ligandos de intercambio iónico para la
purificación de anticuerpos, la presente invención logra la
purificación sin necesidad de añadir detergente al líquido que
comprende los anticuerpos antes de su contacto con la matriz
utilizando ligandos no cargados.
Como es bien sabido, una sulfonamida está
comprendida por una amina, donde al menos uno de los grupos R de
dicha amina es un grupo sulfonilo. En una realización de la presente
matriz, el grupo R del sulfonilo es un grupo acíclico o cíclico
alifático, tal como una cadena lineal de 1-4, tal
como 1 o 2, carbonos y/o heteroátomos de la cual uno o más
hidrógenos pueden haber sido sustituidos por heteroátomos. En una
realización, el grupo R alifático del sulfonilo es un grupo metilo.
En una realización alternativa, el grupo R alifático del sulfonilo
es un grupo etilo.
En una realización de la presente matriz de
separación, los ligandos son monoaminas sulfoniladas, tales como
cisteamina o amoníaco. En una realización alternativa, los ligandos
son poliaminas sulfoniladas, tales como trietilentetraamina. Tales
poliaminas sulfoniladas pueden comprender cualquier número
conveniente de aminas, tal como 2-10. En una
realización ilustrativa, cada poliamina comprende de dos a seis
aminas.
En una realización específica de la presente
matriz de separación, los ligandos están presentes como unidades
repetitivas de un polímero inmovilizado en el soporte. El polímero
puede ser cualquier poliamina adecuada, tal como polialquilenimina.
En una realización, el polímero es una polietilenamina. Como
comprenderá un experto en este campo, el contenido de amina de
semejante polímero puede variar, p. ej. para que comprenda aminas
primarias y/o secundarias en cualquier orden deseado. De este modo,
en una realización, el polímero muestra dos o más grupos ligando
diferentes. Los polímeros se producen fácilmente a partir de los
monómeros adecuados de acuerdo con métodos normalizados en este
campo. Los métodos de acoplamiento de las poliaminas a un soporte
también son bien conocidos y fácilmente realizados por el experto en
este campo, por ejemplo mediante polimerización in situ o
injerto de polímeros, véase p. ej. el documento PCT/SE02/02159 (Ihre
et al.). Una ventaja de esta realización es que permite una
optimización conveniente de las propiedades de la matriz de
separación, p. ej. mediante variación de la longitud del polímero,
ramificación etc.
En una realización, los ligandos son compuestos
acíclicos.
El soporte poroso de la presente matriz de
separación puede ser de cualquier material adecuado. En una
realización, el soporte comprende un material carbohidratado
entrecruzado, tal como agarosa, agar, celulosa, dextrano,
quitosana, konjac, carragenano, gelán, alginato etc. El soporte se
puede preparar fácilmente de acuerdo con los métodos normalizados,
tales como gelatina de suspensión inversa (S Hjerten: Biochim
Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964).
Alternativamente, el soporte es un producto asequible
comercialmente, tal como Sepharose FF (Amersham Biosciences AB,
Uppsala, Suecia). De este modo, en una realización de la presente
matriz, el soporte es un polisacárido entrecruzado. En una
realización específica, dicho polisacárido es la agarosa. Tales
materiales carbohidratados son comúnmente alilados antes de la
inmovilización de sus ligandos. En resumen, se puede llevar a cabo
la alilación con un éter de alilglicidilo, bromuro de alilo o
cualquier otro agente de activación adecuado siguiendo los métodos
normalizados.
En una realización alternativa, el soporte
poroso de la presente matriz de separación comprende polímeros
sintéticos entrecruzados, tales como estireno o derivados de
estireno, divinilbenceno, acrilamidas, ésteres acrilato, ésteres
metacrilato, ésteres vinílicos, vinilamidas etc. Los soportes de
tales polímeros se producen fácilmente de acuerdo con los métodos
normalizados, véase p. ej. "Styrene based polymer supports
developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e
L'Industria 70 (9), 70-75 (1988) ).
Alternativamente, un producto asequible comercialmente, tal como
Source (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) puede ser
modificado en superficie de acuerdo con la invención. No obstante,
en esta realización, la superficie del soporte se modifica
preferiblemente para incrementar su carácter hidrófilo, normalmente
convirtiendo la mayor parte de los dobles enlaces residuales
expuestos en grupos hidroxilo.
La presente matriz de separación se encuentra en
cualquier forma adecuada, tal como una matriz de cromatografía, p.
ej. en forma de partículas esencialmente esféricas o un monolito; un
filtro o membrana; un chip, una superficie, capilares o similares.
De este modo, la presente invención también abarca una columna de
cromatografía empaquetada con una matriz de separación como se ha
descrito antes. En una realización ventajosa, la columna está
elaborada de cualquier material convencional, tal como un plástico
biocompatible, p. ej. polipropileno, o vidrio. La columna puede ser
de un tamaño adecuado para la purificación de anticuerpos a escala
de laboratorio o a gran escala. En una realización específica, la
columna de acuerdo con la invención se proporciona con adaptadores
Luer, conectores de tubos, y tuercas ciegas. De este modo, la
presente invención también abarca un kit que comprende por una
columna de cromatografía empaquetada con una matriz de separación
como se ha descrito antes; al menos un tampón; e instrucciones
escritas para la purificación de anticuerpos en compartimentos
separados. En una realización específica, el presente kit también
comprende los adaptadores Luer, los conectores de tubos, y las
tuercas ciegas.
En un segundo aspecto, la presente invención
hace referencia a un procedimiento para preparar una matriz para la
separación de anticuerpos, cuyo método comprende una primera etapa
de inmovilización de las aminas y/o poliaminas en un soporte poroso
y una etapa posterior de sulfonilación de dichas aminas. El soporte
poroso puede ser como se ha descrito antes, y se puede utilizar
cualquiera de los métodos normalizados para la inmovilización,
véase p. ej. Immobilized Affinity Ligand Techniques,
Herman-son et al., Greg T. Hermanson, A.
Krishna Mallia y Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992. Sin
embargo, como reconocerá un experto en este campo, algunas de las
matrices de separación se pueden preparar igualmente bien mediante
inmovilización de sulfonamidas directamente en el soporte,
dependiendo de la naturaleza del ligando.
En un tercer aspecto, la presente invención es
un método de aislamiento de anticuerpos de un líquido, cuyo método
comprende las etapas de
- (a)
- proporcionar un líquido que comprende al menos un anticuerpo:
- (b)
- poner en contacto dicho líquido con una matriz de separación que comprende un soporte poroso en el cual se han inmovilizado uno o más grupos sulfonamida, por medio de lo cual uno o más anticuerpos son adsorbidos en dicha matriz; y, opcionalmente,
- (c)
- hacer pasar un eluyente sobre dicha matriz para liberar uno o más anticuerpos; y
- (d)
- recuperar al menos un anticuerpo de dicha fracción de eluyente.
\vskip1.000000\baselineskip
En este contexto, se debe entender que el
término "anticuerpos" también incluye fragmentos de anticuerpo
y cualquier proteína de fusión que comprende un anticuerpo o un
fragmento de anticuerpo. De este modo, el presente método es útil
para aislar cualquier molécula de tipo inmunoglobulina, que presenta
las propiedades de unión de un anticuerpo. El líquido que comprende
un anticuerpo puede ser por ejemplo un líquido que se origina a
partir de un cultivo celular productor de anticuerpos o un caldo de
fermentación, a partir del cual se desea purificar uno o más
anticuerpos deseados. Alternativamente, el líquido puede ser sangre
o plasma sanguíneo, del cual se desea eliminar uno o más
anticuerpos para obtener un líquido que sea puro en ese aspecto. De
este modo, en una realización del presente método, el líquido
proporcionado en la etapa (a) también comprende una o más de otras
proteínas distintas de anticuerpos. Como se mostrará en la parte
experimental más abajo, en general, el presente método permite la
adsorción selectiva de anticuerpos a fuerzas iónicas relativamente
bajas. Inesperadamente, los autores de la presente invención
encontraron que el uso de una matriz de separación porosa que
muestra uno o más grupos sulfonamida permite la adsorción de
anticuerpos mientras las proteínas distintas de los anticuerpos no
son adsorbidas. Por consiguiente, el presente método proporciona
preparaciones puras de anticuerpos con rendimientos elevados. El
experto en este campo puede seleccionar fácilmente las condiciones
óptimas para cada estructura del ligando de sulfonamida utilizando
la experimentación rutinaria, como se comentará en la parte
experimental más abajo. Por ejemplo, es bien sabido en este campo
que las propiedades de una matriz de separación se pueden optimizar
por la variación de la naturaleza del gel; en este caso, el grupo R
de la sulfonamida, o el grado de sustitución esto es la densidad de
ligando del soporte. La concentración de sal en el tampón de
adsorción también se puede optimizar para cada ligando. De este
modo, en una realización de la presente invención, se proporciona
la etapa de adsorción (b) a una concentración de sal
Na_{2}SO_{4} de aproximadamente 0,25 M. En una realización
específica, los ligandos comprenden monoaminas, y la etapa (b) se
realiza a una concentración de sal Na_{2}SO_{4} por encima de
aproximadamente 0,5 M.
En el presente método se puede utilizar una
matriz de separación en cualquier forma adecuada, tal como una
matriz de cromatografía, p. ej. en forma de partículas esencialmente
esféricas o un monolito; un filtro de membrana; un chip o similar.
De este modo, en una realización ventajosa, la matriz de separación
de la etapa (b) se proporciona en una columna de cromatografía.
El soporte y los ligandos de la matriz de
separación de la etapa (b) pueden ser cualquiera de los descritos
antes.
Como se ha mencionado, la presente invención ha
mostrado inesperadamente que utilizando la matriz de separación
novedosa de acuerdo con la invención se permite la adsorción
altamente selectiva de anticuerpos a un pH neutro. De este modo, en
una realización, la etapa (b) se realiza a un pH de
6,5-8,3, tal como 7,2-7,6, p. ej.
aproximadamente 7,4.
Los anticuerpos adsorbidos en la columna se
liberan fácilmente mediante elución normalizada por ejemplo mediante
el uso de un eluyente de fuerza iónica descendente. De este modo,
en una realización, la etapa (c) es una elución en gradiente
realizada añadiendo un eluyente de concentración de sal descendente
a la matriz de separación, preferiblemente haciendo pasar dicho
eluyente sobre la matriz. El gradiente puede ser de cualquier forma,
tal como un gradiente lineal o por etapas. Otros esquemas de
elución también son útiles, por ejemplo añadiendo un aglutinante
competitivo al eluyente, añadiendo al eluyente un compuesto que
desplace los anticuerpos adsorbidos sobre la matriz, tal como un
alcohol, una sal etc. o proporcionando un cambio de temperatura,
etc.
Alternativamente, la elución de la etapa (c) se
realiza mediante un ajuste del pH, tal como un descenso o un
aumento del pH. También se puede combinar un ajuste del pH con un
gradiente de sal, como se ha comentado antes. En una realización
específica, la etapa (b) se realiza a un pH por encima del pH
neutro, y la etapa (c) es un gradiente de elución realizado
añadiendo un eluyente de pH descendente.
El presente método es útil para recuperar
cualquier clase de anticuerpo monoclonal o policlonal, tal como
anticuerpos que se originan de anfitriones mamíferos, tales como
ratones, roedores, primates y seres humanos, o anticuerpos que se
originan de células cultivadas tales como hibridomas. En una
realización, los anticuerpos recuperados en la etapa (d) son
anticuerpos humanos o humanizados. Los anticuerpos pueden ser de
cualquier clase, esto es seleccionados del grupo que consiste en
IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. En una realización específica, los
anticuerpos recuperados en la etapa (d) son inmunoglobulina G (IgG).
La presente invención también abarca la purificación de fragmentos
de cualquiera de los anticuerpos mencionados antes así como
proteínas de fusión que comprenden tales anticuerpos.
El presente método permite la adsorción
cuantitativa de anticuerpos. De este modo, en una realización, el
presente método abarca un método como se ha definido antes y además
una etapa (e) de determinación de la cantidad de anticuerpo
espectrofotométricamente. Tales métodos y equipo útil son bien
conocidos por los expertos en este campo. La presente también es
útil en procedimientos analíticos.
Finalmente, la presente invención también hace
referencia a una matriz de separación que comprende un soporte
poroso en el cual se han inmovilizado los ligandos, opcionalmente
por medio de brazos espaciadores, donde dichos ligandos comprenden
uno o más grupos acetamida. Tales grupos acetamida pueden ser p. ej.
trietilentetraamina. El soporte puede ser como se ha descrito antes
en relación a la matriz de sulfonamida. La inmovilización de los
grupos acetamida en un soporte poroso es fácilmente realizada por un
experto en este campo siguiendo los métodos normalizados, tales
como los referidos antes. Este aspecto de la invención también
abarca un método de cromatografía líquida utilizando una matriz de
separación que comprende ligandos de acetamida. Semejante método es
útil para la separación de biomoléculas, tales como proteínas,
virus, ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, plásmidos etc. Las
condiciones adecuadas para la adsorción y la elución son fácilmente
seleccionadas por el experto en este campo.
La Figura 1 muestra algunos ejemplos
seleccionados de aminas sulfoniladas con puntos de anclaje
potenciales a un soporte. Más específicamente, la figura 1 muestra
de izquierda a derecha cisteamina; amoníaco (línea superior); y
dietilentriamina; y trietilentetraamina (línea inferior).
Los presentes ejemplos se proporcionan con fines
meramente ilustrativos, y no se deben considerar limitantes del
alcance de la presente invención definido por las reivindicaciones
adjuntas.
Todas las referencias dadas más abajo y en
cualquier parte de la presente memoria se incluyen en la presente
como referencia.
Se proporciona más abajo la preparación de una
matriz de separación de acuerdo con la invención, donde los grupos R
del sulfonilo son grupos alifáticos.
General:
Los volúmenes de la matriz hacen referencia al
volumen del lecho sedimentado.
Los pesos de la matriz dados en gramos hacen
referencia al peso seco de succión. Se entiende que estas matrices
todavía son material solvatado con agua.
La agitación de la reacción a gran escala hace
referencia a un agitador a motor, suspendido puesto que el uso del
agitador de barra magnética es propenso a dañar las cuentas. Las
reacciones a pequeña escala (hasta 20 ml o g de gel) se realizaron
en viales cerrados y la agitación hace referencia al uso de una mesa
con movimiento oscilatorio.
Los métodos convencionales se utilizaron para el
análisis de la funcionalidad y la determinación del grado de
alilación, epoxidación, o el grado de sustitución de los grupos
intercambiadores iónicos de las cuentas. Estos métodos se
complementaron eventualmente por medio de análisis elemental
adicional de los geles en particular para el átomo de azufre.
Un modo para preparar una matriz de separación
de acuerdo con la invención se ilustra más abajo, partiendo de un
gel de agarosa entrecruzado (Sepharose 6 FF, Amersham Biosciences,
Uppsala, Suecia). Para cada etapa, se describe un ejemplo
específico.
Se activó Sepharose® con alilglicidiléter como
sigue: Se secó por succión una cantidad de 100 g de Sepharose® 6 FF
a 78 g, se mezcló con 0,4 g de NaBH_{4}, 11 g de Na_{2}SO_{4}
y 60 ml de solución acuosa al 50% de NaOH. La mezcla se agitó
durante 1 hora a 50ºC. Tras la adición de 80 ml de alilglicidiléter
se dejó la suspensión a 50ºC agitando vigorosa durante 20 horas
más. Después de la filtración de la mezcla, el gel se lavó
sucesivamente, con 500 ml de agua destilada, 500 ml etanol, 200 ml
de agua destilada, 200 ml de ácido acético 0,2 M y, 500 ml de agua
destilada. La titulación dio un grado de sustitución de 0,4 mmoles
de alilo/ml de gel.
Aparte de la cisteamina, cuya inmovilización se
realizó en condiciones de adición de radicales específicas, los
grupos amina se introdujeron en la matriz directamente por medio de
los átomos de nitrógeno de los grupos amina. En un procedimiento
típico, el acoplamiento a la matriz se realizó con preferencia por
medio de bromación del grupo alilo y sustitución nucleofílica en
condiciones alcalinas.
Se lavó una cantidad de 10 g de gel activado con
alilo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) con dioxano y
se transfirió a un recipiente de reacción que contenía una solución
de cisteamina-HCl (1 g) en 12 ml de dioxano. La
reacción se calentó a 70ºC y se añadió AIBN (0,9 g). La reacción se
dejó 17 horas agitando a 70ºC. Después de la filtración de la
mezcla de reacción, el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de
dioxano, 3x 10 ml de etanol, 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml
de HCl acuoso 0,5 y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo
un gel de Cisteamina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,34
mmoles de amina/ml de gel.
Se añadió bromo a una suspensión agitada de 100
ml de Sepharose® 6 FF activada con alilo (0,4 mmoles de grupos
alilo/ml de gel drenado), 4 g de AcONa y 100 ml de agua destilada,
hasta que se obtuvo un color amarillo persistente. Después se
añadió formiato de sodio hasta que la suspensión se decoloró
completamente. La mezcla de reacción se filtró y el gel se lavó con
500 ml de agua destilada. El gel activado se transfirió después
directamente a un recipiente de reacción y adicionalmente se hizo
reaccionar con el ligando apropiado.
Se transfirió una cantidad de 10 g de gel
activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a
un vial de reacción que contenía una solución de dietilentriamina
(12,5 ml). La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de
la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente
con 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y
finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo gel de
dietilentriamina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,56
mmoles de aminas/ml de gel.
Se transfirió una cantidad de 10 g de gel
activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a
un vial de reacción que contenía una solución de trietilentetraamina
(12,5 ml). La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de
la filtración de la mezcla de reacción, el gel se lavó sucesivamente
con 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y
finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo gel de
trietilentetraamina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,62
mmoles de aminas/ml de gel.
Se transfirió una cantidad de 10 g de gel
activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a
un vial de reacción que contenía una solución de pentaetilenhexamina
(12,5 ml). La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de
la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente
con 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y
finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo gel de
pentaetilenhexamina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,61
mmoles de amina/ml de gel.
Se transfirió una cantidad de 10 g de gel
activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a
un vial de reacción que contenía una solución de 12,5 ml de
polietilenimina (50% en agua). La reacción se dejó 17 horas
agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción
el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de agua destilada, 3x 10
ml de HCl acuoso 0,5 y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se
obtuvo un gel de polietilenimina-Sepharose® con un
grado de sustitución de 0,45 mmoles de aminas/ml de gel.
- 1)
- Se transfirió una cantidad de 10 g de gel activado con bromo (0,32 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reacción que contenía una solución de azida de sodio (1 g) en agua (3 ml) que había sido ajustada a pH 12 mediante la adición de una solución acuosa al 50% de NaOH. La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 20 ml de agua destilada y 3x 10 ml DMF. El gel drenado se redujo adicionalmente en una solución de DTE (1,5 g) y DBU (1,2 ml) en DMF (7,5 ml), se agitó durante 18h a la temperatura ambiente. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de DMF, 3x10 ml de etanol y finalmente 3x 10 ml de agua destilada. Se obtuvo un gel de amina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,21 mmoles de grupos amina/ml de gel.
- 2)
- Se transfirió una cantidad de 10 g de gel activado con bromo (0,4 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reacción que contenía una solución de azida de sodio (1 g) en agua (3 ml) que se había ajustado a pH 12 mediante la adición de una solución acuosa al 50% de NaOH. La reacción se dejó 17 horas agitando a 50ºC. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 20 ml de agua destilada y 3x 10ml de DMF. El gel drenado se redujo adicionalmente en una solución de DTE (1,5 g) y DBU (1,2 ml) en DMF (7,5 ml), se agitó durante 18h a la temperatura ambiente. Después de la filtración de la mezcla de reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x 10 ml de DMF, 3x10 ml de etanol y finalmente 3x10 ml de agua destilada. Se obtuvo un gel de amina Sepharose® con un grado de sustitución de 0,26 mmoles de grupos amina/ml de gel.
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Se lavó una cantidad de 5 g de amina acoplada a
gel con 3xl0 ml de etanol seguido de 3x 10ml de DCM (diclorometano).
El gel se transfirió a un vial y también se añadieron DCM (2 ml) y
3,3 equivalentes de DIPEA, y la mezcla se agitó durante 5 minutos.
Después de la adición gota a gota de 3 equivalentes de cloruro de
metilsulfonilo disuelto en DCM (3 ml), la mezcla de reacción se
agitó a la temperatura ambiente durante 18h. Después de la
filtración de la mezcla reacción el gel se lavó sucesivamente con 3x
10 ml de DCM, 3x10 ml de etanol, 3x10 ml de agua destilada, 3x 10 ml
de HCl 0,5 M y finalmente 3x 10 ml de agua destilada.
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Para someter a ensayo si los nuevos ligandos de
sulfonamida no aromáticos de acuerdo con la invención adsorben la
inmunoglobulina humana (IgG) selectivamente, se sometió a ensayo la
capacidad de adsorción de IgG y tres proteínas modelo diferentes en
diferentes condiciones. El principio del método de ensayo fue que
las proteínas se inyectaron (15 \mul) en una columna HR5/5 (que
contenía los ligandos de sulfonamida inmovilizados sobre Sepharose®
Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) equilibrada con
tampón A (que contenía una sal y un componente tampón). Después se
bombearon 15 ml de tampón A a través de la columna; después se
aplicó un gradiente lineal de tampón A a tampón B (conteniendo el
tampón B componente tampón sin sal) (véase el método UNICORN más
abajo). Los perfiles cromatográficos se controlaron después a 280,
254 y 215 nm.
Para evaluar la cantidad de muestra adsorbida y
la cantidad de muestra eluida de la columna, también se inyectó la
misma cantidad de muestra aplicada a la columna directamente al
control y se integró la respuesta.
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Se utilizaron seis combinaciones de adsorción
(Tampón Anúm) y tampones de desorción (Tampón Bnúm):
- 1.
- Tampón A1: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4) con Na_{2}SO_{4} 0,50 M
- Tampón B1: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4)
- 2.
- Tampón A2: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4) con Na_{2}SO_{4} 0,25 M
- Tampón B1: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4)
- 3.
- Tampón A3: tampón acetato 20 mM (pH 4,0) con Na_{2}SO_{4} 0,50 M
- Tampón B2: tampón acetato 20 mM (pH 4,0)
- 4.
- Tampón A4: tampón acetato 20 mM (pH 4,0) con Na_{2}SO_{4} 0,25 M
- Tampón B2: tampón acetato 20 mM (pH 4,0)
- 5.
- Tampón A2: tampón fosfato 20 mM (pH 7,4) con Na_{2}SO_{4} 0,25 M
- Tampón B3: tampón acetato 100 mM (pH 4,0)
- 6.
- Tampón A5: tampón Glicina 20 mM (pH 10,0) con Na_{2}SO_{4} 0,50 M
- Tampón B4: tampón Glicina 20 mM
Las muestras utilizadas fueron seralbúmina
bovina (BSA), ribonucleasa A (RIB A), transferrina (TRANSF) e
inmunoglobulina humana (IgG, Gammanorm). Las proteínas se
disolvieron en el tampón A a una concentración de 15 mg/ml y se
aplicó solamente una proteína cada vez en la columna.
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Cromatografía Líquida
- Sistema (LC) : ÄKTA® Explorer (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) 10 XT o igual
- Soporte lógico: UNICORN®
- Bucle de inyección: Superloop® 15 \mul
- Columna: HR 5/5
\vskip1.000000\baselineskip
- Velocidad de flujo: 0,5 ml/min
- Célula detectora: 10 mm
- Longitud de onda: 280, 254 y 215 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Método principal:
- 0.00 Base CV, 1.00 {ml}, Cualquiera
- 0.00 Posición de la Columna Desviación de la Posición
- 0.00 AutoCeroUV
- 0.00 Longitud de onda 280 {nm} 254 {nm} 215 {nm}
- 1.00 Longitud de onda 280 {nm} 254 {nm} 215 {nm}
- 1.10 Inyección Parcial (1) VIAL múm., 10 núm. INJVOL1 {\mul}, No,
\hskip2cmSin Aire
- 1.10 AutoCeroUV
- 4.00 Posición de la Columna (Posición2) KOLONN
- 5.00 Inyección Parcial (1) VIAL Núm. 2, 10 núm.INJV02 {p1}, No,
\hskip2cmSin Aire
- 20.00 Gradiente 100 {% B}, 2.00 {base}
- 25.00 Gradiente 100 {% B}, 0.00 {base}
- 25.10 Gradiente 0 {% B}, 1 {base}
- 29.00 Gradiente 0 {%B}, 0 {base}
- 34.00 Gradiente 0 {% B}, 0 {base}
- 34.10 Fin del Método
Para documentar si los ligandos de sulfonamida
no aromáticos adsorben selectivamente las inmunoglobulinas, se
aplicó IgG humana a una columna de 1 ml (HR 5/5) empaquetada con las
nuevas matrices de acuerdo con la invención. Además, también se
aplicaron las proteínas seralbúmina bovina (BSA), ribonucleasa A
(RIB A) y transferrina (TRANSF). Se utilizaron cinco tampones
diferentes con diferente pH y diferente contenido de sal
(Na_{2}SO_{4}) como tampones de adsorción. En la Tabla 1 y 2,
se presentan los resultados a pH 7,4 (Tampones Al y A2). Como
aparece en la Tabla 1 más abajo, cuando se añadían 0,25 M de
Na_{2}SO_{4} a la fase móvil, BSA, RIB A y TRANSF no eran
adsorbidas en los ligandos investigados. Sin embargo, la IgG era
adsorbida cuantitativamente en tres de los cuatro ligandos basados
en poliaminas y el 90% de la IgG aplicada era adsorbida en el cuarto
ligando, esto es el ligando basado en trietilentetraamina. Además,
solamente uno de los amoníacos (monoaminas) esto es el ligando
basado en cisteamina, adsorbía la IgG.
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Como aparece en la Tabla 2 más abajo, si se
utilizaba una fase móvil con una fuerza iónica superior (Tampón A1;
0,50 M de Na_{2}SO_{4}), la transferrina era parcialmente
adsorbida en algunos de los ligandos (Tabla 2) y la IgG era
adsorbida en todos los ligandos. Los ligandos más selectivos fueron
los ligandos de sulfonamida basados en dietilentriamina,
polietilenimina y Amoníaco 1 (Tabla 2) puesto que BSA, RIB A y
TRANSF no fueron adsorbidas en estos ligandos.
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Los resultados presentados antes muestran que
dependiendo de la fuerza iónica del tampón de adsorción de pH 7,4,
los diferentes ligandos de sulfonamida serán óptimos para la
adsorción de IgG.
Un adsorbente ideal para la inmunoglobulina no
solo debe tener una selectividad significativa si no que debe ser
capaz de permitir una elución eficiente. La mayoría de la IgG
adsorbida podría ser desorbida fácilmente con tampón fosfato 20 mM
(pH 7,4) sin sal añadida. La adsorción de IgG utilizando tampón A1
como fase móvil dio como resultado la recuperación de
70-100% de la IgG adsorbida cuando se utilizaba el
tampón de adsorción B1. Sin embargo, la IgG era más difícil de
hacer eluir cuando se adsorbía con tampón A2, pero se podía desorber
fácilmente utilizando el tampón B3 (tampón acetato 100 mM, pH
4,0).
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Como se muestra en la Tabla 3 y 4 más abajo, la
adsorción de IgG en condiciones ácidas no es claramente tan
selectiva como la adsorción a pH 7,4. Utilizando tampón acetato 20
mM (pH 4,0) con la adición de Na_{2}SO_{4} 0,25 M (Tampón A4)
como tampón de adsorción, los ligandos basados en cisteamina,
trietilentetraamina y dietilentriamina adsorben 40, 40 y 60%,
respectivamente, de la cantidad aplicada de IgG (Tabla 3). En las
mismas condiciones la ribonucleasa A y la transferrina no son
adsorbidas. Sin embargo, un 90, 10 y 100% de la seralbúmina bovina
aplicada son adsorbidas en los ligandos basados en cisteamina,
trietilentetraamina y dietilentriamina, respectivamente.
Los resultados anteriores muestran que el
ligando basado en trietilentetraamina es el más selectivo de los
ligandos sometidos a ensayo para IgG. La IgG de la muestra contiene
subclases de diferentes inmunoglobulinas (59% de IgG 1, 36% de IgG
2, 4,9% de IgG 3 y 0,5% de IgG 4). Si el contenido en sal del tampón
de adsorción aumenta, la selectividad para IgG disminuye como
resultado de la adsorción de las otras proteínas. En la Tabla 4 se
presentan los resultados para el tampón A3 (tampón acetato 20 mM (pH
4,0) con Na_{2}SO_{4} 0,50 M) utilizado como tampón de
adsorción. Se muestra claramente que tanto la ribonucleasa A como la
transferrina son adsorbidas en algunos de los ligandos. Además, la
seralbúmina bovina es adsorbida en un grado mayor con el tampón A3
que cuando se utilizaba en tampón A4 (Tabla 3 y 4). El ligando que
es más selectivo cuando se utiliza el tampón A3 parece ser el que
está basado en pentaetilenhexamina puesto que solamente un 10, 20 y
10% son adsorbidos de la cantidad aplicada de BSA, RIB y TRANSF,
respectivamente. Esto se puede comparar con la IgG donde el 50% de
la cantidad aplicada es adsorbida (Tabla 4).
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La desorción cuantitativa de todas las muestras
adsorbidas se completó fácilmente por medio de tampón B2 (tampón
acetato 20 mM, pH 4,0).
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Se han realizado unos pocos experimentos a pH
10,0, y de acuerdo con la Tabla 5 se puede observar que la IgG es
adsorbida cuantitativamente en los ligandos basados en cisteamina y
trietilentetraamina utilizando el tampón de adsorción A5 (tampón
glicina 20 mM (pH 10,0) con Na_{2}SO_{4} 0,5 M). Sin embargo,
solamente un 10% de la cantidad adsorbida de IgG podría ser eluida
con el tampón de desorción B4 (tampón glicina 20 mM). Para obtener
la desorción cuantitativa de IgG el pH se debe cambiar a condiciones
ácidas, por ejemplo utilizando tampón de desorción B3 (tampón
acetato 100 mM, pH 4,0).
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Con el fin de verificar que las estructuras de
sulfonamida de acuerdo con la invención interaccionan con
anticuerpos más fuertemente que los ligandos de acetamida, se
prepararon dos ligandos de cada tipo basándose en los dos ligandos
de amina trietilentetraamina y cisteamina (de acuerdo con el ejemplo
2, sección experimental, más arriba). En la Tabla 6 de más abajo,
se presentan los resultados de la adsorción de IgG para cuatro
sistemas tampón diferentes (Tampones B1-3 y B5).
Como se muestra claramente en la Tabla 6, las estructuras de
sulfonamida de acuerdo con la invención adsorben IgG más
eficazmente en todas las condiciones investigadas en comparación
con los ligandos de acetamida. El ligando de acetamida basado en
cisteamina fue el único ligando que pudo adsorber IgG (50% de la
cantidad aplicada) cuando se utilizaron los tampones Al y A5 como
tampones de adsorción. Sin embargo, este ligando fue incapaz de
adsorber IgG cuando la concentración de sal descendió de
Na_{2}SO_{4} 0,5 M a 0,25 M en tampón fosfato 20 mM (pH 7,4).
Ambos ligandos de metilsulfonamida adsorben IgG en todas las
condiciones investigadas. Estos resultados indican claramente que
los ligandos de metilsulfonamida de acuerdo con la invención son
mejores adsorbentes de IgG que los ligandos de acetamida.
Claims (27)
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Claims (27)
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1. Una matriz de separación que comprende un
soporte poroso en el cual se han inmovilizado ligandos,
opcionalmente por medio de brazos espaciadores, donde dichos
ligandos comprenden una o más sulfonamidas donde un grupo R del
sulfonilo es un compuesto alifático.
2. Una matriz de acuerdo con la reivindicación
1, donde la sulfonamida se acopla al soporte poroso por medio de su
nitrógeno.
3. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el grupo R es un grupo
metilo.
4. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el nitrógeno de la
sulfonamida o las sulfonamidas es una amina primaria o
secundaria.
5. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde los ligandos son
monoaminas.
6. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4, donde los ligandos son
poliaminas.
7. Una matriz de acuerdo con la reivindicación
6, donde cada poliamina comprende de dos a seis aminas.
8. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde los ligandos están presentes
como unidades repetitivas de un polímero inmovilizado en el
soporte.
9. Una matriz de acuerdo con la reivindicación
8, donde el polímero es una polietilenimina.
10. Una matriz de acuerdo con reivindicación 8 o
9, donde el polímero muestra dos o más grupos ligandos
diferentes.
11. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde los ligandos son compuestos
alifáticos.
12. Una matriz de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, donde el soporte es un polisacárido
entrecruzado.
13. Una columna de cromatografía empaquetada con
una matriz de separación como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12.
14. Una columna de cromatografía de acuerdo con
la reivindicación 13, que es sustancialmente estéril.
15. Una columna de cromatografía de acuerdo con
la reivindicación 13 o 14, que es desechable.
16. Un procedimiento de preparación de una
matriz para la separación de anticuerpos, cuyo método comprende una
primera etapa de inmovilización de aminas y/o poliaminas en un
soporte poroso y una etapa posterior de sulfonilación de dichas
aminas para proporcionar ligandos de sulfonamida alifáticos.
17. Un procedimiento de preparación de una
matriz para la separación de anticuerpos, cuyo método comprende una
primera etapa de activación de un soporte poroso y una etapa
posterior de anclaje de las sulfonamidas a los sitios activados por
medio de sus azufres para proporcionar ligandos de sulfonamida
alifáticos.
18. Un método de aislamiento de anticuerpos de
un líquido, cuyo método comprende las etapas de
- (a)
- proporcionar un líquido que comprende al menos un anticuerpo:
- (b)
- poner en contacto dicho líquido con una matriz de separación, que comprende un soporte poroso en el cual están inmovilizados uno o más ligandos de sulfonamida alifáticos, para adsorber uno o más anticuerpos en dicha matriz; y, opcionalmente,
- (c)
- hacer pasar un eluyente sobre dicha matriz para liberar uno o más anticuerpos; y
- (d)
- recuperar al menos un anticuerpo de una fracción del eluyente.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación
18, donde el líquido proporcionado en la etapa (a) también comprende
una o más proteínas distintas.
\newpage
20. Un método de acuerdo con la reivindicación
18 o 19, donde la matriz de separación de la etapa (b) se
proporciona en una cromatografía en columna.
21. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 18-20, donde la matriz de
separación de la etapa (b) se define como en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación
21, donde la etapa (b) se realiza a un pH próximo al neutro, tal
como pH 7,2-7,6, preferiblemente aproximadamente
7,4.
23. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 18-22, donde la etapa (c) es
una elución en gradiente realizada añadiendo un eluyente de
concentración de sal descendente a la matriz de separación.
24. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 18-23, donde la etapa (b) se
realiza a un pH neutro o por encima del mismo y la etapa (c) es una
elución en gradiente realizada añadiendo un eluyente de pH
descendente.
25. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 18-24, donde los anticuerpos
recuperados en la etapa (d) son anticuerpos humanos o
humanizados.
26. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 18-25, donde los anticuerpos
recuperados en la etapa (d) son inmunoglobulina G (IgG).
27. Un método de determinación de la cantidad de
un anticuerpo, cuyo método abarca un método como se define en una
cualquiera de las etapas 18-26 y además una etapa
(e) de determinación de la cantidad de anticuerpo
espectrofotométricamente.