ES2341959T3 - Metodo para aislar acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Método de separación del ácido nucleico genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula que comprende: a) combinar i) soportes en fase sólida cuyas superficies tienen unidas a las mismas un grupo funcional que se une de manera reversible a ácido nucleico, ii) una célula y iii) un reactivo, en el que el reactivo comprende un componente de lisis que provoca la lisis de la célula y un agente de precipitación de ácido nucleico que provoca la precipitación del ácido nucleico de la célula sobre los soportes en fase sólida; produciendo de ese modo una combinación; b) mantener la combinación en condiciones en las que se produce la lisis de la célula y el ácido nucleico de la célula se une de manera reversible a los soportes en fase sólida, produciendo de eso modo soportes en fase sólida que tienen ácido nucleico de la célula unido a los mismos; c) separar los soportes en fase sólida de la combinación; d) poner en contacto los soportes en fase sólida con un tampón de elución que provoca la elución del ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido nucleico genómico desde los soportes en fase sólida, separando de ese modo el ácido nucleico genómico de la célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula.
Description
Método para aislar ácidos nucleicos.
La presente invención se refiere a un método
para aislar ácidos nucleicos.
Muchas aplicaciones de biología molecular, tales
como electroforesis capilar, secuenciación de nucleótidos,
clonación con transcripción inversa y protocolos de terapia génica,
que contemplan la transfección, la transducción o la microinyección
de células de mamífero, requieren el aislamiento de preparaciones de
ácido nucleico de alta calidad.
La llegada de aplicaciones de biología molecular
exigentes ha aumentado la necesidad de protocolos de purificación
de alto rendimiento, y de manera preferible fácilmente
automatizables, que puedan producir preparaciones de ácido nucleico
de alta calidad. Aunque los avances tecnológicos recientes y la
llegada de la robótica han facilitado la automatización de las
reacciones de secuenciación y las etapas de lectura en gel, el
rendimiento todavía está limitado por la disponibilidad de los
métodos fácilmente automatizables de purificación de ácido
nucleico.
Tal como se describe en el presente documento,
los solicitantes proporcionan un método en el que ácido nucleico
genómico de una célula puede separarse de ácido nucleico que tiene
un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido
nucleico genómico (por ejemplo, ADN de plásmido) de la célula,
directamente desde un cultivo de crecimiento celular. Además, los
solicitantes proporcionan un método en el que el ácido nucleico
genómico de una célula puede separarse de ácido nucleico que tiene
un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido
nucleico genómico en un lisado celular, sin la necesidad de preparar
un lisado clarificado.
La lisis alcalina tradicional requiere las
siguientes etapas: concentrar o aglomerar células diluidas en medios
de crecimiento; centrifugar o agitar con vórtex; lisar las células
con un detergente alcalino; sacudir y/o agitar el lisado; añadir
tampón de neutralización; filtrar y/o manipular la muestra para
eliminar la masa floculenta; añadir un soporte en fase sólida y
añadir tampón de unión. Generalmente se requieren etapas de
purificación adicionales para eliminar los detergentes y las sales
como sigue: adición de soportes en fase sólida y adición de un
tampón de unión.
El documento WO 02/055727 da a conocer el
aislamiento de ADN dependiente del tamaño que usa perlas magnéticas
recubiertas con COOH seleccionando una concentración apropiada del
reactivo precipitante (polialquilenglicol y sal).
El aislamiento de ADN de plásmido tal como se
muestra a modo de ejemplo consiste en dos etapas: eliminar en
primer lugar el ADN genómico con perlas magnéticas y unir después el
ADN de plásmido en la disolución restante a nuevas perlas.
Una ventaja de la invención es que permite un
procedimiento simplificado para separar el ácido nucleico genómico
de una célula de ácidos nucleicos que tienen un peso molecular menor
que el peso molecular del ácido nucleico genómico de la célula.
Proporcionando soportes en fase sólida y un reactivo que provoca la
lisis de las células y la precipitación del ácido nucleico de las
células sobre los soportes en fase sólida (un agente de
precipitación de ácido nucleico), pueden eliminarse una o más
etapas del procedimiento de purificación convencional de ácido
nucleico a partir de células completas o intactas. Además,
proporcionando soportes en fase sólida y un reactivo que provoca la
precipitación del ácido nucleico de las células sobre los soportes
en fase sólida, pueden eliminarse una o más etapas del
procedimiento de purificación convencional de ácido nucleico a
partir de lisados celulares. El orden en el que se combinan los
soportes en fase sólida y el reactivo con una célula o un lisado
celular no es crítico. Los soportes en fase sólida y el reactivo
que provoca la precipitación del ácido nucleico de la célula sobre
los soportes en fase sólida y/o la lisis de las células, pueden
combinarse con una célula o un lisado celular secuencialmente (por
ejemplo, como componentes separados) o simultáneamente (por ejemplo,
como un solo componente). Cuando se combinan los soportes en fase
sólida y el reactivo en un solo componente, los métodos descritos
en el presente documento permiten la adición de un único reactivo a
una célula o un cultivo celular, seguida por una incubación, una
separación de un soporte en fase sólida y una elución selectiva
para conseguir la separación del ácido nucleico genómico de una
célula del ácido nucleico de una célula que tiene un peso molecular
que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico de la
célula. Los métodos de la invención no requieren ajustes de pH. El
número reducido de etapas proporcionadas por los reactivos y
métodos descritos en el presente documento simplifican la
automatización del procedimiento de purificación de ácido nucleico
de células o lisados celulares.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un método de separación del ácido nucleico genómico de
una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es
menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la
célula (por ejemplo, ADN de plásmido, ADN episómico, ADN
mitocondrial, ADN de orgánulo, ADN viral) que comprende combinar i)
soportes en fase sólida (por ejemplo, micropartículas magnéticas)
cuyas superficies tienen unidas a las mismas un grupo funcional
(por ejemplo, grupo carboxilo, grupo amino) que se une de manera
reversible a ácido nucleico, ii) una célula y iii) un reactivo, en
el que el reactivo provoca la lisis de la célula y la precipitación
del ácido nucleico de la célula sobre los soportes en fase sólida,
produciendo de ese modo una combinación. La combinación se mantiene
en condiciones en las que se produce la lisis de la célula y el
ácido nucleico de la célula se une de manera reversible a los
soportes en fase sólida; produciendo de ese modo soportes en fase
sólida que tienen ácido nucleico de la célula unido a los mismos.
Los soportes en fase sólida se separan de la combinación y se ponen
en contacto con un tampón de elución (por ejemplo, agua) que
provoca la elución (elución selectiva) del ácido nucleico que tiene
un menor peso molecular que el ácido nucleico genómico desde los
soportes en fase sólida. El ácido nucleico genómico permanece unido
al soporte en fase sólida, dando como resultado de ese modo la
separación del ácido nucleico genómico de la célula de ácido
nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico en la célula.
En el método según la presente invención, el
ácido nucleico que tiene un menor peso molecular es ácido nucleico
de plásmido y los soportes en fase sólida comprenden micropartículas
paramagnéticas. El reactivo puede ser un alcohol tal como etanol,
isopropanol, polialquilenglicol.
La presente invención también se refiere a un
método de separación del ácido nucleico genómico de una célula de
ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico en la célula que comprende
combinar i) soportes en fase sólida cuyas superficies tienen unidas
a las mismas un grupo funcional que se une de manera reversible a
ácido nucleico, ii) un lisado celular y iii) un reactivo, en el que
el reactivo provoca la precipitación del ácido nucleico del lisado
celular sobre los soportes en fase sólida, produciendo de ese modo
una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las el
ácido nucleico del lisado celular se une de manera reversible a los
soportes en fase sólida, produciendo de ese modo soportes en fase
sólida que tienen ácido nucleico de la célula unido a los mismos.
Los soportes en fase sólida se separan de la combinación y se ponen
en contacto con un tampón de elución que provoca la elución del
ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido
nucleico genómico desde los soportes en fase sólida. El ácido
nucleico genómico permanece unido al soporte en fase sólida,
separando de ese modo el ácido nucleico genómico de la célula de
ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico en la célula.
La figura 1 es una ilustración del protocolo
para la separación del ácido nucleico genómico de una célula de
ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido
nucleico genómico en la célula.
La figura 2 es un gel de agarosa de 96 pocillos
que muestra la separación del ácido nucleico genómico de E.
coli de una célula de un plásmido en la célula.
La figura 3 es un histograma de las bases de
Phred 20 (rojo) y Phred 30 (negro) generadas por las lecturas; el
eje Y es el número de lecturas, el eje X son las uniones de Phred 20
en incrementos de 50 pb.
La figura 4 muestra duplicados de ADNg
preparados a partir de 50 \mul de sangre de caballo.
La figura 5 muestra el análisis PicoGreen de 8
muestras de ADNg preparado a partir de sangre de caballo.
La figura 6 muestra una PCR en gradiente de ADNg
preparado a partir de sangre de caballo (usando marcadores Y3B19
con un tamaño de amplicón esperado de 225 pb).
Tal como se describe en el presente documento,
la presente invención proporciona métodos en los que un ácido
nucleico genómico de una célula puede separarse del ácido nucleico
de una célula que tiene un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico (por ejemplo, ADN de plásmido)
usando un número mínimo de etapas. La separación puede realizarse
en un cultivo celular directamente sin la necesidad de aglomerar
las células. Además, los métodos descritos en el presente documento
pueden realizarse directamente en un lisado celular sin la
necesidad de clarificar el lisado de ácido nucleico genómico usando
métodos tradicionales (por ejemplo, centrifugación, tratamiento
químico).
La presente invención proporciona métodos y
reactivos para el aislamiento de ácidos nucleicos. Los reactivos
descritos en el presente documento pueden usarse para separar el
ácido nucleico genómico de una célula (una o más) de ácido nucleico
que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del
ácido nucleico genómico de la célula, combinando la célula con
soportes en fase sólida y un reactivo que provoca la lisis de la
célula y la precipitación del ácido nucleico de la célula sobre los
soportes en fase sólida. Alternativamente, los reactivos descritos
en el presente documento pueden usarse para separar el ácido
nucleico genómico de un lisado celular de ácido nucleico que tiene
un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido
nucleico genómico del lisado celular, combinando el lisado celular
con soportes en fase sólida y un reactivo que provoca la
precipitación del ácido nucleico del lisado celular sobre los
soportes en fase sólida. El ácido nucleico que tiene un peso
molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico
genómico de la célula se eluye entonces de manera selectiva desde
los soportes en fase sólida.
Tal como se describe en el presente documento,
el método comprende unir el ácido nucleico de una célula o un
lisado celular de manera no específica y reversible a soportes en
fase sólida (por ejemplo, micropartículas magnéticas) que tienen
una superficie recubierta con grupo funcional (por ejemplo,
superficie recubierta con carboxilo). Se separan después las
micropartículas del sobrenadante, por ejemplo, aplicando un campo
magnético para extraer las micropartículas magnéticas. Puede
eliminarse entonces la disolución restante (por ejemplo,
sobrenadante), dejando las micropartículas con el ácido nucleico
unido. Una vez separadas del sobrenadante, pueden ponerse en
contacto las micropartículas con un tampón de elución que eluye de
manera selectiva el ácido nucleico que tiene un peso molecular que
es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico de la
célula. Como resultado, se producen un tampón de elución que
contiene ácido nucleico sin unir (ácido nucleico de la célula que
tiene un menor peso molecular que el peso molecular del ácido
nucleico genómico de la célula) y micropartículas magnéticas a las
que todavía está unido ácido nucleico genómico de la célula. Un
tampón de elución es una disolución en la que la concentración de
un reactivo precipitante de ácido nucleico está por debajo del
intervalo requerido para la unión del ácido nucleico que tiene un
peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido
nucleico genómico sobre las micropartículas magnéticas. En una
realización, el eluyente es agua. Además, pueden usarse
disoluciones de sacarosa (al 20%) y formamida (al 100%) para eluir
el ácido nucleico. La elución del ácido nucleico desde las
micropartículas se produce en treinta segundos o menos cuando se
usa un tampón de elución de baja fuerza iónica, por ejemplo, agua.
Una vez que se ha eluido el ácido nucleico unido, se separan las
micropartículas magnéticas del tampón de elución que contiene el
ácido nucleico eluido. Preferiblemente, se separan las
micropartículas magnéticas del tampón de elución mediante medios
magnéticos. Pueden usarse otros métodos conocidos para aquellos
expertos en la técnica para separar las micropartículas magnéticas
del sobrenadante. Por ejemplo, puede usarse filtración o
centrifugación.
El aislamiento de preparaciones de ácido
nucleico de alta calidad a partir de disoluciones de partida de
complejidad y composición diversas es una técnica fundamental en
biología molecular. Como resultado de los reactivos y métodos
descritos en el presente documento, están ahora disponibles métodos
fácilmente automatizables y rápidos de separación del ácido
nucleico genómico de ácido nucleico que tiene un menor peso
molecular que el ácido nucleico genómico. Pueden usarse ácidos
nucleicos aislados mediante los métodos dados a conocer para las
aplicaciones de biología molecular que requieran ácidos nucleicos
de alta calidad, tales como la preparación de moldes de
secuenciación de ADN, la microinyección, transfección o
transformación de células de mamífero, la síntesis in vitro
de horquillas de ARNi, la clonación con transcripción inversa, la
construcción de bibliotecas de ADNc, la amplificación por PCR y la
investigación en terapia génica, así como para otras aplicaciones
con requisitos de calidad menos rigurosos incluyendo, pero sin
limitarse a, transformación, análisis de micromatriz o endonucleasa
de restricción, precipitaciones de ARN selectivas, transposición
in vitro, separación de productos de amplificación por PCR
múltiplex, preparación de cebadores y sondas de ADN y protocolos de
eliminación de moldes.
Los reactivos y métodos descritos en el presente
documento pueden usarse junto con una variedad de técnicas de
purificación de ácido nucleico, incluyendo aquellas descritas en las
patentes estadounidenses n.º 5.705.628 y 5.898.071 así como en el
documento WO 99/58664.
En una realización, la presente invención se
refiere a un método de separación del ácido nucleico genómico de
una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es
menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico (por
ejemplo, ADN de plásmido) en la célula, que comprende combinar i)
soportes en fase sólida cuyas superficies tienen unidas a las
mismas un grupo funcional que se une de manera reversible a ácido
nucleico, ii) una célula y iii) un reactivo, en el que el reactivo
provoca la lisis de la célula y la precipitación del ácido nucleico
de la célula sobre los soportes en fase sólida, produciendo de ese
modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en
las que se produce la lisis de la célula y el ácido nucleico de la
célula se une de manera reversible a los soportes en fase sólida,
produciendo de ese modo soportes en fase sólida que tienen ácido
nucleico de la células unido a los mismos. Los soportes en fase
sólida se separan de la combinación y se ponen en contacto con un
tampón de elución que provoca la elución del ácido nucleico que
tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del ácido
nucleico genómico desde los soportes en fase sólida, pero que no
provoca la elución del ácido nucleico genómico desde los soportes en
fase sólida, separando de ese modo el ácido nucleico genómico de la
célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor
que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la
célula.
célula.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un método de separación del ácido nucleico genómico de
una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es
menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la
célula, que comprende combinar i) soportes en fase sólida cuyas
superficies tienen unidas a las mismas un grupo funcional que se
une de manera reversible a ácido nucleico, ii) un lisado celular y
iii) un reactivo, en el que el reactivo provoca la precipitación
del ácido nucleico del lisado celular sobre los soportes en fase
sólida, produciendo de ese modo una combinación. La combinación se
mantiene en condiciones en las que el ácido nucleico del lisado
celular se une de manera reversible a los soportes en fase sólida,
produciendo de ese modo soportes en fase sólida que tienen ácido
nucleico de la célula unido a los mismos. Los soportes en fase
sólida se eliminan de la combinación y se ponen en contacto con un
tampón de elución que provoca la elución del ácido nucleico que
tiene un peso molecular que es menor que el ácido nucleico genómico,
pero que no provoca la elución del ácido nucleico genómico desde
los soportes en fase sólida, separando de ese modo el ácido
nucleico genómico de la célula de ácido nucleico que tiene un peso
molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico
genómico en la célula.
La presente invención se refiere además a un
método de separación del ácido nucleico genómico de una célula de
ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico en la célula, en el que el
ácido nucleico que tiene un menor peso molecular es adecuado para su
uso en métodos de secuenciación o bien automatizados de alto
rendimiento o bien manuales.
En una realización, la invención es un método
fácilmente automatizable de aislamiento de un molde de ADN de
plásmido para la secuenciación de nucleótidos. El uso de los
reactivos descritos en el presente documento proporciona un medio
alternativo, y fácilmente automatizable, de separación de ácidos
nucleicos.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "separar" pretende significar que el material en
cuestión existe en un medio físico distinto de aquél en el que se
produce en la naturaleza y/o se ha separado, aislado o purificado
parcial o completamente de otras moléculas de ácido nucleico.
Tal como se usa en el presente documento, los
términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico"
se usan como sinónimos con el término polinucleótidos y pretenden
abarcar ADN (por ejemplo, formas monocatenaria, bicatenaria,
cerrada de forma covalente y circular relajada), ARN (por ejemplo,
monocatenario y bicatenario), híbridos de ARN/ADN y
poliamida-ácidos nucleicos (PNA).
"Ácido nucleico genómico" hace referencia
al ácido nucleico cromosómico o genómico presente en una célula.
Normalmente, el peso molecular del ácido nucleico cromosómico o
genómico es de desde aproximadamente 500 kilobases (kb) (por
ejemplo, micoplasma) hasta aproximadamente 500 gigabases (Gb). En
realizaciones particulares, el peso molecular del ácido nucleico
cromosómico o genómico oscila desde aproximadamente 1000 kb hasta
aproximadamente 250 Gb (por ejemplo, cebolla); desde
aproximadamente 10.000 kb hasta aproximadamente 5 Gb; desde
aproximadamente 100.000 kb hasta aproximadamente 1 Gb y desde
aproximadamente 500.000 kb hasta 1.000.000 kb.
"Ácido nucleico que tiene un peso molecular
que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en
la célula" hace referencia a ácido nucleico diferente del ácido
nucleico cromosómico o genómico que está presente en una célula y
puede ser ácido nucleico exógeno o endógeno. El ácido nucleico que
tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del
ácido nucleico genómico en la célula normalmente tiene un peso
molecular entre aproximadamente 1 kb y aproximadamente 250.000 kb
(por ejemplo, BAC). En realizaciones particulares, el ácido
nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico en la célula oscila desde
aproximadamente 5 kb hasta aproximadamente 100.000 kb; desde
aproximadamente 100 kb hasta aproximadamente 10.000 kb; y desde
aproximadamente 1000 kb hasta aproximadamente 5000 kb. Tal como se
usa en el presente documento "ácido nucleico endógeno" (ácido
nucleico de la célula huésped) hace referencia a ácido nucleico que
está presente en la célula cuando se obtiene la célula. "Ácido
nucleico exógeno" (ácido nucleico foráneo; ácido nucleico
recombinante) hace referencia a ácido nucleico que no está presente
en la célula cuando se obtiene (por ejemplo, célula transfectada,
célula transducida). El ácido nucleico exógeno puede estar presente
en una célula como resultado de su introducción en la célula o su
introducción en un antecesor de la célula. El ácido nucleico
exógeno puede introducirse directa o indirectamente en la célula o
un antecesor de la misma mediante los medios conocidos para un
experto habitual en la técnica (por ejemplo, transformación o
transfección). Ejemplos de ácido nucleico exógeno introducido en una
célula incluyen cromosoma artificial bacteriano (BAC), cromosomas
artificiales de levadura (YAC), plásmidos, cósmidos, vector P1 y
ácido nucleico introducido debido a un proceso de amplificación
(por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Tal como
se usa en el presente documento, el término "plásmido" hace
referencia a especies de ADN circular bicatenario que se originan
de una fuente exógena (por ejemplo, se introducen en una célula
huésped) y que pueden autorreplicarse independientemente del ADN
cromosómico del huésped. Por tanto, el término abarca ADN clonado
producido a partir de la replicación de cualquiera de los vectores
mencionados anteriormente. Ejemplos de vectores usados para
introducir ácido nucleico en una célula incluyen pUC, pOT,
pBluescript, pGEM, pTZ, pBR322, pSC101, pACYC, SuperCos y pWE15.
Alternativamente, el ácido nucleico exógeno puede introducirse en
la célula desde un fago dentro del que se ha empaquetado el ácido
nucleico (por ejemplo, cósmido, P1). Ejemplos adicionales de
"ácido nucleico que tiene un peso molecular que es menor que el
peso molecular del ácido nucleico genómico en la célula"
incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico episómico, ácido
nucleico mitocondrial, ácido nucleico de orgánulo, ARN, ARNip,
plastidios, microcromosomas, ácido nucleico de orgánulo, cebadores,
ácido nucleico viral, ácido nucleico bacteriano y ácido nucleico de
otros patógenos.
Un "soporte en fase sólida" es una entidad
que es esencialmente insoluble en condiciones en las que puede
precipitarse un ácido nucleico. Los soportes en fase sólida
adecuados para su uso en los métodos de la presente invención
tienen suficiente área superficial para permitir una unión eficaz y
se caracterizan además por tener superficies que pueden unirse de
manera reversible a ácidos nucleicos. Los soportes en fase sólida
adecuados incluyen, pero no se limitan a, micropartículas, fibras,
perlas y soportes que tienen afinidad por el ácido nucleico y que
pueden adoptar una variedad de formas, que son o bien de forma
regular o bien irregular, siempre que la forma maximice el área
superficial de la fase sólida y adopte un soporte que es susceptible
de manipulaciones a microescala. En una realización, el soporte en
fase sólida es paramagnético, por ejemplo, una micropartícula
paramagnética (magnéticamente sensible). En otra realización, el
soporte en fase sólida incluye una superficie recubierta con grupo
funcional. Por ejemplo, el soporte en fase sólida puede ser una
micropartícula paramagnética recubierta con amina, una
micropartícula paramagnética recubierta con carboxilo o una
micropartícula paramagnética recubierta con grupo carboxilo
encapsulado.
Tal como se usa en el presente documento,
"micropartículas paramagnéticas" hacen referencia a
micropartículas que responden a un campo magnético externo (por
ejemplo, un tubo de plástico o un soporte de placa de
microtitulación con un imán de tierras raras (por ejemplo,
neodimio) integrado) pero que se desmagnetizan cuando se elimina el
campo. Por tanto, las micropartículas paramagnéticas se separan
eficazmente de una disolución usando un imán, pero pueden
resuspenderse fácilmente sin que se produzca la agregación inducida
magnéticamente. Las micropartículas paramagnéticas preferidas
comprenden un núcleo rico en magnetita encapsulado por una capa de
polímero puro. Las micropartículas paramagnéticas adecuadas
comprenden una razón de magnetita/encapsulación de aproximadamente
el 20-35%. Por ejemplo, las partículas magnéticas
que comprenden una razón de magnetita/encapsulación de
aproximadamente el 23%, 25%, 28%, 30%, 32% o 34% son adecuadas para
su uso en la presente invención. Las partículas magnéticas que
comprenden una razón inferior a aproximadamente un 20% se atraen
sólo débilmente hacia los imanes usados para conseguir las
separaciones magnéticas. Dependiendo de la naturaleza de la célula
huésped, la viscosidad del crecimiento celular y la naturaleza del
vector (por ejemplo de alto o bajo número de copias), deben
considerarse las micropartículas paramagnéticas que comprenden un
porcentaje mayor de magnetita. El uso de micropartículas
paramagnéticas encapsuladas, que no tienen hierro o Fe_{3}O_{4}
expuesto en sus superficies, elimina la posibilidad de
interferencia del hierro con la función de la polimerasa en ciertas
manipulaciones en el sentido de 3' del ADN aislado. Sin embargo,
cuanto más grande es el núcleo de magnetita, mayor será la
probabilidad de fuga de la encapsulación (por ejemplo, liberación de
óxidos de hierro). Las micropartículas paramagnéticas adecuadas
para su uso en la presente invención pueden obtenerse por ejemplo
de Bangs Laboratories Inc., Fishers, IN (por ejemplo, estapor®
microesferas magnéticas encapsuladas modificadas con carboxilato),
Agencourt Biosciences y Seradyn.
Las micropartículas paramagnéticas adecuadas
deben ser de un tamaño que su separación de la disolución, por
ejemplo mediante medios magnéticos o mediante filtración, no sea
difícil. Además, las micropartículas paramagnéticas preferidas no
deben ser tan grandes que se minimice su área superficial o que no
sean adecuadas para la manipulación a microescala. Los tamaños
adecuados oscilan desde un diámetro medio de aproximadamente 0,1
\mu hasta un diámetro medio de aproximadamente 100 \mu. Un
tamaño preferido es un diámetro medio de aproximadamente 1,0 \mu.
Las micropartículas magnéticas adecuadas están disponibles
comercialmente de PerSeptive Diagnostics y se denominan BioMag
COOH.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "superficie recubierta con grupo funcional" hace
referencia a una superficie que se recubre con restos que se unen
de manera reversible a ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN o
poliamida-ácidos nucleicos (PNA)). Un ejemplo es una superficie que
se recubre con restos que tienen cada uno un grupo funcional libre
que se une al grupo amino del aminosilano o la micropartícula; como
resultado, las superficies de las micropartículas se recubren con
los restos que contienen grupo funcional. El grupo funcional actúa
como un adsorbente de bioafinidad para ácido nucleico precipitado
(por ejemplo, ADN precipitado con polialquilenglicol). En una
realización, el grupo funcional es un ácido carboxílico. Un resto
adecuado con un grupo funcional ácido carboxílico libre es un resto
de ácido succínico en el que uno de los grupos ácido carboxílico se
une a la amina de los aminosilanos a través de un enlace amida y el
segundo ácido carboxílico no se une, dando como resultado un grupo
ácido carboxílico libre unido o ligado a la superficie de la
micropartícula paramagnética. Las partículas magnéticas recubiertas
con ácido carboxílico están disponibles comercialmente de
PerSeptive Diagnostics (BioMag COOH). Los soportes en fase sólida
adecuados que tienen una superficie recubierta con grupo funcional
que se une de manera reversible a moléculas de ácido nucleico son,
por ejemplo, soportes en fase sólida magnéticamente sensibles que
tienen una superficie recubierta con grupo funcional, tales como,
pero sin limitarse a, micropartículas paramagnéticas recubiertas con
amino, recubiertas con carboxilo y recubiertas con grupo carboxilo
encapsulado.
El material de partida apropiado incluye células
(células completas o intactas), lisados celulares (células en
crecimiento o medios de cultivo) y lisados preparados a partir de
tales células. El material de partida apropiado incluye células
obtenidas de o bien tejido o bien fluidos corporales de mamífero
(por ejemplo, ser humano, primate, equino, canino, felino, bovino,
murino) y lisados preparados a partir de tales células. Por tanto,
puede usarse cualquier tipo de célula que tiene ácido nucleico
genómico y ácido nucleico que tiene un peso molecular menor que el
peso molecular del ácido nucleico genómico. Ejemplos de las células
para su uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero
no se limitan a, células de mamífero (por ejemplo, células
sanguíneas, tales como células de sangre completa), células
bacterianas (por ejemplo, de E. coli tal como DH5\alpha,
DH10B, DH12S, C600 o XL-1 Blue), células de
levadura, células vegetales, células de tejidos (células de, por
ejemplo, C. elegans, colas de ratón, biopsias humanas) y
células huésped que contienen ácido nucleico exógeno (por ejemplo,
ADN recombinante, ADN bacteriano o ADN de forma replicativa) que se
selecciona como diana para su aislamiento a partir de ADN
cromosómico de la célula huésped y otras biomoléculas de la célula
huésped. Alternativamente, el material de partida puede ser lisados
preparados a partir de tales células.
Tal como se usa en el presente documento, una
"célula huésped" es cualquier célula dentro de la que puede
introducirse ácido nucleico exógeno, produciendo de ese modo una
célula huésped que contiene ácido nucleico exógeno, además de ácido
nucleico de la célula huésped. Tal como se usa en el presente
documento, los términos "ácido nucleico de la célula huésped"
y "ácido nucleico endógeno" hacen referencia a especies de
ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico cromosómico o genómico)
que están presentes en una célula huésped cuando se obtiene la
célula. Tal como se usa en el presente documento, el término
"exógeno" hace referencia a ácido nucleico diferente del ácido
nucleico de la célula huésped (por ejemplo, plásmido); el ácido
nucleico exógeno puede estar presente en una célula huésped como
resultado de su introducción en la célula huésped o su introducción
en un antecesor de la célula huésped. Por tanto, por ejemplo, una
especie de ácido nucleico que es exógena a una célula huésped
particular es una especie de ácido nucleico que es no endógena (no
presente en la célula huésped cuando se obtuvo o un antecesor de la
célula huésped). Las células huésped apropiadas incluyen, pero no
se limitan a, células bacterianas, células de levadura, células
vegetales y células de mamífero.
Tal como se describe en el presente documento,
una ventaja de la presente invención es que el ácido nucleico
genómico de una célula puede separarse del ácido nucleico de una
célula que tiene un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico de la célula usando un número
mínimo de etapas. Tal como se describe en el presente documento, la
separación puede realizarse en un cultivo celular directamente sin
la necesidad de aglomerar las células. Además, el método puede
realizarse en un lisado celular, en el que los métodos de la
invención hacen innecesario clarificar el lisado con el fin de
separar el ácido nucleico genómico de una célula de ácido nucleico
que tiene un peso molecular que es menor que el peso molecular del
ácido nucleico genómico.
Tal como se usa en el presente documento, un
"lisado" es una disolución que contiene células que contienen
ácido nucleico genómico y ácido nucleico que tiene un menor peso
molecular que el ácido nucleico genómico y cuyas membranas
celulares se han alterado mediante cualquier medio con el resultado
de que el contenido de la célula, incluyendo el ácido nucleico en
la misma, están en disolución. Un "lisado clarificado" es un
lisado en el que se han eliminado el ácido nucleico genómico o
cromosómico, las proteínas y las membranas de la célula tal como
mediante tratamiento químico o centrifugación del lisado. Las
células se lisan usando métodos conocidos, preparando de ese modo
una mezcla adecuada para su uso con el método de la presente
invención. Por ejemplo, las células pueden lisarse usando medios
químicos (por ejemplo, tratamiento con álcali o álcali y detergente
aniónico), choque isotónico o alteración física (por ejemplo,
homogeneización).
El término "suspensión de células huésped
lisadas", tal como se usa en el presente documento, hace
referencia a una suspensión que comprende células huésped cuyas
membranas se han alterado mediante cualquier medio (por ejemplo,
químico, tal como tratamiento con álcali o álcali y detergente
aniónico, choque isotónico o alteración física mediante
homogeneización); una suspensión de este tipo es una mezcla de
biomoléculas, componentes celulares y residuos de membranas
alteradas de las células huésped. En una realización, se prepara una
suspensión de células huésped lisadas adecuada para su uso en la
presente invención poniendo en contacto las células huésped con una
disolución de álcali y detergente aniónico (por ejemplo,
dodecilsulfato de sodio (SDS)) (por ejemplo, NaOH 0,2 N, SDS al
1%). Opcionalmente, puede incluirse lisozima en el tampón de lisis.
La presencia de un detergente aniónico en la disolución de lisis
funciona para producir un entorno antiproteico neutralizando la
carga eficaz de las proteínas, minimizando de ese modo su atracción
a las superficies de las micropartículas paramagnéticas recubiertas
con grupo funcional. En una realización, la suspensión de células
huésped lisadas no se neutraliza. Opcionalmente, puede añadirse
ARNasa al lisado de células huésped para degradar el ARN de las
células huésped, permitiendo de ese modo que el ADN se una a las
micropartículas magnéticas libre, o esencialmente libre, de ARN.
Según los métodos de la presente invención, se
combina una célula con soportes en fase sólida y un reactivo,
provocando el reactivo que los ácidos nucleicos de la célula se unan
de manera no específica y reversible a los soportes en fase
sólida.
"Unión de ácido nucleico no específica"
hace referencia a la unión de diferentes moléculas de ácido nucleico
con aproximadamente la misma afinidad a micropartículas magnéticas,
a pesar de las diferencias en el tamaño o secuencia de ácido
nucleico de las diferentes moléculas de ácido nucleico. Tal como se
usa en el presente documento, "adsorción facilitada" hace
referencia a un procedimiento mediante el cual se usa un reactivo
precipitante (por ejemplo, un polialquilenglicol) para promover la
precipitación y posterior adsorción de una especie de moléculas de
ADN, que estaba inicialmente en una mezcla, sobre la superficie de
un soporte en fase sólida. La interacción reversible resultante es
distinta de, por ejemplo, una interacción entre dos parejas de unión
(por ejemplo, estreptavidina/biotina, anticuerpo/antígeno o una
interacción específica de secuencia), que se utilizan
convencionalmente con el fin de aislar biomoléculas particulares en
base a su composición o secuencia.
Un "reactivo precipitante de ácido
nucleico" o "agente precipitante de ácido nucleico" es una
composición que provoca que el ácido nucleico de una célula se
separe de la disolución. Los agentes precipitantes adecuados
incluyen alcoholes (por ejemplo, alcoholes de cadena corta, tales
como etanol o isopropanol) y un compuesto poli-OH
(por ejemplo, polialquilenglicol). El reactivo precipitante de ácido
nucleico puede comprender uno o más de estos agentes. El reactivo
precipitante de ácido nucleico está presente en una concentración
suficiente para unir de manera no específica y reversible el ácido
nucleico de la célula sobre los soportes en fase sólida.
Las concentraciones (concentraciones finales) de
alcohol (por ejemplo, etanol, isopropanol) apropiadas para su uso
en los métodos de la presente invención son de desde aproximadamente
el 40% hasta aproximadamente el 60%; desde aproximadamente el 45%
hasta aproximadamente el 55%; y desde aproximadamente el 50% hasta
aproximadamente el 54%.
Los polialquilenglicoles apropiados incluyen
polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol. Puede obtenerse PEG
adecuado de Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis MO., peso molecular
8000, libre de ADNasa y ARNasa, número de catálogo
25322-68-3). El peso molecular del
polietilenglicol (PEG) puede oscilar desde aproximadamente 6000
hasta aproximadamente 10.000, desde aproximadamente 6000 hasta
aproximadamente 8000, desde aproximadamente 7000 hasta
aproximadamente 9000, desde aproximadamente 8000 hasta
aproximadamente 10.000. En una realización particular, se usa PEG
con un peso molecular de aproximadamente 8000. En general, la
presencia de PEG proporciona una disolución hidrófoba que hace que
las moléculas de ácido nucleico hidrófilas se separen de la
disolución. En una realización, la concentración de PEG es de desde
aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 20%. En otras
realizaciones, la concentración de PEG oscila desde aproximadamente
el 7% hasta aproximadamente el 18%; desde apro-
ximadamente el 9% hasta aproximadamente el 16%; y desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 15%.
ximadamente el 9% hasta aproximadamente el 16%; y desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 15%.
Tal como se describió anteriormente, en la
realización en la que el material de partida es una célula, el
reactivo se formula para provocar la lisis de una célula. Puede
usarse una variedad de componentes de lisis para provocar la
alteración de una membrana (tales como tratamiento con álcali,
álcali y detergente aniónico o choque isotónico). En una
realización, el componente de lisis del reactivo es una disolución
de un álcali (NaOH) y/o un detergente aniónico (por ejemplo,
dodecilsulfato de sodio (SDS)) (por ejemplo, concentración final de
NaOH 0,2 N, SDS al 1% cuando se añade a una célula). Opcionalmente,
puede incluirse lisozima en el componente de lisis del primer
reactivo. La presencia de un detergente aniónico en el componente de
lisis funciona para producir un entorno antiproteico neutralizando
la carga eficaz de las proteínas, minimizando de ese modo su
atracción a las superficies del soporte en fase sólida (por ejemplo,
una micropartícula paramagnética recubierta con grupo funcional).
Opcionalmente, puede añadirse ARNasa (por ejemplo, ARNasa 1,75
ng/\mul/ddH_{2}O) al componente de lisis para degradar el ARN
de las células huésped, permitiendo de ese modo que el ADN se una
al soporte en fase sólida libre, o esencialmente libre, de ARN. La
necesidad de incluir una etapa de ARNasa se determinará en gran
parte por el tamaño de la especie de ácido nucleico que se
selecciona como diana para su aislamiento en la precipitación de
ácido nucleico particular que está realizándose. Por ejemplo, si las
condiciones seleccionadas para el aislamiento son apropiadas para
aislar ácidos nucleicos que comprenden al menos 4.000 pares de
bases, entonces es improbable que la especie de ARN sea un
contaminante apreciable.
El reactivo usado en los métodos descritos
anteriormente es útil para aislar un ácido nucleico de una célula.
Este reactivo contiene un agente precipitante de ácido nucleico y un
soporte en fase sólida, y también pueden formularse para provocar
la lisis de una(s) célula(s). El agente precipitante
de ácido nucleico es de concentración suficiente para precipitar el
ácido nucleico de la célula. El soporte en fase sólida en este
reactivo contiene una superficie que se une a ácido nucleico de la
célula. Los componentes del reactivo pueden estar contenidos en un
único reactivo o como componentes separados. Los componentes pueden
combinarse simultánea o secuencialmente con las células. El orden
en el que se combinan los elementos de la combinación no es crítico.
La naturaleza y cantidad de los componentes contenidos en el
reactivo son tal como se describen en los métodos anteriores. El
reactivo puede formularse en una forma concentrada, de tal manera
que se requiere dilución para obtener las funciones y o
concentraciones descritas en los métodos en el presente
documento.
Opcionalmente, puede añadirse una sal al
reactivo para provocar la precipitación del ácido nucleico de la
célula sobre los soportes en fase sólida. Las sales adecuadas que
son útiles para facilitar la adsorción de moléculas de ácido
nucleico seleccionadas como dianas para su aislamiento a las
micropartículas magnéticamente sensibles incluyen cloruro de sodio
(NaCl), cloruro de litio (LiCl), cloruro de bario (BaCl_{2}), de
potasio (KCl), cloruro de calcio (CaCl_{2}), cloruro de magnesio
(MgCl_{2}) y cloruro de cesio (CsCl). En una realización, se usa
cloruro de sodio. En general, la presencia de una sal funciona para
minimizar la repulsión de las cargas negativas de las moléculas de
ácido nucleico. La amplia gama de sales adecuadas para su uso en el
método indica que también pueden usarse muchas otras sales y un
experto habitual en la técnica puede determinar empíricamente los
niveles adecuados. La concentración de sal puede ser desde
aproximadamente 0,1 M hasta aproximadamente 0,5 M; desde
aproximadamente 0,15 M hasta aproximadamente 0,4 M; y desde
aproximadamente 0,2 M hasta aproximadamente 0,4 M.
A altas concentraciones de sal (por ejemplo,
sinónimo con altas fuerzas iónicas), las micropartículas
paramagnéticas adecuadas adsorberán fragmentos de ADN de todos los
tamaños. El término "alta concentración de sal" hace referencia
a concentraciones de sal mayores de aproximadamente 0,5 M. A
"bajas concentraciones de sal" (o bajas fuerzas iónicas), que
tal como se usa en el presente documento connota concentraciones
menores de aproximadamente 0,2 M, no precipitará esencialmente nada
de ADN, de ningún tamaño, incluso en presencia de una concentración
de PEG tan elevada como del 12% (peso/volumen) (Lis, John T, Methods
in Enzymology 65:437-353 (1980). Pueden añadirse
componentes adicionales al reactivo. En una realización, se añade
ARNasa al agente precipitante de ácido nucleico.
Según los métodos de la invención, el
aislamiento de las moléculas de ácido nucleico de la célula se
consigue eliminando el soporte en fase sólida recubierto con ácido
nucleico de la combinación. El soporte en fase sólida (por ejemplo,
una micropartícula paramagnética) puede recuperarse de la primera
combinación, por ejemplo, mediante filtración a vacío,
centrifugación o aplicando un campo magnético para extraer el
soporte en fase sólida (por ejemplo, una micropartícula
paramagnética). Las micropartículas paramagnéticas se separan
preferiblemente de las disoluciones usando medios magnéticos, tal
como aplicar un campo magnético de al menos 1000 Gauss. Sin
embargo, los expertos en la técnica pueden usar otros métodos
conocidos para eliminar las micropartículas magnéticas del
sobrenadante (por ejemplo, filtración a vacío o centrifugación).
Puede eliminarse entonces la disolución restante, dejando los
soportes en fase sólida que tienen el ácido nucleico de la célula
adsorbido a su superficie. Una vez separado de la mezcla, el ácido
nucleico que tiene un menor peso molecular que el peso molecular
del ácido nucleico genómico de la célula que se adsorbe al soporte
en fase sólida puede recuperarse poniendo en contacto el soporte en
fase sólida con un tampón de elución adecuado. Como resultado, se
producen 1) una disolución que comprende las moléculas de ácido
nucleico que tienen un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico en el tampón de elución y 2)
soportes en fase sólida a los que se une el ácido nucleico genómico
de la célula.
Un "tampón de elución" adecuado para su uso
en los métodos de la presente invención es un tampón que eluye de
manera selectiva el ácido nucleico de una célula que tiene un peso
molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico
genómico de la célula. En una realización, un tampón de elución
adecuado para su uso en la presente invención puede ser agua o
cualquier disolución acuosa en la que la concentración del agente
precipitante de ácido nucleico (por ejemplo, isopropanol y/o PEG)
está por debajo de la concentración requerida para la unión del
ácido nucleico de una célula que tiene un peso molecular que es
menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico de la
célula al soporte en fase sólida, tal como se discutió
anteriormente. Por ejemplo, los tampones útiles incluyen, pero no
se limitan a, disoluciones de TRIS-HCl,
Tris-acetato, sacarosa (al 20%) y formamida (al
100%). La elución del ácido nucleico de una célula que tiene un peso
molecular que es menor que el peso molecular del ácido nucleico
genómico de la célula desde el soporte en fase sólida puede
producirse rápidamente (por ejemplo, en treinta segundos o menos)
cuando se usa un tampón de elución de baja fuerza iónica adecuado.
Una vez que se ha eluido el ADN unido, se separa del tampón de
elución el soporte en fase sólida, al que está unido el ácido
nucleico genómico de la célula.
Opcionalmente, pueden eliminarse impurezas (por
ejemplo, residuos celulares, productos químicos, metabolitos,
proteínas o componentes de las células huésped) lavando las
micropartículas paramagnéticas con ácido nucleico diana unido a las
mismas (por ejemplo, poniendo en contacto las micropartículas con
una disolución de tampón de lavado adecuada) antes de separar el
ácido nucleico unido a la micropartícula de los soportes en fase
sólida. Tal como se usa en el presente documento, un "tampón de
lavado" es una composición que disuelve o elimina las impurezas
o bien unidas directamente a la micropartícula o bien asociadas con
el ácido nucleico adsorbido, pero que no solubiliza el ácido
nucleico adsorbido sobre la fase sólida. El pH y la concentración y
composición de solutos del tampón de lavado puede variarse según
los tipos de impurezas que se espera que estén presentes. Por
ejemplo, etanol (por ejemplo, al 70%) ejemplifica un tampón de
lavado preferido útil para eliminar PEG y la sal en exceso. Las
micropartículas magnéticas con ácido nucleico unido también pueden
lavarse con más de una disolución de tampón de lavado. Las
micropartículas pueden lavarse con la frecuencia que se requiera
(por ejemplo, de tres a cinco veces) para eliminar las impurezas
deseadas. Sin embargo, se limita preferiblemente el número de
lavados con el fin de minimizar la pérdida de rendimiento del ácido
nucleico unido. Una disolución de tampón de lavado adecuada tiene
varias características. En primer lugar, la disolución de tampón de
lavado debe tener una concentración de sal suficientemente alta
(una fuerza iónica suficientemente alta) para que el ácido nucleico
unido a las micropartículas magnéticas no se elimine por elución de
las micropartículas, sino que permanezca unido a las
micropartículas. Una concentración de sal adecuada es mayor de
aproximadamente 0,1 M y es de manera preferible de aproximadamente
0,5 M. En segundo lugar, se elige la disolución de tampón de manera
que se disuelvan las impurezas que se unen al ácido nucleico o las
micropartículas. Pueden variarse el pH y la concentración y
composición de solutos de la disolución tampón según los tipos de
impurezas que se espera que estén presentes. Las disoluciones de
lavado adecuadas incluyen las siguientes: SSC 0,5 x 5; sulfato de
amonio 100 mM, Tris 400 mM pH 9, MgCl_{2} 25 mM y albúmina sérica
bovina (BSA) al 1%; y NaCl 0,5 M. En una realización, la disolución
de tampón de lavado comprende Tris-acetato 25 mM (pH
7,8), acetato de potasio (KOAc) 100 mM, acetato de magnesio
(Mg_{2}OAc) 10 mM y ditiotreitol (DDT) 1 mM. En otra realización,
la disolución de lavado comprende SDS al 2%, Tween al 10% y/o Triton
al 10%.
El aislamiento de preparaciones de ácido
nucleico de alta calidad a partir de disoluciones de partida de
complejidad y composición diversas es una técnica fundamental en
biología molecular. Por tanto, como resultado del trabajo descrito
en el presente documento, están ahora disponibles métodos fácilmente
automatizables y novedosos de separación de moléculas de ácido
nucleico que tienen un peso molecular que es menor que el peso
molecular del ácido nucleico genómico. En una realización, se añade
el reactivo a la célula mediante un dispositivo de transferencia de
muestras múltiples. En otra realización, se añade el primer reactivo
simultáneamente a una pluralidad de muestras, por ejemplo, al menos
6, 12, 24, 96, 384 ó 1536 muestras, conteniendo cada muestra una o
más células. En otra realización, el primer reactivo se suministra
secuencialmente a una pluralidad de muestras (por ejemplo, al menos
6, 12, 24, 96, 384 ó 1536 muestras) conteniendo cada muestra una o
más células. La invención incluye métodos de análisis de una
pluralidad de muestras de ácido nucleico. Los métodos incluyen
proporcionar una pluralidad de muestras de ácido nucleico aisladas
mediante un método descrito en el presente documento y analizar las
muestras, por ejemplo, realizar análisis de secuencias en las
muestras.
En otra realización, el ácido nucleico aislado
de una o una pluralidad de muestras se somete a análisis adicional
(por ejemplo, análisis de secuencias). Los ácidos nucleicos aislados
mediante los métodos dados a conocer pueden usarse para las
aplicaciones de biología molecular que requieren ácidos nucleicos de
alta calidad, por ejemplo, la preparación de moldes de
secuenciación de ADN, la microinyección, transfección o
transformación de células de mamífero, la síntesis in vitro
de sondas de ARN, la clonación con transcripción inversa, la
construcción de bibliotecas de ADNc, la amplificación por PCR o la
investigación en terapia génica, así como para otras aplicaciones
con requisitos de calidad menos rigurosos incluyendo, pero sin
limitarse a, transformación, análisis de micromatriz o endonucleasa
de restricción, precipitaciones de ARN selectivas, transposición
in vitro, separación de productos de amplificación por PCR
múltiplex, ARNip in vitro, horquillas de ARNi, preparación
de cebadores y sondas de ADN y protocolos de eliminación de
moldes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Una realización de un protocolo para la
separación de ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que
el ácido nucleico genómico en una célula.
El siguiente protocolo se ilustra en la figura
1.
- 1.
- Pipetear 200 \mul de medios de crecimiento bacteriano 2xYT que contienen el antibiótico apropiado dentro de cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos Costar de 300 \mul (n.º de cat. 3750).
- 2.
- Inocular cada pocillo con una colonia bacteriana de E. coli (DH10B, DH5alpha: Invitrogen) que contiene un único plásmido. Pueden inocularse directamente los cultivos de crecimiento desde siembras en césped de agar o desde disoluciones madre de gliceral.
- 3.
- Cubrir la placa con un sello poroso y agitar vigorosamente (por ejemplo, 300 rpm) a 37ºC durante 16 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Añadir 60 \mul de disolución de tampón de lisis paramagnético (NaOH 0,4 N, SDS al 2%, micropartículas magnéticas con COOH Agencourt sólidas al 0,0016%) a cada pocillo de la placa fuente y agitar o mezclar con la punta.
- 2.
- Añadir 60 \mul de disolución de lavado A (isopropanol al 100%) a las muestras. Realizar 15 mezclas con la punta una vez que se ha añadido la disolución de lavado A. Las condiciones de mezclado con la punta pueden variar dependiendo del orificio de la punta.
- 3.
- Colocar la placa fuente sobre un SPRIplate96-R(TM) magnético (n.º cat. Agencourt Biosciences) durante 5 minutos para separar las perlas de la disolución.
- 4.
- Aspirar y descartar la disolución clarificada de la placa destino mientras está situada en un SPRIplate96-R(TM) (imanes en forma de anillo).
- 5.
- Dispensar 200 \mul de la disolución de lavado B (etanol al 70%) a cada pocillo de la placa destino como una disolución de lavado.
- 6.
- Eliminar la disolución de lavado de etanol y repetir la etapa cuatro veces.
- 7.
- Secar la placa destino a 37ºC durante 30 minutos.
- 8.
- Añadir 40 \mul del tampón de elución (ddH_{2}O + ARNasa A 1,75 ng/\mul) a cada pocillo de la placa y agitar. El agua de calidad para reactivo es el tampón de elución recomendado. Agitar con vórtex o agitar la placa tras añadir el tampón de elución o esperar 10 minutos para que se produzca la elución.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la reacción de 1/24ª de BigDye añadir:
- 60 \mul de ADN purificado
- 1 \mul de cóctel BigDye
- Cóctel BigDye
- 5 partes de terminador BigDye
- 1 parte de 200 \mum de cebador M13-21
- 4 partes de tampón 15 x BigDye
- Secuencia del ciclo
- 95ºC durante 2 minutos
- 50 ciclos de (54ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 2,5 minutos, 95ºC durante 5 segundos)
- 4ºC hasta la limpieza
\vskip1.000000\baselineskip
Purificar las reacciones de secuenciación usando
cualquier precipitación con EtOH convencional del kit CleanSeq de
Agencourt (n.º de cat. 000121 y 000222).
Eluir el producto de la precipitación de
CleanSeq en 30 \mul de ddH_{2}O y colocar en un aparato ABI 3700
ó 3730 para la detección de secuenciación.
Más de 11.000 secuencias de lecturas, usando
polímero POP5 en el aparato ABI 3700, produjeron tasas de pase del
90% (la lectura de pase debe promediar phred 20 desde
100-300 pb), y 625 bases de Phred20.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se fragmentó ADN genómico de chimpancé, se
reparó en los extremos con polimerasa T4 y Klenow (NEB) y se clonó
en el vector bacteriano pOT. Se sometieron a electroporación células
DH10B (Invitrogen) y se sembraron en placa en agar con
cloranfenicol 25 \mug/ml y se hicieron crecer durante la noche. Se
recogieron las colonias con un aparato Gentix Qpix dentro de 200
\mul de 2XYT, caldo de cloranfenicol 50 \mug/ml y se hicieron
crecer durante 16 horas. Se purificaron los clones en la placa de
crecimiento en una plataforma robótica FX de Beckman.
\vskip1.000000\baselineskip
Comparación del método descrito en el presente
documento (OneStep Prep) con el método descrito en la patente
estadounidense n.º 6.534.262 (McPrep). Se purificaron 24 muestras
usando dos métodos de purificación diferentes; McPrep y el método
de purificación de una sola etapa descrito en el presente documento.
Se cargaron muestras controladas en un gel de agarosa para comparar
la recuperación (figura 2). Se añadieron 60 \mul de tampón de
lisis paramagnético (NaOH 0,4 N, SDS al 2%, perlas paramagnéticas
con COOH de Seradyn 160 mg/litro) además de 60 \mul de
isopropanol al 100% (o 100 \mul de PEG al 40%) al cultivo celular
y se mezcló con la punta 15 veces. Se separaron las muestras
durante 6 minutos en una placa con imanes de Agencourt (1000 gauss).
Se eliminó el sobrenadante y se enjuagaron las perlas separadas 5
veces con etanol al 70%. Tras la elución con ARNasa A 1,75
ng/\mul/ddH_{2}O (Sigma), se ejecutaron las muestras en un
E-gel 96 (Invitrogen) para estimar al recuperación
de ADN relativa (figura 2). También se ejecutó el análisis Pico
Green (Molecular Probes) en las muestras y la recuperación de ADN
promedio fue de 20 ng/\mul. Se registró la conductividad promedio
de las muestras para estimar cualquier contaminación con sales del
caldo de crecimiento reuniendo los 40 \mul de eluyente de 10
pocillos. La conductividad era inferior a 20 \mus/cm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eluyeron las muestras en 40 \mul de ARNasa
1,75 ng/\mul/ddH_{2}O y se agitaron mediante robot durante 20
ciclos de 5 cm a 2 Hz. Se aspiraron 3 \mul de ADN y se colocaron
en 0,5 \mul de reactivo (1/3X BigDye) más 3 pmol de cebador -21.
Se cubrieron las reacciones con aceite mineral y se secuenciaron en
ciclos en una placa de 384 pocillos. Se secuenciaron en ciclos las
muestras según las recomendaciones de los fabricantes. Se
purificaron las reacciones de secuenciación con el kit CleanSeq de
Agencourt y se eluyeron en 15 \mul de ddH_{2}O y se
termosellaron antes de cargarse en el aparato ABI 3700.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron datos de secuenciación de ADN
usando la plataforma de secuenciación ABI 3700 y la química de
secuenciación de 1/48ªX BigDye V3.1 y el polímero POP5. Se realizó
la electroforesis a 58800 V con una inyección de 30 segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron 12672 lecturas de secuenciación a
partir de 6336 muestras purificadas (tabla 1). Las altas tasas de
pase, la alta intensidad de señal y el alto promedio de pares de
bases de Phred 20 (Ewing et al., Genome Research,
8:175-185 (1998)) obtenidos son excepcionales para
la química de secuenciación de BigDye diluido 48 veces. Un
histograma del rendimiento de las lecturas se representa en la
figura 3.
La figura 2 muestra un gel de agarosa de 96
pocillos con 13 columnas por 8 filas. La 13ª columna es el vector
de 3,2 kb pGEM de 200 ng (Promega). El electrodo positivo está en la
parte inferior de la imagen. Se eluyen las muestras Prep en 40
\mul de diversos tampones de elución y se cargan 10 \mul en el
gel. Puede observarse un plásmido de 3-5 kb en los
geles sin signo de ADN genómico de E. coli que permanecen en
los pocillos de agarosa. Puede observarse ARN en los pocillos que
no se eluyeron en ARNasa 1,75 ng/\mul (fila F).
\vskip1.000000\baselineskip
Puede observarse que se recupera más ADN de
plásmido usando el método de una sola etapa frente a usar el método
McPrep (fila A frente a fila B y fila C frente a fila D). Se espera
esto puesto que el método McPrep requiere que el ADN genómico de
E. coli se una a un conjunto de perlas y se retire el
sobrenadante enriquecido con plásmidos a otra placa para unirse a
una segunda mezcla. Esta etapa de eliminación del sobrenadante hace
difícil aspirar el 100% del sobrenadante con plásmidos sin alterar
las perlas magnéticas con ADN genómico, de manera que se espera una
pérdida de ADN.
- Fila A:
- 10 \mul/40 \mul de McPrep
- Fila B:
- 10 \mul/40 \mul de OneStep Prep
- Fila C:
- 10 \mul/40 \mul de McPrep
- Fila D:
- 10 \mul/40 \mul de OneStep Prep
- Fila E y F:
- 10 \mul/40 \mul de OneStep Prep con y sin ARNasa
- Fila G:
- 10 \mul/40 \mul de McPrep con ARNasa
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron 3 \mul de ADN de plásmido eluido
para la secuenciación de BigDye. Se determinó la calidad de lectura
del electroferograma ejecutando Phred (Ewing et al., Genome
Research, 8:175-185 (1998)). Las bases de Phred 30
tienen una tasa de error de 1 en 1000, las bases de Phred 40 tienen
una tasa de error de 1 en 10.000. El recuento del número de bases
de phred 20 que produce cada lectura es una métrica de calidad de
secuenciación convencional (tabla).
\vskip1.000000\baselineskip
La tasa de pase se define como el número de
lecturas que cumplen el criterio de PASE/lecturas totales.
P30 = Número promedio de Phred 30 por placa de
384 pocillos
P20 = Número promedio de Phred 20 por placa de
384 pocillos
CP20 = Número promedio de Phred 20 contiguas por
placa de 384 pocillos
P15 = Número promedio de Phred 15 por placa de
384 pocillos
Qual = Puntuaciones de Phred promedio durante la
lectura completa: un promedio por toda la placa de 384 pocillos
Criterio de PASE - una lectura debe promediar la
calidad Phred20 en una ventana de 200 pb desde 100 pb hasta 300
pb
SigA = Unidades fluorescentes relativas promedio
en el canal A para las 96 lecturas
SigG = Unidades fluorescentes relativas promedio
en el canal G para las 96 lecturas
SigC = Unidades fluorescentes relativas promedio
en el canal C para las 96 lecturas.
SigT = Unidades fluorescentes relativas promedio
en el canal T para las 96 lecturas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La figura 3 es un histograma de las bases de
Phred 20 (rojo) y Phred 30 (negro) generadas por las lecturas. El
eje Y es el número de las lecturas, el eje X son los depósitos de
phred 20 en incrementos de 50 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se obtuvo sangre completa de caballo en una
razón 1:1 con el anticoagulante de Alsever (dextrosa al 2,05%,
citrato de sodio al 0,5%, ácido cítrico al 0,055%, cloruro de sodio
al 0,42%).
Se añaden 60 \mul de tampón de lisis
paramagnético (NaOH 0,4 N, SDS al 2%, perlas paramagnéticas con COOH
de Seradyn 160 mg/litro) además de 80 \mul de isopropanol al 100%
al cultivo celular y se mezcla con la punta 15 veces. Se separaron
las muestras durante 15 minutos en una placa con imanes de Agencourt
(1000 gauss). Se eliminó el sobrenadante y se enjuagaron las perlas
separadas 5 veces con etanol al 70%. Tras la elución con ddH_{2}O
(Sigma), se ejecutaron las muestras en un E-gel 96
(Invitrogen) para estimar la recuperación de ADN relativa (figura
4). También se ejecutó el análisis Pico Green (Molecular Probes) en
las muestras y la recuperación de ADN promedio es de 0,5 ng/\mul
(figura 5). Se verificó la calidad del ADN en su aplicabilidad a la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una aplicación en el
sentido de 3' común (figura 6).
La figura 4 muestra duplicados de ADNg
preparados a partir de 50 \mul de sangre de caballo. La figura 5
muestra el análisis PicoGreen de 8 muestras de ADNg preparado. La
figura 6 muestra una PCR en gradiente del ADNg preparado anterior
(usando marcadores Y3B19 con un tamaño de amplicón esperado de 225
pb).
Aunque se ha mostrado y descrito particularmente
esta invención con referencia a las realizaciones preferidas de la
misma, los expertos en la técnica entenderán que pueden realizarse
diversos cambios en la forma y los detalles en la misma sin
apartarse del alcance de la invención abarcada por las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (15)
1. Método de separación del ácido nucleico
genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular
que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en
la célula que comprende:
- a)
- combinar
- i)
- soportes en fase sólida cuyas superficies tienen unidas a las mismas un grupo funcional que se une de manera reversible a ácido nucleico,
- ii)
- una célula y
- iii)
- un reactivo, en el que el reactivo comprende un componente de lisis que provoca la lisis de la célula y un agente de precipitación de ácido nucleico que provoca la precipitación del ácido nucleico de la célula sobre los soportes en fase sólida;
- \quad
- produciendo de ese modo una combinación;
- b)
- mantener la combinación en condiciones en las que se produce la lisis de la célula y el ácido nucleico de la célula se une de manera reversible a los soportes en fase sólida, produciendo de eso modo soportes en fase sólida que tienen ácido nucleico de la célula unido a los mismos;
- c)
- separar los soportes en fase sólida de la combinación;
- d)
- poner en contacto los soportes en fase sólida con un tampón de elución que provoca la elución del ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido nucleico genómico desde los soportes en fase sólida,
separando de ese modo el ácido nucleico genómico
de la célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es
menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método de separación del ácido nucleico
genómico de una célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular
que es menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en
la célula que comprende:
- a)
- combinar
- i)
- soportes en fase sólida cuyas superficies tienen unidas a las mismas un grupo funcional que se une de manera reversible a ácido nucleico,
- ii)
- un lisado celular y
- iii)
- un reactivo, en el que el reactivo comprende un agente de precipitación de ácido nucleico que provoca la precipitación del ácido nucleico del lisado celular sobre los soportes en fase sólida;
- \quad
- produciendo de ese modo una combinación;
- b)
- mantener la combinación en condiciones en las que el ácido nucleico del lisado celular se une de manera reversible a los soportes en fase sólida, produciendo de eso modo soportes en fase sólida que tienen ácido nucleico de la célula unido a los mismos;
- c)
- separar los soportes en fase sólida de la combinación;
- d)
- poner en contacto los soportes en fase sólida con un tampón de elución que provoca la elución del ácido nucleico que tiene un menor peso molecular que el ácido nucleico genómico desde los soportes en fase sólida,
separando de ese modo el ácido nucleico genómico
de la célula de ácido nucleico que tiene un peso molecular que es
menor que el peso molecular del ácido nucleico genómico en la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el ácido nucleico que tiene un menor
peso molecular se selecciona del grupo que consiste en: ácido
nucleico de plásmido, ácido nucleico episómico, ácido nucleico
mitocondrial, ácido nucleico de orgánulo y ácido nucleico viral.
4. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que los soportes en fase sólida comprenden
micropartículas paramagnéticas.
5. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el ácido nucleico que tiene un menor
peso molecular es ácido nucleico de plásmido y los soportes en fase
sólida comprenden micropartículas paramagnéticas.
6. Método según la reivindicación 4 o la
reivindicación 5, en el que las micropartículas paramagnéticas
tienen una superficie recubierta en el que la superficie recubierta
se selecciona del grupo que consiste en: una superficie recubierta
con grupo carboxilo, una superficie recubierta con grupo amina y una
superficie recubierta con grupo carboxilo encapsulado.
7. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el reactivo comprende un alcohol.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
el alcohol se selecciona del grupo que consiste en: etanol,
isopropanol y polialquilenglicol.
9. Método según la reivindicación 7, en el que
el reactivo comprende además una sal.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
la sal se selecciona del grupo que consiste en: NaCl, LiCl y
MgCl_{2}.
11. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el tampón de elución comprende agua.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el tampón de elución comprende ARNasa.
13. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que los soportes en fase sólida se separan
de la combinación usando un método seleccionado del grupo que
consiste en: aplicar un campo magnético, aplicar filtración a vacío
y aplicar centrifugación.
14. Método según la reivindicación 2, en el que
la célula se selecciona del grupo que consiste en: una célula
bacteriana, una célula que contiene ácido nucleico viral y una
célula de mamífero.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
la célula de mamífero es una célula de sangre completa.
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