DE60010500T2

DE60010500T2 - Verbundnanopartikel sowie deren konjugate mit biomolekülen

Info

Publication number: DE60010500T2
Application number: DE60010500T
Authority: DE
Inventors: Abdelhamid Elaissari; Eric Bosc; Christian Pichot; Bernard Mandrand; Jerôme BIBETTE; Olivier Mondain-Monval
Original assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Biomerieux SA; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-11-05
Filing date: 2000-11-06
Publication date: 2005-05-12
Anticipated expiration: 2020-11-07
Also published as: DE60010500D1; US6866838B1; FR2800635A1; ATE266201T1; JP4980532B2; JP2012017332A; JP2003513093A; ES2220560T3; FR2800635B1; CA2390077A1; AU1288201A; WO2001033223A1; EP1226438B1; EP1226438A1; US20050137334A1; US7001589B2

Description

Die Mikroverkapselung ist ein Verfahren, das zur Herstellung von kleinen Feststoffpartikeln verwendet wird, die mit zumindest einer Polymerschicht umhüllt sind. Diese Verfahren werden insbesondere zur Herstellung von anorganischen Pulvern verwendet, die mit einer organischen Polymerschicht umhüllt sind. Von solchen Systemen wird angenommen, dass sie Eigenschaften, insbesondere bessere mechanische Eigenschaften, aufweisen, die sich von der Summe der Eigenschaften der einzelnen Bestandteile unterscheiden. Die Verfahren der Mikroverkapselung werden insbesondere auf dem Gebiet der Herstellung von Pigmenten, Tinten, Kunststoffen und Farben verwendet. Eine der wichtigsten Anwendungen von verkapselten Partikeln in Pigmenten findet sich auf dem Gebiet der Emulsionsfarben. Wenn aber die durch Verkapselung hergestellten anorganischen Partikel magnetisierbar sind, öffnet dies spezielle Wege auf dem Gebiet der Biologie, z.B. durch Koppeln von Proteinen oder Antikörpern an die verkapselten Partikel für eine Verwendung in diagnostischen Assays. Solche Partikel werden außerdem in biochemischen Trennverfahren verwendet. Allgemein gesprochen sind verkapselte Partikel interessant als Träger, Vektor oder Vehikel auf den Gebieten der Bioverfahrenstechnik, der Diagnostik und der Pharmazie. Zu diesem Zweck werden sie wie in der medizinischen Diagnostik als feste Träger für biologische Makromoleküle verwendet.
Kolloidale Partikel weisen im Vergleich mit herkömmlichen festen Trägern wie Röhren und Platten etliche Vorteile auf, insbesondere da sie es ermöglichen, eine große Oberfläche für spezifische Wechselwirkungen bereitzustellen und da sie einfach chemisch modifizierbar sind, um an ihrer Oberfläche funktionelle Gruppen einzuführen, die dazu neigen, mit anderen Molekülen, z.B. biologischen Molekülen wie Antikörpern oder Fragmenten von Antikörpern, Proteinen, Polypeptiden, Polynukleotiden, Nukleinsäuren, Fragmenten von Nukleinsäuren, Enzymen oder chemischen Molekülen wie Katalysatoren, Arzneimitteln, Käfigmolekülen, Chelatbildner, zu reagieren.
Unter den kolloidalen Partikeln haben die magnetischen Latexteilchen ein großes Interesse auf dem Gebiet der Analytik hervorgerufen und werden z.B. als ein Mittel zum Trennen und/oder Detektieren von Analyten wie Antigenen, Antikörpern, biochemischen Molekülen, Nukleinsäuren und Anderen verwendet.
Die Verbundstoffpartikel vom Typ magnetisches Polymer werden im Allgemeinen unter dem Gesichtspunkt der Größe in drei Kategorien eingeteilt: kleine Partikel mit einem Durchmesser kleiner als 50 nm, große Partikel mit einem Durchmesser größer als 2 μm und mittlere Partikel mit einem Durchmesser von 50 bis 1000 nm.
Damit sie aber als gute Kandidaten insbesondere für eine diagnostische Anwendung in Betracht gezogen werden können, müssen sie gewisse Kriterien erfüllen. Unter dem Gesichtspunkt der Morphologie ist es bevorzugt, dass sie relativ kugelförmig sind und dass die magnetische Ladung auf relativ homogene Weise in der Polymermatrix verteilt ist. Sie dürfen sich nicht auf irreversible Weise unter dem Einfluss eines Magnetfelds aneinander anlagern, was bedeutet, dass sie einfach, schnell und auf reversible Weise redispergiert werden können. Desgleichen müssen sie eine relativ niedrige Dichte aufweisen, um das Phänomen der Sedimentation zu verringern. Vorteilhafterweise sollen sie eine enge Korngrößenverteilung aufweisen. Man spricht auch von monodispersen oder isodispersen Partikeln.
Die großen magnetischen Partikel haben daher aufgrund ihrer Größe und Dichte in Suspension in einer flüssigen Phase die Tendenz, sich schnell abzusetzen. Außerdem neigen sie dazu, nachdem sie einem Magnetfeld ausgesetzt wurden, sich aneinander anzulagern, da sie dazu neigen, aufgrund dieser Tatsache auf permanente Weise magnetisiert zu werden. Man spricht hier von remanenter Magnetisierung. Sie stellen also keine guten Kandidaten dar.
Im Gegensatz dazu weisen die kleinen magnetischen Partikel aufgrund ihrer Brown'schen Bewegung die Tendenz auf, in Suspension zu verbleiben und sind schwierig, sogar überhaupt durch einen Magnet angezogen zu werden, insbesondere wenn das angelegte Magnetfeld relativ schwach ist. Sie sind daher nicht für die zuvor genannten Verwendungen geeignet.
Es besteht also ein offensichtliches Interesse daran, Verbundstoffpartikel vom Typ magnetisches Polymer herzustellen, die eine mittlere Größe von 50 bis 1000 nm aufweisen, und die zugleich die zuvor genannten Nachteile beheben und insbesondere den hier zuvor dargelegten Kriterien entsprechen. Die Erfindung ist aber, wie das nachstehend beschrieben wird, nicht auf magnetisierbare Verbundstoffpartikel beschränkt.
Man kann die Dynal-Partikel (kommerzieller Name) erwähnen. Diese Partikel sind Mikrosphären, die einen porösen Kern aus Polystyrol und Eisenoxid aufweisen, wobei die Eisenoxide durch Imprägnierung im Bereich der an der Oberfläche des Polystyrols verfügbaren Poren abgelagert wurden und die ferner eine Hülle aus einem anderen Polymer aufweisen, die die Eisenoxide der porösen Mikrosphären verkapseln. Sie weisen einen Durchmesser von 2,8 μm (Partikel M280) bzw. von 4,5 μm (Partikel M450) auf und sind in ihrer Größe relativ gleichförmig. Sie werden also als isodisperse Partikel angesehen, weisen aber aufgrund ihrer großen Größe die zuvor genannten Nachteile auf, hauptsächlich das Phänomen der Sedimentation. Weiterhin ist ihre spezifische Oberfläche gering.
Die Patentanmeldung EP 0 390 634 beschreibt magnetisierbare Verbundstoffmikrosphären aus einem hydrophoben vernetzten vinylaromatischen Polymer mit einem Durchmesser im Bereich von 50 bis 10000 nm, die einen festen Kern, der aus magnetisierbaren Partikeln gebildet wird und eine Hülle aufweisen, die durch ein hydrophobes Copolymer gebildet wird, das aus zumindest einem hydrophoben vinylaromatischen Monomer und zumindest einem in dem oder den vinylaromatischen Monomeren löslichen, ungesättigten emulgierenden polyethylenischen Monomer entstanden ist und dass dazu neigt, sich mit dem oder den Monomeren zu vernetzen. Obgleich sie der Anforderung an die Größe entsprechen können, weisen sie den Nachteil auf, dass sie keine gleichförmige Verteilung der magnetischen Ladung aufweisen, die im Inneren des Kerns lokalisiert ist. Außerdem, und wie dieses aus den diesem Patent anhängenden Figuren deutlich wird, sind diese Partikel in der Größe nicht homogen. Es handelt sich also um eine Gesamtheit an polydispersen Partikeln, die fraktioniert werden müssen, um nur die Partikel mit der gewünschten Größe zurückzubehalten. Schließlich entspricht aufgrund der Tatsache, dass die magnetisierbaren Partikel im Inneren des festen Kerns auf zufällige und starre Weise in ihrer Orientierung angeordnet sind, das resultierende magnetische Moment der Verbundstoffmikrosphären dem der algebraischen Summe der Momente der magnetisierbaren Partikel, mit der Folge einer Verminderung des resultierenden Moments, die mit dieser zufälligen Verteilung der Partikel im Inneren des festen Kerns in Zusammenhang steht.
Wie nachstehend ersichtlich, ist eine der Eigenschaften der Verbundstoffnanosphären der Erfindung, dass, wenn sie magnetisiert sind, die dispergierten Nanopartikel im Inneren des im Wesentlichen flüssigen Kerns ausreichend beweglich sind, dass ihr resultierendes magnetisches Moment eine Abtrennung unter Einwirkung selbst eines schwachen Magnetfelds erleichtert, was einen unbestreitbaren Vorteil im Vergleich mit magnetischen Partikeln mit festem Kern von dem Typ darstellt, wie er in der Patentanmeldung EP 0 390 634 beschrieben ist. Es ist besonders vorteilhaft, wenn der Gehalt an magnetischen Nanopartikeln gering ist.
Die Erfindung betrifft somit neue verkapselte Verbundstoffnanosphären, die die zuvor genannten Nachteile überwinden.
Die verkapselten Verbundstoffnanosphären der Erfindung weisen im Bereich ihres Kerns eine Beladung mit anorganischen Materials auf, das gleichförmig im Inneren des Kerns verteilt ist, sie sind isodispers in der Größe und sind dazu geeignet, in Bereichen verwendet zu werden, die so unterschiedlich sind wie die Biologie, insbesondere für die Diagnostik, die Herstellung von Farben, Tinten oder Anderes.
Die Verbundstoffnanosphären der Erfindung weisen einen Durchmesser von etwa 50 bis etwa 1000 nm ± 5 %, vorzugsweise von etwa 100 bis etwa 500 nm ± 5 % und vorteilhafterweise von 100 bis 200 nm ± 5 % auf und weisen Folgendes auf, nämlich

– einen im Wesentlichen flüssigen Kern, der aus einer organischen Phase und aus anorganischen Nanopartikeln gebildet ist, die auf homogene Weise in der organischen Phase verteilt sind, und
– eine Hülle, die aus zumindest einem hydrophilen Polymer gebildet ist, das aus der Polymerisation von zumindest einem wasserlöslichen Monomer insbesondere einem N-Alkylacrylamid, einem N,N-Dialkylacrylamid und ganz besonders aus N-Isopropylacrylamid (NIPAM), N-Methylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N,N-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N-Isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-Propylacrylamid entstanden ist.

Plusminus 5 % bedeutet, dass der durchschnittliche Volumendurchmesser als bei etwa plusminus 5 % definiert ist. Die Größe wird durch Lichtstreuung gemessen.
Der im Wesentlichen flüssige Kern weist Folgendes auf, nämlich

– (i) einen aliphatischen oder cyclischen Kohlenwasserstoff, ausgewählt aus den Verbindungen, die 5 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen, deren Isomeren und deren Mischungen. Vorzugsweise ist der Kohlenwasserstoff ausgewählt aus Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan, Decan, Undecan und Dodecan, wobei selbstverständlich ist, dass der Fachmann weiß, die Bedingungen der Polymerisation des Verfahrens zur Herstellung in Abhängigkeit von der Auswahl des oder der enthaltenen Kohlenwasserstoff(s) anzupassen. Insbesondere wenn die Polymerisation durch ein Erhöhen der Temperatur bewirkt wird, muss der Reaktionsaufbau an flüchtige Kohlenwasserstoffe wie Pentan und an die Art des ausgewählten Polymerisationsstarters angepasst werden,
– (ii) anorganische Nanopartikel, ausgewählt aus den metallischen Oxiden von Eisen, Titan, Cobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Nickel; Magnetit; Hämatit; den Ferriten wie den Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink; den Legierungen von Cobalt, Nickel; den Zeolithen; Talk; den Tonen wie Bentonit und Kaolin; Aluminiumoxid; Siliciumdioxid; Graphit; Ruß oder anderen anorganischen Materialien. Vorzugsweise sind die anorganischen Materialien ausgewählt aus den metallischen Oxiden von Eisen, Titan, Cobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Nickel; Magnetit; Hämatit; den Ferriten wie den Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink; den Legierungen von Cobalt, Nickel.

Der Kern wie zuvor definiert kann ferner einen Marker wie einen Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder radioaktiven Marker aufweisen, wobei es so ist, dass der Marker bei der Herstellung der Emulsion, wie in dem folgenden Beispiel 1 beschrieben, eingeführt wird.
Die anorganischen Nanopartikel machen 5 bis 95 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 90 Gew.-%, noch bevorzugter 20 bis 80 Gew.-% und vorteilhafterweise 50 bis 80 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Verbundstoffnanosphären aus.
In einer Ausführungsform der Erfindung weist die Hülle ein hydrophiles Polymer, wie zuvor definiert, auf, das eine äußere Schicht der Hülle bildet, und ferner ein hydrophobes Polymer auf, das eine innere Schicht der Hülle bildet, die an der Grenzfläche zwischen der äußeren Schicht der Hülle und dem im Wesentlichen flüssigen Kern angeordnet ist.
Das hydrophobe Polymer ist ausgewählt aus den wasserunlöslichen vinylaromatischen Monomeren, wie Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, tert-Butylstyrol, Vinyltoluol wie auch den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Comonomeren wie den Alkylacrylaten und den Alkylmethacrylaten, in denen die Alkylgruppe 3 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, den Estern von Ethylensäuren, die 4 oder 5 Kohlenstoffatome aufweisen und von Alkylen, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome aufweisen, den Methacrylsäuren, den Styrolderivaten, den Dienverbindungen.
Die Verbundstoffnanosphären der Erfindung finden insbesondere Anwendung auf den Gebieten der Farben, der Tinten, der Kunststoffe und, wenn sie funktionalisiert sind, auf den verschiedenen Gebieten der Biologie, insbesondere zur Trennung von biologischen oder biochemischen Molekülen, für diagnostische Assays, zur Herstellung von therapeutischen, prophylaktischen oder kosmetischen Zusammensetzungen.
In einer Ausführungsform der Erfindung weisen die Verbundstoffnanosphären außerdem an der Oberfläche der Hülle funktionelle Gruppen auf, die dazu neigen, mit Molekülen, z.B. biologischen Molekülen, wechselzuwirken, wobei die funktionellen Gruppen wie folgt angebracht werden, nämlich (i) entweder durch Behandeln der Oberfläche der Hülle, z.B. auf chemische Weise wie durch Hydrolyse oder Aufpfropfen von funktionellen Gruppen, (ii) oder durch Zugabe von zumindest einem funktionellen Monomer wie Methacrylsäure, Acrylsäure, Etaconsäure, Aminoethylmethacrylat, Aminopropylmethacrylamid, (iii) oder durch Zugabe eines funktionellen Starters wie Dimethyl-2,2'-azobis(2-methylpropionat), 4,4'-Azobis(4-cyanovaleriansäure) und 2,2'-Azobis(2-cyanopropanol). Die so funktionalisierten Verbundstoffnanosphären können zur Konzentration von Nukleinsäuren nach dem Protokoll, das in der Patentanmeldung EP 0 842 184 beschrieben ist oder zur Konzentration von Proteinen gemäß dem Protokoll, das in der Patentanmeldung WO 99/35500 beschrieben ist, verwendet werden.
Die Verbundstoffnanosphären der Erfindung können also funktionalisiert werden und an der Oberfläche der Hülle reaktive funktionelle Gruppen wie Carboxylgruppen, Amingruppen, Thiolgruppen, Hydroxylgruppen, Tosylgruppen, Hydrazingruppen aufweisen, die dazu neigen, mit zumindest einem Liganden zu reagieren.
Die so gebildeten funktionalisierten Nanosphären neigen dazu, einen Liganden zu mobilisieren, z.B. ein biologisches Molekül wie einen Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers, ein Protein, ein Polypeptid, ein Enzym, ein Polynukleotid, eine Sonde, einen Starter, ein Fragment einer Nukleinsäure; chemi sche Moleküle wie chemische Polymere, medikamentöse Sustanzen, Käfigmoleküle, chelierende Mittel, Katalysatoren, Biotin.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Konjugate, die aus den Verbundstoffnanosphären der Erfindung entstanden sind, die mit zumindest einem Liganden wie zuvor definiert gekoppelt sind und deren Verwendung.
Zum Beispiel werden diese Konjugate in immunologischen Tests zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von Proteinen, Antigenen, Antikörpern in einer biologischen Probe oder in Assays verwendet, die die Technologie der Sonden zur Detektion und/oder zur Quantifizierung einer Nukleinsäure oder eines Fragments einer Nukleinsäure in einer biologischen Probe verwenden. Die Verwendung von Sonden zur Detektion und/oder Quantifizierung einer Nukleinsäure in einer Probe ist dem Fachmann wohlbekannt und man kann als erläuterndes Beispiel die Sandwichhybridisierungstechnik nennen. Die Konjugate der Erfindung können gleichermaßen als "Trägermittel von Startern" für eine Amplifikationsreaktion von Nukleinsäuren in einer Probe, z.B. durch PCR (Polymerized Chain Reaction) oder allen anderen geeigneten Amplifikationstechniken, verwendet werden und ermöglichen somit die Detektion und/oder Quantifizierung von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Reagenz und eine diagnostische Zusammensetzung, die unter anderem die Verbundstoffnanosphären oder die Konjugate aufweisen und die Verwendung dieses Reagenzes in einem analytischen Assay, z.B. für die Konfiguration von Proteinen oder Nukleinsäuren oder auch in einem diagnostischen Assay.
Die Konjugate finden außerdem Anwendung auf dem Gebiet der Therapie oder der Prophylaxe als Vehikel oder Vektor für eine medikamentöse Substanz, ein Mittel zum Reparieren von defekten Genen, ein Mittel, das dazu neigt, die Expression eines Gens zu blockieren oder zu inhibitieren, wie einer Antisens-Sonde in der Therapie oder ein Mittel, das dazu neigt, die Aktivität eines Proteins zu blockieren oder zu inhibitieren, und sie können aus diesem Grund in einer therapeutischen oder prophylaktischen Zusammensetzung verwendet werden.
Die Konjugate der Erfindung sind somit geeignet, eine medikamentöse Substanz in einer therapeutischen oder prophylaktischen Zusammensetzung zu transportieren, die das Konjugat zusammen mit einem geeigneten und pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoff und/oder Verdünnungsmittel und/oder Exzipienten aufweist, wobei die medikamentöse Substanz in der Lage ist, in vivo freigesetzt zu werden. Definitionen von pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und Zusatzstoffen sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th ed., Mack Publishing Co., beschrieben.
Die Konjugate der Erfindung sind außerdem geeignet, ein Gen von therapeutischem Interesse zu transportieren, das für zumindest ein Protein von Interesse oder ein Fragment eines Proteins von Interesse codiert, wobei es so ist, dass unter einem Protein zugleich ein Protein in seiner allgemeinsten verwendeten Definition und ein Antikörper zu verstehen ist. Es ist leicht verständlich, dass ein solches Konjugat in eine therapeutische oder prophylaktische Zusammensetzung eingearbeitet werden kann, die die zur Expression dieses Gens von therapeutischem Interesse notwendigen Elemente aufweist.
Die Konjugate der Erfindung sind, wenn sie in eine therapeutische oder prophylaktische Zusammensetzung eingearbeitet sind, ebenfalls zum in vivo-Transfer von Antisens-Sonden oder Antisens-Oligonukleotiden verwendbar. Die Antisens sind in der Lage, spezifisch mit der Synthese eines Zielproteins durch Inhibitieren, der Bildung und/oder des Funktionierens des Polysoms während des Positionierens der rRNA im Ziel zu interferieren. Daher zielt die häufige Auswahl der Sequenz, die das Codon zum Start der Translation umfasst, als Ziel für ein Inhibitieren durch ein Antisens-Oligonukleotid auf das Verhindern der Bildung des Startkomplexes ab. Andere Mechanismen des Inhibitierens durch Antisens-Oligonukleotide schließen eine Aktivierung der Ribonuklease H, die die Antisens-Oligonukleotid/mRNA-Hybride verdaut, oder eine Interferenz im Bereich der Splicestellen durch Antisens-Nukleotide ein, wobei das Ziel eine Splicestelle der mRNA ist. Die Antisens-Oligonukleotide sind gleichfalls komplementär zu DNA-Sequenzen und können durch Bildung einer Triplehelix im Bereich der Translation interferieren, die Antisens-Nukleotide paaren sich durch Wasserstoffbindung, die de Hoogsteen genannt werden, im Bereich der großen Furche mit der DNA-Doppelhelix. In diesem speziellen Fall spricht man genauer von Antigen-Oligonukleotiden. Es ist verständlich, dass die Antisens-Nukleotide genau komplementär zur Ziel-DNA oder RNA, mit der sie hybridisieren sollen, sein können, aber auch nicht genau komplementär, unter der Bedingung, dass sie mit dem Ziel hybridisieren. Desgleichen kann es sich um Antisens-Nukleotide handeln, die im Bereich der Internukleotidbindung nicht modifiziert oder modifiziert sind. All diese Vorstellungen bilden Teil des Allgemeinwissens des Fachmanns.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine therapeutische Zusammensetzung, die unter anderem ein Vektorkonjugat eines Antisens-Oligonukleotids wie zuvor definiert aufweist.
Schließlich sind die Konjugate außerdem geeignet, Komplexe vom Typ Käfigmolekül/Cryptat, Chelatbildner/cheliertes Molekül zu bilden oder als Vehikel für Katalysatoren in einer chemischen Anwendung zu dienen.
Die Verbundstoffnanosphären und Konjugate der Erfindung werden durch ein Verkapselungsverfahren durch Polymerisierung einer Emulsion gemäß dem in den folgenden Beispielen beschriebenen Protokoll erhalten, und die Erfindung betrifft außerdem ein solches Herstellungsverfahren.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird (i) eine stabile und isodisperse Ausgangsemulsion bereitgestellt, die aus zwei nicht mischbaren Phasen gebildet wird, nämlich einer hydrophoben Phase A, die durch Tröpfchen gebildet wird, die anorganische Nanopartikel aufweisen, die auf homogene Weise in einer organischen Phase dispergiert sind, die einen Grenzflächenaktiven Stoff aufweist, wobei die Phase A in einer hydrophilen Phase B dispergiert ist, (ii) wird in die hydrophile Phase B zumindest ein wasserlösliches Monomer, ein wasserlösliches Vernetzungsmittel und ein wasserlöslicher Polymerisationsstarter eingebracht und (iii) das wasserlösliche Monomer wird in Gegenwart des Vernetzungsmittels und des Starters polymerisiert.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird vor dem Schritt (ii) zumindest ein hydrophobes Monomer und ein erster wasserlöslicher Polymerisationsstarter in die hydrophile Phase eingebracht, und danach wird die Zugabe des zumindest einen wasserlöslichen Monomers und des Vernetzungsmittels und gegebenenfalls, wenn notwendig, eines zweiten wasserlöslichen Polymerisationsstarters, der gleich oder unterschiedlich zum ersten Starter ist, durchgeführt, wobei verständlich ist, dass die Zugabe eines zweiten Polymerisationsstarters nur verwendet wird, wenn die Menge des ersten Polymerisationsstarters begrenzt oder nicht ausreichend ist, um die Polymerisation vollständig durchzuführen. Die Gesamtmenge des Starters liegt bei 1 bis 10 Mol-%, vorzugsweise bei 1 bis 5 Mol-% bezogen auf die Gesamtkonzentration der Monomere.
Der wasserlösliche Starter ist ausgewählt aus dem Peroxydisulfatsalzen, nämlich den Persulfaten wie Kaliumpersulfat, Natriumpersulfat und Ammoniumpersulfat; den Hydroperoxiden wie Cumolhydroperoxid; Wasserstoffperoxid; 2,2'-Azobisamidinpropanhydrochlorid, Dimethyl-2,2'-azobis(2-methylpropionat), 4,4'-Azobis(4-cyanvaleriansäure) und 2,2'-Azobis(2-cyanpropanol). Unter diesen sind Dimethyl-2,2'-azobis(2-methylpropionat), 4,4'-Azobis(4-cyanvaleriansäure) und 2,2'-Azobis(2-cyanpropanol) funktionelle Starter. Die Persulfate sind wasserlösliche Starter. Eine Zersetzung und Einwirkung von Wärme erzeugt radikalische Sulfatanionen, die dazu beitragen, die Nanosphäre zu laden. Wasserstoffperoxid zersetzt sich in Wasser unter Bildung von Hydroxylradikalen, die nicht geladen sind. Die Hydroperoxide sind zugleich in der wässrigen Phase und den die Monomere bildenden Partikeln löslich. Die Zersetzung des Hydroperoxids erzeugt ein Hydroxyl und ein anderes Sauerstoff-haltiges Radikal, die sich in Abhängigkeit vom Typ des verwendeten Peroxids in einer der Phasen verteilen. Bei Cumolhydroperoxid im Falle der Polymerisation von Styrol wird davon ausgegangen, dass es sich im Bereich der Schnittstelle zwischen dem Partikel der Monomere und Wasser zersetzt, wobei die Hydroxylradikale in die wässrige Phase eintreten und die nicht polaren Radikale in Richtung des Partikels diffundieren. Von der kationischen oder anionischen Natur des Starters hängt der kationische oder anionische Charakter der Verbundstoffnanosphären der Erfindung und des resultierenden Konjugats ab.
Der Starter wird entweder gleichzeitig mit der Zugabe der Monomere oder vor deren Zugabe oder auch nach deren Zugabe in die hydrophile Phase eingebracht.
Das wasserlösliche Monomer und das hydrophobe Monomer entsprechen den zuvor gegebenen Definitionen.
Das wasserlösliche Vernetzungsmittel ist ausgewählt aus N,N'-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglykoldimethacrylat.
Die organische hydrophobe Phase A ist eine Phase, die einen aliphatischen oder cyclischen Kohlenwasserstoff aufweist, der ausgewählt ist aus den Verbindungen, die 5 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen, deren Isomeren und deren Mischungen. Insbesondere ist der Kohlenwasserstoff ausgewählt aus Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan, Decan, Undecan, Dodecan, wobei verständlich ist, dass, wenn die Polymerisation durch Erhöhen der Temperatur bewirkt wird, der Fachmann den Reaktionsaufbau an die flüchtigen Bestandteile wie Pentan und an die Art des ausgewählten Polymerisationsstarters anpassen muss. Die Phase B ist eine wässrige Phase wie Wasser.
Die Polymerisation wird vorzugsweise durch Erhöhen der Temperatur auf etwa 60 bis etwa 90°C, vorzugsweise auf etwa 70°C in Gegenwart des Polymerisationsstarters durchgeführt, wobei verständlich ist, dass die Bedingungen der Polymerisation durch den Fachmann in Abhängigkeit von der Art des gewählten Starters bestimmt werden; oder sie wird durch Photochemie mit Hilfe von Strahlung wie UV-Strahlung oder einem Laserstrahl oder anderen Energiequellen durchgeführt.
Beispiel 1
Eine stabile und isodisperse Ausgangsemulsion wurde gemäß dem einen oder dem anderen in diesem Beispiel beschriebenen Protokoll hergestellt.
(i) Die Primäremulsion wurde mit Hilfe eines Emulgierverfahrens durch schrittweises Einarbeiten der dispersen Phasen, die aus 45 Gew.-% Eisenoxid in Octan gebildet wird, in die kontinuierliche Phase, die aus Natriumdodecylsulfat mit einer Konzentration von 50 Gew.-% in Wasser gebildet wird, bis zum Erhalt von Fraktionen, die 80 Gew.-% des organischen Ferrofluids aufweisen, hergestellt, und zwar durch Scheren mit Hilfe einer Kolloidmühle (Ika: kommerzieller Name).
Die so definierte Mischung wurde danach in einer Couette vom Typ PG398 mit einem vorherbestimmten Scherverhältnis aufgespalten. Die so hergestellte Primäremulsion ist eine polydisperse Emulsion, die durch eine breite Verteilung der Tröpfchendurchmesser charakterisiert ist und die danach zum Erhalt der in der Größe isodispersen Ausgangslösung durch wiederholtes magnetisches Sichten behandelt wird.
(ii) Die Primäremulsion wurde mit Hilfe eines Emulgierverfahrens gebildet, und zwar durch schnelles Zugeben der dispersen Phase, die aus Octan, 73 Gew.-% Eisenoxid und einem lipophilen Grenzflächen-aktiven Mittel vom Typ Monoglycerin- oder Polyglycerinpolyricinoleat (1 bis 10 Gew.-%) gebildet wird, zu der kontinuierlichen Phase, die durch einen Grenzflächenaktiven Stoff vom Typ Tergitol NP10 (31 Gew.-%) gebildet wird, und zwar mittels eines Spatels. Die so definierte Mischung wird danach in einer Couette vom Typ PG398 mit einem vorher definierten Scherverhältnis aufgespalten. Die so hergestellte Primäremulsion ist eine relativ isodisperse Emulsion, die durch eine enge Verteilung der Tröpfchendurchmesser charakterisiert wird und die danach zum Erhalt der in der Größe isodispersen Ausgangsemulsion durch wiederholtes magnetisches Sichten behandelt wird.
Beispiel 2
In einen 25 ml-Polymerisationskolben werden 20 ml Emulsion (1 Gew.-% dispergiert in Natriumdodecylsulfat (SDS) mit der 0,8-fachen kritischen Micellankonzentration (CMC) und in Wasser) verbracht. Die Lösung wird für 9 Stunden durch Durchblasen von Stickstoff zum Austreiben der Luft entgast. 24 μl Styrolmonomere und 4,3 mg Kaliumpersulfatstarter gelöst in 0,4 ml Wasser werden zugegeben, und die Mischung wird für 2 Stunden unter Rühren gehalten. Die Temperatur wird danach unter Rühren für 20 Minuten auf 70°C erhöht. Eine Mischung (280 mg N-Isopropylacrylamid gelöst in 1 ml Wasser, 11 mg Methylenbisacrylamid gelöst in 0,4 ml Wasser, 30 μl Methacrylsäure) wird über einen Zeitraum von 30 Minuten zugegeben. Die Polymerisation wird während 12 Stunden unter Stickstoffatmosphäre und bei einer Temperatur von 70°C durchgeführt. Die Gegenwart von funktionellen Gruppen wird durch die Methacrylsäure sichergestellt.
Der endfertige magnetische Latex zeigt bei 20°C die folgenden Eigenschaften: Der durch Lichtstreuung bestimmte Durchmesser liegt bei 192 nm ± 5 nm. Der Gehalt an Eisenoxid liegt bei etwa 75 %.
Beispiel 3
In einen 50 ml-Polymerisationsreaktor werden 15 ml Emulsion (0,7 % in SDS mit einmal der CMC und in Wasser) verbracht. Die Lösung wird für 3 h:30 min durch Durchblasen von Stickstoff entgast. 7 μl Styrolmonomere und 2 μl Methacrylsäure werden zugegeben, und die Mischung wird für 20 Minuten unter Rühren gehalten. Der Starter (Kaliumpersulfat, 2 mg), gelöst in 0,1 ml Wasser, wird zugegeben, und die Lösung wird für 10 Minuten homogenisiert. Die Temperatur wird danach unter Rühren für 25 Minuten auf 70°C erhöht. Die folgende Mischung (80 mg N-Isopropylacrylamid gelöst in 0,5 ml Wasser, 6 μl Methacrylsäure, 6 μl Styrol) wird wie folgt dazugegeben: Zugabe von 200 μl der Mischung und Homogenisierung für 30 Minuten gefolgt von der Zugabe von 200 μl der Mischung und Homogenisierung für 30 Minuten vor dem Zugeben der anderen Bestandteile der Mischung. Die Polymerisationsreaktion wird unter Rühren mit 300 U/min für 16 Stunden unter Stickstoffatmosphäre und bei einer Temperatur von 70°C durchgeführt. Die Gegenwart von funktionellen Gruppen wird durch die Methacrylsäure sichergestellt.
Der endfertige magnetische Latex weist die folgenden Eigenschaften auf: einen Durchmesser von 187 nm ± 5 nm bei 20°C, bestimmt durch Lichtstreuung und einen Gehalt an Eisenoxid von etwa 70 %. Zetapotential –50 mV bei pH 10 und 0 mV bei pH 4,5.
Beispiel 4
In einen 50 ml-Polymerisationskolben werden 15 ml einer Emulsion (0,7 % dispergiert in Wasser mit einmal der CMC Triton X405) eingeführt. Diese Emulsion wurde zuvor durch Durchblasen von Stickstoff für 5 Stunden entgast. 7 μl Styrolmonomere und 2 mg N-(3-Aminopropyl)methacrylamid gelöst in 0,2 ml Wasser werden zugegeben. Die Mischung wird vor dem Zugeben von 2 mg 2,2'-Azobisamidinpropanhydrochlorid (dem Starter) gelöst in 0,2 ml Wasser für 25 Minuten homogenisiert. Nach einer Homogenisierung von 20 Minuten wird die Temperatur für 25 Minuten auf 70°C erhöht, und die folgende Mischung (80 mg N-Isopropylacrylamid gelöst in 0,5 ml Wasser, 2 mg Methylenbisacrylamid gelöst in 0,1 ml Wasser, 6 mg N-(3-Aminopropyl)methacrylamid gelöst in 0,1 ml Wasser) wird auf die folgende Weise zugegeben: Zugabe von 0,2 ml der Mischung und Homogenisierung für 20 Minuten, Zugabe von 0,2 ml der Mischung und Homogenisierung für 30 Minuten, Zugabe des Rests der Mischung.
Die Polymerisationsreaktion wird unter Rühren mit 300 U/min für 16 Stunden unter Stickstoffatmosphäre und bei einer Temperatur von 70°C durchgeführt. Die Gegenwart von Amingruppen wird durch das N-(3-Aminopropyl)methacrylamid sichergestellt.
Der endfertige magnetische Latex weist die folgenden Eigenschaften auf: Ein Durchmesser von 187 nm ± 5 nm bei 20°C bestimmt durch Lichtdiffusion und einen Eisenoxidgehalt im Bereich von 70 %. Zetapotential + 50 mV bei pH 4, –50 mV bei pH 10.
Beispiel 5
Zu 240 μl eines magnetischen Latex mit 3 %, der wie zuvor beschrieben erhalten wurde, werden aufeinander folgend 60 μl Tween 20 (1 %), 636 μl Phosphatpuffer (10 mMol mit pH 6,9), 60 μl N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimiddihydrochlorid (25 mg/ml), 156 μl N-Hydroxysulfonsuccinimid (25 mg/ml) und Streptavidin (48 μl mit 1 mg/ml) zugegeben.
Die Mischung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, und die Partikel werden danach durch Anlegen eines Magnetfelds konzentriert und danach in einem Puffer, der einen grenzflächenaktiven Stoff aufweist (Phosphat 10 mMol, pH 6,0 + Tween 20 0,05 %), redispergiert.
9,9 μl eines biotinylierten Oligonukleotids (ODN) mit 17 Meren, das ein Molekulargewicht von 5753 g/Mol aufweist, mit einer Konzentration von 338 nMol/ml, werden zu 400 μl der zuvor synthetisierten mit Streptavidin bedeckten Partikel zugegeben, um die Positivkontrolle zu bilden. 20 μl eines nicht biotinylierten und nicht aminierten Oligonukleotids mit 17 Meren (Molekulargewicht: 6452 g/Mol mit einer Konzentration von 167 nMol/ml) werden zu 400 μl der zuvor synthetisierten mit Streptavidin bedeckten Partikel zugegeben, um die Negativkontrolle zu bilden.
Die beiden Kontrollen werden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dreimal abgetrennt und redispergiert, das erste Mal mit einem basischen Puffer (Phosphat 10 mMol, pH 9,9 + SDS, 5 mal die kritische micellare Konzentration), das zweite Mal mit einem Puffer mit neutralem pH (Phosphat 10 mMol, pH 6,9 + Tween 20 0,05 %) und das dritte Mal in 280 μl PEG, das Lachssperma-DNA enthält.
In den beiden Fällen werden 20 μl mit Meerettichperoxidase markierte ODN, die komplementär zur ODN der Positivkontrolle ist (17 Mere, Konzentration 9 nMol/ml) zugegeben.
Die beiden Kontrollen werden erneut für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, werden erneut abgetrennt und von Neuem in 400 μl PEG, das Lachssperma-DNA enthält, dispergiert.
50 μl Orthophenylendiamin werden zu 50 μl der Partikel zugegeben. Die enzymatische Reaktion wird für 5 Minuten durchgeführt und durch Zugabe von 50 μl Schwefelsäure (1 Mol) gestoppt.
Die Partikel werden vom Überstand abgetrennt und Letztere wird durch Kolorimetrie auf einem Axia Microreader (kommerzieller Name, von bioMérieux) bei 492 und 630 nm vermessen.
Die Positivkontrolle ergibt eine optische Dichte von 2000 Einheiten DO während die Negativkontrolle eine Dichte von 1000 Einheiten DO ergibt.
Die beobachteten Schwankungen in der Größe vor und nach der Polymerisation in den vorhergehenden Beispielen wird der Kombination der beiden folgenden Phänomene zugeschrieben: a) ein mögliches Verdampfen eines Teils der organischen Phase und b) eine Umwandlung der Polymerisation von einem Beispiel zum Anderen. Der Gehalt an Eisenoxid nach der Polymerisation ist im Wesentlichen in der gleichen Größenordnung wie in der vor der Polymerisation verwendeten Emulsion.

Claims

Verbundstoffnanosphären, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Durchmesser zwischen etwa 50 und 1.000 nm, ± 5 %, aufweisen und dass sie Folgendes aufweisen, nämlich – einen im Wesentlichen flüssigen Kern, der aus einer organischen Phase und aus anorganischen Nanopartikeln gebildet ist, die in der organischen Phase verteilt sind, und – eine Hülle, die aus zumindest einem hydrophilen Polymer gebildet ist, das aus der Polymerisation von zumindest einem wasserlöslichen Monomer insbesondere einem N-Alkylacrylamid oder einem N-N-Dialkylacrylamid entstanden ist.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Durchmesser zwischen etwa 100 und 500 nm, ± 5 %, aufweisen.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Durchmesser vorteilhafterweise zwischen etwa 100 und 200 nm, ± 5 %, aufweisen.
Verbundstoffnanosphären nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Monomer ausgewählt ist aus N-Isopropylacrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N-isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid.
Verbundstoffnanosphären nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der flüssige Kern Folgendes aufweist, nämlich – (i) einen aliphatischen oder zyklischen Kohlenwasserstoff, ausgewählt aus den Verbindungen, die 5 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen, deren Isomeren und deren Mischungen – (ii) anorganische Nanopartikel ausgewählt aus den metallischen Oxiden von Eisen, Titan, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Nickel; Magnetit; Hämatit; den Ferriten wie den Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink; den Legierungen von Kobalt, Nickel; den Zeoliten; Talk; den Tonen wie Bentonit und Kaolin; Aluminiumoxid; Siliziumdioxid; Graphit; Ruß oder anderen anorganischen Materialien.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel ausgewählt sind aus den metallischen Oxiden von Eisen, Titan, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Nickel; Magnetit; Hämatit, den Ferriten wie den Ferriten von Mangan, Nickel, Mangan-Zink; den Legierungen von Kobalt, Nickel.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern zusätzlich noch einen Marker wie einen Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder radioaktiven Marker aufweist.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff ausgewählt ist aus Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan, Decan, Undecan und Dodecan.
Verbundstoffnanosphären nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganischen Nanopartikel bezogen auf das Gesamtgewicht der Verbundstoffnanosphären 5 bis 95 Gew.-% ausmachen.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganischen Nanopartikel bezogen auf das Gesamtgewicht der Verbundstoffnanosphären 10 bis 90 Gew.-% ausmachen.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganischen Nanopartikel bezogen auf das Gesamtgewicht der Verbundstoffnanosphären 20 bis 80 Gew.-% ausmachen.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganischen Nanopartikel bezogen auf das Gesamtgewicht der Verbundstoffnanosphären 50 bis 80 Gew.-% ausmachen.
Verbundstoffnanosphären nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle ein in den Ansprüchen 1 oder 4 definiertes hydrophiles Polymer aufweist, wobei dieses Polymer eine äußere Schicht der Hülle bildet und dass sie ein hydrophobes Polymer aufweist, das eine innere Schicht der Hülle bildet, die an der Grenzfläche zwischen der äußeren Schicht der Hülle und dem im Wesentlichen flüssigen Kern angeordnet ist.
Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Polymer ausgewählt ist aus den Homopolymeren der wasserunlöslichen vinylaromatischen Monomere, wie Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, tert-Butylstyrol, Vinyltoluol, wie auch den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Comonomeren, wie den Alkylacrylaten und den Alkylmethacrylaten, in denen die Alkylgruppe 3 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, den Estern von Ethylensäuren, die 4 oder 5 Kohlenstoffatome aufweisen und von Alkylen, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome aufweisen, den Methacrylsäuren, den Styrolderivaten, den Dienverbindungen.
Verbundstoffnanosphären nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich an der Oberfläche der Hülle reaktive funktionelle Gruppen wie Carboxylgruppen, Amingruppen, Thiolgruppen, Aldehydgruppen, Hydroxylgruppen, Tosylgruppen, Hydrazingruppen aufweisen, die dazu neigen, mit zumindest einem Liganden zu reagieren.
Konjugate, die von Verbundstoffnanosphären nach Anspruch 15 abgeleitet sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit zumindest einem Liganden gekoppelt sind, der ausgewählt ist aus einem Antikörper, einem Fragment eines Antikörpers, einem Protein, einem Polypeptid, einem Enzym, einem Polynukleotid, einer Sonde, einem Starter, einem Fragment einer Nukleinsäure, und Biotin.
Reagenz, das unter anderem zumindest eine in den Ansprüchen 1 bis 15 definierte Nanosphäre oder ein in Anspruch 16 definiertes Konjugat aufweist.
Diagnostische Zusammensetzung, die unter anderem ein im Anspruch 17 definiertes Reagenz aufweist.
Verwendung eines im Anspruch 17 definierten Reagenzes oder einer in Anspruch 18 definierten Zusammensetzung, in einem diagnostischen Assay.
Konjugate, die von Verbundstoffnanosphären nach den Ansprüchen 1 bis 14 abgeleitet sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit zumindest einem Liganden gekoppelt sind, der ausgewählt ist aus den medikamentösen Substanzen, den Antisense-Sonden, den Genreparaturmitteln oder den Genen von therapeutischem Interesse, den Mitteln zum Blockieren oder Inhibitieren einer Proteinaktivität.
Therapeutische oder prophylaktische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter anderem ein Konjugat nach Anspruch 20 aufweist.
Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 20 zur Herstellung einer therapeutischen oder prophylaktischen Zusammensetzung.
Konjugate, die von Verbundstoffnanosphären nach den Ansprüchen 1 bis 13 abgeleitet sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit zumindest einem Liganden gekoppelt sind, der ausgewählt ist aus den Käfigmolekülen, den chelierenden Mitteln und den Katalysatoren.
Verfahren zum Herstellen von Verbundstoffnanosphären bei dem (i) eine stabile und isodisperse Ausgangsemulsion bereitgestellt wird, die aus zwei nicht mischbaren Phasen gebildet wird, nämlich einer hydrophoben Phase A, die durch Tröpfchen gebildet wird, die anorganische Nanopartikel aufweisen, die auf homogene Weise in einer organischen Phase dispergiert sind, die einen grenzflächenaktiven Stoff aufweist, wobei die Phase A in einer hydrophilen Phase B dispergiert ist, (ii) in die hydrophile Phase B zumindest ein wasserlösliches Monomer, ein wasserlösliches Vernetzungsmittel und ein wasserlöslicher Polymerisationsstarter eingebracht wird, und das wasserlösliche Monomer in Gegenwart des Vernetzungsmittels und des Starters polymerisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 24, bei dem vor dem Schritt (ii) zumindest ein hydrophobes Monomer und ein erster Polymerisationsstarter in die hydrophile Phase eingebracht wird und, falls notwendig, in Schritt (ii) ein zweiter Polymerisationsstarter eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 24 und 25, bei dem der erste wasserlösliche Polymerisationsstarter und gegebenenfalls der zweite Polymerisationsstarter entweder gleichzeitig mit der Zugabe der wasserlöslichen bzw. hydrophoben Monomere oder vor oder nach der Zugabe der wasserlöslichen bzw. hydrophoben Monomere, in die hydrophile Phase eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, bei dem der wasserlösliche Starter ausgewählt ist aus den Peroxydisulfatsalzen, nämlich den Persulfaten, wie Kaliumpersulfat, Natriumpersulfat und Ammoniumpersulfat; den Hydroperoxiden wie Cumolhydroperoxid; Wasserstoffperoxid; 2-2'-Azobisamidinpropanhydrochlorid, Dimethyl-2,2'-azobis(2-methylpropionat), 4,4'-Azobis(4-cyanvaleriansäure) und 2,2'-Azobis(2-cyanpropanol).
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Monomer ausgewählt ist aus den N-Alkylacrylamiden und den N-N-Dialkylacrylamiden, insbesondere N-Isopropylacrylamid, N-Methylacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-n-Propylacrylamid, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Cyclopropylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N-Methyl-N-isopropylacrylamid, N-Methyl-N-n-propylacrylamid und dass das hydrophobe Monomer ausgewählt ist aus den wasserunlöslichen vinylaromatischen Monomeren wie Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, tert-Butylstyrol, Vinyltoluol, wie auch den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Comonomeren wie den Alkylacrylaten und den Alkylmethacrylaten, in denen die Alkylgruppe 3 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, den Estern von Ethylensäuren, die 4 oder 5 Kohlenstoffatome aufweisen und von Alkylen, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome aufweisen, den Methacrylsäuren, den Styrolderivaten und den Dienverbindungen.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Monomer ausgewählt ist aus den wasserunlöslichen vinylaromatischen Monomeren wie Styrol, Methylstyrol, Ethylstyrol, tert-Butylstyrol, Vinyltoluol wie auch den Copolymeren dieser Monomere untereinander und/oder mit anderen Copolymeren wie den Alkylacrylaten und den Alkylmethacrylaten, in denen die Alkylgruppe 3 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, den Estern von Ethylensäuren, die 4 oder 5 Kohlenstoffatome aufweisen und von Alkylen, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome aufweisen, den Methacrylsäuren, den Styrolderivaten, den Dienverbindungen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, bei dem das wasserlösliche Vernetzungsmittel ausgewählt ist aus N,N'-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglycoldimethacrylat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, bei dem die hydrophobe organische Phase A eine Phase ist, die einen aliphatischen oder zyklischen Kohlenwasserstoff aufweist, der ausgewählt ist aus den Verbindungen, die 5 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen, deren Isomeren und deren Mischungen insbesondere aus Pentan, Hexan, Heptan, Octan, Nonan, Decan, Undecan, Dodecan und bei dem die Phase B eine wässrige Phase, insbesondere Wasser, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerisation durch Erhöhen der Temperatur auf etwa 60° bis etwa 90°C, vorzugsweise auf etwa 70°C in Gegenwart des Polymerisationsstarters oder durch Photochemie mit Hilfe von Strahlung wie UV-Strahlung oder einem Laserstrahl durchgeführt wird.